Summary
Nous décrivons un procédé simple pour l'isolement des plaquettes lavées à partir de sang humain suivie par des mesures de l'agrégation plaquettaire induite par l'agoniste par turbidimétrie. À titre d'exemple, nous appliquons cette méthode pour étudier la réponse d'agrégation des plaquettes sanguines humaines au collagène après une pré-incubation avec l'inhibiteur du canal Pannexin1 bleu brillant FCF.
Abstract
Turbidimétrie est une technique de laboratoire qui est appliquée pour mesurer l'agrégation des plaquettes en suspension soit dans le plasma (plasma riche en plaquettes, PRP) ou dans un tampon (plaquettes lavées), par l'utilisation d'une ou d'une combinaison d'agonistes. L'utilisation de plaquettes lavées séparés de leur environnement de plasma et en l'absence d'anticoagulants permet d'étudier les propriétés intrinsèques des plaquettes. Parmi le grand groupe d'agonistes, l'acide arachidonique (AA), l'adénosine di-phosphate (ADP), la thrombine et le collagène sont les plus fréquemment utilisés. La réponse d'agrégation est quantifié en mesurant la densité optique relative (OD) dans le temps de suspension de plaquettes sous agitation continue. Les plaquettes en suspension homogène limitent le passage de la lumière après l'addition d'un agoniste, le changement de forme des plaquettes se produit produisant une légère augmentation transitoire de la DO. Après cette étape d'activation initiale, les caillots de plaquettes forment progressivement, ce qui permet le passage de la lumière à travers la suspension en tant que resULT de diamètre extérieur a diminué. Le processus d'agrégation est finalement exprimé en pourcentage, par rapport à la densité optique du plasma pauvre en plaquettes ou de tampon. l'étalonnage est donc essentiel Rigoureuse au début de chaque expérience. En règle générale: étalonnage à 0% est réglé en mesurant la DO d'une suspension de plaquettes non stimulées tout en mesurant la densité optique du milieu de suspension ne contenant pas de plaquettes représente une valeur de 100%. L'agrégation plaquettaire est généralement visualisé sous la forme d'une courbe d'agrégation en temps réel. Turbidimétrie est l'un des plus souvent des techniques de laboratoire utilisées pour l'étude de la fonction plaquettaire et est considéré comme l'étalon-or historique et utilisé pour le développement de nouveaux agents pharmaceutiques visant à inhiber l'agrégation plaquettaire. Nous décrivons ici des protocoles détaillés pour 1) la préparation de plaquettes lavées humaine et 2) l'analyse turbidimétrique de l'agrégation induite par le collagène de plaquettes lavées humain prétraité avec le colorant alimentaire bleu brillant FCF qui a été récemment iDENtifié comme inhibiteur de canaux (Pannexin1 de Panx1).
Introduction
Les plaquettes sont des éléments essentiels du sang et de leur principale fonction en même temps que les facteurs de coagulation-est d'arrêter le saignement après une blessure des vaisseaux sanguins. Les plaquettes sont de petits (2-3 pm) de fragments anucléées dérivés de mégacaryocytes de la moelle osseuse 1. Les plaquettes circulent dans l'état non activé, au cours de laquelle ils apparaissent comme des structures en forme de lentille. Lors de l'interruption de l'endothélium, les plaquettes se réunissent pour le site de la lésion des vaisseaux sanguins pour boucher le trou, un processus appelé hémostatique primaire. Dans un premier temps , les plaquettes se fixent aux molécules de sous-endothélial, tels que le collagène et le facteur de von Willebrand, qui sont exposés à la suite de l'étape d'adhésion des blessures 2. Ensuite, ils changent de forme et sécrètent chimique étape messagers-activation. Enfin, ils se connectent les uns aux autres en comblant l'étape récepteurs de l'agrégation. L'hémostase primaire est suivie par un processus secondaire impliquant l'activation de la cascade de la coagulation avec un dépôt de fibrine, qui stabilisents le thrombus initial 2.
Des événements ischémiques aigus tels que l' infarctus du myocarde 3 résultent souvent de thrombus qui se forment en raison de la perturbation physique (rupture) d'une plaque athéroscléreuse. médicaments antiplaquettaires actuels sont la pierre angulaire du traitement de cette maladie généralisée mais leur bénéfice clinique est limitée par un risque accru de saignement. Les médicaments les plus prescrits chez les patients cardio - vasculaires, l' aspirine et des composés anti-P2Y12, cible le thromboxane A2 et les voies d' ADP 4, respectivement, qui sont les principales voies conduisant à l' activation des plaquettes. Cependant, la recherche novatrice vers de nouvelles cibles qui équilibre de façon optimale les effets antithrombotiques et le risque est encore nécessaire hémorragique.
A partir des années 1960 5 aujourd'hui, turbidimétrique agrégométrie a joué un rôle crucial dans la recherche, l' amélioration de notre connaissance de la réactivité plaquettaire et in le contrôle de la puissance des réactifs anti-thrombotiques chez les humains. Turbidimétrie a d'abord été appliquée à PRP extrait à partir d'échantillons de sang. En effet, la collecte de sang réalisée dans des tubes contenant du citrate permet une production rapide et importante de PRP sans avoir aucun effet sur l'intégrité et la fonction plaquettaire. Cependant, la stabilité à court terme (environ 3 h) de PRP et les enzymes plasmatiques restantes, telles que la thrombine, et la faible concentration de calcium associé à des profils d'agrégation potentiellement artefactuelles sont des inconvénients majeurs pour l'utilisation de PRP. Un pas important a été la mise au point d'un procédé pour l' isolement des plaquettes avec une centrifugation supplémentaire et lavage étapes 6. En bref, le PRP est isolé à partir de sang total prélevé sur citrate-dextrose acide (ACD) et les plaquettes sont isolés après les étapes de centrifugation en série avant d'être remis en suspension dans un tampon de phosphate iso-osmotique (le tampon de Tyrode) contenant du glucose, de l'albumine de sérum humain et c divalentations (Ca 2+ et Mg 2+). Pour éviter des changements dans la réactivité plaquettaire, le pH du tampon de Tyrode est soigneusement maintenu à 7,35 à 7,4. De plus, l' activation indésirable des plaquettes est empêchée par l' addition de la prostacycline (PGI 2) avant des étapes de centrifugation. Enfin, l'ajout de apyrase empêche les plaquettes de devenir résistant à la chaux contre l'action de l'ATP / ADP. La suspension de plaquettes résultante manque de facteurs coagulants et la stabilité des plaquettes est augmentée d'au moins deux fois par rapport à des solutions PRP. En outre, le fait que les plaquettes sont bons mais inactifs intactes la reproductibilité des mesures turbidimétriques et offre la possibilité d'étudier l'action d'agonistes ou d'antagonistes de l'agrégation plaquettaire de manière optimale.
En utilisant cette méthode, nous avons montré dans une étude récente que l'inhibition de la formation de canaux de Panx1 par une approche génétique (souris knock-out) ou en diminuant l'activité des canaux Panx1 par pharmacologiqueapproche réduit l' agrégation plaquettaire induite par le collagène 7. Forme Panx1 canaux ATP à libération, qui sont exprimés de manière ubiquitaire dans de nombreux types de cellules , y compris les plaquettes humaines 7, 8. En fait, nous avons démontré par turbidimétrie sur les plaquettes lavées humain qui a 7 min préincubation avec un groupe de blocage des produits chimiques plus ou moins spécifiques (probénécide, la méfloquine et 10 peptides Panx1) avant l'addition de divers agonistes, inhibée spécifiquement induite par le collagène l'agrégation plaquettaire alors que les réponses des plaquettes à AA et ADP ne sont pas affectés. Nous avons démontré que la libération d'ATP par la voie Panx1 interfère spécifiquement dans la voie de signalisation de GPVI conduisant à l'agrégation induite par le collagène. Fait intéressant, plusieurs composés approuvés par la FDA avec des applications dans d'autres maladies (probénécide, méfloquine) affectent l'activité des canaux Panx1 dans les plaquettes. D'une part, cela ouvre de nouvelles perspectives thérapeutiques pour sélectionnermodifier ivement réactivité plaquettaire. D'autre part, il faut tenir compte des effets secondaires potentiels de ces composés. Dans ce contexte, le colorant alimentaire sain bleu brillant FCF utilisé dans plusieurs bonbons et des boissons énergisantes a été décrit comme un inhibiteur sélectif de Panx1 9. Nous décrivons ici un protocole pour l'isolement des plaquettes lavées de l'homme et des mesures turbidimétriques de l'agrégation plaquettaire adapté pour étudier l'effet du colorant bleu brillant FCF comme un antagoniste de l'agrégation plaquettaire.
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Protocol
Cinq volontaires sains non apparentés ont été recrutés pour le prélèvement sanguin pour les tests d'isolement et l'agrégation plaquettaire. Le consentement éclairé écrit a été obtenu et le protocole a été approuvé par le Comité central d'éthique des Hôpitaux Universitaires de Genève. Tous les bénévoles certifiés pour être en bonne santé et ont pris aucun médicament interférant plaquettaire pendant au moins les 10 jours précédant les expériences.
1. Tampon Préparation pour la collecte de sang humain et Lavé Isolation Platelet
- Préparer une solution aqueuse d'acide-citrate-dextrose 100 mL (ACD) en dissolvant 1,4 g de monohydrate d'acide citrique (C 6 H 8 O 7 • H 2 O, 66,6 mM), 2,5 g de dihydrate de citrate trisodique (Na 3 C 6 H 5 O 7 • H 2 O 2, 85 mM) et 2 g de D anhydre (+) - glucose. Le pH de la solution est d'environ 4,5.
- Préparer des solutions de stock pour le tampon de Tyrode comme suit
- Préparer la solution mère 1 en dissolvant 80 g de NaCl, 2 g de KCl, 10 g de NaHCO 3 et de 0,58 g de NaH 2 PO 4 * H 2 O dans 500 ml d'eau distillée 2 O. Les concentrations finales respectives sont 2,73 M, 53,6 mM, 238 mM et 8,4 mM. Conserver la solution à 4 ° C.
- Préparer la solution mère en dissolvant 2 g 10,15 MgCl2 * 6 H 2 O (100 mM) dans 500 ml d' H 2 O. distillée Conserver la solution à 4 ° C.
- Préparer la solution mère en dissolvant 3 g 10,95 (100 mM) CaCl 2 * 6 H 2 O dans 500 ml d' eau distillée 2 O. Conserver la solution à 4 ° C.
- Préparer du tampon de Tyrode en diluant 2,5 ml de solution mère 1 dans un volume final de 50 ml avec de l' eau distillée 2 O. Ceci correspond à des concentrations finales de 136,5 mM de NaCl, 2,68 mM de KCl, 11,9 mM de NaHCO 3 et de 0,42 mM de NaH 2 PO 4 * H 2 O. Ajuster le pH à 7,35 et stériliser par filtration à 0,22 um filters.
- Préparer le tampon d'albumine de Tyrode 0,35% (tampon TA 7) par dilution de 5 ml de solution mère 1, 1 ml de solution mère 2, 2 mL de solution mère 3, 0,5 ml de 1 M de HEPES, 1,8 ml de sérum - albumine humaine 200 g / L et 0,1 g de D anhydre (+) - glucose dans un volume final de 100 ml distillée H 2 O.
- Ajuster le pH à 7,35 avec du HCl 1 N et régler l'osmolarité de 295 mOsm / L par addition de H 2 O distillée (10% du volume total). Les concentrations finales dans cette solution sont les suivantes : 124 mM de NaCl, 2,44 mM de KCl, 10,82 mM NaHCO 3, 0,38 mM de NaH 2 PO 4 * H 2 O, 0,91 mM de MgCl2 * 6 H 2 O, 1,82 mM de CaCl2 * 6 H 2 O . Garder tampon TA à 37 ° C pendant toute l'expérience.
2. Collecte de sang
- Recueillir 45-50 ml de sang veineux à partir de la veine cubitale antérieure en utilisant une aiguille 19 G et peu ou pas tourniquet, dans des tubes de 50 ml de ConTaining anticoagulant ACD (1 volume ACD pour 6 volumes de sang). Jeter le premier 1-2 ml de sang pour éviter la présence de la thrombine et le facteur tissulaire.
- Après la collecte, mélanger le sang avec l'ACD en inversant doucement le tube. Incuber l'échantillon pendant 10 min à 37 ° C.
3. Préparation de l'homme Washed plaquettes
- Préchauffer la centrifugeuse à 37 ° C. Toutes les étapes de centrifugation ci-dessous sont effectuées à cette température.
- Envoyer le sang collecté dans des tubes de 15 ml (5 ml par tube) et centrifuger à 250 g pendant 13 min pour obtenir du PRP.
Remarque: Cette étape de centrifugation conduit à la production de trois couches de l'échantillon: 1) La couche supérieure, composée de plasma, de plaquettes, et une petite fraction de globules blancs. 2) La couche intermédiaire, une partie riche en globules blancs. 3) La couche inférieure, qui est constitué essentiellement de globules rouges. - Recueillir le PRP par pipetage la supérieure layer avec précaution dans un nouveau tube de 15 ml au maximum pour éviter une contamination par les globules rouges et blancs, et incuber pendant 10 min à 37 ° C.
- Centrifuger le PRP à 2200 g pendant 12 min (pour 5 ml de PRP).
NOTE: doit être effectuée Cette étape de centrifugation avec frein à faible ou sans frein. - Retirer le surnageant (plasma pauvre en plaquettes), et remettre en suspension avec précaution du culot avec 10 ml de tampon TA contenant 2 ul / ml d'héparine (5000 U / ml) et 2,5 ul / ml de 25 uM PGI 2 en utilisant une matière plastique pipette Pasteur. Incuber pendant 10 min à 37 ° C.
- Ajouter 2,5 ul / ml de 25 uM de PGI 2 et centrifuger pendant 8 min à 1900 xg (avec frein ou sans frein bas).
- Eliminer le surnageant et remettre en suspension le culot avec 5 ml de tampon TA contenant 2,5 ul / ml de 25 uM PGI 2 en utilisant une pipette Pasteur en matière plastique. Incuber pendant 10 min à 37 ° C.
- Au cours de la période d'incubation, pipeter 150 ul de la suspension de plaquettes dansdans un tube de 1,5 ml et compter les plaquettes, en utilisant un compteur de cellules automatisé (qui détecte la taille des cellules du sang en mesurant les variations de la résistance en courant continu).
- Après l'incubation de 10 min, ajouter 2,5 ul / ml de 25 uM PGI 2 de la suspension de plaquettes et immédiatement centrifuger à 1900 g pendant 8 min.
- Retirer le surnageant et remettre en suspension le culot à une concentration de 250.000 plaquettes / ul avec un volume suffisant de tampon TA ( par exemple , si le nombre de cellules est de 500.000 par uL, remettre en suspension dans 10 ml de tampon TA) contenant 32 pl / ml d'apyrase à 0,01 U / mL (concentration finale de 0,32 U / mL).
NOTE: Une concentration élevée de l' apyrase est utilisé pour éviter la désensibilisation des récepteurs de la P2X1 induites par la sécrétion spontanée de l' ATP 10, 11 en l' absence d'agonistes. Ceci est important parce que les réponses induite par le collagène sont induites par paracrine rapide / activation autocrine de P2X1 par l'ATP publié from activé plaquettes. Si la voie de signalisation plaquettaire ne nécessite pas de manière critique la préservation de la fonction P2X1, utilisez 0,02 U / ml apyrase. Plusieurs études (examinées dans Mahaut-Smith et al. 10) ont démontré que 0,02 apyrase U / ml évite désensibilisation récepteur P2Y1 ADP avec des réponses P2X1 négligeables. - Incuber la suspension de cellules pendant au moins 30 min à 37 ° C avant d'effectuer les mesures aggregometric. La préparation est stable pendant 5 à 8 heures.
4. agrégométrie
- Préparer le fibrinogène (56 mg / ml) dans du tampon de Tyrode.
- Pipeter 260 ul de suspension de plaquettes dans des cuvettes en verre (Figure 1A; cuvette gauche) contenant 10 pl de fibrinogène (56 mg / mL) et une tige d'agitation magnétique, puis incuber la suspension pendant 2 - 3 minutes à 37 ° C dans les puits d'incubation présents dans l'agrégomètre (Figure 1B et 1C).
- Pré-incubation avec le Panx1inhibiteur bleu brillant FCF par addition de 10 ul d'une 2,8 mM ou 28 mM de solution mère (concentration finale de 100 uM et 1 mM, respectivement) pendant 7 minutes à 37 ° C.
- Calibrer l'agrégomètre à une valeur d'agrégation assomptive 100% par mesure de la DO d'une cuvette contenant 10 ul de fibrinogène (56 mg / ml), 10 ul de bleu brillant FCF (2,8 mM ou 28 mM) et du tampon TA sans plaquettes.
- Placer la cuvette dans une agrégation et sous agitation automatique et appuyez sur la touche correspondante sur le clavier de l'ordinateur relié à l'agrégomètre (c. - presse F1 si bien d'agrégation 1 est utilisé).
NOTE: Cette expérience décrite ci-dessous comprend bleu brillant FCF. Le composé utilisé pour le calibrage doit être ajusté à la condition expérimentale.
- Placer la cuvette dans une agrégation et sous agitation automatique et appuyez sur la touche correspondante sur le clavier de l'ordinateur relié à l'agrégomètre (c. - presse F1 si bien d'agrégation 1 est utilisé).
- Calibrer l'agrégomètre à une valeur d'agrégation de 0% assomptive en utilisant le même échantillon de plaquettes qui seront utilisées pour l'expérience sous Stirrin automatiqueg.
- Placez la cuvette bien dans l'agrégation et appuyez sur la touche correspondante sur le clavier de l'ordinateur lié à la agrégomètre. Attendez environ 20-30 s avant de poursuivre. Ce délai permet d'assurer que l'agrégation ne se produit avant d'ajouter les agonistes.
Remarque: Comme toute différence dans le nombre de plaquettes peut avoir un effet sur le diamètre extérieur mesuré, l'étape d'étalonnage à 0% doit être répétée pour chaque mesure individuelle.
- Placez la cuvette bien dans l'agrégation et appuyez sur la touche correspondante sur le clavier de l'ordinateur lié à la agrégomètre. Attendez environ 20-30 s avant de poursuivre. Ce délai permet d'assurer que l'agrégation ne se produit avant d'ajouter les agonistes.
- Ajouter 20 ul d'agoniste souhaité, tel que 15 pg / ml de collagène (finale 1 pg / ml) ou 1,125 mM d'acide arachidonique (75 uM final), dans la cuvette. Immédiatement démarrer l'enregistrement, sous agitation continue et automatique en appuyant sur la touche correspondante sur le clavier de l'ordinateur relié à l'agrégomètre.
REMARQUE: L'ajout de l'agoniste induit une activation plaquettaire. Agrégats plaquettaires peuvent être clairement distinguées dans la cuve de verre à la fin de l'expérience (Figure 1A; droiCuve t). - L'enregistrement arrête automatiquement après 6 min. À ce stade, sauvegardez les données en cliquant sur l'icône de sauvegarde de l'ordinateur.
NOTE: Le calcul du taux d'agrégation est effectuée par l'ordinateur, qui exprime le résultat final du processus d'agrégation en pourcentage. - Analyser les données.
- Pour des informations détaillées supplémentaires sur les protocoles pour la préparation de suspensions de plaquettes lavées et de la mesure turbidimétrique de l' agrégation plaquettaire, se référer à d' autres documents rédigés par des experts dans le domaine de 12, 13.
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Representative Results
Le logiciel agrégomètre produit automatiquement les courbes d'agrégation et donne les valeurs pour l'agrégation maximale en pourcentage. Les valeurs peuvent être copiées dans un logiciel d'analyse de données afin d'effectuer des analyses statistiques et de visualiser les valeurs d'agrégation maximale sous forme de graphiques à barres. En option, chaque point de la courbe d'agrégation peut être exporté successivement dans un tableur puis de logiciels statistiques (par exemple GraphPad) afin de visualiser les courbes. Certains chercheurs utilisent la pente maximale de la courbe d'agrégation pour calculer la vitesse et l'aire sous la courbe pour évaluer l'activité des plaquettes. Le temps de latence et le changement de forme peuvent également visualiser graphiquement.
Un exemple typique d'une courbe d'agrégation des plaquettes humaines lavées dans des conditions de commande (H 2 O) est représentée sur la figure 2A. Ajout de l'agonist (collagène), induite (après un bref délai) un creux dans la courbe d'agrégation provoquée par le changement de forme des plaquettes. Ensuite, le pourcentage d'agrégation a progressivement augmenté au fil du temps jusqu'à ce qu'une valeur maximale a été atteinte à environ 3-4 min. Une légère diminution du pourcentage d'agrégation a été observée à la fin de l'enregistrement de 6 min, ce qui reflète une certaine désagrégation. Comme cela est illustré sur la figure 2A-B, on le lave humain préincubation des plaquettes avec l'inhibiteur de canal Panx1 bleu brillant FCF, à une concentration de 1 mM, ralentie ou totalement aboli le changement de forme des plaquettes initiales et bloqué l' agrégation induite par le collagène de plaquettes lavées obtenu à partir de 5 différents volontaires sains non apparentés. Lorsque les plaquettes où préincubées avec une concentration plus faible (100 M) de bleu brillant FCF, l'effet inhibiteur du colorant sur les réponses induite par le collagène et le changement de forme ne sont pas observés plus (voir la figure 2A pour un exemple). QUANTIFication des réponses de l' agrégation plaquettaire induite par 1 ug / ml de collagène a révélé que 1 mM de bleu brillant FCF réduit de manière significative les réponses d'agrégation maximale par rapport aux conditions de contrôle, ainsi que pour une plus faible concentration (100 uM) d' un inhibiteur de Panx1 (figure 2C). L'inhibition de l'agrégation plaquettaire était spécifique de réponses induites par le collagène et non en raison d'effets secondaires indésirables de bleu brillant FCF (sur la viabilité des cellules, par exemple) de la même concentration du colorant (1 mM) n'a pas affecté la réponse d'agrégation induite par un autre agoniste, soit 75 pM AA, comme illustré sur la figure 2D. Ces résultats confirment le rôle spécifique des canaux de Panx1 dans les réponses d'agrégation induite par le collagène de plaquettes humaines que nous et d' autres avons montré précédemment avec d' autres inhibiteurs pharmacologiques de Panx1 tels que probénécide, méfloquine, et les 10 peptides spécifiques Panx1 7, 8.
Figure 1: agrégométrie. (A) de l' image représentative de cuvettes en verre (contenant un aimant d' agitation) utilisé pour agrégométrie. La cuvette à gauche montre les plaquettes au repos alors que la cuvette à droite illustre les agrégats plaquettaires après l'activation induite par le collagène. (B) de l' image représentative d'un agrégomètre 8 puits pour des mesures turbidimétriques. Les puits utilisés (astérisque) pour incuber les suspensions de plaquettes présentes dans une cuvette de verre à 37 ° C, et celles utilisées pour les mesures (flèche blanche) sont indiqués en C. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2: Une forte concentration de bleu brillant FCF blocs Platelet Activation en réponse au collagène. (A) des traces représentatives de l' agrégation induite par le collagène de plaquettes lavées humaine obtenues à partir du même volontaire sain (V1) dans des conditions de contrôle (H 2 O; bleu foncé) , soit après 7 min pré - incubation avec l'inhibiteur de Panx1 bleu brillant FCF à 1 mM ( bleu clair) ou à 100 pM (couleur bleue intermédiaire). traces d'agrégation ont été enregistrées pendant 6 min. (B) des traces représentatives de l' agrégation induite par le collagène de plaquettes lavées humain obtenu à partir de 4 volontaires sains (V2-V5) après 7 min de préincubation avec l'inhibiteur de Panx1 bleu brillant FCF (1 mM). (C) Quantification des réponses d'agrégation maximale des plaquettes lavées humain dans des conditions témoins (barre blanche) ou après 7 min préincubation avec du bleu brillant FCF à 100 uM (barres grises) ou à 1 mM (barre noire). N = 5. P ****0; 0,0001; ANOVA suivi post-test de Bonferroni pour comparaisons multiples; Les résultats sont exprimés en moyenne ± SEM. (D) des traces représentatives de l' agrégation induite par AA de plaquettes lavées humaine obtenues à partir de 5 volontaires en bonne santé (V1-V5) après 7 min de préincubation avec l'inhibiteur de Panx1 bleu brillant FCF (1 mM). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Il y a un grand intérêt à trouver de nouveaux médicaments capables de moduler la fonction plaquettaire afin d'éviter une thrombose sans augmenter le risque de saignement. A cet effet, des tests in vitro de laboratoire qui peuvent surveiller de manière fiable et reproductible des réponses d'agrégation dans les plaquettes humaines sont absolument nécessaires. Turbidimétrique agrégométrie est une technique facile à réaliser. Cependant, certaines précautions doivent garder à l'esprit. Les mesures doivent être effectuées sous agitation continue en tant que processus d'agrégation est largement dépendante de l'agitation. Il est également important de maintenir les plaquettes à une température physiologique de 37 ° C afin d'éviter tout type d'activation prématurée. Préactivation des plaquettes peut également se produire lors de la collecte du sang et de la préparation de plaquettes lavées, ce qui conduit à une agrégation spontanée. Ainsi, des mesures prudentes doivent être prises au cours de la procédure complète de préparation de plaquettes.
Turbidimétrie est basée on la mesure de la densité optique de la suspension de plaquettes. Cela rend la technique ne convient pas pour la mesure de l'agrégation dans le sang total en raison de la présence de globules rouges. Ainsi, turbidimétrie peut être effectuée que sur PRP ou plaquettes lavées isolées à partir de PRP. Bien que facile à traiter et plutôt bon marché, turbidimétrie a été reconnu comme insensible à la présence de microagrégats 14, 15. Lorsque microagrégats devraient être d' une importance capitale, agrégométrie impédance, qui mesure la variation de la résistance électrique lorsque les plaquettes adhèrent à une électrode immergée dans un échantillon de sang total citraté, est mieux 16. Le processus d'agrégation plaquettaire est également largement dépendante de la numération plaquettaire dans la suspension de plaquettes 17; cytométrie en flux est utilisé chez les patients souffrant de thrombocytopénie 18, dont le nombre maximum de plaquettes quipeut être obtenue est insuffisante pour turbidimétrie. Cependant, l'avantage général de turbidimétrie est qu'il permet une analyse détaillée de la réactivité plaquettaire, tels que le changement de forme et de la ventilation, qui ne peut être évaluée dans des échantillons de sang.
Il est important de se rendre compte que la variation naturelle de l' agrégation plaquettaire humaine existe en raison des différences d'âge, le sexe et le style de vie ainsi que l' état de santé du sujet dont la fonction plaquettaire est contestée 19, 20, 21. Une telle variation naturelle peut être de l'ordre de 10-20% dans les résultats turbidimétriques, doivent donc être pris en charge, lors de l'exécution et l'interprétation de ces expériences, pour obtenir des plaquettes de nombre suffisant de volontaires sains non apparentés pour permettre des statistiques fiables. Cette limitation est toutefois contrebalancée par le fait que les mesures turbidimétriques sont hautement reproductibles, au moins lors de l'agrégationles procédures sont bien normalisés dans les laboratoires. Les efforts de normalisation ont été faites par la Société internationale de Thrombose et Hémostase 22. Pour cette raison, turbidimétrie est toujours le test le plus couramment rencontré pour la mesure de l'agrégation plaquettaire dans les deux laboratoires de sciences cliniques et de base et reste une technique de choix pour étudier l'effet des médicaments sur les réponses des plaquettes.
Dans la présente étude, nous avons démontré, à l'aide turbidimétrie pour mesurer les réponses dans les plaquettes humaines lavées, qu'un colorant alimentaire couramment utilisé bleu brillant FCF affecte l'agrégation plaquettaire. Élégantes études électrophysiologiques ont révélé un blocage spécifique des canaux Panx1 par ce colorant 9, 23. En effet, des concentrations élevées (1 mM) de ce colorant ont montré des effets inhibiteurs sur les deux changement de forme induit par le collagène et l'agrégation maximale mais 10 fois plus faibles concentrations (100 uM)du colorant n'a pas affecté la réponse de l'agrégation plaquettaire. Selon l'avis scientifique sur la réévaluation du bleu brillant FCF (E133) comme additif alimentaire, publié par l'Autorité européenne de sécurité alimentaire 24, la concentration maximale autorisée de bleu brillant FCF (poids moléculaire = 792,84 g / mol) est de 500 mg / kg de nourriture. H 2 O, cela correspondrait à 0,63 mm, ce qui est une concentration inférieure à 1,59 fois que l'une inhiber l' agrégation plaquettaire induite par le collagène dans nos expériences. En supposant que seule une petite fraction du colorant sera absorbé dans l'intestin après ingestion par voie orale, et que le colorant sera finalement dilué dans le volume de 5 litres de sang d'une personne adulte, l'apport quotidien de ce colorant alimentaire bleu a probablement à dépasser largement les niveaux normaux avant que les effets secondaires sur l'agrégation plaquettaire peuvent être anticipés. effets secondaires possibles de la plus forte concentration du colorant dans nos expériences sur la viabilité des plaquettes, par exemple, ont étéexclu par la présence de réponses d'agrégation solide à un autre agoniste (AA). Ces réponses AA non affectées ont également confirmé que les effets inhibiteurs de bleu brillant FCF semblent impliquer spécifiquement la voie de signalisation de collagène. Ceci est en ligne avec notre étude antérieure 7 détaillant l'endroit spécifique pour la libération d' ATP par la voie de Panx1 dans la réponse de l' agrégation plaquettaire induite par le collagène.
En adaptant le protocole d'isolement plaquettaire lavé à cette étude, nous décrivons une méthode simple et directe pour isoler les plaquettes du sang humain. Après plusieurs étapes de lavage effectuées essentiellement par centrifugation, les plaquettes sont remises en suspension dans un milieu qui respecte les conditions physiologiques précis, y compris le pH, la température de travail et de la concentration d'ions divalents, mais assure l'absence de protéines plasmatiques. Ceci est un avantage de cette technique par rapport à d'autres méthodes telles que la filtration sur gel, dans lequel l'élimination du plasma components ne se produit pas 25.
Toutes les étapes de la procédure de lavage sont d'une importance cruciale pour obtenir des résultats reproductibles lors de l'utilisation des plaquettes lavées. Une pléthore de médicaments peut influencer la réactivité plaquettaire, il est donc essentiel que les volontaires en bonne santé sont invités à ne pas prendre de médicaments pendant au moins 10 jours précédant la collecte de sang. De plus, la collecte de sang exige que l' attention est portée à éviter un écoulement traumatisme de la veine ou trop lente , car cela pourrait provoquer la génération de thrombine et l' activation plaquettaire subséquente 22. Dans le même sens, le potentiel d' activation des plaquettes au cours des étapes de centrifugation et de lavage peut être évité par l'utilisation répétée de PGI 2. En raison de sa très faible stabilité, PGI 2 devrait être ajoutée à chaque étape de lavage immédiatement avant chaque centrifugation. La remise en suspension des plaquettes dans le tampon TA (à un pH physiologique) contenant apyrase assure que les réponses des plaquettes restentintact. La présence d'apyrase dans la suspension de plaquettes est essentielle pour permettre la dégradation de l'ATP et de l'ADP afin de préserver les plaquettes à partir d'une désensibilisation de leurs récepteurs purinergiques. Comme la voie de signalisation Panx1 implique l' activation du récepteur de P2X1 dans les plaquettes humaines lors de l' activation des récepteurs de collagène, on a ajouté une concentration relativement élevée d'apyrase (0,32 U / mL) à la suspension de plaquettes afin d'éviter la désensibilisation de P2X1 7. Pour éviter densensitization d'autres récepteurs purinergiques dans les plaquettes, des concentrations plus faibles de apyrase seraient suffisantes 10.
Bien que la procédure des étapes en série de centrifugations et lavages sont laborieux et nécessite plus de temps, les plaquettes lavées obtenues en utilisant ce protocole offrent l'avantage d'une meilleure stabilité à 37 ° C (8/5 h) par rapport aux plaquettes utilisées directement à partir de PRP (1 -3 h). Cependant, le choix d'utiliser ou de plaquettes lavées PRP doivent être caudement et devrait inclure des considérations telles que la quantité de sang disponible pour l'expérience, l'agoniste à utiliser, ainsi que la question qui sera abordée. Par exemple, comme la fixation du fibrinogène aux intégrines α2β3 activées est le principal mécanisme de médiation de l'agrégation plaquettaire, l'absence de fibrinogène dans les plaquettes lavées pourraient influer sur la réaction; en particulier, lorsque des agonistes faibles (tels que l' ADP) sont utilisés 13. Ce problème est moins critique quand un agoniste puissant est utilisé, tel que la thrombine ou le collagène, qui sont eux-mêmes capables d'induire la libération de fibrinogène à partir de granules alpha. Pourtant, nous ajoutons régulièrement fibrinogène exogène à la suspension de plaquettes humaines lavées pour augmenter l'amplitude de la réponse d'agrégation induite par le collagène.
En conclusion, en utilisant les plaquettes lavées humaines et turbidimétrie, nous avons constaté que le colorant alimentaire bleu brillant FCF, par ses effets inhibiteurs sur Panx1, représenteun inhibiteur potentiel de la fonction plaquettaire.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par des subventions de la National Science Foundation (Suisse 310030_162579 / 1 à Brenda Renata Kwak et 320030_144150 à Pierre Fontana), ainsi que par une subvention de la Fondation suisse de cardiologie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| citric acid monohydrate (C6H8O7*H2O) | Roth | 5949-29-1 | danger of eye damage/irritation |
| trisodium citrate dihydrate (Na3C6H5O7*2H2O) | Sigma-Aldrich | S1804 | - |
| D(+)-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | - |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | - |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | - |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S6014 | - |
| Sodium dihydrogenophosphate monohydrate (NaH2PO4*H2O) | Sigma-Aldrich | S9638 | - |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2*6H2O) | Sigma-Aldrich | M9272 | - |
| Calcium chloride hexahydrate (CaCl2*6H2O) | Sigma-Aldrich | 442909 | danger of eye damage/irritation |
| N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (Hepes) | ThermoFisher Scientific | 15630 | - |
| human serum albumin | CSL Behring | 00257/374 | - |
| hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 320331 | Corrosive and irritative for the respiratory system. Can cause severe skin and eye damages. |
| Eppendorf 5810 R | Fisher Scientific | - | - |
| heparin | Drosspharm AG/SA | 20810 | |
| prostacyclin I2 (PGI2) | Cayman | 18220 | - |
| apyrase from potatoes | Sigma-Aldrich | A6535 | - |
| fibrinogen (Haemocomplettan) | CSL Behring | HS 73466011 | - |
| thrombo-aggragometer SD-Medical | SD-Innovation | TA8V | - |
| Brilliant blue FCF (Erioglaucine disodium salt) | Sigma-Aldrich | 80717 | Harmful to aquatic life with long lasting effects (Avoid release to the environnement) |
| collagen | Horm, Nycomed | - | |
| arachidonic acid | Bio/Data corporation | C/N 101297 | - |
| cell counter Sysmex KX-21N | Sysmex Digitana | - | - |
| HEPES | Gibco | 15630-056 | - |
| glass cuvettes | SD-Innovation | THCV1000 | - |
| magnetic stirrers | SD-Innovation | THA100 | - |
References
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