Summary
Descreve-se um método simples para o isolamento de plaquetas lavadas a partir de sangue humano seguido por meio de medições de agregação plaquetária induzida por agonistas por turbidimetria. Como exemplo, aplicam-se este método para estudar a resposta de agregação de plaquetas humanas a colagénio depois de uma pré-incubação com o inibidor do canal Pannexin1 Brilliant Blue FCF.
Abstract
Turbidimetria é uma técnica de laboratório que é aplicado para medir a agregação de plaquetas em suspensão em qualquer de plasma (plasma rico em plaquetas, PRP) ou em tampão de plaquetas lavadas (), pelo uso de um ou uma combinação de agonistas. A utilização de plaquetas lavadas separadas do seu ambiente de plasma e na ausência de anticoagulantes permite o estudo das propriedades intrínsecas de plaquetas. Entre o grande painel de agonistas, o ácido araquidónico (AA), a adenosina-di fosfato de (ADP), colagénio e trombina são os mais frequentemente utilizados. A resposta de agregação é quantificada através da medição da densidade óptica relativa (DO) ao longo do tempo de suspensão de plaquetas, sob agitação contínua. As plaquetas em suspensão homogénea limitar a passagem de luz após a adição de um agonista, alteração da forma das plaquetas ocorre a produção de um pequeno aumento transitório da OD. Seguindo este passo de activação inicial, a formação de coágulos de plaquetas formar gradualmente, o que permite a passagem de luz através da suspensão como um result de diminuição da OD. O processo de agregação é em última análise, expresso como uma percentagem, em comparação com o diâmetro externo de plasma pobre em plaquetas ou tampão. calibração rigorosa é, portanto, essencial no início de cada experimento. Como uma regra geral: calibração de 0% é definido através da medição da DO de uma suspensão de plaquetas não estimuladas ao medir o OD do meio de suspensão que não contém plaquetas representa um valor de 100%. A agregação plaquetária é geralmente visualizado como uma curva de agregação em tempo real. Turbidimetria é uma das técnicas de laboratório mais comumente utilizados para a investigação da função plaquetária e é considerado como padrão-ouro histórico e utilizado para o desenvolvimento de novos agentes farmacêuticos que visam inibir a agregação plaquetária. Aqui, nós descrevemos protocolos detalhados para 1) preparação de plaquetas humanas lavadas e 2) análise turbidimétrico de agregação induzida por colagénio de plaquetas humanas lavadas pré-tratados com o corante alimentar azul brilhante FCF que foi recentemente idencado como um inibidor dos canais de Pannexin1 (Panx1).
Introduction
As plaquetas são componentes cruciais do sangue e a sua principal função-juntamente com factores de coagulação-se para parar o sangramento após a lesão do vaso sanguíneo. As plaquetas são fragmentos pequenos (2-3 mm) anuclear derivados de megacariócitos de medula óssea 1. As plaquetas circulam no estado n activado, durante a qual eles aparecem como estruturas em forma de lente. Após a interrupção do endotélio, as plaquetas se reúnem para o local da lesão vaso sanguíneo para tapar o buraco, um processo chamado hemostasia primária. Inicialmente, as plaquetas para anexar moléculas de sub-endotelial, tais como o colagénio e o factor de von Willebrand, que são expostos como um resultado do passo de lesão-adesão 2. Em seguida, eles mudam de forma e secretar passo mensageiros-activação química. Finalmente, eles se conectam uns com os outros colmatando passo receptores de agregação. hemostase primária é seguida por um processo secundário envolvendo activação da cascata de coagulação com a deposição de fibrina, que estabilizams o trombo inicial 2.
Eventos isquémicos agudos, tais como enfarte do miocárdio 3 muitas vezes resultar de trombos que formam por causa de ruptura física (ruptura) de uma placa aterosclerótica. medicamentos anti-plaquetários atuais são a pedra angular do tratamento desta doença generalizada, mas seu benefício clínico é limitado por um aumento do risco de sangramento. As drogas mais prescritas em pacientes com doenças cardiovasculares, compostos da aspirina e anti-P2Y12, o alvo do tromboxano A2 e os percursos ADP 4, respectivamente, que são as principais vias que conduzem à activação de plaquetas. No entanto, pesquisas inovadoras para novos alvos que otimamente equilibrar efeitos antitrombóticos e risco hemorrágico ainda é necessária.
A partir da década de 1960 5 até hoje, agregometria turbidimétrico tem desempenhado um papel crucial na pesquisa, aumentando o nosso conhecimento da reatividade plaquetária e iN, a monitorização da actividade dos reagentes anti-trombóticos em seres humanos. Turbidimetria foi inicialmente aplicada ao PRP extraída a partir de amostras de sangue. Com efeito, a colheita de sangue realizada em tubos contendo citrato permite a produção rápida e grande de PRP sem ter qualquer efeito sobre a integridade e a função das plaquetas. No entanto, a estabilidade a curto prazo (cerca de 3 h) de PRP e os restantes enzimas plasmáticas, tais como a trombina, e a baixa concentração de cálcio associado com perfis de agregação potencialmente artefatuais são de grande inconveniente para a utilização de PRP. Um importante passo em frente tem sido o desenvolvimento de um método para o isolamento de plaquetas com centrifugação e passos de lavagem 6 adicional. Em suma, o PRP foi isolado a partir de sangue total recolhido de ácido-citrato-dextrose (ACD) e as plaquetas são isolados depois de passos de centrifugação de série antes de serem ressuspensas num tampão iso-osmótico fosfato (tampão de Tyrode) contendo glucose, albumina do soro humano e divalente cções (Ca 2+ e Mg 2+). Para evitar alterações na reactividade das plaquetas, o pH do tampão de Tyrode é cuidadosamente mantida a 7,35-7,4. Além disso, a activação indesejada de plaquetas é impedida pela adição de prostaciclina (PGI 2) antes de alguns passos de centrifugação. Finalmente, a adição de apirase evita que as plaquetas lavadas de se tornar resistente contra a acção de ATP / ADP. A suspensão de plaquetas resultante não tem factores coagulantes e a estabilidade de plaquetas é aumentada de pelo menos duas vezes, em comparação com soluções de PRP. Além disso, o facto de que as plaquetas são inactivos mas garante intactas a reprodutibilidade das medições turbidimétricas e fornece a capacidade para estudar a acção de agonistas ou antagonistas de agregação de plaquetas de uma forma optimizada.
Usando este método, temos demonstrado num estudo recente de que a inibição da formação de canais Panx1 por uma abordagem genética (knock-out ratinhos) ou diminuir a actividade de canal Panx1 por farmacológicaaproxima-se reduzida a agregação de plaquetas induzida por colagénio 7. Panx1 forma canais de ATP de libertação, que são ubiquamente expressos em muitos tipos de células incluindo plaquetas humanas 7, 8. De facto, foi demonstrado por turbidimetria em plaquetas humanas lavadas que um 7 min de pré-incubação com um painel de mais-ou-menos específicos bloqueadores químicos (probenecida, mefloquina e 10 péptidos Panx1) antes da adição de vários agonistas, inibiu especificamente induzida por colagénio agregação plaquetária enquanto as respostas de plaquetas para AA e ADP não foram afetados. Nós demonstramos que o ATP libertação por meio de canais Panx1 interfere especificamente na via de sinalização de GPVI que conduz à agregação induzida por colagénio. Curiosamente, vários compostos aprovados pela FDA, com aplicações em outras doenças (probenecida, mefloquina) afectar a actividade de canais Panx1 em plaquetas. Por um lado, isso abre novas perspectivas terapêuticas para selecionarvamente modificar a reactividade de plaquetas. Por outro lado, deve-se considerar os potenciais efeitos secundários destes compostos. Neste contexto, o corante de alimentos seguros Brilliant Blue FCF usado em vários doces e bebidas energéticas tem sido descrito como um inibidor selectivo da Panx1 9. Descrevemos aqui um protocolo para o isolamento de plaquetas humanas lavadas e medições turbidimétricas de agregação de plaquetas adaptado para investigar o efeito do corante azul brilhante FCF como um antagonista da agregação plaquetária.
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Protocol
Cinco voluntários saudáveis não relacionados foram recrutados para a amostragem de sangue para testes de isolamento e de agregação de plaquetas. consentimento informado por escrito foi obtido e o protocolo foi aprovado pelo Comitê de Ética da Central dos Hospitais da Universidade de Genebra. Todos os voluntários certificados para ser saudável e não ter tomado quaisquer drogas interferir plaquetas durante pelo menos os 10 dias que antecederam os experimentos.
1. Preparação de buffer para coleta de sangue humano e lavou Isolamento de plaquetas
- Prepara-se uma solução aquosa de 100 mL de ácido-citrato-dextrose (ACD) por dissolução de 1,4 g de mono-hidrato de ácido cítrico (C 6 H 8 O 7 • H2O, 66,6 mM), 2,5 g de citrato trissódico di-hidratado (Na 3 C 6 H 5 O 7 • 2 H2O, 85 mM) e 2 g de D anidro (+) - glucose. O pH da solução é cerca de 4,5.
- Preparar soluções estoque de tampão de Tyrode como segue
- Preparar a soluo de estoque 1 por dissolução de 80 g de NaCl, 2 g de KCl, 10 g de NaHCO3 e 0,58 g de NaH 2 PO 4 * H2O em 500 mL de H2O destilada As respectivas concentrações finais são 2,73 M, 53,6 mM, 238 mM e 8,4 mM. Manter a solução a 4 ° C.
- Preparar a solução stock 2 por dissolução de 10,15 g de MgCl2 * 6 H2O (100 mM) em 500 mL de H2O destilada Mantenha a solução a 4 ° C.
- Preparar solução mãe 3 por dissolução de 10,95 g (100 mM), CaCl2 * 6 H2O em 500 mL de H2O destilada Mantenha a solução a 4 ° C.
- Preparar tampão de Tyrode por diluição de 2,5 ml de solução de estoque 1 em um volume final de 50 ml com água destilada H 2 O. Isto corresponde a concentrações finais de NaCl 136,5 mM, KCl 2,68 mM, 11,9 mM de NaHCO3 e 0,42 mM NaH 2 PO 4 * H2O Ajustar o pH a 7,35 e esterilizar por filtração com 0,22? m-filters.
- Preparar albumina de tampão de 0,35% de Tyrode (tampão TA 7) por diluição de 5 ml de solução stock de 1, 1 mL de solução stock de 2, 2 mL de solução de reserva 3, 0,5 ml de HEPES 1M, 1,8 ml de 200 g / L de albumina de soro humano e 0,1 g de D anidro (+) - glucose num volume final de 100 mL de H2O destilada
- Ajustar o pH a 7,35 com HC1 IN e ajustar a osmolaridade a 295 mOsm / l através da adição de H2O destilada (10% do volume total). As concentrações finais nesta solução são: NaCl 124 mM, KCl 2,44 mM, 10,82 mM de NaHCO3, 0,38 mM NaH 2 PO 4 * H2O, MgCl 0,91 mM de 2 * 6 H2O, CaCl 1,82 2 * 6 H2O . Manter tampão TA a 37 ° C durante todo o experimento.
Coleção 2. Sangue
- Recolha de 45-50 ml de sangue venoso, a partir da veia antecubital usando uma agulha G 19, e pouca ou nenhuma torniquete, em tubos de 50 ml de ConAtaining ACD anticoagulante (1 volume de ACD para 6 volumes de sangue). Rejeitar os primeiros 1-2 ml de sangue para evitar a presença de trombina e factor tecidular.
- Após a recolha, misturar o sangue com o ACD por invertendo suavemente o tubo. Incubar a amostra durante 10 min a 37 ° C.
3. Preparação de plaquetas humanas lavadas
- Pré-aqueça o centrifugador a 37 ° C. Todos os passos de centrifugação abaixo são realizadas a esta temperatura.
- Despachar o sangue recolhido em tubos de 15 mL (5 mL por tubo) e centrifugar a 250 xg durante 13 min para se obter o PRP.
NOTA: Este passo de centrifugação resulta na produção de três camadas da amostra: 1) A camada superior, composta de plasma, plaquetas, e uma pequena fracção de glóbulos brancos. 2) A camada intermédia, uma porção rica em glóbulos brancos. 3) A camada inferior, que é essencialmente composto por células vermelhas do sangue. - Recolhe-se o PRP por pipetagem a la superioryer cuidadosamente para um novo tubo de 15 mL para evitar ao máximo a contaminação por glóbulos vermelhos e brancos do sangue, e incubar durante 10 min a 37 ° C.
- Centrifugar o PRP a 2200 x g durante 12 min (para 5 ml de PRP).
NOTA: Esta etapa de centrifugação deve ser realizada com baixa freio ou sem freio. - Remover o sobrenadante (plasma pobre em plaquetas), e ressuspender cuidadosamente o sedimento com 10 ml de tampão TA contendo 2 ul / ml de heparina (5000 U / mL) e 2,5 mL / mL de 25? M PGI 2, utilizando uma pipeta de Pasteur de plástico. Incubar durante 10 min a 37 ° C.
- Adicionar 2,5 uL / mL de 25? M PGI2 e centrifuga-se durante 8 minutos a 1900 xg (com baixo freio ou sem travão).
- Remover o sobrenadante e ressuspender o pellet com 5 mL de tampão TA contendo 2,5 uL / mL de 25? M PGI2 usando uma pipeta de Pasteur de plástico. Incubar durante 10 min a 37 ° C.
- Durante o período de incubação, pipeta 150 uL da suspensão de plaquetas empara um tubo de 1,5 ml e contagem de plaquetas, usando um contador de células automatizado (que detecta o tamanho das células do sangue medindo as mudanças na resistência de corrente contínua).
- Após a incubação de 10 min, adicionar 2,5 mL / mL de 25? M PGI2 para a suspensão de plaquetas e centrifugar imediatamente a 1900 x g durante 8 min.
- Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento para uma concentração de 250.000 plaquetas / microlitro com um volume adequado de tampão TA (isto é, se a contagem de células é de 500.000 por ml, ressuspender em 10 ml de tampão TA) contendo 32 pL / mL de apirase em 0,01 L / ml (concentração final de 0,32 U / ml).
NOTA: alta concentração de apirase é utilizado para evitar a dessensibilização de receptores P2X1 induzidas pela secreção espontânea de ATP 10, 11 na ausência de agonistas. Isto é importante porque as respostas induzidas por colagénio são induzidas por parácrina rápido / activação autócrina de P2X1 por ATP libertado from plaquetas activadas. Se a via de sinalização de plaquetas não requer criticamente preservação da função P2X1, usar 0,02 U / mL de apirase. Vários estudos (revisto em Mahaut-Smith et al. 10) demonstraram que a 0,02 U / mL de apirase evita ADP dessensibilização do receptor de P2Y1 com respostas P2X1 negligenciáveis. - Incubar a suspensão de células durante pelo menos 30 min a 37 ° C antes da realização das medições aggregometric. A preparação é estável durante 5 a 8 horas.
4. agregometria
- Preparar fibrinogénio (56 mg / mL) em tampão de Tyrode.
- Pipetar 260 L de suspensão de plaquetas em cuvetes de vidro (Figura 1A; cuvete esquerdo) contendo 10 ul de fibrinogénio (56 mg / mL) e uma haste de agitação magnética, depois incubar a suspensão durante 2-3 min a 37 ° C em poços de incubação presentes no agregómetro (Figura 1B e 1C).
- Pré-incubar com o Panx1inibidor Brilliant Blue FCF pela adição de 10 uL de uma solução 2,8 mM ou estoque 28 mM (concentração final de 100 uM e 1 mM, respectivamente) durante 7 minutos a 37 ° C.
- Calibrar o agregómetro para um valor assumptive agregação de 100%, medindo a OD de uma cuvete contendo 10 ul de fibrinogénio (56 mg / mL), 10 uL Brilliant Blue FCF (2,8 mM ou 28 mM) e tampão TA sem plaquetas.
- Coloque a cuvete num agregado bem sob agitação automática e pressionar o botão correspondente no teclado do computador ligado ao agregómetro (isto é, prima F1 se bem a agregação 1 é utilizado).
NOTA: Este experimento descrito abaixo inclui Brilliant Blue FCF. O composto usado para calibragem tem de ser ajustado para a condição experimental.
- Coloque a cuvete num agregado bem sob agitação automática e pressionar o botão correspondente no teclado do computador ligado ao agregómetro (isto é, prima F1 se bem a agregação 1 é utilizado).
- Calibrar o agregómetro para um valor assumptive agregação 0% utilizando a mesma amostra de plaquetas que será utilizado para a experiência sob mexendo automáticag.
- Coloque a cuvete na agregação bem e pressione o botão correspondente no teclado do computador ligado à agregómetro. Aguarde cerca de 20-30 s antes de prosseguir. Este atraso serve para assegurar que nenhuma agregação acontece antes da adição dos agonistas.
NOTA: Como qualquer diferença no número de plaquetas pode ter um efeito sobre a DO medida, o passo de calibração 0% precisa de ser repetido para cada medição individual.
- Coloque a cuvete na agregação bem e pressione o botão correspondente no teclado do computador ligado à agregómetro. Aguarde cerca de 20-30 s antes de prosseguir. Este atraso serve para assegurar que nenhuma agregação acontece antes da adição dos agonistas.
- Adiciona-se 20 uL de agonista desejado, tal como 15 ug de colagénio / ml (1? G / ml final) ou 1,125 mM de ácido araquidónico (75 uM final), na cuvete. começar imediatamente a gravação, sob agitação automático contínuo pressionando o botão correspondente no teclado do computador ligado ao agregómetro.
NOTA: A adição do agonista induz a activação de plaquetas. Agregados de plaquetas pode ser claramente distinguida na cuvete de vidro no final da expericia (Figura 1A; right cuvete). - A gravação é interrompida automaticamente após 6 min. Neste ponto, salvar os dados clicando no ícone salvar do computador.
NOTA: O cálculo da taxa de agregação é executada pelo computador, que expressa os resultados finais do processo de agregação como uma porcentagem. - Analisar os dados.
- Para informação adicional sobre extensa protocolos para a preparação das suspensões de plaquetas lavadas e medição turbidimétrica de agregação de plaquetas, referem-se outros papéis de autoria de peritos no campo 12, 13.
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Representative Results
O software aggregometer produz automaticamente as curvas de agregação e dá os valores de agregação máxima em percentagem. Os valores podem ser copiados para um software de análise de dados, a fim de realizar a análise estatística e visualizar os valores de agregação máxima na forma de gráficos de barras. Opcionalmente, cada ponto individual da curva de agregação pode ser exportado sucessivamente para um software de folha de cálculo e, em seguida, para o software de estatística (por exemplo, GraphPad), a fim de visualizar as curvas. Alguns pesquisadores usam a inclinação máxima da curva de agregação para calcular a velocidade ea área sob a curva para avaliar a atividade plaquetária. O intervalo de tempo e mudança de forma, também pode ser visualizado graficamente.
Um exemplo típico de uma curva de agregação de plaquetas humanas lavadas em condições de controlo (H2O) é mostrado na Figura 2A. A adição da umagonist (colagénio), induzida (após um breve período de tempo) uma depressão da curva de agregação causada pela alteração da forma das plaquetas. Então, a percentagem de agregação aumentada gradualmente ao longo do tempo, até um valor máximo foi atingido a cerca de 3-4 minutos. Uma ligeira diminuição da percentagem de agregação foi observada para o fim da gravação 6 min, o que reflecte uma desagregação. Tal como ilustrado na Figura 2A-B, pré-incubação de plaquetas humanas lavadas com o inibidor do canal Panx1 azul brilhante FCF, a uma concentração de 1 mM, mais lento ou totalmente abolida a alteração da forma das plaquetas inicial e bloqueado a agregação induzida pelo colagénio de plaquetas lavadas obtidas a partir de cinco diferentes voluntários saudáveis não relacionados. Quando as plaquetas, onde, previamente incubadas com uma concentração mais baixa (100? M) de azul brilhante FCF, o efeito inibitório do corante sobre as respostas induzidas por colagénio e alteração de forma não foram observadas mais (ver Figura 2A para um exemplo). Quantificação das respostas de agregação de plaquetas induzida por colagénio 1 ug / ml revelou que 1 mM de azul brilhante FCF reduziu significativamente as respostas de agregação máxima quando comparada com as condições de controlo, bem como a uma concentração mais baixa (100? M) de inibidor Panx1 (Figura 2C). A inibição da agregação de plaquetas era específica para as respostas induzidas por colagénio e não devido a efeitos secundários indesejados de azul brilhante FCF (sobre a viabilidade celular, por exemplo) como a mesma concentração de corante (1 mM) não afectou a resposta de agregação induzida pela um outro agonista, isto é, 75 uM AA, tal como ilustrado na Figura 2D. Estes resultados confirmam o papel específico de canais Panx1 em respostas de agregação induzida por colagénio de plaquetas humanas que nós e outros já previamente mostradas com outros inibidores farmacológicos de Panx1 tais como probenecida, mefloquina, e os 10 péptidos específicos Panx1 7, 8.
Figura 1: O teste de agregação. (A) Imagem representativa de cuvetes de vidro (contendo um íman agitação) utilizado para agregometria. A cuvete da esquerda mostra as plaquetas em repouso, enquanto a tina à direita ilustra agregados de plaquetas depois da activação induzida por colagénio. (B) Imagem representativa de um agregómetro de 8 poços para medições de turbidimetria. Os poços utilizado (asterisco) a incubar suspensões de plaquetas presentes numa cuvete de vidro a 37 ° C, e as utilizadas para as medições (seta branca) são indicadas em C. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: uma alta concentração de Brilliant Blue FCF Blocos ativação de plaquetas em resposta ao colágeno. (A) traços representativos de agregação induzida por colagénio de plaquetas humanas lavadas obtidas a partir do mesmo voluntário saudável (V1) sob condições de controlo (H2O; azul escuro) ou após 7 minutos de pré-incubação com o inibidor Panx1 Brilliant Blue FCF a 1 mM ( luz azul) ou a 100? M (cor azul intermediário). vestígios de agregação foram registadas durante 6 minutos. (B) traços representativos de agregação induzida por colagénio de plaquetas humanas lavadas obtidos a partir de 4 voluntários saudáveis (V2-V5) após 7 minutos de pré-incubação com o inibidor Panx1 brilhante FCF azul (1 mM). (C) A quantificação de respostas de agregação máxima de plaquetas humanas lavadas em condições de controlo (barra branca) ou depois de 7 min de pré-incubação com azul brilhante FCF em 100 uM (barras cinza) ou a 1 mM (barra preta). N = 5. P ****0; 0,0001; ANOVA seguido por pós-teste de Bonferroni para comparações múltiplas; Os resultados são expressos como média ± SEM. (D) traços representativos de agregação induzida por AA de plaquetas humanas lavadas obtidas a partir de 5 voluntários saudáveis (V1-V5) após 7 minutos de pré-incubação com o inibidor Panx1 brilhante FCF azul (1 mM). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Há um grande interesse em encontrar novos medicamentos capazes de modular a função das plaquetas, a fim de prevenir a trombose sem aumentar o risco de hemorragia. Para este efeito, em testes in vitro de laboratório, que pode de forma fiável e reprodutível monitorizar respostas de agregação em plaquetas humanas são absolutamente necessárias. agregometria Turbidimétrico é uma técnica fácil de executar. No entanto, algumas precauções devem ser mantidos em mente. As medições têm de ser executadas sob agitação contínua, como o processo de agregação é em grande parte dependente da agitação. É também importante para manter as plaquetas a uma temperatura fisiológica de 37 ° C, a fim de evitar qualquer tipo de activação prematura. Pré-activação de plaquetas também pode ocorrer durante a recolha de sangue e plaquetas lavadas preparação, levando à agregação espontânea. Assim, devem ser tomadas medidas cuidadosas durante o procedimento completo de preparação de plaquetas.
Turbidimetria é baseado on a medição do OD da suspensão de plaquetas. Isso faz com que a técnica não adaptado para a medição de agregação em sangue total devido à presença de glóbulos vermelhos. Assim, turbidimetria pode ser realizada apenas em PRP ou plaquetas lavadas isoladas a partir de PRP. Embora fácil de lidar e bastante barato, turbidimetria foi reconhecido como insensível à presença de microagregados 14, 15. Quando se espera que microagregados ser de importância crítica, agregometria de impedância, que mede a variação na resistência eléctrica quando as plaquetas aderem a um eléctrodo imerso numa amostra de sangue total citrado, é mais adequado 16. O processo de agregação de plaquetas também é largamente dependente da contagem de plaquetas na suspensão de plaquetas 17; citometria de fluxo é utilizada em pacientes que sofrem de trombocitopenia 18, dos quais o número máximo de plaquetas quepode ser obtido é insuficiente para turbidimetria. No entanto, a vantagem geral de turbidimetria é que ele permite uma análise detalhada de reactividade de plaquetas, tais como alteração de forma e de desagregação, que não pode ser avaliada em amostras de sangue total.
É importante perceber que a variação natural na agregação plaquetária humana existe devido às diferenças de idade, sexo e estilo de vida, bem como o estado de saúde do sujeito cuja plaquetas função é desafiado 19, 20, 21. Tal variação natural pode ser da ordem de 10-20% nos resultados turbidimricos, portanto, deve ser tomado cuidado, quando se realiza e interpretar estes experimentos, na obtenção de plaquetas a partir de um número suficiente de voluntários saudáveis não relacionados para permitir que as estatísticas fiáveis. Esta limitação é no entanto contrabalançadas pelo facto de que as medições da turvação são altamente reprodutíveis, pelo menos quando a agregaçãoos procedimentos são bem padronizadas em laboratórios. Os esforços de normalização têm sido feitas pela Sociedade Internacional de Trombose e Hemostasia 22. Por esta razão, turbidimetria ainda é o teste mais comumente encontrado para a medição da agregação plaquetária em ambos os laboratórios clínicos e de ciência básica e continua a ser uma técnica de escolha para estudar o efeito de drogas nas respostas de plaquetas.
No presente estudo demonstrámos, utilizando turbidimetria para medir as respostas de plaquetas humanas lavadas, que um corante alimentar comumente utilizado azul brilhante FCF afecta a agregação de plaquetas. Estudos eletrofisiológicos elegantes têm revelado um bloqueio específico de canais Panx1 por este corante 9, 23. Na verdade, concentrações elevadas (1 mM) de deste corante mostrou efeitos inibidores sobre ambos alteração de forma induzida por colagénio e agregação máxima, mas 10 vezes menores concentrações (100 pM)do corante não afetou a resposta de agregação plaquetária. De acordo com as conclusões científicas sobre o re-avaliação de azul brilhante FCF (E133) como um aditivo alimentar, publicado pela Autoridade Europeia para a 24, a concentração admissível máxima de azul brilhante FCF (peso molecular = 792,84 g / mol) é de 500 mg / kg de alimento. Para H2O, isto corresponderia a 0,63 mM, o que é uma concentração de 1,59-vezes inferior do que a uma inibição da agregação de plaquetas induzida por colagénio nas nossas experiências. Partindo do princípio de que apenas uma pequena fracção do corante será absorvido nos intestinos após a ingestão oral, e que o corante será finalmente diluída no volume 5-L de sangue de uma pessoa adulta, o consumo diário de este corante alimentar azul tem provavelmente para ultrapassar largamente os níveis normais antes de quaisquer efeitos secundários sobre a agregação de plaquetas pode ser previsto. Os possíveis efeitos secundários da concentração mais elevada do corante nas nossas experiências sobre a viabilidade de plaquetas, por exemplo, eramexcluídos pela presença de respostas de agregação sólidas para outro agonista (AA). Estas respostas AA não afectados também confirmado que os efeitos inibitórios de azul brilhante FCF parecem envolver especificamente a via de sinalização de colagénio. Isto está em linha com o nosso estudo anterior 7 detalhando o local específico para libertação de ATP através de canais Panx1 na resposta de agregação de plaquetas induzida por colagénio.
Ao adaptar o protocolo de isolamento de plaquetas lavadas para este estudo, nós descrevemos um método simples e fácil para isolar plaquetas de sangue humano. Após vários passos de lavagem realizado essencialmente por centrifugação, as plaquetas são ressuspendidos em um meio que respeita a condições precisas fisiológicos, incluindo o pH, a temperatura de trabalho e concentração de iões di valentes, mas assegura a ausência de proteínas do plasma. Esta é uma vantagem desta técnica em relação aos métodos alternativos, tais como filtração em gel em que a eliminação de plasma de componennão ents não ocorre 25.
Todos os passos do processo de lavagem é de importância crucial para se obter resultados reprodutíveis quando se utiliza plaquetas lavadas. Uma infinidade de drogas pode influenciar a reatividade plaquetária, assim, é essencial que os voluntários saudáveis são convidados a não tomar qualquer medicação durante pelo menos 10 dias que antecedem a coleta de sangue. Além disso, a recolha de sangue necessita que é prestada atenção para evitar traumas veia ou fluxo muito lenta como esta pode causar a geração de trombina e subsequente activação de plaquetas 22. Ao longo das mesmas linhas, activação de plaquetas potencial durante os passos de centrifugao e de lavagem podem ser evitados pelo uso repetido de PGI2. Devido à sua baixa estabilidade, PGI 2 deve ser adicionado a cada passo de lavagem imediatamente antes de cada centrifugação. A re-suspensão de plaquetas em tampão TA (a um pH fisiológico) contendo apirase assegura que as respostas de plaquetas permanecemintacta. A presença de apirase na suspensão de plaquetas é essencial para permitir a degradação de ATP e ADP, a fim de preservar as plaquetas de uma dessensibilização dos seus receptores purinérgicos. Como a via de sinalização Panx1 envolve a activação do receptor P2X1 em plaquetas humanas no momento da activação do receptor de colagénio, foram adicionados uma concentração relativamente elevada de apirase (0,32 U / mL) à suspensão de plaquetas a fim de evitar a dessensibilização P2X1 7. Para evitar densensitization de outros receptores purinérgicos em plaquetas, as concentrações mais baixas de apirase seria suficiente 10.
Embora o procedimento de centrifugações e lavagens de série passos são de trabalho intenso e exigem mais tempo, as plaquetas lavadas obtido usando este protocolo oferecem a vantagem de uma maior estabilidade a 37 ° C (5-8 h), em comparação com plaquetas usados directamente a partir de PRP (1 -3 h). No entanto, a escolha do uso de PRP ou plaquetas lavadas deve ser feita cautiously e deve incluem considerações, tais como a quantidade de sangue disponível para a experiência, o agonista a ser usado, bem como a questão que serão abordados. Por exemplo, como a ligação de fibrinogénio ao activados α2β3 integrinas é o principal mecanismo de mediadora da agregação das plaquetas, a ausência de fibrinogénio em plaquetas lavadas podem influenciar a reacção; em particular, quando agonistas fracas (tal como ADP) são usados 13. Este problema é menos crítico quando um agonista poderoso é usado, tal como a trombina ou o colagénio, que são por si só capaz de induzir a libertação de fibrinogénio a partir de grânulos alfa. Ainda assim, habitualmente adicionar fibrinogénio exógeno para a suspensão de plaquetas humanas lavadas, a fim de aumentar a amplitude da resposta de agregação induzida por colagénio.
Em conclusão, utilizando plaquetas humanas lavadas e turbidimetria, verificou-se que o corante alimentar azul brilhante FCF, através dos seus efeitos inibitórios sobre Panx1, representaum inibidor potencial da função das plaquetas.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por subsídios da Swiss National Science Foundation (310030_162579 / 1 a Brenda Renata Kwak e 320030_144150 para Pierre Fontana), bem como por uma bolsa da Fundação suíça Coração.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| citric acid monohydrate (C6H8O7*H2O) | Roth | 5949-29-1 | danger of eye damage/irritation |
| trisodium citrate dihydrate (Na3C6H5O7*2H2O) | Sigma-Aldrich | S1804 | - |
| D(+)-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | - |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | - |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | - |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S6014 | - |
| Sodium dihydrogenophosphate monohydrate (NaH2PO4*H2O) | Sigma-Aldrich | S9638 | - |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2*6H2O) | Sigma-Aldrich | M9272 | - |
| Calcium chloride hexahydrate (CaCl2*6H2O) | Sigma-Aldrich | 442909 | danger of eye damage/irritation |
| N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (Hepes) | ThermoFisher Scientific | 15630 | - |
| human serum albumin | CSL Behring | 00257/374 | - |
| hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 320331 | Corrosive and irritative for the respiratory system. Can cause severe skin and eye damages. |
| Eppendorf 5810 R | Fisher Scientific | - | - |
| heparin | Drosspharm AG/SA | 20810 | |
| prostacyclin I2 (PGI2) | Cayman | 18220 | - |
| apyrase from potatoes | Sigma-Aldrich | A6535 | - |
| fibrinogen (Haemocomplettan) | CSL Behring | HS 73466011 | - |
| thrombo-aggragometer SD-Medical | SD-Innovation | TA8V | - |
| Brilliant blue FCF (Erioglaucine disodium salt) | Sigma-Aldrich | 80717 | Harmful to aquatic life with long lasting effects (Avoid release to the environnement) |
| collagen | Horm, Nycomed | - | |
| arachidonic acid | Bio/Data corporation | C/N 101297 | - |
| cell counter Sysmex KX-21N | Sysmex Digitana | - | - |
| HEPES | Gibco | 15630-056 | - |
| glass cuvettes | SD-Innovation | THCV1000 | - |
| magnetic stirrers | SD-Innovation | THA100 | - |
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