Summary
Vi beskriver en enkel fremgangsmåde til isolering af vaskede blodplader fra humant blod efterfulgt af agonist-induceret blodpladeaggregering målinger ved turbidimetri. Som eksempel anvender vi denne metode til undersøgelse af aggregeringsrespons af humane blodplader til collagen efter en præ-inkubation med Pannexin1 kanal inhibitoren Brilliant Blue FCF.
Abstract
Turbidimetri er et laboratorium teknik, der anvendes til at måle aggregation af blodplader suspenderet i enten plasma (blodpladerigt plasma, PRP) eller i puffer (vaskede blodplader), ved anvendelse af en eller en kombination af agonister. Anvendelsen af vaskede blodplader adskilt fra deres plasma miljø og i fravær af antikoagulanter muliggør studere iboende blodplade egenskaber. Blandt de stort panel af agonister, arachidonsyre (AA), adenosin-diphosphat (ADP), thrombin og kollagen er den hyppigst anvendte. Den aggregeringsrespons kvantificeres ved måling af den relative optiske densitet (OD) over tid af blodpladesuspension under kontinuerlig omrøring. Blodplader i homogen suspension begrænse passagen af lys efter tilsætning af en agonist, forekommer blodplade formændring fremstilling af en lille forbigående stigning i OD. Efter denne indledende aktiveringstrin, blodplade blodpropper danner gradvist, tillader passage af lys gennem suspensionen som en result af nedsat OD. Aggregeringsprocessen til sidst udtrykkes som en procentdel i forhold til OD af blodpladefattig plasma eller puffer. Streng kalibrering er derfor vigtigt i starten af hvert forsøg. Som en generel regel: kalibrering til 0% er indstillet ved at måle OD af en ikke-stimuleret blodplade suspension, medens måling af OD af suspensionen indeholdende ingen blodplader repræsenterer en værdi på 100%. Blodpladeaggregering almindeligvis visualiseret som en tidstro aggregeringskurven. Turbidimetri er en af de mest almindeligt anvendte laboratoriemetoder til undersøgelse af blodpladefunktion og betragtes som det historiske guldstandard og anvendes til udvikling af nye farmaceutiske midler rettet mod inhibering af blodpladeaggregering. Her beskriver vi detaljerede protokoller for 1) fremstilling af humane vaskede blodplader og 2) turbidimetrisk analyse af kollagen-induceret aggregering af humane vaskede blodplader forbehandlet med fødevarer farvestof Brilliant Blue FCF, der var for nylig identified som en inhibitor for Pannexin1 (Panx1) kanaler.
Introduction
Blodplader er afgørende blodkomponenter og hovedfunktion-sammen med koagulationsfaktorer-er at stoppe blødning efter blodkarbeskadigelse. Blodplader er små (2-3 um) anuclear fragmenter afledt megakaryocytter i knoglemarven 1. Blodplader cirkulerer i ikke-aktiveret tilstand, hvor de vises som linseformede strukturer. Ved afbrydelse af endotelet, blodplader samles til stedet med blodkarbeskadigelse at tilslutte hullet, en proces, der kaldes primær hæmostase. Indledningsvis, blodplader tillægger subendoteliale molekyler, såsom collagen og von Willebrand-faktor, der er udsat som følge af skade-adhæsion trin 2. Derefter kan de ændrer form og udskiller kemiske budbringere-aktiveringstrin. Endelig har de forbindelse til hinanden ved at slå bro receptorer-aggregering trin. Primær hæmostase efterfølges af en sekundær proces, der involverer aktivering af koagulationskaskaden med fibrinaflejring, som stabilisererr den indledende thrombe 2.
Akutte iskæmiske hændelser, såsom myocardieinfarkt 3 resulterer ofte fra thrombi, der danner grund af fysisk afbrydelse (sprængning) af en aterosklerotisk plak. Aktuelle trombocythæmmende lægemidler er hjørnestenen i behandlingen af denne udbredte sygdom, men deres kliniske fordel er begrænset af en øget risiko for blødning. De mest ordinerede lægemidler i kardiovaskulære patienter, aspirin og anti-P2Y12 forbindelser målrette thromboxan A2 og ADP veje 4 henholdsvis som er de vigtigste veje, der fører til blodpladeaktivering. Men innovativ forskning i retning af nye mål, der optimalt ville balancere antitrombotiske effekter og hæmoragisk risiko er stadig nødvendigt.
Fra 1960'erne 5 til dag, har turbidimetrisk aggregometri spillet en afgørende rolle inden for forskning, forbedre vores viden om trombocytreaktivitet og jegn overvågning af styrken af antithrombotiske reagenser i mennesker. Turbidimetri blev oprindeligt anvendt til PRP ekstraheret fra blodprøver. Faktisk blodtapning udført i rør indeholdende citrat giver hurtig og stor produktion af PRP uden at have nogen virkning på blodplade integritet og funktion. Men den kortsigtede stabilitet (ca. 3 h), PRP og de resterende plasmatiske enzymer, såsom thrombin, og koncentrationen lavt calciumindhold forbundet med potentielt kulturgenstandsspor sammenlægning profiler er af væsentlig ulempe for anvendelsen af PRP. Et vigtigt skridt fremad har været udviklingen af en fremgangsmåde til blodplade isolering med yderligere centrifugering og vask trin 6. Kort sagt er PRP isoleret fra fuldblod opsamlet på syre-citrat-dextrose (ACD) og blodplader isoleret efter seriel centrifugeringstrin inden de resuspenderes i en iso-osmotisk phosphatpuffer (Tyrodes puffer) indeholdende glucose, humant serumalbumin og divalent ctioner (Ca2 + og Mg2 +). For at undgå ændringer i trombocytreaktivitet pH af Tyrodes puffer omhyggeligt holdt ved 7,35-7,4. Desuden er uønsket aktivering af blodplader forhindres ved tilsætning af prostacyclin (PGI2) før nogle centrifugeringstrin. Endelig tilsætning af apyrase forhindrer vaskede blodplader bliver resistente mod virkningen af ATP / ADP. Den resulterende blodpladesuspension mangler koagulerende faktorer og stabiliteten af blodplader forøget med mindst to gange sammenlignet med PRP løsninger. Desuden den omstændighed, at blodplader er inaktive, men intakte warrants reproducerbarheden af turbidimetriske målinger og giver mulighed for at studere virkningen af agonister eller antagonister af blodpladeaggregering på en optimal måde.
Under anvendelse af denne metode har vi vist i en nylig undersøgelse, at inhibering af dannelsen af Panx1 kanaler ved en genetisk tilgang (knock-out-mus) eller faldende Panx1 kanalaktivitet ved farmakologisktilgange reduceret collageninduceret blodpladeaggregering 7. Panx1 danner ATP-frigivelse kanaler som ubikvitært udtrykt i mange celletyper, herunder humane blodplader 7, 8. Faktisk, vi demonstreret ved turbidimetri på humane vaskede blodplader at en 7 min præinkubation med et panel af mere eller mindre specifikke kemiske blokkere (probenecid, mefloquin og 10 Panx1 peptider) forud for tilsætning af forskellige agonister, inhiberede specifikt collageninduceret blodpladeaggregation mens blodplade reaktioner på AA og ADP ikke blev påvirket. Vi påvist, at ATP frigivelse gennem Panx1 kanaler specifikt interfererer i GPVI signalering, der fører til collagen-induceret aggregering. Interessant, flere FDA-godkendte forbindelser med anvendelser i andre sygdomme (probenecid, mefloquin) påvirke aktiviteten af Panx1 kanaler i blodplader. På den ene side er dette åbner nye terapeutiske perspektiver for at vælgeively modificere trombocytreaktivitet. På den anden side bør man overveje potentielle sekundære virkninger af disse forbindelser. I den forbindelse sikre fødevarer farvestof Brilliant Blue FCF bruges i flere slik og energidrikke er blevet beskrevet som en selektiv inhibitor af Panx1 9. Vi beskriver her en protokol til isolering af humane vaskede blodplader og turbidimetriske målinger af blodpladeaggregering er indrettet til at undersøge virkningen af den Brilliant Blue FCF farvestof som en antagonist af blodpladeaggregering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Fem ubeslægtede raske frivillige blev rekrutteret til blodprøveudtagning for blodplade isolerings- og sammenlægning tests. Skriftligt informeret samtykke blev opnået, og protokollen blev godkendt af den centrale etiske komité af Geneve universitetshospitaler. Alle frivillige certificeret til at være sund og ikke at have taget nogen blodplade-interfererende stoffer i mindst de sidste 10 dage forud forsøgene.
1. Buffer Forberedelse til humant Blodprøvetagning og Washed Blodplade Isolation
- Forberede en 100 mL vandig opløsning af syre-citrat-dextrose (ACD) ved at opløse 1,4 g citronsyremonohydrat (C6H 8 O 7 • H2O, 66,6 mM), 2,5 g trinatriumcitratdihydrat (Na 3 C 6 H 5 O 7 • 2 H2O, 85 mM) og 2 g vandfrit D (+) - glucose. PH af opløsningen er ca. 4,5.
- Forbered stamopløsninger for Tyrodes buffer som følger
- Forberede stamopløsning 1 ved at opløse 80 g NaCI, 2 g KCI, 10 g NaHCO3 og 0,58 g NaH 2 PO4 * H2O i 500 ml destilleret H2O De respektive slutkoncentrationer er 2,73 M, 53,6 mM, 238 mM og 8,4 mM. Hold opløsningen ved 4 ° C.
- Forberede stamopløsning 2 ved at opløse 10,15 g MgCl2 * 6 H2O (100 mM) i 500 ml destilleret H2O Hold opløsning ved 4 ° C.
- Forberede stamopløsning 3 ved at opløse 10,95 g (100 mM) CaCl2 * 6 H2O i 500 ml destilleret H2O Hold opløsning ved 4 ° C.
- Forberede Tyrodes puffer ved at fortynde 2,5 ml stamopløsning 1 i et slutvolumen på 50 ml med destilleret H2O Dette svarer til slutkoncentrationer på 136,5 mM NaCl, 2,68 mM KCI, 11,9 mM NaHCO3 og 0,42 mM NaH 2PO 4 * H2O pH justeres til 7,35, og der steriliseres ved filtrering med 0,22 um filters.
- Forberede Tyrodes albumin 0,35% puffer (TA puffer 7) ved at fortynde 5 ml stamopløsning 1, 1 ml stamopløsning 2, 2 ml stamopløsning 3, 0,5 ml 1 M HEPES, 1,8 ml 200 g / l humant serumalbumin og 0,1 g vandfrit D (+) - glucose i et endeligt volumen på 100 ml destilleret H2O
- PH justeres til 7,35 med 1 N HCI og indstille osmolariteten til 295 mOsm / l ved tilsætning af destilleret H2O (10% af totalt volumen). Slutkoncentrationer i denne opløsning er: 124 mM NaCl, 2,44 mM KCI, 10,82 mM NaHCO3, 0,38 mM NaH 2 PO4 * H2O, 0,91 mM MgCl2 * 6 H2O, 1,82 mM CaCl2 * 6 H2O . Hold TA-buffer ved 37 ° C under hele forsøget.
2. Blodprøvetagning
- Saml 45-50 ml veneblod fra antecubital vene anvendelse af en 19 G nål og ingen eller lav årepresse, i 50 ml glas conholdende ACD antikoagulant (1 volumen ACD til 6 volumener blod). Kassere den første 1-2 ml blod for at undgå tilstedeværelsen af thrombin og vævsfaktor.
- Efter opsamling blandes blodet med ACD ved forsigtigt at vende røret. Prøven inkuberes i 10 minutter ved 37 ° C.
3. Fremstilling af human vaskede blodplader
- Forvarm centrifugen til 37 ° C. Alle centrifugeringstrin nedenfor udføres ved denne temperatur.
- Afsende opsamlede blod i 15 ml rør (5 ml pr rør) og centrifugeres ved 250 xg i 13 min for at opnå PRP.
BEMÆRK: Denne centrifugeringstrin resulterer i produktionen af tre lag i prøven: 1) Det øvre lag, der består af plasma, blodplader, og en lille fraktion af hvide blodlegemer. 2) Det mellemliggende lag, en portion rig på hvide blodlegemer. 3) Bundlaget, der hovedsagelig er sammensat af røde blodlegemer. - Indsamle PRP ved pipettering af øvre layer omhyggeligt ind i en ny 15 ml rør til maksimalt forhindre forurening med røde og hvide blodlegemer, og inkuberes i 10 minutter ved 37 ° C.
- Centrifugere PRP ved 2200 xg i 12 min (til 5 ml PRP).
BEMÆRK: Denne centrifugeringstrin bør udføres med lav bremse eller uden bremse. - Fjern supernatanten (blodpladefattige plasma), og forsigtigt pellet resuspenderes med 10 ml TA-buffer indeholdende 2 pi / ml heparin (5.000 U / ml) og 2,5 pi / ml 25 uM PGI2 ved anvendelse af en plast Pasteur pipette. Inkuber i 10 minutter ved 37 ° C.
- Tilføje 2,5 pi / ml 25 uM PGI2 og centrifugeres i 8 minutter ved 1.900 xg (med lav bremse eller uden bremse).
- Fjern supernatanten og resuspender pelleten med 5 mL TA-buffer indeholdende 2,5 pl / ml 25 uM PGI2 ved anvendelse af en plast Pasteur-pipette. Inkuber i 10 minutter ved 37 ° C.
- I inkubationsperioden pipetteres 150 pi af blodpladesuspension itil et 1,5 ml rør og tælle blodplader under anvendelse af en automatiseret celletæller (som detekterer størrelsen af blodceller ved at måle ændringerne i jævnstrøm resistens).
- Efter 10 minutters inkubation tilsættes 2,5 pi / ml 25 uM PGI2 til blodpladesuspensionen og straks centrifugere ved 1.900 xg i 8 min.
- Fjern supernatanten og resuspender pelleten til en koncentration på 250.000 blodplader / pl med et tilstrækkeligt volumen af TA-puffer (dvs. hvis celletallet er 500.000 pr pi, resuspender i 10 ml TA puffer) indeholdende 32 pl / ml apyrase ved 0,01 U / ml (slutkoncentration 0,32 U / ml).
BEMÆRK: Høj koncentration af apyrase anvendes til at undgå desensibilisering af P2X1-receptorer induceret af spontan sekretion af ATP 10, 11 i fravær af agonister. Dette er vigtigt, fordi collagen-inducerede responser induceret af hurtig parakrine / autokrin aktivering af P2X1 af ATP frigivet frabout blodplader. Hvis blodplade signalvejen ikke kritisk kræver bevarelse af P2X1 funktion, bruges 0,02 U / ml apyrase. Adskillige undersøgelser (gennemgået i Mahaut-Smith et al. 10) viste, at 0,02 U / ml apyrase undgår ADP-receptor P2Y1 desensibilisering med ubetydelige P2X1 responser. - Inkuber cellesuspensionen i mindst 30 minutter ved 37 ° C før udførelse af aggregometric målinger. Præparatet er stabilt i 5 til 8 timer.
4. aggregometri
- Forberede fibrinogen (56 mg / ml) i Tyrodes puffer.
- Pipetter 260 pi blodpladesuspension i glaskuvetter (figur 1A; venstre kuvette) indeholdende 10 pi af fibrinogen (56 mg / ml) og en stang til magnetisk omrøring, derefter inkubere suspensionen til 2 - 3 min ved 37 ° C i nuværende inkubering blev brøndene i aggregometer (figur 1B og 1C).
- Præinkuberes med Panx1inhibitor Brilliant Blue FCF ved tilsætning af 10 pi af en 2,8 mM eller 28 mM stamopløsning (slutkoncentration 100 pM og 1 mM) i 7 min ved 37 ° C.
- Kalibrer aggregometer til en assumptive 100% aggregation værdi ved at måle OD af en kuvette indeholdende 10 pi fibrinogen (56 mg / ml), 10 pi Brilliant Blue FCF (2,8 mM eller 28 mM) og TA-buffer uden blodplader.
- Anbring kuvetten i en samling godt under automatisk omrøring og trykke på den tilsvarende knap på tastaturet af computeren forbundet med aggregometer (dvs. tryk F1, hvis der anvendes aggregation brønd 1).
BEMÆRK: Dette eksperiment beskrevet nedenfor omfatter Brilliant Blue FCF. Forbindelsen anvendt til kalibrering skal justeres til den eksperimentelle betingelse.
- Anbring kuvetten i en samling godt under automatisk omrøring og trykke på den tilsvarende knap på tastaturet af computeren forbundet med aggregometer (dvs. tryk F1, hvis der anvendes aggregation brønd 1).
- Kalibrer aggregometer til en assumptive 0% aggregering værdi ved anvendelse af den samme blodpladeprøve, der vil blive anvendt til forsøget under automatisk stirring.
- Placer kuvetten i aggregeringen godt og trykke på den tilsvarende knap på tastaturet af computeren er forbundet med aggregometret. Vent i cirka 20-30 s, før du fortsætter. Denne forsinkelse tjener til at sikre, at ingen sammenlægning sker, før du tilføjer agonister.
BEMÆRK: Som nogen forskel i antallet af blodplader kan have en effekt på den målte OD, skal gentages for hver enkelt måling 0% kalibreringstrinnet.
- Placer kuvetten i aggregeringen godt og trykke på den tilsvarende knap på tastaturet af computeren er forbundet med aggregometret. Vent i cirka 20-30 s, før du fortsætter. Denne forsinkelse tjener til at sikre, at ingen sammenlægning sker, før du tilføjer agonister.
- Tilsæt 20 pi ønskede agonist, såsom 15 ug / ml collagen (1 ug / ml endelig) eller 1,125 mM arachidonsyre (75 pM slut), ind i kuvetten. Straks begynder optagelsen under konstant automatisk omrøring ved at trykke på den tilsvarende knap på tastaturet af computeren er forbundet med aggregometret.
BEMÆRK: Tilsætningen af agonisten inducerer blodpladeaktivering. Blodpladeaggregater kan tydeligt skelnes i glasset kuvette ved slutningen af forsøget (figur 1A; right kuvette). - Optagelsen stopper automatisk efter 6 min. På dette tidspunkt, skal du gemme dataene ved at klikke på ikonet spare på computeren.
BEMÆRK: Beregningen af aggregeringshastigheden udføres af computeren, som udtrykker de endelige resultater af aggregeringsprocessen som en procentdel. - Analysere data.
- For yderligere omfattende information om protokoller til fremstilling af vaskede blodplader suspensioner og turbidimetrisk måling af blodpladeaggregering, henvise til andre papirer forfattet af eksperter på området 12, 13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den aggregometer software producerer automatisk sammenlægning kurver og giver værdierne for maksimal aggregering i procent. Værdierne kan kopieres til en dataanalyse software for at statistisk analyse og visualisere maksimal sammenlægning værdier i form af søjlediagrammer. Eventuelt kan hvert enkelt punkt af aggregeringsreaktionerne kurver eksporteres successivt i et regneark-software og derefter til statistisk software (f.eks GraphPad) for at visualisere kurverne. Nogle forskere anvender den maksimale hældning af aggregering kurven for at beregne hastigheden og arealet under kurven for at vurdere blodpladeaktivitet. Den halter tid og form forandring kan også visualiseres grafisk.
Et typisk eksempel på en aggregeringskurven af vaskede humane blodplader under kontrolbetingelser (H2O) er vist i figur 2A. Tilsætning af engonist (collagen), inducerede (efter en kort forsinkelse) en fordybning i aggregeringskurven forårsaget af formændring af blodpladerne. Derefter blev den procentdel af aggregering gradvist forøget over tid, indtil en maksimal værdi nåede ved ca. 3-4 min. Et lille fald i andelen af aggregation blev observeret mod slutningen af 6 min optagelse, som afspejler en opdeling. Som illustreret i figur 2A-B, præinkubering humane vaskede blodplader med den Panx1 kanal inhibitoren Brilliant Blue FCF, i en koncentration på 1 mM, forsinkes eller helt afskaffet første ændring blodplade form og blokeret collagen-induceret aggregering af vaskede blodplader opnået fra 5 forskellige ubeslægtede raske frivillige. Når blodplader hvor præinkuberet med en lavere koncentration (100 uM) af Brilliant Blue FCF, blev den inhiberende virkning af farvestoffet på collageninducerede reaktioner og formændring ikke observeret længere (se figur 2A for et eksempel). Quantifgement af blodpladeaggregering responser induceret af 1 pg / ml collagen afslørede, at 1 mM Brilliant Blue FCF signifikant reducerede maksimale aggregeringsresponser sammenlignet med kontrolbetingelser samt til en lavere koncentration (100 uM) af Panx1 inhibitor (figur 2C). Inhibering af blodpladeaggregering var specifik for kollagen-inducerede responser og ikke på grund af uønskede bivirkninger af Brilliant Blue FCF (på cellelevedygtighed, for eksempel) som den samme koncentration af farvestof (1 mM) påvirkede ikke aggregering induceret af en anden agonist, dvs. 75 pM AA, som vist i figur 2D. Disse resultater bekræfter den specifikke rolle Panx1 kanaler i collagen-induceret aggregeringsresponser af humane blodplader, som vi og andre tidligere har vist med andre farmakologiske inhibitorer af Panx1 såsom probenecid, mefloquin, og de specifikke 10 Panx1 peptider 7, 8.
Figur 1: aggregometri. (A) Repræsentativ billede af glaskuvetter (indeholdende en omrøring magnet) anvendt til aggregometri. Kuvetten til venstre viser hvilende blodplader mens kuvetten til højre illustrerer blodpladeaggregater efter collagen-induceret aktivering. (B) Repræsentativ billede af en 8-brønds aggregometer for turbidimetriske målinger. Brøndene anvendes (stjerne) at inkubere thrombocytsuspensionerne stede i et glas kuvette ved 37 ° C, og dem, der anvendes til målingerne (hvid pil) er angivet i C. Venligst klik her for en større version af denne figur.
Figur 2: en høj koncentration af Brilliant Blue FCF Blocks trombocytaktivering i Reaktion på Collagen. (A) Repræsentative spor af collagen-induceret aggregering af humane vaskede blodplader opnået fra samme raske frivillige (V1) under kontrolbetingelser (H2O; mørk blå) eller efter 7 min præinkubation med Panx1 inhibitoren Brilliant Blue FCF ved 1 mM ( lyseblå) eller ved 100 uM (mellemprodukt blå farve). Sammenlægning spor blev registreret i 6 minutter. (B) Repræsentative spor af collagen-induceret aggregering af humane vaskede blodplader opnået fra 4 raske frivillige forsøgspersoner (V2-V5) efter 7 min præinkubation med Panx1 inhibitoren Brilliant Blue FCF (1 mM). (C) Kvantificering af maksimale aggregeringsresponser af humane vaskede blodplader under kontrolbetingelser (hvid søjle) eller efter 7 min præinkubation med Brilliant Blue FCF ved 100 uM (grå søjle) eller ved 1 mM (sort søjle). N = 5. **** P0 0,0001; ANOVA efterfulgt af Bonferroni post-test for multipel sammenligning; Resultaterne er udtrykt som middelværdi ± SEM. (D) Repræsentative spor af AA-induceret aggregering af humane vaskede blodplader opnået fra 5 raske frivillige (V1-V5) efter 7 min præinkubation med Panx1 inhibitoren Brilliant Blue FCF (1 mM). Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Der er stor interesse for at finde nye lægemidler kan modulere trombocytfunktionen for at forhindre blodpropper uden at øge risikoen for blødning. Til dette formål in vitro laboratorieforsøg, som pålideligt og reproducerbart kan overvåge aggregeringsresponser i humane blodplader er absolut nødvendige. Turbidimetrisk aggregometri er en nem teknik til at udføre. Men har brug for nogle forholdsregler, der skal holdes for øje. Målingerne skal udføres under kontinuerlig omrøring som aggregeringen proces er meget afhængig af omrøring. Det er også vigtigt at holde blodpladerne ved en fysiologisk temperatur på 37 ° C for at undgå enhver form for for tidlig aktivering. Præaktivering af blodplader kan også forekomme under blodprøvetagning og vaskede blodplader forberedelse, hvilket fører til spontan aggregering. Således bør tages omhyggelige forholdsregler under hele proceduren for blodpladepræparation.
Turbidimetri er baseret on måling af OD af blodpladesuspensionen. Dette gør teknikken uegnet til aggregering måling i fuldblod på grund af tilstedeværelsen af røde blodlegemer. Således kan turbidimetri kun udføres på PRP eller vaskede blodplader isoleret fra PRP. Selv let at håndtere og temmelig billig, er turbidimetri blevet anerkendt som ufølsom over for tilstedeværelsen af mikroaggregater 14, 15. Når mikroaggregater forventes at være af afgørende betydning, impedans aggregometri, som måler variationen i elektrisk modstand, når blodplader klæber til en elektrode nedsænket i en citrat helblodsprøve, er bedre egnet 16. Blodpladeaggregeringsprocessen er også meget afhængig af blodpladetælling i blodpladesuspensionen 17; flowcytometri anvendes til patienter, der lider af trombocytopeni 18, fra hvem det maksimale antal blodplader, somkan opnås er utilstrækkelig til turbidimetri. den generelle fordel ved turbidimetri er imidlertid, at den tillader en detaljeret analyse af trombocytreaktivitet, såsom formændring og opdeling, som ikke kan vurderes i fuldblodsprøver.
Det er vigtigt at indse, at naturlig variation i menneskelig trombocytaggregationen eksisterer på grund af forskelle i alder, køn og livsstil samt sundhedstilstanden af emnet, hvis trombocytfunktionen udfordres 19, 20, 21. Sådan naturlig variation kan være i størrelsesordenen 10-20% i de turbidimetriske resultater, derfor bør man være omhyggelig, når der udføres og fortolkningen af disse eksperimenter, i at opnå blodplader fra tilstrækkeligt mange ubeslægtede raske frivillige at tillade pålidelige statistikker. Denne begrænsning er imidlertid opvejes af det forhold, at turbidimetriske målinger er meget reproducerbar, i det mindste når aggregeringprocedurer er godt standardiseret på tværs laboratorier. Der er foretaget standardiseringsarbejde af International Society of Trombose og Hæmostase 22. Af denne grund, turbidimetri er stadig den hyppigst forekommende test til måling af trombocytaggregation i både kliniske og basale laboratorier og forbliver en teknik til valg for at studere effekten af lægemidler på blodplader reaktioner.
I den foreliggende undersøgelse har vi vist, ved hjælp af turbidimetri at måle responser i humane vaskede blodplader, at en almindeligt anvendt fødevarer farvestof Brilliant Blue FCF påvirker blodpladeaggregering. Elegant elektrofysiologiske undersøgelser har afsløret en specifik blokade af Panx1 kanaler ved denne farvestof 9, 23. Faktisk høje koncentrationer (1 mM) af denne farvestof udviste inhibitoriske virkninger på både collagen-induceret formændring og maksimal aggregering men 10 gange lavere koncentrationer (100 pM)af farvestoffet påvirkede ikke blodpladeaggregationsrespons. Ifølge den videnskabelige udtalelse om reevaluering af Brilliant Blue FCF (E133) som et fødevaretilsætningsstof, offentliggjort af Europæiske Fødevaresikkerhedsautoritet 24, den maksimale tilladte koncentration af Brilliant Blue FCF (molekylvægt = 792,84 g / mol) er 500 mg / kg foder. For H2O, ville dette svare til 0,63 mM, hvilket er en 1,59-gange lavere koncentration end den inhiberende collageninduceret blodpladeaggregering i vores eksperimenter. Antages det, at kun en lille del af farvestoffet vil blive absorberet i tarmene efter oral indtagelse, og at farvestoffet endelig vil blive fortyndet i 5-L volumen af blod fra en voksen person, den daglige indtagelse af denne blå fødevarer farvestof sandsynligvis har at langt overstige normale niveauer før eventuelle bivirkninger for blodpladeaggregering kan forventes. Mulige bivirkninger af den højeste koncentration af farvestoffet i vores forsøg med blodplade levedygtighed, for eksempel, varudelukket ved tilstedeværelsen af faste aggregeringsresponser til en anden agonist (AA). Disse upåvirkede AA responser bekræftede også, at inhibitoriske virkninger af Brilliant Blue FCF tilsyneladende specifikt involvere collagen signalvej. Dette er på linje med vores tidligere undersøgelse 7 beskriver bestemt sted for ATP frigivelse gennem Panx1 kanaler i collagen blodpladeaggregering respons.
Ved at tilpasse protokol af vaskede blodplader isolation til denne undersøgelse beskriver vi en enkel og ligetil metode til isolering af blodplader fra humant blod. Efter adskillige vasketrin udført i det væsentlige ved centrifugering, er blodplader resuspenderes i et medium, der respekterer præcise fysiologiske tilstande, herunder pH, arbejdstemperatur og koncentration af divalente ioner men sikrer fravær af plasmaproteiner. Dette er en fordel ved denne teknik igen alternative metoder, såsom gelfiltrering, hvori fjernelse af plasma kompenser ikke forekommer 25.
Alle trinnene i vaskeproceduren er af afgørende betydning for at opnå reproducerbare resultater ved brug vaskede blodplader. En overflod af lægemidler kan påvirke trombocytreaktivitet, derfor er det vigtigt, at de frivillige raske bliver bedt om at ikke tage nogen medicin i mindst 10 dage forud blodtapning. Desuden blodtapning nødvendiggør, at der lægges vægt på at undgå vene traume eller for langsom strømning da dette kan forårsage dannelsen af thrombin og efterfølgende blodpladeaktivering 22. På samme måde kan potentielle blodpladeaktivering under centrifugeringen og vasketrin undgås ved gentagen brug af PGI2. På grund af dens meget lave stabilitet bør PGI2 hvormed hvert vasketrin umiddelbart før hver centrifugering. Ophvirvling af blodplader i TA-puffer (ved en fysiologisk pH) indeholdende apyrase sikrer, at blodplade reaktioner forbliverintakt. Tilstedeværelsen af apyrase i blodpladesuspensionen er afgørende for at tillade nedbrydning af ATP og ADP for at bevare blodplader fra en desensibilisering af deres purinerge receptorer. Som Panx1 signalvejen involverer P2X1-receptoraktivering i humane blodplader upon collagen receptoraktivering, vi tilføjet en relativt høj koncentration af apyrase (0,32 U / ml) til blodpladesuspensionen for at undgå P2X1 desensibilisering 7. At undgå densensitization andre purinerge receptorer i blodplader, ville lavere koncentrationer af apyrase være tilstrækkelig 10.
Selv om proceduren af serielle centrifugeringer og vaskevæsker trin er arbejdskrævende og kræver mere tid, opnåede vaskede blodplader ved anvendelse af denne protokol tilbyder fordelen ved højere stabilitet ved 37 ° C (5-8 timer) sammenlignet med blodplader anvendes direkte fra PRP (1 -3 h). Dog bør der, valget mellem at bruge PRP eller vaskede blodplader cautiously og bør omfatte overvejelser såsom mængden af blod til rådighed for eksperimentet, at agonisten anvendes såvel som det spørgsmål, som vil blive behandlet. For eksempel som bindingen af fibrinogen til aktiveret α2β3-integriner er den vigtigste mekanisme medierer blodpladeaggregering, fravær af fibrinogen i vaskede blodplader kunne påvirke reaktionen; navnlig når svage agonister (såsom ADP) anvendes 13. Dette problem er mindre kritisk, når der anvendes en kraftig agonist, såsom thrombin eller collagen, som er i sig selv i stand til at inducere frigivelsen af fibrinogen fra a-granuler. Stadig, vi rutinemæssigt tilføje exogent fibrinogen til det vaskede humane blodpladesuspensionen for at øge amplituden af aggregering induceret af kollagen.
Afslutningsvis ved anvendelse af human vaskede blodplader og turbidimetri, vi fandt, at fødevaren farvestoffet Brilliant Blue FCF gennem sine inhiberende virkninger på Panx1, betegneren potentiel inhibitor af blodpladefunktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra den schweiziske National Science Foundation (310030_162579 / 1 til Brenda Renata Kwak og 320030_144150 til Pierre Fontana) samt af en bevilling fra den schweiziske Hjerteforeningen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| citric acid monohydrate (C6H8O7*H2O) | Roth | 5949-29-1 | danger of eye damage/irritation |
| trisodium citrate dihydrate (Na3C6H5O7*2H2O) | Sigma-Aldrich | S1804 | - |
| D(+)-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | - |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | - |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | - |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S6014 | - |
| Sodium dihydrogenophosphate monohydrate (NaH2PO4*H2O) | Sigma-Aldrich | S9638 | - |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2*6H2O) | Sigma-Aldrich | M9272 | - |
| Calcium chloride hexahydrate (CaCl2*6H2O) | Sigma-Aldrich | 442909 | danger of eye damage/irritation |
| N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (Hepes) | ThermoFisher Scientific | 15630 | - |
| human serum albumin | CSL Behring | 00257/374 | - |
| hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 320331 | Corrosive and irritative for the respiratory system. Can cause severe skin and eye damages. |
| Eppendorf 5810 R | Fisher Scientific | - | - |
| heparin | Drosspharm AG/SA | 20810 | |
| prostacyclin I2 (PGI2) | Cayman | 18220 | - |
| apyrase from potatoes | Sigma-Aldrich | A6535 | - |
| fibrinogen (Haemocomplettan) | CSL Behring | HS 73466011 | - |
| thrombo-aggragometer SD-Medical | SD-Innovation | TA8V | - |
| Brilliant blue FCF (Erioglaucine disodium salt) | Sigma-Aldrich | 80717 | Harmful to aquatic life with long lasting effects (Avoid release to the environnement) |
| collagen | Horm, Nycomed | - | |
| arachidonic acid | Bio/Data corporation | C/N 101297 | - |
| cell counter Sysmex KX-21N | Sysmex Digitana | - | - |
| HEPES | Gibco | 15630-056 | - |
| glass cuvettes | SD-Innovation | THCV1000 | - |
| magnetic stirrers | SD-Innovation | THA100 | - |
References
- Patel, S. R., Hartwig, J. H., Italiano, J. E. The biogenesis of platelets from megakaryocyte proplatelets. J Clin Invest. 115 (12), 3348-3354 (2005).
- Andrews, R. K., Berndt, M. C. Platelet physiology and thrombosis. Thromb Res. 114 (5-6), 447-453 (2004).
- Go, A. S., et al. Heart disease and stroke statistics--2014 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 129 (3), e28-e292 (2014).
- Creager, M. A. Results of the CAPRIE trial: efficacy and safety of clopidogrel. Clopidogrel versus aspirin in patients at risk of ischaemic events. Vasc Med. 3 (3), 257-260 (1998).
- Born, G. V., Cross, M. J. The Aggregation of Blood Platelets. J Physiol. 168, 178-195 (1963).
- Cazenave, J. P., Hemmendinger, S., Beretz, A., Sutter-Bay, A., Launay, J. [Platelet aggregation: a tool for clinical investigation and pharmacological study Methodology]. Ann Biol Clin (Paris). 41 (3), 167-179 (1983).
- Molica, F., et al. Functional role of a polymorphism in the Pannexin1 gene in collagen-induced platelet aggregation. Thromb Haemost. 114 (2), 325-336 (2015).
- Taylor, K. A., Wright, J. R., Vial, C., Evans, R. J., Mahaut-Smith, M. P. Amplification of human platelet activation by surface pannexin-1 channels. J Thromb Haemost. 12 (6), 987-998 (2014).
- Wang, J., Jackson, D. G., Dahl, G. The food dye FD&C Blue No. 1 is a selective inhibitor of the ATP release channel Panx1. J Gen Physiol. 141 (5), 649-656 (2013).
- Mahaut-Smith, M. P., Jones, S., Evans, R. J. The P2X1 receptor and platelet function. Purinergic Signal. 7 (3), 341-356 (2011).
- Hechler, B., et al. Inhibition of platelet functions and thrombosis through selective or nonselective inhibition of the platelet P2 receptors with increasing doses of NF449 [4,4',4'',4'''-(carbonylbis(imino-5,1,3-benzenetriylbis-(carbonylimino)))tetrakis -benzene-1,3-disulfonic acid octasodium salt]. J Pharmacol Exp Ther. 314 (1), 232-243 (2005).
- Cazenave, J. P., et al. Preparation of washed platelet suspensions from human and rodent blood. Methods Mol Biol. 272, 13-28 (2004).
- Jarvis, G. E.
- Thompson, N. T., Scrutton, M. C., Wallis, R. B. Particle volume changes associated with light transmittance changes in the platelet aggregometer: dependence upon aggregating agent and effectiveness of stimulus. Thromb Res. 41 (5), 615-626 (1986).
- Malinski, J. A., Nelsestuen, G. L. Relationship of turbidity to the stages of platelet aggregation. Biochim Biophys Acta. 882 (2), 177-182 (1986).
- Riess, H., Braun, G., Brehm, G., Hiller, E. Critical evaluation of platelet aggregation in whole human blood. Am J Clin Pathol. 85 (1), 50-56 (1986).
- Hayward, C. P., et al. An evaluation of methods for determining reference intervals for light transmission platelet aggregation tests on samples with normal or reduced platelet counts. Thromb Haemost. 100 (1), 134-145 (2008).
- Frelinger, A. L. 3rd, et al. Platelet function tests, independent of platelet count, are associated with bleeding severity in. ITP. Blood. 126 (7), 873-879 (2015).
- Fusegawa, Y., Goto, S., Handa, S., Kawada, T., Ando, Y. Platelet spontaneous aggregation in platelet-rich plasma is increased in habitual smokers. Thromb Res. 93 (6), 271-278 (1999).
- Davis, R. B., Boyd, D. G., McKinney, M. E., Jones, C. C. Effects of exercise and exercise conditioning on blood platelet function. Med Sci Sports Exerc. 22 (1), 49-53 (1990).
- Yee, D. L., Sun, C. W., Bergeron, A. L., Dong, J. F., Bray, P. F. Aggregometry detects platelet hyperreactivity in healthy individuals. Blood. 106 (8), 2723-2729 (2005).
- Cattaneo, M., et al. Recommendations for the Standardization of Light Transmission Aggregometry: A Consensus of the Working Party from the Platelet Physiology Subcommittee of SSC/ISTH. J Thromb Haemost. , (2013).
- Patel, D., Zhang, X., Veenstra, R. D. Connexin hemichannel and pannexin channel electrophysiology: how do they differ? FEBS Lett. 588 (8), 1372-1378 (2014).
- European Food Safety Authority. Scientific Opinion on the re-evaluation of Brilliant Blue FCF (E 133) as a food additive. EFSA Journal. 8 (11), 1853-1889 (2010).
- Lages, B., Scrutton, M. C., Holmsen, H. Studies on gel-filtered human platelets: isolation and characterization in a medium containing no added Ca2+, Mg2+, or K+. J Lab Clin Med. 85 (5), 811-825 (1975).
