Summary
允许从生物样品中鉴定和分离干细胞群体的方法对于癌症及其以外的干细胞靶向治疗的进展至关重要。在这里,我们提供使用染料触发侧群体表型的癌症干细胞分离的详细方案。
Abstract
癌症是干细胞驱动的疾病,并且这些细胞的根除已成为主要的治疗目标。解密癌症干细胞(CSCs)的脆弱性和鉴定合适的分子靶标依赖于允许其在异种样品如细胞系和离体肿瘤组织中的特异性鉴别的方法。流式细胞术/ FACS是在单细胞水平上多参数解剖生物样品的强大技术,是迄今为止选择的方法,用于回收活细胞进行下游分析。表面标志物如CD44和CD133以及醛脱氢酶酶活性的检测常常用于通过FACS定义和分离来自肿瘤样品的CSCs。以方法学细节描述的补充方法利用ABC药物转运蛋白的功能性染料挤出,其识别通常称为侧群体(SP)的不同的荧光 - 细胞群体。 SP;癌细胞表现出典型的干细胞特征,并且可以使用抑制染料挤出药物转运蛋白(最常见的是ABCB1 / P-糖蛋白/ MDR1 / CD243和ABCG2 / Bcrp1 / CD338)的试剂来消除和功能确认。此外,SP测定与其他流式细胞术评估(如表面抗原染色,醛脱氢酶检测和死细胞鉴别( 例如 ,使用7-AAD或碘化丙啶(PI))相容。因此,我们基于功能而不是表型参数,机械地描述了CSC识别,分离和子表征的有价值且广泛适用的方法。尽管最初以Hoechst 33342作为引发染料,但我们在此着重于在配备有紫色激光源的任何流式细胞仪上可分辨的最新的基于紫罗兰染料的SP表型。
Introduction
由于对该疾病的遗传和分子理解以及诸如治疗性抗体和小分子抑制剂等靶向药物的出现的引人注目的进展,原发性癌症疗法在过去十年中已经大大改善。相比之下,转移性和复发性疾病通常是不可治愈的,并且这些临床环境中的发病率和死亡率仍然很高。 CSCs在肿瘤内代表不同的亚群,并具有典型的干细胞特性,如克隆性/致瘤性,多药耐药和不对称细胞分裂1,2 。因此,CSCs不仅可以促进转移性进展和肿瘤异质性,而且在治疗期间也会持续使患者复发。因此,治疗性CSC消除是预防疾病复发并允许长期治愈癌症的重要医疗需要3
识别脆弱性和阐明消除CSCs的策略在很大程度上取决于允许从生物样品中纯化以进行后续表达谱和/或功能调查的方法。反过来,这些方法依赖于对这些细胞特异的表面,细胞内或功能性标记。 CSC特异性表面标志物包括但不限于CD44,CD133,CD24和CD90,并且已被用于鉴定多种肿瘤实体(包括乳腺癌和结肠癌)中的CSC群体。另一种标记物醛脱氢酶(ALDH)显示细胞内定位,并且可以在功能上检测到提供酶转化产生光的各自的底物。使用此测试,CSC群体也已被鉴定在不同的肿瘤实体5 。一种补充方法,通常称为SP分析,并在此处描绘方法学细节,利用ABC药物转运蛋白的活性染料流出来鉴定出少量的荧光样干细胞样细胞群6,7,8 。为了实现这一点,给定的样品在亲脂性DNA结合荧光团的存在下孵育,其通过被动扩散进入所有细胞并靶向用于结合的核和线粒体DNA。没有ABC药物转运蛋白表达的非CSCs累积染料,导致明亮的荧光,而CSCs主动挤出染料,减少荧光。药物转运蛋白活性的药理学抑制消除了功能上的SP表型,应用于控制目的。具有SP特征的CSC群体已经公开在卵巢癌9,10 ,前列腺癌11 ,> 12,乳腺癌13 ,肺癌14 ,子宫内膜癌15 ,胶质瘤16,17和骨肉瘤18 。重要的是,SP测定与癌细胞系和原发性肿瘤组织相容,即使主要材料构成额外的挑战,例如对特定肿瘤细胞鉴别策略的需求(某些宿主细胞群体也可表现出SP特征) 19,20 。
两种最成功的SP赋予药物转运蛋白是ABCB1 / P-糖蛋白/ MDR1 / CD243和ABCG2 / Bcrp1 / CD338 8,9,21;然而,其他药物转运蛋白也可以是SP表型的分子决定因素( 例如 ,ABCB5) 22 。 ABCB1可以有效地阻断维拉帕米,而ABCG2的活性可以用fumitremorgin C(FTC)6,19来明确消除。 SP分析的特殊强度是可以与其他染色( 例如表面标志物和ALDH)组合,并且允许活细胞恢复,从而与下游功能调查相容。此外,由于CSC人群9,23中ABC药物转运蛋白的保护性高,所以SP检测广泛适用。
最初,使用Hoechst 33342作为触发染料24进行了SP检测。该染料具有优异的分辨率,但需要紫外激光激发;因此其适用性自然限于高端流式细胞仪器。 DyeCycle Violet(DCV) 25的出现开启了新的avenu用于SP分析,并将该方法扩展到缺乏紫外激光源(紫激光源足以解决DCV-SP细胞)的标准流式细胞仪器的适用性。重要的是,Hoechst 33342和DCV具有共同的泵特异性,表明染料应识别相同的细胞群体。
在这里,我们提供了基于DCV的SP分析的详细实验方案,以便在独立实验室中快速简便地再现。因此,我们认为我们的文章是CSC研究人员的资源,应该有助于这种有用的细胞生物学方法的优化和标准化。
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Protocol
该协议完全符合机构伦理审查委员会的准则。如果使用本文所述的方案调查人或动物组织,研究人员有义务获得其机构或国家相关审查委员会的批准。
注意事项安全处理生物样本的标准注意事项适用于本协议。这包括戴手套和实验室外套,并尽可能在生物安全柜内进行工作。
1.细胞的制备
- 癌细胞系
- 在37℃下,在10-30mL合适培养基( 例如 ,补充有10%( v / v )FBS,2mM L-谷氨酰胺和1×青霉素/链霉素的RPMI 1640)中培养相应的人或鼠癌细胞系和收获使用0.05%胰蛋白酶-EDTA或一些其他去除剂消化的亚融合细胞( 即 70-90%)的细胞手术程序使用计数室和台盼蓝染色确定细胞计数并检查活力。活细胞的比例应超过85%。
注意:携带SP隔室的人类癌细胞系的实例包括MCF7 / HTB-22和SKBR3 / HTB-30(乳腺癌),A2780和SKOV-3 / HTB-77(卵巢癌)和A549(肺癌) 26 。
- 在37℃下,在10-30mL合适培养基( 例如 ,补充有10%( v / v )FBS,2mM L-谷氨酰胺和1×青霉素/链霉素的RPMI 1640)中培养相应的人或鼠癌细胞系和收获使用0.05%胰蛋白酶-EDTA或一些其他去除剂消化的亚融合细胞( 即 70-90%)的细胞手术程序使用计数室和台盼蓝染色确定细胞计数并检查活力。活细胞的比例应超过85%。
- 离体肿瘤组织
- 采取新鲜的手术肿瘤标本,或者从可移植或遗传工程小鼠肿瘤模型收获肿瘤组织。取200-1,000mg组织,并通过机械解聚( 例如 ,使用剪刀或手术刀)和酶消化( 例如 ,使用胶原酶/分解酶/ DNA酶混合物)产生单细胞悬液。
- 通过70μm截止滤网过滤样品。确定细胞计数并使用计数室和台盼检查生存力ue染色。
注意:消化鸡尾酒通常含有200μg/ mL胶原酶P,0.8U / mL分散酶和25μg/ mL DNA酶I,孵育时间通常为20-50分钟。理想地,根据针对被研究组织27,28,29优化的方案进行组织解聚。
2.测试样品
- 在新鲜培养基(含营养素载体)中,将细胞浓度调整至1×10 6个细胞/ mL,因为染料挤出是一种活跃的耗能过程。最后,将1 mL样品转移到普通流式细胞仪/ FACS圆底管(标记为“测试”)。
注意:为获得最佳结果,可能需要滴定细胞浓度(例如5×10 5 -1×10 6 -2.5×10 6个细胞/ mL),但是细胞浓度通常较低产生更高的分辨率19 。只有对于需要回收最大数量的SP细胞的分选应用,建议将细胞浓度提高到1×10 7个细胞/ mL。 - 向样品中加入10μM的DCV,通过轻柔涡旋或重悬至3-5倍混匀。继续进行抑制控制。
注意:最佳结果可能取决于触发染料的滴定(例如2.5; 5; 10; 20μM),但较高的染料浓度通常会产生较高的分辨率19 。
3.抑制控制
- 将250μL含染料的细胞悬浮液转移到新的流式细胞仪/ FACS圆底管(标记为“对照”)。加入50μM维拉帕米或20μMFTC,并通过移液混匀。
注意:维拉帕米和FTC是SP分析中最完善的抑制剂,但具有不同的外排泵特异性y:维拉帕米抑制几种ABC药物转运蛋白,包括ABCB1和ABCB5,而FTC对ABCG2具有特异性6,19。如果单个样品的SP状态未知,则建议在不同的管中使用维拉帕米和FTC。
4.染色
- 盖上“测试”和“对照”管,并在37℃下在黑暗中孵育90分钟,每15分钟温和搅拌。 SP细胞中的大多数染料挤出将在头45分钟内发生,但非SP细胞中的染料积累(有助于分辨)仅在75-90分钟后才达到最大值19 。
- 染色完成后,将细胞洗涤在3-4mL冰冷的PBS中,并将沉淀物重悬于100μL的体积(PBS)中。将细胞保持在黑暗中并在冰上冷却,并进行附加标记染色。或者,直接进行流式细胞仪分析裂解。
其他标记的组合
- 向DCV染色的细胞中加入所需的荧光染料缀合的抗体组,充分混合,并在4℃下在黑暗中孵育细胞20-30分钟。在3 - 4 mL冰冷的PBS中洗涤细胞,并进行死细胞鉴别。
注意:与DCV容易兼容且几乎不需要补偿的抗体格式包括PerCP或PerCP-Cy5.5,PE-Cy7,APC,Alexa Fluor 647,APC-Cy7,APC-H7,BV711,Alexa Fluor 750和BV786 。与DCV兼容但可能需要补偿的格式包括FITC,Alexa Fluor 488,PE和BV650。与DCV实际上不兼容的格式包括BV421,V450和V500。 - 以特定制造商推荐的浓度将7-AAD(或PI)添加到DCV染色的细胞中,并在黑暗中孵育5-10分钟。通过70μm截止过滤器过滤样品,并进行流式细胞术分析。
流式细胞分析
注意:建议在染色过程中打开相应的流式细胞仪器,以便在样品准备就绪后立即进行一切设置。这还包括标准维护程序,如系统性能跟踪和油箱补充。
- 获取流式细胞仪上的细胞并将其置于双变量FSC / SSC点图上(图1B)。通过比较FSC的不同信号( 即高度,宽度,面积)来排除双重和聚合(图1C)。
- 如果已经包括死细胞标记物,则将活细胞部分( 例如 ,7-AAD阴性)门禁( 图1D )。在“蓝色”和“红色”DCV发射的双变量点图上可视化单个细胞。为此,在y轴上显示“蓝色”荧光通道( 例如 ,450/50),“红色“荧光通道( 例如 525/50)。
- 将两个通道切换到线性模式,并相应地调整检测器电压,使SP位于左下象限的图的一侧 。相反,非SP位于反映细胞周期分布(G1和G2)的图的右上象限。关闭SP并停止采集( 图1E )。
注意:DCV定义的SP细胞可以使用配备有紫激光激发源( 即 405nm激光线)的流式细胞仪检测。 SP分析的一个特点是发射的荧光以线性模式测量,并在两个单独的通道中显示在双变量点图上。 DCV的“蓝色”发射在约450nm处测量( 例如 ,使用450/40标准滤光片),并且在约510-585nm测量DCV的“红色”发射( 例如 ,使用510/50,a五25/50或585/15过滤器) 19 。由于测定的特殊化学性质,“红色”荧光通道19中 ,SP和非SP细胞之间的分离通常较高。
- 加载禁止控制并获取数据。 SP细胞已经消失或基本上减少( 图1F )。如有必要,根据这些数据细化SP门。
- 为了研究SP细胞的表面标志物表达,将DCV的“红色”荧光留在x轴上,并以对数模式( 例如 ,APC)在y轴上显示相应的荧光通道。相应地调整检测器电压,并将所研究的标记物的SP细胞的分数筛选为阳性( 图1G )。由SP细胞共同表达特定标记物在图30的左上象限中产生相应的信号。
- 记录数据和/或排序SP细胞。
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Representative Results
提供了A2780细胞的代表性SP分析,A2780细胞是先前显示存在SP占细胞的1%以下的人卵巢癌细胞9 。细胞在37℃下在补充有10%( v / v )FBS,2mM L-谷氨酰胺和1×青霉素/链霉素的RPMI 1640中培养,并以0.05%胰蛋白酶-EDTA处理,以85%融合收获。将细胞在PBS中洗涤并通过70μm截止的过滤器过滤。使用计数室和台盼蓝染色测定细胞计数,并在37℃下在黑暗中用10μMDCV染色1×10 6个细胞/ mL(新鲜培养基)90分钟。平行地,将等分试样在20μMFTC的存在下在完全相同的条件下孵育。将细胞在4mL PBS中洗涤,并以预滴定浓度将针对ABCG2的APC缀合的抗体加入到“试验”管中。孵化后在4℃下放置25分钟,将细胞在PBS中洗涤,并加入7-AAD以标记死细胞。将样品在冰上冷却并在FACS仪器上分析。所描绘的门控策略或多或少普遍适用于其他样品,即使高度异质的材料,例如来自组织标本的样品可能需要使用特定表面标记( 例如 EpCAM,CD45,CD31)预定义靶细胞部分。显示的结果旨在作为其他实验室中基于DCV的SP检测的参考。因此,研究的细胞群体的相对定位应该与其他具有独立生物样品的研究人员获得的那些大致相当,但肯定不相同。
图1:工作流程和代表性成果。 (A)使用DCV染色的SP检测的主要流程图G。附加标记的附着是可选的,但强烈建议使用死细胞鉴别。 ( BG )在FACS仪器上进行的A2780人卵巢癌细胞的代表性SP分析。细胞根据FSC / SSC特征(B)门控,通过比较FSC的不同参数( 例如 ,高度和宽度)( C )排除双峰和聚集体。此后,通过7-AAD-阴性(或PI阴性)细胞级分( D )的门控鉴别死细胞。然后,将活细胞显示在蓝色和红色DCV发射的线性双变量点图上,并且将SP(和相应的非SP)门控( E )。现在通过相应的抑制控制(在这种情况下使用FTC)进行相同的分析,这将导致SP门( F )内的细胞几乎完全消失。最后,所识别的SP可以更具特色, 例如 ,通过dete消除可能负责染料挤出的ABC药物转运蛋白,从而赋予SP表型(在这种情况下为ABCG2,符合FTC敏感性)。 ( G )。 FTC,fumitremorgin C; ALDH,醛脱氢酶。 请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
癌症临床管理进展也取决于针对CSCs的治疗方式的发展。允许从生物样品中可靠分离CSCs的方法将加速鉴定合适的靶标,因此在这项工作中至关重要。 SP分析是确定表达ABC药物转运蛋白的CSC群体的确定和有价值的技术,并且DCV的实施已经将其适用性扩展到标准流式细胞仪器。在机理上,SP鉴别利用ABC药物转运蛋白的活性染料流出来检测基于低荧光的CSC,从而在图的底部留下相应的非SP的特征定位。重要的是,基于DCV的SP检测是一种稳健且直接的方法,最关键的步骤是(i)细胞的制备(ii)染色过程(iii)选择适当的抑制itor和(iv)流式细胞术分析。因为染料挤出是一种活跃的能量消耗过程,因此开始具有良好的细胞活力特别相关;只有可行(表达药物转运蛋白)细胞可以产生SP。此外,优化染料浓度与细胞密度之间的比例通常是有意义的,从而增强SP细胞的分离(进而需要滴定DCV和细胞)。一般规则是染料浓度越高,细胞浓度越低导致分离效果越好19 。成功进行DCV实验的关键是使用ABC药物转运蛋白活性的药理学抑制剂对SP的功能验证。如前所述,维拉帕米和FTC是SP分析中最成熟的抑制剂,具有不同的泵特异性(FTC特异于ABCG2,而维拉帕米抑制多个泵)。对于SP状态未知的样品,建议使用两者抑制剂分开管。另一个选择是使用pan-ABC药物转运蛋白抑制剂利血平4 。然而,研究人员应该意识到这种化合物的自发荧光可能会干扰DCV信号19 。一旦细胞被分析蓝色和红色DCV发射,检测器电压应该被调整,使得两个群体( 即 SP和非SP)在最大分离时是可见的。如果图片看起来很奇怪,对数缩放可能是为什么(在这种情况下,将两个通道切换回线性模式)的原因。
同样重要的是注意到基于DCV的SP测定既不是癌症特异性的,也不是原来开发用于肿瘤学应用的。相反,它是特定于ABC药物转运蛋白,因此也有助于检测和分离生理(组织)干细胞,如谱系- Sca-1 + c-kit +造血干细胞25 。此外,在关键身体部位建立专门障碍的分化细胞类型也可以表现SP特征20 。因此,将基于DCV的SP检测应用于原代组织,因此需要使用合适的标记对靶细胞群进行特异性鉴别。
鉴于CSC人群9,23之间的药物外排泵的高度保存性,基于DCV的SP检测是广泛适用的,这也是其成功应用于肿瘤实体的一个事实,包括不同种质层起源的实体9,17 , 18 。其他优点包括(i)具有耐药性直接影响的细胞(特别重要的是解决临床相关的癌细胞亚群介导疾病复发(ii)检测功能性而不是静态参数可以赋予更多的测定特异性并改善分辨率19,31,32。从概念/技术方面来看,基于DCV的SP检测与抗体介导的表面染色明显不同:(i)靶结构显示细胞内定位并代表核酸而不是蛋白质。 (ii)该测定法检测蛋白质活性 ,而不仅仅是存在或密度。 (iii)靶细胞由于低荧光而不是正信号而定义。 (iv)作为DNA结合染料,DCV对于染色期间细胞或染料浓度的甚至轻微变化敏感。 (v)以线性模式测量DCV荧光,而不是对数。 (vi)DCV荧光( 即由单个荧光团产生的荧光)在两个单独的通道中测量在单个波长范围内。尽管有这些具体细节,基于DCV的SP分析易于执行,并显然扩展了用于CSC研究的流式细胞仪工具箱。
基于DCV的SP分析还为其他标记物提供了许多可能性,与常规抗体介导的表面染色(可能的许多格式)兼容,并且检测ALDH酶活性的商业测定。然而,我们这里专注于表面染色,读者参考已发表的文献4 ,以查看ALDH活性的代码检索方法学细节。在任何情况下,DCV触发的SP分析应与死细胞鉴别相结合,为此目的,明显的试剂是7-AAD和PI。
值得注意的是,DCV定义的SP细胞(和非SP对照细胞)可以使用相应的流式细胞术仪器的分选应用进行活体纯化。因为SP测定检测到功能性pa通常只有活细胞才能产生,所以恢复的SP细胞的活力一般可以很高(有时约为100%)。如果仍然存在排序后的可行性问题,可以检查不同的技术参数,例如分拣机喷嘴的尺寸,缓冲剂的性质和排序过程中的温度(使用70μm喷嘴,我们从未有过问题可行性,但更大的喷嘴仍然可以帮助非常细腻的细胞)。回收的细胞可以进行下游分析,例如qRT-PCR,Western印迹和全局表达谱( 例如 ,使用基因阵列或更近期的RNASeq技术)。此外,可以研究分离的SP细胞的功能性干细胞特征( 例如 ,单细胞克隆形成和连续移植),或进行亚培养以建立可能在9个月内稳定的富集或甚至纯的SP细胞的细胞系。在我们的研究中,我们使用普通的中等和常规2D塑料烧瓶来对DCV定义的CSCs进行亚培养9 ,但干细胞选择性模式如锚定依赖性/ 3D培养条件和特殊培养基也是可行的。我们建议给予SP隔室的体外扩张最有利的条件需要单独检查。
总之,我们在这里描述了通过基于DCV的SP分析的CSC识别/隔离的详细实验工作流程。本文将协助CSC研究人员在自己的实验室中实施和建立有效的方法,进一步促进治疗性抗CSC策略的阐明,以改善癌症临床治疗。
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Disclosures
作者宣称没有利益冲突。还没有非作者参与手稿的准备工作。
Acknowledgments
Maximilian Boesch由奥地利科学基金会FWF(授权号J-3807)的ErwinSchrödinger奖学金支持。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Vybrant DyeCycle Violet | Thermo Fisher Scientific | V35003 | Ready to use |
Verapamil hydrochloride | Sigma-Aldrich | V4629 | Dissolve in ethanol |
Fumitremorgin C | Sigma-Aldrich | F9054 | Dissolve in DMSO |
7-AAD (or propidium iodide - PI) | BioLegend | 420403 | Ready to use |
Standard cell culture reagents (e.g., medium, FBS, L-glutamine, antibiotics, PBS, trypsin-EDTA, etc.) | Different suppliers | ||
Sample/cells of interest (e.g., human or murine cancer cell line, human or murine tumor tissue) | Different suppliers | ||
Flow cytometric instrument (FACS; analyzer or cell sorter) | Different suppliers | Violet laser source required | |
FACS tubes (round-bottom) | Different suppliers | Tubes with cap recommended | |
70 µm cut-off strainers | Different suppliers | Optional but recommended | |
Digestion enzyme mix (e.g., collagenase/dispase/Dnase) | Different suppliers | Only relevant for tissue dissociation | |
Flurochrome-conjugated antibodies against surface markers of interest | Different suppliers | Optional | |
ALDEFLUOR Kit | STEMCELL Technologies | 01700 | Optional |
References
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