Summary
Les méthodes permettant la caractérisation et l'isolement des populations de cellules souches à partir d'échantillons biologiques sont essentielles pour l'avancement des traitements ciblés par les cellules souches dans le cancer et au-delà. Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour l'isolement des cellules souches du cancer en utilisant le phénotype de la population latérale déclenchée par le colorant.
Abstract
Le cancer est une maladie à base de cellules souches et l'éradication de ces cellules est devenue un objectif thérapeutique majeur. La déchiffrement des vulnérabilités des cellules souches cancéreuses (CSC) et l'identification de cibles moléculaires appropriées reposent sur des méthodes permettant leur discrimination spécifique dans des échantillons hétérogènes tels que les lignées cellulaires et le tissu tumoral ex vivo . La cytométrie de flux / FACS est une technologie puissante pour disséquer de manière paramétrique des échantillons biologiques au niveau de la cellule unique et date de la méthode de choix pour récupérer les cellules vivantes pour les analyses en aval. Les marqueurs de surface tels que CD44 et CD133 ainsi que la détection de l'activité enzymatique de l'aldéhyde déshydrogénase ont souvent été utilisés pour définir et trier les CSC à partir d'échantillons de tumeurs par FACS. Une approche complémentaire, illustrée ici en détail méthodologique, utilise l'extrusion fonctionnelle de colorant par les transporteurs de médicaments ABC, qui identifie une population distincte de cellules fluorescentes-dim communément appelées population latérale (SP). SP; Les cellules cancéreuses présentent des caractéristiques canoniques de cellules souches et peuvent être abrogées et confirmées fonctionnellement en utilisant des agents qui inhibent le transporteur de médicament extrudant de colorant (le plus souvent ABCB1 / P-glycoprotein / MDR1 / CD243 et ABCG2 / Bcrp1 / CD338). En outre, le test SP est compatible avec d'autres évaluations cytométriques en flux telles que la coloration des antigènes de surface, la détection des aldéhydes déshydrogénases et la discrimination des cellules mortes ( p. Ex . Avec 7-AAD ou iodure de propidium (PI)). Ainsi, nous décrivons une méthode valable et largement applicable pour l'identification, l'isolement et la sous-caractérisation CSC mécaniquement basée sur un paramètre fonctionnel, plutôt que phénotypique. Bien que, initialement, exécuté avec Hoechst 33342 en tant que colorant déclencheur, nous nous concentrons ici sur le phénotype SP Violet à base de colorant plus récent qui résolue sur tout cytomètre de flux équipé d'une source laser violette.
Introduction
L'efficacité des thérapies primaires contre le cancer s'est considérablement améliorée au cours de la dernière décennie en raison de progrès convaincants dans la compréhension génétique et moléculaire de la maladie et l'avènement de médicaments ciblés tels que les anticorps thérapeutiques et les inhibiteurs de petites molécules. En revanche, la maladie métastatique et récurrente est encore généralement incurable et la morbidité et la mortalité restent élevées dans ces milieux cliniques. Les CSC représentent une sous-population distincte dans les tumeurs et sont dotés de propriétés canoniques de cellules souches telles que la clonogénicité / tumorigénicité, la résistance aux médicaments multiples et la division cellulaire asymétrique 1 , 2 . Ainsi, les CSC non seulement entraînent une progression métastatique et une hétérogénéité des tumeurs, mais persistent également pendant le traitement pour prédisposer le patient à la rechute. L'élimination thérapeutique du SCC est donc un besoin médical important pour prévenir la récidive de la maladie et permettre un traitement à long terme du cancer 3
L'identification des vulnérabilités et l'élucidation des stratégies pour éradiquer les CSC dépend fortement des méthodes qui permettent leur purification à partir d'échantillons biologiques pour le profilage d'expression et / ou l'investigation fonctionnelle subséquente. À leur tour, de telles méthodes reposent sur des marqueurs de surface, intracellulaires ou fonctionnels spécifiques à ces cellules. Les marqueurs de surface spécifiques au CSC incluent, mais sans s'y limiter, CD44, CD133, CD24 et CD90, et ont été utilisés pour identifier les populations de CSC dans une variété d'entités tumorales, y compris le cancer du sein et le cancer du côlon 4 . Un autre marqueur, l'aldéhyde déshydrogénase (ALDH), montre une localisation intracellulaire et peut être détecté fonctionnellement en fournissant un substrat respectif dont la conversion enzymatique produit de la lumière. En utilisant ce test, les populations du SCC ont également été identifiées dans diverses entités tumorales 5 . Une méthode complémentaire, communément appelée analyse SP et représentée ici en m Détail éthodologique, exploite l'efflux de colorant actif par les transporteurs de médicaments ABC pour identifier de petites populations de cellules fluorescentes de type tige faible 6 , 7 , 8 . Pour ce faire, un échantillon donné est incubé en présence d'un fluorophore lipophile qui lient de l'ADN qui pénètre dans toutes les cellules par diffusion passive et cible l'ADN nucléaire et mitochondrial pour la liaison. Les CSC non-dépourvus d'expression du transporteur de drogue ABC accumulent le colorant, ce qui entraîne une fluorescence brillante, tandis que les CSC extrudent activement le colorant qui réduit la fluorescence. L'inhibition pharmacologique de l'activité du transporteur de médicament abroge et confirme fonctionnellement le phénotype SP et doit être utilisée à des fins de contrôle. Les populations du CSC présentant des caractéristiques SP ont été révélées, entre autres, dans le cancer de l'ovaire 9 , 10 , le cancer de la prostate 11 ,> 12, cancer du sein 13 , cancer du poumon 14 , cancer de l'endomètre 15 , gliome 16 , 17 et sarcome de l'os 18 . Il est important de noter que le dosage SP est compatible avec les lignées cellulaires cancéreuses et les tissus tumoraux primaires, même si le matériau primaire pose des défis supplémentaires tels que l'exigence d'une stratégie spécifique de discrimination de cellules tumorales (certaines populations de cellules hôtes peuvent également présenter des caractéristiques de SP) 19 , 20 .
Les deux transporteurs de médicaments les plus reconnus sont les ABCB1 / P-glycoprotein / MDR1 / CD243 et ABCG2 / Bcrp1 / CD338 8 , 9 , 21 ; Cependant, d'autres transporteurs de médicaments peuvent également être un déterminant moléculaire du phénotype SP ( p. Ex . ABCB5) 22 . ABCB1Peut être bloqué efficacement avec le verapamil, alors que l'activité de l'ABCG2 peut être abrogée spécifiquement avec la fumétémorgin C (FTC) 6 , 19 . Une force particulière de l'analyse SP est qu'elle peut être combinée avec d'autres taches ( p. Ex. , Marqueurs de surface et ALDH) et qu'elle permet une récupération de cellules vivantes ainsi compatible avec les recherches fonctionnelles en aval. De plus, la détection de SP est largement applicable en raison de la grande conservation des transporteurs de médicaments ABC parmi les populations du SCC 9,23.
À l'origine, la détection de SP a été effectuée en utilisant le Hoechst 33342 comme colorant de déclenchement 24 . Ce colorant atteint une excellente résolution mais nécessite une excitation laser ultraviolet; De sorte que son applicabilité est naturellement limitée aux instruments cytométriques de flux haut de gamme. L'avènement de DyeCycle Violet (DCV) 25 a ouvert une nouvelle avenueEs pour l'analyse SP et a étendu l'applicabilité de cette méthode aux instruments cytométriques à flux standard dépourvus d'une source laser ultraviolette (une source laser violette suffit pour résoudre les cellules DCV-SP). Fait important, Hoechst 33342 et DCV partagent des spécificités communes de la pompe, indiquant que l'un ou l'autre colorant devrait identifier les mêmes populations de cellules.
Ici, nous fournissons un protocole expérimental détaillé de l'analyse SP à base de DCV pour une reproduction rapide et facile dans les laboratoires indépendants. Nous percevons donc notre article comme une ressource pour les chercheurs du SCC qui devrait contribuer à l'optimisation et à la normalisation de cette méthode biologique cellulaire utile.
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Protocol
Ce protocole est en pleine conformité avec les lignes directrices de la Commission d'examen éthique institutionnel. Si les tissus humains ou animaux sont étudiés en utilisant le protocole décrit ici, les chercheurs sont obligés d'obtenir l'approbation du comité d'examen pertinent de leur établissement ou de leur pays.
Attention: Les précautions standard pour la manipulation sécuritaire des échantillons biologiques s'appliquent à ce protocole. Cela comprend le port de gants et une blouse de laboratoire, et l'exécution du travail dans un coffret de sécurité biologique dans la mesure du possible.
1. Préparation des cellules
- Lignes cellulaires cancéreuses
- Culturez une lignée cellulaire cancéreuse humaine ou murine respective à 37 ° C dans 10 à 30 ml de milieu approprié ( p. Ex. , RPMI 1640 additionné de 10% ( v / v ) de FBS, 2 mM de L-glutamine et 1x pénicilline / streptomycine) et de récolte Les cellules à la sous-confluence ( c.-à-d. 70-90%) en utilisant une digestion avec 0,05% de trypsine-EDTA ou un autre de-attProcédure d'entraide. Déterminer le nombre de cellules et vérifier la viabilité en utilisant une chambre de comptage et une coloration au bleu trypan. La fraction de cellules viables devrait dépasser 85%.
NOTE: Des exemples de lignées cellulaires cancéreuses humaines hébergeant des compartiments SP incluent MCF7 / HTB-22 et SKBR3 / HTB-30 (cancer du sein), A2780 et SKOV-3 / HTB-77 (cancer des ovaires) et A549 (cancer du poumon) 26 .
- Culturez une lignée cellulaire cancéreuse humaine ou murine respective à 37 ° C dans 10 à 30 ml de milieu approprié ( p. Ex. , RPMI 1640 additionné de 10% ( v / v ) de FBS, 2 mM de L-glutamine et 1x pénicilline / streptomycine) et de récolte Les cellules à la sous-confluence ( c.-à-d. 70-90%) en utilisant une digestion avec 0,05% de trypsine-EDTA ou un autre de-attProcédure d'entraide. Déterminer le nombre de cellules et vérifier la viabilité en utilisant une chambre de comptage et une coloration au bleu trypan. La fraction de cellules viables devrait dépasser 85%.
- Tumeur tumorale ex vivo
- Prenez un nouvel échantillon de tumeur chirurgicale ou, en variante, récoltez un tissu tumoral à partir d'un modèle de tumeur de souris transplantable ou génétiquement modifiée. Prendre 200-1 000 mg de tissu et générer une seule suspension de cellules par désagrégation mécanique ( p. Ex. , En utilisant des ciseaux ou un scalpel) et une digestion enzymatique ( par exemple , en utilisant un cocktail de collagénase / dispase / DNase).
- Filtrer l'échantillon à travers un filtre de coupe de 70 μm. Déterminer le nombre de cellules et vérifier la viabilité en utilisant une chambre de comptage et trypan blUe coloration.
NOTE: Les cocktails de digestion contiennent fréquemment 200 μg / mL de colagénase P, 0,8 U / mL de dispase et 25 μg / mL de DNase I, et les temps d'incubation varient habituellement de 20 à 50 min. Idéalement, la désagrégation des tissus est réalisée selon un protocole optimisé pour le tissu sous enquête 27 , 28 , 29 .
2. Échantillons de test
- Ajuster la concentration cellulaire à 1 x 10 6 cellules / mL dans un milieu de culture frais (un véhicule contenant des nutriments est important car l'extrusion de colorant est un processus actif consommant de l'énergie). Enfin, transférez 1 mL d'échantillon dans un tube à fond rond de cytométrie à flux ordinaire / FACS (étiqueté «test»).
REMARQUE: Pour des résultats optimaux, il peut être nécessaire que la concentration cellulaire soit titrée (par exemple, 5 x 10 5 -1 x 10 6 -2,5 x 10 6 cellules / mL), mais une concentration cellulaire inférieureCède une résolution plus élevée 19 . Seulement pour le tri des applications où un nombre maximum de cellules SP doit être récupéré, il est recommandé d'augmenter la concentration de cellules jusqu'à 1 x 10 7 cellules / mL. - Ajouter 10 μM de DCV à l'échantillon et bien mélanger, soit par vortex ou rembourrage doux pendant 3-5x. Procéder aux contrôles d'inhibition.
NOTE: Les résultats optimaux peuvent dépendre du titrage du colorant déclencheur (par exemple 2.5; 5; 10; 20 μM), mais une concentration de colorant plus élevée donne généralement une résolution plus élevée 19 .
3. Contrôle de l'inhibition
- Transférer 250 μL de la suspension de cellules contenant du colorant vers une nouvelle cytométrie de flux / tube à fond rond FACS (appelé «contrôle»). Ajouter 50 μM de verapamil ou 20 μM de FTC et bien mélanger par pipettage.
REMARQUE: le Verapamil et le FTC sont les inhibiteurs les mieux établis pour l'analyse SP mais ont une spécificité de pompe à effluent différenteY: le Verapamil inhibe plusieurs transporteurs de médicaments ABC dont ABCB1 et ABCB5, alors que le FTC est spécifique à ABCG2 6 , 19 . Si l'état SP d'un échantillon individuel est inconnu, il est donc recommandé d'utiliser à la fois le verapamil et le FTC dans des tubes séparés.
4. Coloration
- Capuchons les tubes "test" et "contrôle" et les incuber à 37 ° C dans l'obscurité pendant 90 min, avec une agitation douce toutes les 15 min. La majeure partie de l'extrusion de colorant dans les cellules SP se produira dans les premières 45 minutes, mais l'accumulation de colorant dans les cellules non SP (contribuant à la résolution) n'est que maximale après 75-90 min 19 .
- Une fois la coloration terminée, laver les cellules dans 3-4 mL de PBS glacé et ré-endiguer la pastille dans un volume de 100 μL (PBS). Gardez les cellules dans l'obscurité et refroidissez sur de la glace, et procéder à la coloration des marqueurs supplémentaires. Alternativement, effectuez directement des analyses cytténiques de fluxLyse.
5. Coûts pour d'autres marqueurs
- Ajouter un panel désiré d'anticorps conjugués au fluorochrome aux cellules colorées au DCV, bien mélanger et incuber les cellules à 4 ° C dans l'obscurité pendant 20 à 30 minutes. Lavez les cellules dans 3 à 4 ml de PBS glacé et passez à la discrimination des cellules mortes.
REMARQUE: les formats d'anticorps qui sont facilement compatibles avec DCV et pratiquement ne nécessitent pas de compensation incluent PerCP ou PerCP-Cy5.5, PE-Cy7, APC, Alexa Fluor 647, APC-Cy7, APC-H7, BV711, Alexa Fluor 750 et BV786 . Les formats compatibles avec DCV mais nécessitant une compensation incluent FITC, Alexa Fluor 488, PE et BV650. Les formats qui ne sont pratiquement pas compatibles avec DCV incluent BV421, V450 et V500. - Ajouter 7-AAD (ou PI) aux cellules colorées au DCV à la concentration recommandée par le fabricant en particulier et incuber les échantillons pendant 5 à 10 minutes dans l'obscurité. Filtrer les échantillons à travers des filtres de coupure de 70 μm et procéder à une analyse cytométrique en flux.
6. Analyse cytométrique de flux
REMARQUE: Il est recommandé d'allumer l'instrument de cytométrie de flux respectif pendant le processus de coloration déjà afin que tout soit réglé dès que les échantillons sont prêts. Cela inclut également les procédures de maintenance standard telles que le suivi des performances du système et le remplissage des citernes.
- Acquérir les cellules sur le cytomètre de flux et les placer sur un diagramme de points FSC / SSC bivarié (Figure 1B). Excluez les doublets et les agrégats en comparant les différents signaux de FSC ( c.-à-d. Hauteur, largeur, zone) (figure 1C).
- Si un marqueur de cellule morte a été inclus, portez sur la fraction de cellule viable ( par exemple , 7-AAD-négatif) ( Figure 1D ). Visualisez les cellules singulet viables sur un diagramme de points bivarié pour les émissions de DCV «bleu» et «rouge». À cette fin, affichez le canal de fluorescence "bleu" sur l'axe des y ( par exemple , 450/50) et le 'Canal de fluorescence rouge 'sur l'axe des abscisses ( p . Ex. 525/50).
- Commutez les deux canaux en mode linéaire et ajustez les tensions du détecteur de manière correspondante afin que le SP se situe sur le côté de l'intrigue dans le quadrant inférieur gauche. À l'inverse, le non-SP localise le quadrant supérieur droit de la parcelle reflétant la distribution du cycle cellulaire (G1 et G2). Garez le SP et arrêtez l'acquisition ( Figure 1E ).
REMARQUE: les cellules SP définies par DCV peuvent être détectées à l'aide d'instruments cytométriques en flux équipés d'une source d'excitation laser violette ( c'est-à-dire d' une ligne laser 405 nm). Il s'agit d'une analyse spécifique de SP que la fluorescence émise est mesurée en mode linéaire et dans deux canaux séparés affichés sur un diagramme de points bivarié. L'émission "bleu" de DCV est mesurée à environ 450 nm ( par exemple , avec un filtre standard 450/40) et l'émission "rouge" de DCV est mesurée à environ 510-555 nm ( par exemple , avec un 510/50, a 525/50 ou un filtre 585/15) 19 . En raison de la chimie particulière du dosage, la séparation entre les cellules SP et non SP est généralement plus élevée dans le canal de fluorescence "rouge" 19 .
- Chargez le (s) contrôle (s) d'inhibition et obtenez les données. Les cellules SP ont maintenant disparu ou sont considérablement réduites ( figure 1F ). Si nécessaire, affiner la porte SP en fonction de ces données.
- Pour étudier l'expression du marqueur de surface par les cellules SP, laisser la fluorescence "rouge" de DCV sur l'axe des abscisses et afficher un canal de fluorescence respectif sur l'axe des y en mode logarithmique ( p. Ex . APC). Régler les tensions du détecteur de manière correspondante et laisser tomber la fraction de cellules SP positif pour le (s) marqueur (s) étudié (s) ( Figure 1G ). La co-expression d'un marqueur particulier par des cellules SP donne un signal respectif dans le quadrant supérieur gauche de l'intrigue 30 .
- Enregistrez leDes données et / ou trier les cellules SP.
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Representative Results
L'invention concerne une analyse SP représentative des cellules A2780, une lignée cellulaire de cancer de l'ovaire humaine précédemment présentée pour abriter un SP représentant moins de 1% des cellules 9 . Les cellules ont été cultivées à 37 ° C dans du RPMI 1640 supplémenté avec 10% ( v / v ) de FBS, 2 mM de L-glutamine et 1x pénicilline / streptomycine et récolté à 85% de confluence en utilisant un traitement avec 0,05% de trypsine-EDTA. Les cellules ont été lavées dans du PBS et filtrées sur des filtres de coupure de 70 μm. Le nombre de cellules a été déterminé à l'aide d'une chambre de comptage et une coloration au bleu trypan et 1 x 10 6 cellules / mL (milieu frais) ont été colorées avec DCV 10 uM pendant 90 minutes à 37 ° C dans l'obscurité. En parallèle, une partie de celui-ci a été incubée en présence de FTC 20 uM dans les mêmes conditions. Les cellules ont été lavées dans 4 mL de PBS et un anticorps conjugué APC contre ABCG2 a été ajouté au tube "test" à une concentration pré-titrée. Après incubationPendant 25 min à 4 ° C, les cellules ont été lavées dans du PBS et du 7-AAD a été ajouté pour étiqueter des cellules mortes. Les échantillons ont été refroidis sur glace et analysés sur un instrument FACS. La stratégie de verrouillage représentée est plus ou moins universellement applicable à d'autres échantillons, bien que des matériaux hautement hétérogènes tels que des échantillons provenant d'échantillons de tissus puissent nécessiter une pré-définition de la fraction de cellule cible en utilisant des marqueurs de surface spécifiques ( p. Ex. , EpCAM, CD45, CD31). Les résultats présentés sont destinés à servir de référence pour la détection de SP à base de DCV dans d'autres laboratoires. Par conséquent, les localisations relatives des populations de cellules étudiées devraient être approximativement comparables, mais sûrement pas identiques, à celles obtenues par d'autres chercheurs avec des échantillons biologiques indépendants.
Figure 1: flux de travail et résultats représentatifs. (A) Diagramme principal pour la détection de SP à l'aide de DCV staining. La prudence pour les marqueurs supplémentaires est facultative, mais la discrimination des cellules mortes est fortement recommandée. ( BG ) Analyse SP représentative des cellules de cancer de l'ovaire humain A2780 réalisées sur un instrument FACS. Les cellules sont fermées selon les caractéristiques FSC / SSC (B) et les doublets et les agrégats sont exclus en comparant les différents paramètres du FSC ( p. Ex . Hauteur et largeur) ( C ). Par la suite, les cellules mortes sont discriminées par gating sur la fraction cellulaire 7-AAD-négative (ou PI-négative) ( D ). Les cellules individuelles en direct sont ensuite affichées sur un diagramme de points bivarié linéaire pour l'émission DCV bleue et rouge et le SP (et le non-SP correspondant) est gated ( E ). La même analyse est maintenant effectuée avec un contrôle d'inhibition respectif (dans ce cas, FTC a été utilisé), ce qui devrait conduire à une disparition presque complète des cellules dans la porte SP ( F ). Enfin, le SP identifié peut être plus étroitement caractérisé, par exemple , par deteRanger le (s) transporteur (s) de médicaments ABC qui pourrait être responsable de l'extrusion de colorant, ce qui confère le phénotype SP (dans ce cas ABCG2, en ligne avec la sensibilité FTC). ( G ). FTC, fumitremorgin C; ALDH, aldéhyde déshydrogénase. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Les progrès dans la gestion clinique du cancer dépendent également du développement de modalités de traitement ciblant les CSC. Les méthodes permettant l'isolement fiable des CSC à partir d'échantillons biologiques accéléreront l'identification des cibles appropriées et sont donc d'une importance cruciale dans cette entreprise. L'analyse SP est une technique établie et précieuse pour identifier les populations du SCC qui expriment les transporteurs de médicaments ABC et la mise en œuvre de DCV a étendu son applicabilité aux instruments cytométriques à flux standard. Sur le plan mécanique, la discrimination par le SP exploite l'efflux de colorant actif par les transporteurs de médicaments ABC pour détecter les CSC basés sur une faible fluorescence impliquant une localisation caractéristique sur le côté inférieur de la parcelle à gauche vers le SP non correspondant. Il est important de noter que la détection de SP basée sur DCV est une méthode robuste et directe, les étapes les plus critiques étant (i) la préparation des cellules (ii) le processus de coloration (iii) la sélection d'une inhibition appropriéeItor et (iv) l'analyse cytométrique en flux. Parce que l'extrusion de colorant est un processus actif consommant de l'énergie, il est particulièrement important de commencer par une bonne viabilité cellulaire; Seules les cellules viables (exprimant le transporteur de médicaments) peuvent produire un SP. En outre, il est souvent logique d'optimiser le rapport entre la concentration de colorant et la densité cellulaire et ainsi améliorer la séparation des cellules SP (ce qui nécessite un titrage à la fois de DCV et de cellules). Une règle générale est que à la fois une concentration de colorant plus élevée et une concentration de cellule inférieure entraînent une séparation améliorée 19 . La clé de l'expérience réussie de DCV est la validation fonctionnelle du SP à l'aide d'inhibiteurs pharmacologiques de l'activité de transporteur de médicaments ABC. Comme indiqué précédemment, le verapamil et la FTC sont parmi les inhibiteurs les plus établis pour l'analyse SP et ont des spécificités de pompe différentes (la FTC est spécifique pour ABCG2, alors que le verapamil inhibe plusieurs pompes). Pour les échantillons présentant un état SP inconnu, il est donc recommandé d'utiliser les deuxInhibiteurs dans des tubes séparés. Une autre option est l'utilisation de l'inhibiteur de transport de médicaments pan-ABC réserpine 4 . Cependant, les chercheurs doivent savoir que l'autofluorescence de ce composé peut entraver le signal DCV 19 . Une fois que les cellules sont analysées pour l'émission DCV bleue et rouge, les tensions du détecteur doivent être ajustées de sorte que les deux populations ( c'est-à-dire SP et non-SP) soient visibles avec une séparation maximale. Si l'image semble étrange, la mise à l'échelle logarithmique peut être la raison pour laquelle (dans ce cas, remplacez les deux canaux en mode linéaire).
Il est également important de noter que le test SP basé sur DCV n'est ni spécifique pour le cancer, ni développé à l'origine pour une application en oncologie. Au lieu de cela, il est spécifique pour les transporteurs de médicaments ABC et facilite ainsi la détection et l'isolement des cellules souches physiologiques (tissus), comme la lignée - Sca-1 + c-kit +Cellules souches hématopoïétiques 25 . En outre, les types de cellules différenciées établissant des barrières dédiées dans des sites de corps cruciaux peuvent également présenter des caractéristiques SP 20 . L'application de la détection SP de DCV aux tissus primaires nécessite donc une discrimination spécifique de la population de cellules cibles en utilisant des marqueurs appropriés.
Compte tenu de la haute conservation des pompes d'efflux de médicaments parmi les populations du SCC 9 , 23 , la détection de SP à base de DCV est largement applicable, ce qui est également illustré par son utilisation réussie à travers des entités tumorales, y compris des entités d'origine différente de la couche germinale 9 , 17 , 18 . D'autres avantages comprennent que (i) les cellules ayant des implications directes dans la résistance aux médicaments sont identifiées (particulièrement important pour la lutte contre les subdivisions de cellules cancéreuses cliniquement pertinentes, la médiation de la maladie se reproduitRence) et que (ii) la détection d'un paramètre fonctionnel, plutôt que statique, pourrait conférer plus de spécificité au dosage et améliorer la résolution 19 , 31 , 32 . Du côté conceptuel / technologique, la détection de SP à base de DCV est clairement distincte des colorants de surface médiés par des anticorps: (i) La structure cible montre la localisation intracellulaire et représente l'acide nucléique et non la protéine. (Ii) L'analyse détecte l' activité des protéines , et non la simple présence ou la densité. (Iii) Les cellules cibles sont définies en vertu d'une faible fluorescence, et non d'un signal positif. (Iv) En tant que colorant liant l'ADN, le DCV est sensible à même de légères variations dans la concentration de la cellule ou du colorant pendant la coloration 19 . (V) La fluorescence DCV est mesurée en mode linéaire, non logarithmiquement. (Vi) la fluorescence DCV ( c'est-à-dire la fluorescence générée par un seul fluorophore) est mesurée dans deux canaux distincts, nOt dans une gamme de longueur d'onde unique. En dépit de ces spécificités, l'analyse SP à base de DCV est facile à réaliser et, évidemment, étend la boîte à outils cytométrique en flux pour la recherche CSC.
L'analyse SP à base de DCV offre également de nombreuses possibilités de compatibilité avec d'autres marqueurs, compatibles avec les colorants traditionnels à médiation par anticorps (de nombreux formats possibles) et le test commercial détectant l'activité enzymatique ALDH. Cependant, nous nous sommes concentrés sur la coloration de la surface et le lecteur se réfère à la littérature publiée 4 pour voir les détails méthodologiques sur la codétisation de l'activité ALDH. Dans tous les cas, l'analyse SP déclenchée par DCV devrait être combinée avec une discrimination de cellules mortes et les réactifs évidents à cet effet sont 7-AAD et PI.
Il est à noter que les cellules SP définies par DCV (et les cellules témoins non SP) peuvent être purifiées en direct à l'aide de l'application de tri des instruments cytométriques à flux correspondants. Parce que le test SP détecte un pa fonctionnelQue les cellules viables ne peuvent produire que la viabilité des cellules SP récupérées peut généralement être élevée (parfois approximativement à 100%). S'il y a également des problèmes de viabilité post-triés, des paramètres techniques différents peuvent être vérifiés tels que la taille de la buse de tri, la nature de l'agent tampon et la température pendant le tri (en utilisant une buse de 70 μm dont nous n'avons jamais eu de problèmes Viabilité, mais une buse plus grande pourrait encore aider à des cellules très délicates). Les cellules récupérées peuvent être soumises à des analyses en aval telles que qRT-PCR, Western Blot et profil global d'expression ( p. Ex. , En utilisant un tableau de gènes ou la technologie RNASeq plus récente). En outre, des cellules SP isolées peuvent être étudiées pour des caractéristiques fonctionnelles des cellules souches ( p. Ex. , Une clonogénicité à une seule cellule et une transplantation en série), ou sous-cultivées pour établir des lignées cellulaires de cellules SP enrichies ou même pures qui pourraient être stables pendant des mois 9 . Dans notreÉtudions, nous avons utilisé des flacons en plastique 2D moyens et conventionnels à des CSC définis par DCV sous-culturels 9 , mais des modalités sélectives de cellules souches telles que des conditions de culture indépendantes de l'ancrage / 3D et des médias spécialisés seront également réalisables. Nous proposons que les conditions les plus favorables pour l' expansion in vitro d'un compartiment SP donné devront être vérifiées individuellement.
En résumé, nous décrivons ici le flux de travail expérimental détaillé de l'identification / isolement CSC au moyen d'une analyse SP à base de DCV. Notre document devrait aider les chercheurs du SCC à mettre en œuvre et à établir cette méthode utile dans leurs propres laboratoires, ce qui devrait favoriser l'élucidation des stratégies thérapeutiques anti-CSC pour améliorer la gestion clinique du cancer.
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Disclosures
Les auteurs n'ont aucun conflit d'intérêt à déclarer. Il n'y a pas non plus d'implication non-auteur dans la préparation du manuscrit.
Acknowledgments
Maximilian Boesch est soutenu par une bourse Erwin Schrödinger du FWF FTSA (numéro de délivrance J-3807).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vybrant DyeCycle Violet | Thermo Fisher Scientific | V35003 | Ready to use |
| Verapamil hydrochloride | Sigma-Aldrich | V4629 | Dissolve in ethanol |
| Fumitremorgin C | Sigma-Aldrich | F9054 | Dissolve in DMSO |
| 7-AAD (or propidium iodide - PI) | BioLegend | 420403 | Ready to use |
| Standard cell culture reagents (e.g., medium, FBS, L-glutamine, antibiotics, PBS, trypsin-EDTA, etc.) | Different suppliers | ||
| Sample/cells of interest (e.g., human or murine cancer cell line, human or murine tumor tissue) | Different suppliers | ||
| Flow cytometric instrument (FACS; analyzer or cell sorter) | Different suppliers | Violet laser source required | |
| FACS tubes (round-bottom) | Different suppliers | Tubes with cap recommended | |
| 70 µm cut-off strainers | Different suppliers | Optional but recommended | |
| Digestion enzyme mix (e.g., collagenase/dispase/Dnase) | Different suppliers | Only relevant for tissue dissociation | |
| Flurochrome-conjugated antibodies against surface markers of interest | Different suppliers | Optional | |
| ALDEFLUOR Kit | STEMCELL Technologies | 01700 | Optional |
References
- Pattabiraman, D. R., Weinberg, R. A. Tackling the cancer stem cells - what challenges do they pose? Nat Rev Drug Discov. 13 (7), 497-512 (2014).
- Boesch, M., et al. Heterogeneity of Cancer Stem Cells: Rationale for Targeting the Stem Cell Niche. Biochim Biophys Acta. 1866 (2), 276-289 (2016).
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