Summary
Методы, позволяющие характеризовать и изолировать популяции стволовых клеток из биологических образцов, имеют решающее значение для продвижения направленного на стволовые клетки лечения рака и других заболеваний. Здесь мы предоставляем подробный протокол для изоляции раковых стволовых клеток, используя фенотип побочной популяции, вызванный красителем.
Abstract
Рак - это заболевание, вызванное стволовыми клетками, и ликвидация этих клеток стала основной терапевтической целью. Расшифровка уязвимостей раковых стволовых клеток (CSC) и определение подходящих молекулярных мишеней основывается на методах, которые позволяют их специфическую дискриминацию в гетерогенных образцах, таких как клеточные линии и ex vivo опухолевые ткани. Проточная цитометрия / FACS - это мощная технология для многопараметрического рассечения биологических образцов на уровне отдельных клеток и на сегодняшний день является методом выбора для восстановления живых клеток для последующего анализа. Маркеры поверхности, такие как CD44 и CD133, а также определение ферментативной активности альдегиддегидрогеназы часто использовались для определения и сортировки CSCs из образцов опухолей с помощью FACS. Дополнительный подход, описанный здесь в методологических деталях, использует функциональную экструзию красителя транспортерами АВС-лекарств, которая идентифицирует отличную популяцию флуоресцентно-тусклых клеток, обычно называемую боковой популяцией (SP). SPРаковые клетки проявляют канонические характеристики стволовых клеток и могут быть аннулированы и функционально подтверждены с использованием агентов, которые ингибируют экструдирующий краситель экстракт транспортера (чаще всего ABCB1 / P-гликопротеин / MDR1 / CD243 и ABCG2 / Bcrp1 / CD338). Кроме того, SP-анализ совместим с другими проточно-цитометрическими оценками, такими как окрашивание поверхностных антигенов, детекция альдегиддегидрогеназы и различение мертвых клеток ( например , с 7-AAD или иодидом пропидия (PI)). Таким образом, мы описываем ценный и широко применимый метод для идентификации, изоляции и подхарактеристики CSC, механически основанный на функциональном, а не фенотипическом параметре. Несмотря на то, что первоначально Hoechst 33342 был первоначально использован в качестве триггерного красителя, здесь мы сосредоточимся на более позднем фенотипе SP, основанном на фиолетовом красителе, который может быть разрешен на любом проточном цитометре, оснащенном источником фиолетового лазера.
Introduction
Эффективность первичной онкологической терапии значительно улучшилась за последнее десятилетие благодаря убедительным достижениям в генетическом и молекулярном понимании заболевания и появлению целевых лекарств, таких как терапевтические антитела и ингибиторы малых молекул. Напротив, метастатическая и рецидивирующая заболеваемость по-прежнему обычно неизлечима, а заболеваемость и смертность остаются высокими в этих клинических условиях. CSC представляют четкую субпопуляцию в опухолях и наделены каноническими свойствами стволовых клеток, такими как клоногенность / туморогенность, множественная лекарственная устойчивость и ассиметричное деление клеток 1 , 2 . Таким образом, CSC не только приводят к метастатическому прогрессированию и гетерогенности опухолей, но также сохраняются во время лечения, чтобы предрасположить пациента к рецидиву. Таким образом, терапевтическое удаление CSC является важной медицинской необходимостью для предотвращения рецидива заболевания и долгосрочного лечения рака 3
Идентификация уязвимостей и выяснение стратегий по искоренению CSC сильно зависит от методов, которые позволяют их очищать от биологических образцов для последующего профилирования экспрессии и / или функционального исследования. В свою очередь, такие методы опираются на поверхностные, внутриклеточные или функциональные маркеры, которые являются специфическими для этих клеток. CSC-специфичные поверхностные маркеры включают, но не ограничиваются ими, CD44, CD133, CD24 и CD90 и использовались для идентификации популяций CSC в различных опухолевых образованиях, включая рак молочной железы и рак толстой кишки 4 . Другой маркер, альдегиддегидрогеназа (ALDH), показывает внутриклеточную локализацию и может быть функционально обнаружен, обеспечивая соответствующий субстрат, ферментативное превращение которого вызывает свет. Используя этот тест, популяции CSC были идентифицированы также в разнообразных опухолевых сущностях. 5 . Дополнительный метод, обычно называемый анализом SP и представленный здесь в m Этодологическая деталь, улавливает активный отток красителя транспортерами АВС-препаратов для выявления небольших популяций флуоресцентно-тучных стволоподобных клеток 6 , 7 , 8 . Чтобы достичь этого, данный образец инкубируют в присутствии липофильного ДНК-связывающего флуорофора, который поступает во все клетки через пассивную диффузию и направляет ядерную и митохондриальную ДНК на связывание. Не-CSC, лишенные экспрессии транспортера лекарственного препарата ABC, аккумулируют краситель, приводящий к яркой флуоресценции, тогда как CSC активно экструдируют краситель, который уменьшает флуоресценцию. Фармакологическое ингибирование активности переносчика лекарственных средств отменяет и функционально подтверждает фенотип SP и должно использоваться для контроля. Группы CSC, проявляющие характеристики SP, были описаны, среди прочих, при раке яичников 9 , 10 , раке предстательной железы 11 ,> 12, рак молочной железы 13 , рак легкого 14 , рак эндометрия 15 , глиома 16 , 17 и костная саркома 18 . Важно отметить, что анализ SP совместим как с раковыми клеточными линиями, так и с первичной опухолевой тканью, хотя первичный материал создает дополнительные проблемы, такие как потребность в конкретной стратегии дискриминации опухолевых клеток (некоторые популяции клеток-хозяев также могут проявлять характеристики СП) 19 , 20 ,
Двумя наиболее известными SP-переносчиками наркотиков являются ABCB1 / P-гликопротеин / MDR1 / CD243 и ABCG2 / Bcrp1 / CD338 8 , 9 , 21 ; Однако другие переносчики лекарственных средств могут также быть молекулярным детерминантом фенотипа SP ( например , ABCB5) 22 . ABCB1Может эффективно блокироваться верапамилом, тогда как активность ABCG2 может быть специально аннулирована фумитремонгином C (FTC) 6 , 19 . Особая сила SP-анализа заключается в том, что он может сочетаться с другими окрашиваниями ( например , поверхностными маркерами и ALDH) и что он позволяет восстановление живой клетки, таким образом, совместимым с последующими функциональными исследованиями. Более того, обнаружение SP широко применимо из-за высокой консервации транспортеров ЛСД среди популяций CSC 9 , 23 .
Первоначально детектирование SP было выполнено с использованием Hoechst 33342 в качестве триггерного красителя 24 . Этот краситель достигает превосходного разрешения, но требует возбуждения ультрафиолетовым лазером; Поэтому его применимость, естественно, ограничивается высокоточными проточными цитометрическими приборами. Появление DyeCycle Violet (DCV) 25 открыло новый авенюДля анализа SP и расширил применимость этого метода к стандартным проточным цитометрическим приборам, не имеющим источника ультрафиолетового лазера (источника фиолетового лазера достаточно для разрешения клеток DCV-SP). Важно отметить, что Hoechst 33342 и DCV обладают общими характеристиками насоса, указывая, что либо краситель должен идентифицировать одни и те же популяции клеток.
Здесь мы предоставляем подробный экспериментальный протокол анализа на основе DCV для быстрого и легкого воспроизведения в независимых лабораториях. Таким образом, мы воспринимаем нашу статью как ресурс для исследователей CSC, который должен способствовать оптимизации и стандартизации этого полезного клеточно-биологического метода.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Этот протокол полностью соответствует стандартным рекомендациям Совета по этическим обзорам. Если человеческая или животная ткань исследуется с использованием протокола, представленного здесь, исследователи обязаны получить одобрение от соответствующего наблюдательного совета своего учреждения или страны.
Предостережение: Стандартные меры предосторожности для безопасного обращения с биологическими образцами применяются к этому протоколу. Это включает в себя ношение перчаток и лабораторного халата, а также выполнение работ в рамках биобезопасности по возможности.
1. Приготовление клеток
- Раковые клеточные линии
- Культуру соответствующую клеточную линию человека или мышиного рака при 37 ° С в 10-30 мл соответствующей среды ( например , RPMI 1640, дополненную 10% ( об. / Об . ) FBS, 2 мМ L-глутамином и 1x пенициллином / стрептомицином) и сбора Клетки в суб-конфлюэнтности ( т.е. 70-90%), используя переваривание с использованием 0,05% трипсина-ЭДТК или какого-либо другого де-аттестаБолевой процесс. Определите количество клеток и проверьте жизнеспособность, используя подсчетную камеру и трипановое синее окрашивание. Доля жизнеспособных клеток должна превышать 85%.
ПРИМЕЧАНИЕ. Примерами раковых клеточных линий человека, несущих SP-клетки, являются MCF7 / HTB-22 и SKBR3 / HTB-30 (рак молочной железы), A2780 и SKOV-3 / HTB-77 (рак яичников) и A549 (рак легких)
- Культуру соответствующую клеточную линию человека или мышиного рака при 37 ° С в 10-30 мл соответствующей среды ( например , RPMI 1640, дополненную 10% ( об. / Об . ) FBS, 2 мМ L-глутамином и 1x пенициллином / стрептомицином) и сбора Клетки в суб-конфлюэнтности ( т.е. 70-90%), используя переваривание с использованием 0,05% трипсина-ЭДТК или какого-либо другого де-аттестаБолевой процесс. Определите количество клеток и проверьте жизнеспособность, используя подсчетную камеру и трипановое синее окрашивание. Доля жизнеспособных клеток должна превышать 85%.
- Опухолевая ткань ex vivo
- Возьмите свежий образец хирургической опухоли или, альтернативно, собирайте опухолевые ткани из трансплантируемой или генно-инженерной мышиной модели опухоли. Принять 200-1000 мг ткани и создать суспензию отдельных клеток путем механической дезагрегации ( например , используя ножницы или скальпель) и ферментативного расщепления ( например , с использованием коктейля коллагеназа / dispase / DNase).
- Отфильтруйте образец через сетчатый фильтр 70 мкм. Определите количество клеток и проверьте жизнеспособность с помощью счетной камеры и трипана бUe окрашивание.
ПРИМЕЧАНИЕ. Коктейли для пищеварения часто содержат 200 мкг / мл коллагеназы Р, 0,8 ЕД / мл диспазы и 25 мкг / мл ДНКазы I, а время инкубации обычно составляет 20-50 мин. В идеальном случае дезагрегация тканей выполняется в соответствии с протоколом, оптимизированным для исследуемой ткани 27 , 28 , 29 .
2. Образцы для испытаний
- Отрегулируйте концентрацию клеток до 1 × 10 6 клеток / мл в свежей питательной среде (питательный носитель, содержащий питательные вещества, важен, поскольку экструзия красителя является активным энергоемким процессом). Наконец, перенесите 1 мл образца в обычную проточную цитометрию / круглодонную трубку FACS (обозначенную как «тест»).
ПРИМЕЧАНИЕ. Для получения оптимальных результатов может потребоваться титрование концентрации клеток (например, 5 × 10 5 -1 × 10 6 -2,5 × 10 6 клеток / мл), но более низкая общая концентрация клетокДает более высокое разрешение 19 . Только для сортировки приложений, где требуется максимальное количество клеток SP, рекомендуется увеличить концентрацию клеток до 1 x 10 7 клеток / мл. - Добавьте 10 мкМ DCV к образцу и хорошо перемешайте, либо мягким вортексом, либо ресуспендируя в течение 3-5х. Переходите к управлению запретом.
ПРИМЕЧАНИЕ. Оптимальные результаты могут зависеть от титрования запускающего красителя (например, 2,5; 5; 10; 20 мкМ), но более высокая концентрация красителя обычно дает более высокое разрешение 19 .
3. Контроль ингибирования
- Перенесите 250 мкл содержащей краситель клеточной суспензии в новую проточную цитометрию / круглодонную трубку FACS (обозначенную как «контроль»). Добавьте 50 мкМ верапамила или 20 мкМ FTC и хорошо перемешайте с помощью пипетки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Верапамил и FTC являются наиболее хорошо зарекомендовавшими себя ингибиторами для SP-анализа, но имеют различные характеристики оттока насосаY: Верапамил ингибирует несколько АВС-транспортеров лекарственных средств, включая ABCB1 и ABCB5, тогда как FTC специфичен для ABCG2 6 , 19 . Если статус SP индивидуального образца неизвестен, рекомендуется использовать верапамил и FTC в отдельных пробирках.
4. Окрашивание
- Закройте пробные и контрольные пробирки и инкубируйте их при 37 ° C в темноте в течение 90 минут, осторожно перемешивая каждые 15 минут. Большая часть экструзии красителя в SP-клетках будет происходить в течение первых 45 мин, но накопление красителя в не-SP клетках (способствующих разрешению) является максимальным только через 75-90 мин 19 .
- После того, как окрашивание завершено, промойте клетки в 3-4 мл охлажденного льдом PBS и ресуспендируйте осадок в объеме 100 мкл (также PBS). Держите клетки в темноте и охлажденные на льду, и перейти к окрашиванию дополнительных маркеров. Альтернативно, непосредственно проводят проточные цитометрические анализылизис.
5. Стоимость для других маркеров
- Добавьте желаемую панель антител, конъюгированных с флуорохромом, к окрашенным DCV клеткам, хорошо перемешайте и инкубируйте клетки при 4 ° C в темноте в течение 20-30 минут. Промойте клетки в 3 - 4 мл охлажденного льдом PBS и приступайте к дискриминации мертвых клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ. Форматы антител, которые легко совместимы с DCV и практически не требуют компенсации, включают PerCP или PerCP-Cy5.5, PE-Cy7, APC, Alexa Fluor 647, APC-Cy7, APC-H7, BV711, Alexa Fluor 750 и BV786 , Форматы, совместимые с DCV, но требующие компенсации, включают FITC, Alexa Fluor 488, PE и BV650. Форматы, которые практически не совместимы с DCV, включают BV421, V450 и V500. - Добавьте 7-AAD (или PI) к окрашенным DCV клеткам в концентрации, рекомендованной конкретным производителем, и инкубируйте образцы в течение 5-10 минут в темноте. Отфильтровывают пробы через отрезные сетчатые фильтры 70 мкм и проводят проточный цитометрический анализ.
6. Проточный цитометрический анализ
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется включать соответствующий проточный цитометрический прибор в процессе окрашивания, чтобы все было установлено, как только образцы будут готовы. Это включает в себя также стандартные процедуры обслуживания, такие как отслеживание производительности системы и заполнение бака.
- Приобретите клетки на проточном цитометре и закройте их на двумерном точечном участке FSC / SSC (рисунок 1B). Исключайте дублеты и агрегаты, сравнивая разные сигналы FSC ( т.е. высоту, ширину, площадь) (рис. 1C).
- Если включается маркер мертвых клеток, затвор на жизнеспособной клеточной фракции ( например , 7-AAD-отрицательный) ( рисунок 1D ). Визуализируйте жизнеспособные синглетные клетки на двумерном точечном участке для «синей» и «красной» эмиссии DCV. Для этого отобразите «голубой» канал флуоресценции на оси у ( например , 450/50)Красный "канал флуоресценции на оси х ( например , 525/50).
- Переключите оба канала в линейный режим и соответственно отрегулируйте напряжения детектора, чтобы SP находилась в стороне графика в нижнем левом квадранте. Напротив, не-SP располагается в правом верхнем квадранте графика, отражающего распределение клеточного цикла (G1 и G2). Запустите SP и остановите захват ( рисунок 1E ).
ПРИМЕЧАНИЕ: Определенные DCV клетки SP могут быть обнаружены с использованием проточных цитометрических приборов, оснащенных источником возбуждения фиолетового лазера ( то есть лазерной линией 405 нм). Специфика SP-анализа заключается в том, что излучаемая флуоресценция измеряется в линейном режиме и в двух отдельных каналах, отображаемых на двумерном точечном участке. «Синюю» эмиссию DCV измеряют приблизительно при 450 нм ( например , со стандартным фильтром 450/40), а «красную» эмиссию DCV измеряют приблизительно при 510-558 нм ( например , при 510/50, 525/50 или 585/15) 19 . Из-за особой химии анализа разделение между SP и не-SP клетками, как правило, выше в «красном» канале флуоресценции 19 .
- Загрузите контроль (и) ингибирования и получите данные. SP-клетки теперь исчезли или существенно уменьшены ( рис. 1F ). Если необходимо, уточните строб SP на основе этих данных.
- Чтобы исследовать экспрессию поверхностного маркера клетками SP, оставьте «красную» флуоресценцию DCV по оси x и выведите соответствующий канал флуоресценции на ось y в логарифмическом режиме ( например , APC). Отрегулируйте напряжения детектора соответствующим образом и закройте часть клеток SP, окрашивающих положительный результат в исследуемый маркер (ы) ( рис. 1G ). Совместная экспрессия конкретного маркера с помощью SP-клеток дает соответствующий сигнал в верхнем левом квадранте графика 30 .
- ЗапишитеДанные и / или сортировать SP-ячейки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
При условии, что это представляет собой репрезентативный анализ SP клеток A2780, линия клеток рака яичников человека, которая ранее была показана для учета СП, составляет менее 1% клеток 9 . Клетки культивировали при 37 ° С в RPMI 1640, дополненном 10% ( об. / Об . ) FBS, 2 мМ L-глутамином и 1x пенициллином / стрептомицином и собирали при 85% -ном слиянии, используя обработку 0,05% трипсина-ЭДТА. Клетки промывали в PBS и фильтровали через отрезные фильтры 70 мкм. Количество клеток определяли, используя подсчетную камеру и окраску трипановым синим, и 1 × 10 6 клеток / мл (свежая среда) окрашивали 10 мкМ DCV в течение 90 мин при 37 ° C в темноте. Параллельно их аликвоту инкубировали в присутствии 20 мкМ FTC при точно таких же условиях. Клетки промывали в 4 мл PBS и к тестовой пробирке добавляли антитело против APC-конъюгированного против ABCG2 при предварительно титрованной концентрации. После инкубацииВ течение 25 мин при 4 ° С, клетки промывали в PBS и добавляли 7-AAD для обозначения мертвых клеток. Образцы охлаждали на льду и анализировали на приборе FACS. Изображенная стратегия стробирования более или менее универсально применима к другим образцам, даже если высоко гетерогенный материал, такой как образцы из образцов тканей, может потребовать предварительного определения фракции клеток-мишеней с использованием определенных поверхностных маркеров ( например , EpCAM, CD45, CD31). Представленные результаты предназначены для использования в качестве основы для обнаружения СП на основе СП в других лабораториях. Следовательно, относительные локализации исследуемых клеточных популяций должны быть примерно сопоставимы, но, конечно же, не идентичны тем, которые получены другими исследователями с независимыми биологическими образцами.
Рисунок 1: Рабочий процесс и репрезентативные результаты. (A) Принципиальная блок-схема для определения SP с использованием DCV-красителяг. Стоимость дополнительных маркеров не является обязательной, но настоятельно рекомендуется исключить мертвые ячейки. ( BG ) Представитель SP анализ клеток рака яичников человека A2780, выполненных на приборе FACS. Ячейки стробируются в соответствии с характеристиками FSC / SSC (B), и дублеты и агрегаты исключаются путем сравнения различных параметров FSC ( например , высоты и ширины) ( C ). После этого мертвые клетки различаются стробированием на 7-AAD-отрицательную (или PI-отрицательную) фракцию клеток ( D ). Живые одиночные ячейки затем отображаются на линейном двумерном точечном участке для синего и красного DCV-излучения, а SP (и соответствующий не-SP) стробируется ( E ). Тот же анализ теперь выполняется с соответствующим контролем ингибирования (в этом случае использовался FTC), и это должно привести к почти полному исчезновению ячеек внутри вентиля SP ( F ). Наконец, идентифицированный SP может быть более близко охарактеризован, например , deteRmining транспортер (-ы) лекарств АВС, которые могут быть ответственны за экструзию красителя, тем самым придавая фенотип SP (в данном случае ABCG2, в соответствии с чувствительностью FTC). ( G ). FTC, фумитреморгин C; ALDH, альдегиддегидрогеназа. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Прогресс в клиническом лечении рака также зависит от развития методов лечения, ориентированных на CSC. Методы, позволяющие надежно изолировать CSC от биологических образцов, ускорят идентификацию подходящих целей и, следовательно, имеют решающее значение в этом начинании. SP-анализ представляет собой установленный и ценный метод идентификации популяций CSC, которые экспрессируют транспортеры лекарственных средств ABC, и внедрение DCV расширило его применимость к стандартным проточным цитометрическим приборам. Механически, SP-дискриминация использует активный отток красителя транспортерами АВС-препаратов для обнаружения CSC на основе низкой флуоресценции, влекущей за собой характерную локализацию на стороне нижнего участка графика до соответствующего не-SP. Важно отметить, что обнаружение SP на основе DCV - это надежный и простой метод, наиболее важные из которых: (i) подготовка клеток; (ii) процесс окрашивания; (iii) выбор подходящего ингибитораItor и (iv) проточный цитометрический анализ. Поскольку экструзия красителей является активным энергоемким процессом, особенно важно начать с хорошей жизнеспособности клеток; Только жизнеспособные (переносчики, экспрессирующие лекарство) клетки могут продуцировать SP. Кроме того, часто имеет смысл оптимизировать соотношение между концентрацией красителя и клеточной плотностью и тем самым усиливать разделение клеток SP (в свою очередь, это требует титрования как DCV, так и клеток). Общим правилом является то, что как более высокая концентрация красителя, так и более низкая концентрация клеток приводят к улучшению разделения 19 . Ключом к успешному эксперименту DCV является функциональная валидация SP, использующая фармакологические ингибиторы активности транспортера препарата ABC. Как уже отмечалось ранее, верапамил и FTC являются одними из наиболее известных ингибиторов для SP-анализа и имеют разные характеристики помпы (FTC специфичен для ABCG2, тогда как верапамил ингибирует несколько насосов). Для образцов с неизвестным статусом SP рекомендуется использовать обаИнгибиторы в отдельных пробирках. Другим вариантом является применение резерпина-ингибитора транспортера лекарственного средства против панкреатита 4 . Однако исследователи должны знать, что аутофлуоресценция этого соединения может потенциально влиять на сигнал DCV 19 . Когда ячейки анализируются на синюю и красную эмиссию DCV, напряжения детектора следует отрегулировать так, чтобы обе совокупности ( т.е. SP и не SP) были видны с максимальным разделением. Если изображение выглядит странным, может быть причиной логарифмического масштабирования (в этом случае, переключите оба канала обратно в линейный режим).
Важно также отметить, что основанный на DCV SP анализ не специфичен для рака и не был изначально разработан для применения в онкологии. Вместо этого он специфичен для АВС-транспортеров лекарственных средств и, таким образом, также облегчает обнаружение и выделение физиологических (тканевых) стволовых клеток, таких как линии происхождения - Sca-1 + c-kit +Гемопоэтические стволовые клетки 25 . Кроме того, дифференцированные типы клеток, устанавливающие выделенные барьеры на ключевых участках тела, также могут обладать SP-характеристиками 20 . Применяя детектирование SPV на основе DCV к первичным тканям, следовательно, требуется специфическая дискриминация популяции целевых клеток с использованием подходящих маркеров.
Ввиду высокой консервации насосов для оттока наркотиков среди популяций CSC 9 , 23 широко применяется детектирование на основе DCV на основе DCV, что также подтверждается его успешным использованием среди опухолевых сущностей, включая сущности различного происхождения зародышевого слоя 9 , 17 , 18 . Другие преимущества заключаются в том, что (i) идентифицированы клетки с прямыми показателями резистентности к лекарственным средствам (что особенно важно для решения клинически значимых подракостей раковых клеток, опосредующих рецидивы заболеванияИ что (ii) обнаружение функционального, а не статического параметра могло бы придать больше специфичности анализа и улучшить разрешение 19 , 31 , 32 . С концептуальной / технологической стороны детектирование SP на основе DCV четко отличается от опосредованных антителами поверхностных окрашиваний: (i) Целевая структура показывает внутриклеточную локализацию и представляет собой нуклеиновую кислоту, а не белок. (Ii) Анализ выявляет активность белка, а не простое присутствие или плотность. (Iii) Клетки-мишени определяются в силу низкой флуоресценции, а не положительного сигнала. (Iv) В качестве ДНК-связывающего красителя DCV чувствителен даже к незначительным изменениям концентрации клеток или красителей при окрашивании 19 . (V) Флуоресценция DCV измеряется в линейном режиме, а не логарифмически. (Vi) флуоресценция DCV ( т.е. флуоресценция, генерируемая одним флуорофором) измеряется по двум отдельным каналам, nВ одном диапазоне длин волн. Несмотря на эти особенности, анализ SP SP на основе DCV легко выполняется и, по-видимому, расширяет проточный цитометрический инструментарий для исследования CSC.
Анализ SPV на основе DCV также предлагает множество возможностей для оценки стоимости других маркеров, совместимых как с обычными опосредованными антителами поверхностными окрашиваниями (возможно, с многочисленными форматами), так и с коммерческим анализом, определяющим ферментативную активность ALDH. Однако мы здесь сосредоточились на поверхностном окрашивании, и читатель ссылается на опубликованную литературу 4, чтобы увидеть методологические детали кодирования активности ALDH. В любом случае анализ SP, вызванный DCV, должен сочетаться с различием мертвых клеток, и для этого очевидными реагентами являются 7-AAD и PI.
Следует отметить, что DC-определенные SP-клетки (и не-SP-контрольные клетки) могут быть подвергнуты живой очистке, используя приложение сортировки соответствующих проточных цитометрических инструментов. Поскольку SP-анализ обнаруживает функциональный paЧто только жизнеспособные клетки могут продуцировать, можно ожидать, что жизнеспособность восстановленных клеток SP будет высокой (иногда приближается к 100%). Если, тем не менее, могут возникнуть проблемы с жизнеспособностью после сортировки, могут быть проверены различные технические параметры, такие как размер сопла сортировщика, природа буферного агента и температура во время сортировки (с использованием сопла 70 мкм у нас никогда не было проблем с Жизнеспособность, но большее сопло может все еще помочь для очень деликатных клеток). Восстановленные клетки могут быть подвергнуты последующему анализу, такому как qRT-PCR, Вестерн-блоттингу и профилированию глобальной экспрессии ( например , с использованием массива генов или более поздней технологии RNASeq). Кроме того, изолированные клетки SP можно исследовать на функциональные характеристики стволовых клеток ( например , на клетогенность отдельных клеток и последовательную трансплантацию) или субкультивировать, чтобы установить линии клеток обогащенных или даже чистых клеток SP, которые могут быть стабильными в течение месяцев 9 . В нашемМы использовали нормальные средние и обычные двумерные пластиковые колбы для субкультурных DCS-определенных CSCs 9 , но возможны также селективные стволовые клетки модальности, такие как условия не зависящие от закрепления / 3D-культуры и специализированные среды. Мы предлагаем, чтобы наиболее благоприятные условия для in vitro расширения данного отсека SP должны быть проверены индивидуально.
Таким образом, мы здесь изображаем подробный экспериментальный рабочий процесс идентификации / изоляции CSC с помощью SP анализа на основе DCV. Наш документ должен помочь исследователям CSC внедрить и установить этот полезный метод в их собственных лабораториях, что должно еще больше способствовать выяснению терапевтических стратегий анти-CSC для улучшения клинического лечения рака.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов для объявления. Также нет участия автора в подготовке рукописи.
Acknowledgments
Максимилиана Боэша поддерживает Erwin Schrödinger Fellowship из Австрийского фонда науки FWF (грант номер J-3807).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vybrant DyeCycle Violet | Thermo Fisher Scientific | V35003 | Ready to use |
| Verapamil hydrochloride | Sigma-Aldrich | V4629 | Dissolve in ethanol |
| Fumitremorgin C | Sigma-Aldrich | F9054 | Dissolve in DMSO |
| 7-AAD (or propidium iodide - PI) | BioLegend | 420403 | Ready to use |
| Standard cell culture reagents (e.g., medium, FBS, L-glutamine, antibiotics, PBS, trypsin-EDTA, etc.) | Different suppliers | ||
| Sample/cells of interest (e.g., human or murine cancer cell line, human or murine tumor tissue) | Different suppliers | ||
| Flow cytometric instrument (FACS; analyzer or cell sorter) | Different suppliers | Violet laser source required | |
| FACS tubes (round-bottom) | Different suppliers | Tubes with cap recommended | |
| 70 µm cut-off strainers | Different suppliers | Optional but recommended | |
| Digestion enzyme mix (e.g., collagenase/dispase/Dnase) | Different suppliers | Only relevant for tissue dissociation | |
| Flurochrome-conjugated antibodies against surface markers of interest | Different suppliers | Optional | |
| ALDEFLUOR Kit | STEMCELL Technologies | 01700 | Optional |
References
- Pattabiraman, D. R., Weinberg, R. A. Tackling the cancer stem cells - what challenges do they pose? Nat Rev Drug Discov. 13 (7), 497-512 (2014).
- Boesch, M., et al. Heterogeneity of Cancer Stem Cells: Rationale for Targeting the Stem Cell Niche. Biochim Biophys Acta. 1866 (2), 276-289 (2016).
- Li, Y., et al. Suppression of cancer relapse and metastasis by inhibiting cancer stemness. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (6), 1839-1844 (2015).
- Greve, B., Kelsch, R., Spaniol, K., Eich, H. T., Götte, M. Flow cytometry in cancer stem cell analysis and separation. Cytometry A. 81 (4), 284-293 (2012).
- Marcato, P., Dean, C. A., Giacomantonio, C. A., Lee, P. W. Aldehyde dehydrogenase: its role as a cancer stem cell marker comes down to the specific isoform. Cell Cycle. 10 (9), 1378-1384 (2011).
- Golebiewska, A., Brons, N. H., Bjerkvig, R., Niclou, S. P. Critical appraisal of the side population assay in stem cell and cancer stem cell research. Cell Stem Cell. 8 (2), 136-147 (2011).
- Hirschmann-Jax, C., et al. A distinct "side population" of cells with high drug efflux capacity in human tumor cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (39), 14228-14233 (2004).
- Zhou, S., et al. The ABC transporter Bcrp1/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype. Nat Med. 7 (9), 1028-1034 (2001).
- Boesch, M., et al. The side population of ovarian cancer cells defines a heterogeneous compartment exhibiting stem cell characteristics. Oncotarget. 5 (16), 7027-7039 (2014).
- Szotek, P. P., et al. Ovarian cancer side population defines cells with stem cell-like characteristics and Mullerian Inhibiting Substance responsiveness. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (30), 11154-11159 (2006).
- Brown, M. D., et al. Characterization of benign and malignant prostate epithelial Hoechst 33342 side populations. Prostate. 67 (13), 1384-1396 (2007).
- Mathew, G., et al. ABCG2-mediated DyeCycle Violet efflux defined side population in benign and malignant prostate. Cell Cycle. 8 (7), 1053-1061 (2009).
- Engelmann, K., Shen, H., Finn, O. J. MCF7 side population cells with characteristics of cancer stem/progenitor cells express the tumor antigen MUC1. Cancer Res. 68 (7), 2419-2426 (2008).
- Ho, M. M., Ng, A. V., Lam, S., Hung, J. Y. Side population in human lung cancer cell lines and tumors is enriched with stem-like cancer cells. Cancer Res. 67 (10), 4827-4833 (2007).
- Kato, K., et al. Endometrial cancer side-population cells show prominent migration and have a potential to differentiate into the mesenchymal cell lineage. Am J Pathol. 176 (1), 381-392 (2010).
- Bleau, A. M., et al. PTEN/PI3K/Akt pathway regulates the side population phenotype and ABCG2 activity in glioma tumor stem-like cells. Cell Stem Cell. 4 (3), 226-235 (2009).
- Harris, M. A., et al. Cancer stem cells are enriched in the side population cells in a mouse model of glioma. Cancer Res. 68 (24), 10051-10059 (2008).
- Murase, M., et al. Side population cells have the characteristics of cancer stem-like cells/cancer-initiating cells in bone sarcomas. Br J Cancer. 101 (8), 1425-1432 (2009).
- Boesch, M., Wolf, D., Sopper, S. Optimized Stem Cell Detection Using the DyeCycle-Triggered Side Population Phenotype. Stem Cells Int. 2016, 1652389 (2016).
- Golebiewska, A., et al. Side population in human glioblastoma is non-tumorigenic and characterizes brain endothelial cells. Brain. 136 (PT 5), 1462-1475 (2013).
- Boesch, M., et al. Drug transporter-mediated protection of cancer stem cells from ionophore antibiotics. Stem Cells Transl Med. 4 (9), 1028-1032 (2015).
- Fukunaga-Kalabis, M., et al. Tenascin-C promotes melanoma progression by maintaining the ABCB5-positive side population. Oncogene. 29 (46), 6115-6124 (2010).
- Dean, M., Fojo, T., Bates, S. Tumour stem cells and drug resistance. Nat Rev Cancer. 5 (4), 275-284 (2005).
- Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J Exp Med. 183 (4), 1797-1806 (1996).
- Telford, W. G., Bradford, J., Godfrey, W., Robey, R. W., Bates, S. E. Side population analysis using a violet-excited cell-permeable DNA binding dye. Stem Cells. 25 (4), 1029-1036 (2007).
- Boesch, M., et al. High prevalence of side population in human cancer cell lines. Oncoscience. 3 (3-4), 85-87 (2016).
- Ali, M. Y., Anand, S. V., Tangella, K., Ramkumar, D., Saif, T. A. Isolation of Primary Human Colon Tumor Cells from Surgical Tissues and Culturing Them Directly on Soft Elastic Substrates for Traction Cytometry. J Vis Exp. (100), e52532 (2015).
- Azari, H., et al. Isolation and expansion of human glioblastoma multiforme tumor cells using the neurosphere assay. J Vis Exp. (56), e3633 (2011).
- Hasselbach, L. A., et al. Optimization of high grade glioma cell culture from surgical specimens for use in clinically relevant animal models and 3D immunochemistry. J Vis Exp. (83), e51088 (2014).
- Boesch, M., et al. DyeCycle Violet used for side population detection is a substrate of P-glycoprotein. Cytometry A. 81 (6), 517-522 (2012).
- Patrawala, L., et al. Side population is enriched in tumorigenic, stem-like cancer cells, whereas ABCG2+ and ABCG2- cancer cells are similarly tumorigenic. Cancer Res. 65 (14), 6207-6219 (2005).
- Guha, P., et al. Nicotine promotes apoptosis resistance of breast cancer cells and enrichment of side population cells with cancer stem cell-like properties via a signaling cascade involving galectin-3, alpha9 nicotinic acetylcholine receptor and STAT3. Breast Cancer Res Treat. 145 (1), 5-22 (2014).
