Summary
Métodos que permiten la caracterización y el aislamiento de las poblaciones de células madre de muestras biológicas son fundamentales para el avance de los tratamientos dirigidos a células madre en el cáncer y más allá. Aquí, proporcionamos un protocolo detallado para el aislamiento de células madre de cáncer utilizando el fenotipo de población lateral desencadenada por tinte.
Abstract
El cáncer es una enfermedad conducida por células madre y la erradicación de estas células se ha convertido en un objetivo terapéutico importante. La desciframización de las vulnerabilidades de las células madre de cáncer (CSC) y la identificación de objetivos moleculares adecuados se basa en métodos que permiten su discriminación específica en muestras heterogéneas tales como líneas celulares y tejido tumoral ex vivo . La citometría de flujo / FACS es una poderosa tecnología para diseccionar de forma multiparamétrica muestras biológicas a nivel de célula única y es hasta la fecha el método de elección para recuperar células vivas para análisis de aguas abajo. Los marcadores de superficie tales como CD44 y CD133, así como la detección de actividad enzimática de aldehído deshidrogenasa, se han utilizado a menudo para definir y clasificar CSCs de muestras tumorales mediante FACS. Un enfoque complementario, descrito aquí en detalle metodológico, hace uso de la extrusión de colorante funcional por transportadores de fármacos ABC, que identifica una población distinta de células fluorescentes-dim comúnmente denominadas población lateral (SP). SP, Las células cancerosas exhiben características de células madre canónicas y pueden ser anuladas y confirmadas funcionalmente utilizando agentes que inhiben el transportador de fármacos extruyendo el colorante (más frecuentemente ABCB1 / P-glicoproteína / MDR1 / CD243 y ABCG2 / Bcrp1 / CD338). Además, el ensayo de SP es compatible con otras evaluaciones de citometría de flujo tales como tinción de antígenos de superficie, detección de aldehído deshidrogenasa y discriminación de células muertas ( por ejemplo , con 7-AAD o yoduro de propidio (PI)). Por lo tanto, describimos un valioso y ampliamente aplicable método de CSC de identificación, aislamiento y sub-caracterización mecánica basada en un funcional, en lugar de un parámetro fenotípico. Aunque originalmente se realizó con Hoechst 33342 como colorante desencadenante, aquí nos centramos en el fenotipo más reciente basado en colorante Violeta SP que se puede resolver en cualquier citómetro de flujo equipado con una fuente de láser violeta.
Introduction
La eficacia de las terapias de cáncer primarias ha mejorado sustancialmente durante la última década debido a los avances en la comprensión genética y molecular de la enfermedad y el advenimiento de fármacos dirigidos como anticuerpos terapéuticos e inhibidores de moléculas pequeñas. En contraste, la enfermedad metastásica y recurrente sigue siendo típicamente incurable, y la morbilidad y la mortalidad siguen siendo altos en estos ajustes clínicos. Las CSCs representan una subpoblación distinta dentro de los tumores y están dotadas de propiedades de células madre canónicas tales como clonogenicidad / tumorigenicidad, resistencia a múltiples fármacos y división celular asimétrica 1 , 2 . Por lo tanto, CSCs no sólo impulsan la progresión metastásica y la heterogeneidad tumoral, sino que también persisten durante el tratamiento para predisponer al paciente a la recaída. Por lo tanto, la eliminación terapéutica del CSC es una necesidad médica importante para prevenir la recurrencia de la enfermedad y permitir la curación a largo plazo del cáncer 3
La identificación de las vulnerabilidades y la elucidación de las estrategias para erradicar las CSC depende en gran medida de métodos que permitan su purificación a partir de muestras biológicas para su posterior perfilación y / o investigación funcional. A su vez, tales métodos se basan en marcadores superficiales, intracelulares o funcionales que son específicos para estas células. Los marcadores de superficie específicos de CSC incluyen, pero no se limitan a, CD44, CD133, CD24 y CD90, y se han usado para identificar poblaciones de CSC en una variedad de entidades tumorales incluyendo cáncer de mama y cáncer de colon 4 . Otro marcador, aldehido deshidrogenasa (ALDH), muestra localización intracelular y puede ser detectado funcionalmente proporcionando un sustrato respectivo cuya conversión enzimática produce luz. Usando esta prueba, las poblaciones CSC se han identificado en diversas entidades tumorales, así 5 . Un método complementario, comúnmente denominado análisis SP y retratado aquí en m Ethodological, aprovecha el eflujo de colorante activo por los transportadores de fármacos ABC para identificar pequeñas poblaciones de células de tallo fluorescente-dim-like 6 , 7 , 8 . Para conseguir esto, se incuba una muestra dada en presencia de un fluoróforo de unión al ADN lipófilo que entra en todas las células a través de la difusión pasiva y se dirige al ADN nuclear y mitocondrial para la unión. Los no CSCs que carecen de expresión del transportador de fármacos ABC acumulan el colorante dando como resultado una fluorescencia brillante, mientras que CSCs extruyen activamente el colorante que reduce la fluorescencia. La inhibición farmacológica de la actividad transportadora de fármacos abroga y confirma funcionalmente el fenotipo SP y debe usarse para fines de control. Las poblaciones de CSC que presentan características de SP se han descrito, entre otros, en cáncer de ovario 9 , 10 , cáncer de próstata 11 ,> 12, cáncer de mama 13 , cáncer de pulmón 14 , cáncer endometrial 15 , glioma 16 , 17 y sarcoma óseo 18 . Es importante destacar que el ensayo SP es compatible con ambas líneas celulares de cáncer y tejido tumoral primario, aunque el material primario plantea retos adicionales tales como el requisito de una estrategia específica de discriminación de células tumorales (ciertas poblaciones de células huésped también pueden presentar características de SP) 19 , 20 .
Los dos transportadores de fármacos que confieren SP más establecidos son ABCB1 / P-glicoproteína / MDR1 / CD243 y ABCG2 / Bcrp1 / CD338 8 , 9 , 21 ; Sin embargo, otros transportadores de drogas puede ser un determinante molecular del fenotipo SP también ( por ejemplo , ABCB5) [ 22] . ABCB1Puede bloquearse eficazmente con verapamilo, mientras que la actividad de ABCG2 puede ser derogada específicamente con fumitremorgin C (FTC) 6 , 19 . Una fuerza particular del análisis de SP es que puede combinarse con otras tinciones ( por ejemplo , marcadores de superficie y ALDH) y que permite la recuperación de células vivas siendo así compatible con investigaciones funcionales posteriores. Por otra parte, la detección de SP es ampliamente aplicable debido a la alta conservación de los transportadores de drogas ABC entre las poblaciones de CSC [ 9 , 23] .
Originalmente, la detección de SP se ha realizado utilizando Hoechst 33342 como un colorante desencadenante 24 . Este colorante consigue una excelente resolución pero requiere excitación con láser ultravioleta; Por lo tanto su aplicabilidad se limita naturalmente a los instrumentos de citometría de flujo de gama alta. La llegada de DyeCycle Violet (DCV) 25 ha abierto nuevas avenidasEs para el análisis SP y amplió la aplicabilidad de este método a los instrumentos de citometría de flujo estándar que carecen de una fuente láser ultravioleta (una fuente láser violeta es suficiente para resolver las células DCV-SP). Es importante destacar que Hoechst 33342 y DCV comparten especificidades comunes de la bomba, lo que indica que cualquier colorante debe identificar las mismas poblaciones de células.
Aquí, proporcionamos un protocolo experimental detallado del análisis de SP basado en DCV para una reproducción rápida y fácil en laboratorios independientes. Por lo tanto, percibimos nuestro artículo como un recurso para los investigadores de CSC que debería contribuir a la optimización y estandarización de este útil método biológico-celular.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Este protocolo cumple con las directrices estándar de la Junta de Revisión Institucional de Ética. Si se investiga el tejido humano o animal usando el protocolo descrito aquí, los investigadores están obligados a obtener la aprobación de la junta de revisión de su institución o país.
Precaución: Las precauciones estándar para el manejo seguro de muestras biológicas se aplican a este protocolo. Esto incluye usar guantes y una bata de laboratorio, y realizar el trabajo bajo un gabinete de bioseguridad siempre que sea posible.
1. Preparación de células
- Líneas celulares de cáncer
- Cultivo de una respectiva línea celular de cáncer humano o murino a 37 ° C en 10-30 ml de medio apropiado ( por ejemplo , RPMI 1640 suplementado con FBS al 10% ( v / v ), L-glutamina 2 mM y penicilina / estreptomicina 1x) y cosecha Las células en la subconfluencia ( es decir, 70-90%) usando la digestión con tripsina-EDTA al 0,05% o algún otro de-attProcedimiento de diagnóstico. Determine el recuento celular y compruebe su viabilidad utilizando una cámara de recuento y una tinción con azul de tripano. La fracción de células viables debe superar el 85%.
NOTA: Ejemplos de líneas celulares de cáncer humano que albergan compartimentos SP incluyen MCF7 / HTB-22 y SKBR3 / HTB-30 (cáncer de mama), A2780 y SKOV-3 / HTB-77 (cáncer de ovario) y A549 (cáncer de pulmón) 26 .
- Cultivo de una respectiva línea celular de cáncer humano o murino a 37 ° C en 10-30 ml de medio apropiado ( por ejemplo , RPMI 1640 suplementado con FBS al 10% ( v / v ), L-glutamina 2 mM y penicilina / estreptomicina 1x) y cosecha Las células en la subconfluencia ( es decir, 70-90%) usando la digestión con tripsina-EDTA al 0,05% o algún otro de-attProcedimiento de diagnóstico. Determine el recuento celular y compruebe su viabilidad utilizando una cámara de recuento y una tinción con azul de tripano. La fracción de células viables debe superar el 85%.
- Tejido tumoral ex vivo
- Tome una muestra de tumor quirúrgico fresco o, alternativamente, recolecte el tejido tumoral de un modelo de tumor de ratón transplantado o genéticamente modificado. Tome 200-1,000 mg de tejido y genere una suspensión de una sola célula por desagregación mecánica ( por ejemplo , usando tijeras o un bisturí) y digestión enzimática ( por ejemplo , usando un cóctel de colagenasa / dispasa / DNasa).
- Filtrar la muestra a través de un filtro de corte de 70 μm. Determinar el recuento celular y comprobar la viabilidad utilizando una cámara de recuento y trypan blUe tinción.
NOTA: Los cócteles de digestión con frecuencia contienen 200 μg / ml de colagenasa P, 0,8 U / mL dispase y 25 μg / mL de DNasa I, y los tiempos de incubación típicamente varían de 20 a 50 min. Idealmente, la desagregación de tejidos se realiza de acuerdo con un protocolo optimizado para el tejido bajo investigación 27 , 28 , 29 .
2. Muestras de prueba
- Ajustar la concentración celular a 1 x 106 células / ml en medio de cultivo fresco (un vehículo que contiene nutrientes es importante, ya que la extrusión del colorante es un proceso que consume energía). Por último, transfiera 1 ml de muestra a un tubo circular de citometría de flujo / FACS (denominado "ensayo").
NOTA: Para obtener resultados óptimos, puede ser necesario que la concentración celular sea titulada (por ejemplo 5 x 10 5 -1 x 10 6 -2,5 x 10 6 células / ml), pero una concentración de células más baja en generalProporciona una mayor resolución 19 . Sólo para las aplicaciones de clasificación en las que se recuperará un número máximo de células SP, se recomienda aumentar la concentración celular hasta 1 x 10 7 células / mL. - Añadir 10 μM de DCV a la muestra y mezclar bien, ya sea por vórtice suave o resuspender durante 3-5x. Proceder a los controles de inhibición.
NOTA: Los resultados óptimos pueden depender de la titulación del colorante desencadenante (por ejemplo 2.5; 5; 10; 20 μM), pero una concentración de colorante más alta generalmente produce una mayor resolución 19 .
3. Controles de Inhibición
- Transferir 250 μl de la suspensión celular que contiene tinte a un nuevo tubo de citometría de flujo / FACS de fondo redondo (denominado "control"). Añadir 50 μ M de verapamil o 20 μ M de FTC y mezclar bien por pipeteado.
NOTA: Verapamil y FTC son los inhibidores más bien establecidos para el análisis de SP, pero tienen diferentes especificaciones de bomba de eflujoY: Verapamil inhibe varios transportadores de fármacos ABC incluyendo ABCB1 y ABCB5, mientras que FTC es específico para ABCG2 6,19. Si se desconoce el estado de SP de una muestra individual, se recomienda utilizar ambos verapamil y FTC en tubos separados.
4. Tinción
- Capa los tubos 'test' y 'control' y los incuba a 37 ° C en la oscuridad durante 90 minutos, agitando suavemente cada 15 min. La mayor parte de la extrusión de colorantes en las células SP se producirá dentro de los primeros 45 min, pero la acumulación de colorante en las células no SP (contribuyendo a la resolución) es sólo máximo después de 75-90 min 19 .
- Una vez completada la tinción, se lavan las células en 3-4 ml de PBS enfriado con hielo y se resuspende el sedimento en un volumen de 100 μl (PBS también). Mantenga las celdas en la oscuridad y enfríe en hielo, y proceda a la tinción de marcadores adicionales. Alternativamente, realizar directamente citometría de flujo anaLisis
5. Costura para otros marcadores
- Añadir un panel deseado de anticuerpos conjugados con fluorocromo a las células teñidas con DCV, mezclar bien e incubar las células a 4 ° C en la oscuridad durante 20-30 min. Lave las células en 3 - 4 mL de PBS helado y proceda a la discriminación de células muertas.
NOTA: Los formatos de anticuerpos que son fácilmente compatibles con DCV y prácticamente no requieren compensación incluyen PerCP o PerCP-Cy5.5, PE-Cy7, APC, Alexa Fluor 647, APC-Cy7, APC-H7, BV711, Alexa Fluor 750 y BV786 . Los formatos que son compatibles con DCV pero pueden requerir compensación incluyen FITC, Alexa Fluor 488, PE y BV650. Los formatos que no son prácticamente compatibles con DCV incluyen BV421, V450 y V500. - Añadir 7-AAD (o PI) a las células teñidas con DCV a la concentración recomendada por el fabricante en particular e incubar las muestras durante 5 - 10 min en la oscuridad. Filtrar las muestras a través de filtros de corte de 70 μm y proceder al análisis de citometría de flujo.
6. Análisis de citometría de flujo
NOTA: Se recomienda encender el respectivo instrumento de citometría de flujo durante el proceso de tinción ya para que todo se fije tan pronto como las muestras estén listas. Esto incluye también los procedimientos de mantenimiento estándar, como el seguimiento del rendimiento del sistema y el relleno del tanque.
- Adquirir las células en el citómetro de flujo y las puertas en un gráfico de puntos bivariados FSC / SSC (Figura 1B). Excluir dobletes y agregados comparando las diferentes señales de FSC ( es decir , altura, ancho, área) (Figura 1C).
- Si se ha incluido un marcador de células muertas, se introduce en la fracción de células viables ( por ejemplo , 7-AAD-negativo) ( Figura 1D ). Visualice las células singuetas viables en una gráfica de puntos bivariada para la emisión de DCV 'azul' y 'roja'. Con este fin, visualice el canal de fluorescencia "azul" en el eje y ( por ejemplo , 450/50) y el canal de fluorescencia "Rojo 'en el eje x ( por ejemplo , 525/50).
- Cambie ambos canales al modo lineal y ajuste los voltajes del detector correspondientemente para que el SP se sitúe al lado del gráfico en el cuadrante inferior izquierdo. Por el contrario, el no SP se sitúa en el cuadrante superior derecho de la gráfica que refleja la distribución del ciclo celular (G1 y G2). Puerta del SP y detener la adquisición ( Figura 1E ).
NOTA: Las células SP definidas por DCV pueden detectarse utilizando instrumentos de citometría de flujo equipados con una fuente de excitación láser violeta ( es decir, una línea láser de 405 nm). Es uno específico del análisis de SP que la fluorescencia emitida se mide en modo lineal y en dos canales separados mostrados en una gráfica de puntos bivariada. La emisión "azul" de DCV se mide aproximadamente a 450 nm ( por ejemplo , con un filtro estándar 450/40) y la emisión "roja" de DCV se mide aproximadamente a 510-585 nm ( por ejemplo , con un 510/50, un 525/50 o un filtro 585/15) 19 . Debido a la química particular del ensayo, la separación entre células SP y no SP es generalmente mayor en el canal de fluorescencia "rojo" 19 .
- Cargue el (los) control (es) de inhibición y adquiera los datos. Las células SP han desaparecido o se han reducido sustancialmente ( Figura 1F ). Si es necesario, refine la puerta SP con base en estos datos.
- Para investigar la expresión del marcador de superficie por células SP, deje la fluorescencia "roja" de DCV en el eje x y muestre un canal de fluorescencia respectivo en el eje y en modo logarítmico ( por ejemplo , APC). Ajustar los voltajes del detector correspondientemente y cubrir la fracción de células SP con tinción positiva para el marcador investigado ( Figura 1G ). La co-expresión de un marcador particular por células SP produce una señal respectiva en el cuadrante superior izquierdo de la parcela 30 .
- Registre elDatos y / o ordenar las células SP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Se proporciona un análisis SP representativo de células A2780, una línea celular de cáncer de ovario humano previamente mostrada para albergar un SP que representa menos del 1% de células 9 . Las células se cultivaron a 37ºC en RPMI 1640 suplementado con FBS al 10% ( v / v ), L-glutamina 2 mM y 1 x penicilina / estreptomicina y se cosecharon al 85% de confluencia usando tratamiento con tripsina-EDTA al 0,05%. Las células se lavaron en PBS y se filtraron a través de filtros de corte de 70 μm. El recuento de células se determinó usando una cámara de recuento y tinción con azul de tripán y se tiñeron 1 x 106 células / ml (medio fresco) con DCU 10 μM durante 90 minutos a 37ºC en la oscuridad. Paralelamente, se incubó una parte alıcuota de la misma en presencia de 20 μM de FTC exactamente bajo las mismas condiciones. Las células se lavaron en 4 ml de PBS y un anticuerpo conjugado con APC contra ABCG2 se añadió al tubo de ensayo a una concentración pretitulada. Después de la incubaciónDurante 25 minutos a 4 ° C, las células se lavaron en PBS, y se añadió 7-AAD para marcar células muertas. Las muestras se enfriaron en hielo y se analizaron en un instrumento FACS. La estrategia de bloqueo representada es más o menos universalmente aplicable a otras muestras, aunque material altamente heterogéneo tal como muestras de muestras de tejido puede requerir predefinición de la fracción de células diana usando marcadores de superficie específicos ( por ejemplo , EpCAM, CD45, CD31). Los resultados mostrados pretenden servir como referencia para la detección de SP basada en DCV en otros laboratorios. Por lo tanto, las localizaciones relativas de las poblaciones de células investigadas deberían ser aproximadamente comparables, pero seguramente no idénticas, a las obtenidas por otros investigadores con muestras biológicas independientes.
Figura 1: Flujo de trabajo y resultados representativos. (A) Diagrama de flujo principal para la detección de SP usando DCV stainingramo. La costura de marcadores adicionales es opcional, pero se recomienda altamente la discriminación de células muertas. ( BG ) Análisis SP representativo de células de cáncer de ovario humano A2780 realizadas en un instrumento FACS. Las células se clasifican según las características FSC / SSC (B) y los dobletes y agregados se excluyen comparando los diferentes parámetros del FSC ( por ejemplo , altura y ancho) ( C ). A continuación, las células muertas son discriminadas por gating en la fracción de células 7-AAD negativo (o PI-negativo) ( D ). Las células individuales vivas se muestran entonces en un diagrama de puntos bivariante lineal para la emisión de DCV azul y roja y el SP (y el no-SP correspondiente) es cerrado ( E ). El mismo análisis se hace ahora con un control de inhibición respectivo (en este caso se usó FTC), y esto debería conducir a una desaparición casi completa de las células dentro de la puerta SP ( F ). Finalmente, el SP identificado puede ser caracterizado más estrechamente, por ejemplo , por deteRminando el (los) transportador (es) de fármaco ABC que podría ser responsable de la extrusión del colorante confiriendo por tanto el fenotipo SP (en este caso ABCG2, en línea con la sensibilidad de FTC). ( G ). FTC, fumitremorgin C; ALDH, aldehído deshidrogenasa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
El progreso en el manejo clínico del cáncer también depende del desarrollo de modalidades de tratamiento dirigidas a las CSC. Métodos que permiten el aislamiento fiable de CSC de muestras biológicas acelerará la identificación de objetivos adecuados y por lo tanto de importancia crítica en este esfuerzo. SP es una técnica establecida y valiosa para identificar las poblaciones de CSC que expresan los transportadores de fármacos ABC y la implementación del DCV ha extendido su aplicabilidad a los instrumentos estándar de citometría de flujo. Mecanicamente, la discriminación de SP aprovecha el eflujo de colorante activo por los transportadores de fármacos ABC para detectar CSC basados en baja fluorescencia que implican una localización característica en el lado del fondo de la parcela que queda a la correspondiente no SP. Es importante destacar que la detección de SP basada en DCV es un método robusto y directo, siendo los pasos más críticos (i) la preparación de células (ii) el proceso de tinción (iii) la selección de un inhibidor apropiadoY (iv) el análisis de citometría de flujo. Debido a que la extrusión de colorantes es un proceso de consumo de energía activo, es particularmente relevante empezar con una buena viabilidad celular; Sólo las células viables (transportadoras de fármacos que expresan) pueden producir un SP. Además, a menudo tiene sentido optimizar la relación entre la concentración de colorante y la densidad celular y por lo tanto mejorar la separación de las células SP (a su vez, esto requiere la titulación tanto de DCV como de células). Una regla general es que tanto una concentración de colorante más alta como una concentración celular más baja dan lugar a una separación mejorada 19 . La clave para un experimento de DCV exitoso es la validación funcional del SP usando inhibidores farmacológicos de la actividad del transportador de fármacos ABC. Como se ha indicado anteriormente, el verapamilo y la FTC se encuentran entre los inhibidores más establecidos para el análisis SP y tienen diferentes especificidades de la bomba (FTC es específico para ABCG2, mientras que verapamil inhibe varias bombas). Para muestras con estado de SP desconocido, se recomienda utilizar tantoInhibidores en tubos separados. Otra opción es el uso de la pan-ABC droga transportador inhibidor reserpina [ 4] . Sin embargo, los investigadores deben ser conscientes de que la autofluorescencia de este compuesto puede interferir con la señal de DCV [ 19] . Una vez que se analizan las células para la emisión de DCV azul y rojo, las tensiones del detector deben ajustarse de manera que ambas poblaciones ( es decir, SP y no SP) sean visibles con máxima separación. Si la imagen se ve extraña, la escala logarítmica podría ser la razón por la cual (en este caso, cambie ambos canales de vuelta al modo lineal).
También es importante señalar que el ensayo de SP basado en DCV no es específico para el cáncer ni ha sido desarrollado originalmente para su aplicación en oncología. En cambio, es específico para los transportadores de fármacos ABC y por lo tanto también facilita la detección y aislamiento de células madre fisiológicas (de tejido), tales como linaje - Sca-1 + c-kit +Células madre hematopoyéticas 25 . Además, los tipos de células diferenciadas que establecen obstáculos específicos en los sitios del cuerpo crucial también pueden presentar características SP [ 20] . La aplicación de la detección de SP basada en DCV a tejidos primarios requiere por tanto una discriminación específica de la población de células diana utilizando marcadores adecuados.
En vista de la alta conservación de bombas de eflujo de fármaco entre las poblaciones CSC 9 , 23 , la detección de SP basada en DCV es ampliamente aplicable, hecho que también se ejemplifica por su uso exitoso a través de entidades tumorales que incluyen entidades de diferentes orígenes 9 , 18 . Otras ventajas incluyen que (i) se identifican células con implicaciones directas en la resistencia a fármacos (particularmente importante para abordar los subgrupos de células cancerígenas clínicamente relevantes que median la recurrencia de la enfermedad(Ii) la detección de un parámetro funcional, en lugar de estático, podría conferir más especificidad de ensayo y mejorar la resolución 19 , 31 , 32 . Desde el punto de vista conceptual / tecnológico, la detección de la SP basada en DCV es claramente distinta de las tinciones superficiales mediadas por anticuerpos: (i) La estructura diana muestra la localización intracelular y representa el ácido nucleico, no la proteína. (Ii) El ensayo detecta la actividad proteica, no la mera presencia o densidad. (Iii) Las células diana se definen en virtud de una baja fluorescencia, no por una señal positiva. (Iv) Como un colorante de unión al ADN, el DCV es sensible incluso a ligeras variaciones en la concentración de células o tintes durante la tinción 19 . (V) La fluorescencia DCV se mide en modo lineal, no logarítmicamente. (Vi) La fluorescencia de DCV ( es decir, la fluorescencia generada por un único fluoróforo) se mide en dos canales separados, nOt en un solo rango de longitud de onda. A pesar de estos datos específicos, el análisis de SP basado en DCV es fácil de realizar y evidentemente extiende la caja de herramientas de citometría de flujo para la investigación de CSC.
El análisis de SP basado en DCV también ofrece muchas posibilidades de costaining para otros marcadores, siendo compatible con los medios convencionales de tinción de superficie mediada por anticuerpos (numerosos formatos posibles) y el ensayo comercial que detecta la actividad enzimática de ALDH. Sin embargo, aquí se centró en la tinción de la superficie y el lector se refiere a la literatura publicada 4 para ver detalles metodológicos sobre codetection de la actividad de ALDH. En cualquier caso, el análisis de SP activado por DCV debe combinarse con la discriminación de células muertas y los reactivos obvios para este propósito son 7-AAD y PI.
Cabe destacar que las células SP definidas por DCV (y las células de control no SP) pueden purificarse en vivo utilizando la aplicación de clasificación de los correspondientes instrumentos de citometría de flujo. Debido a que el ensayo SP detecta un pa funcionalEn general, se puede esperar que la viabilidad de las células SP recuperadas sea elevada (a veces aproximada al 100%). Sin embargo, si hay problemas con la viabilidad posterior a la clasificación, se pueden verificar diferentes parámetros técnicos, como el tamaño de la boquilla del clasificador, la naturaleza del agente tamponador y la temperatura durante la clasificación (usando una boquilla de 70 μm nunca tuvimos problemas con Viabilidad, pero una boquilla más grande podría ayudar a células muy delicadas). Las células recuperadas pueden someterse a análisis en sentido descendente tales como qRT-PCR, Western blot y perfiles de expresión global ( por ejemplo , utilizando matriz de genes o la tecnología RNASeq más reciente). Además, las células SP aisladas pueden ser investigadas en cuanto a las características funcionales de las células madre ( p . Ej. , Clonogenicidad de una sola célula y transplante en serie) o subcultivadas para establecer líneas celulares de células SP enriquecidas o incluso puras que podrían ser estables durante los meses 9 . En nuestro, Utilizamos matraces de plástico 2D normales y convencionales para subculturar CSCs 9 definidos por el DCV, pero también son viables las modalidades selectivas de células madre, tales como condiciones de cultivo independientes del anclaje / 3D y medios especializados. Proponemos que las condiciones más favorables para la expansión in vitro de un compartimento SP dado deberán ser verificadas individualmente.
En resumen, aquí representamos el flujo de trabajo experimental detallado de la identificación / aislamiento de CSC por medio de análisis de SP basado en DCV. Nuestro trabajo ayudará a los investigadores de la CSC a implementar y establecer este método útil en sus propios laboratorios, lo que debería promover la elucidación de las estrategias terapéuticas anti-CSC para mejorar el manejo clínico del cáncer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen conflictos de interés para declarar. Tampoco hay participación de ningún autor en la preparación del manuscrito.
Acknowledgments
Maximilian Boesch cuenta con el apoyo de una Beca Erwin Schrödinger del Fondo Austríaco de Ciencia FWF (concesión número J-3807).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vybrant DyeCycle Violet | Thermo Fisher Scientific | V35003 | Ready to use |
| Verapamil hydrochloride | Sigma-Aldrich | V4629 | Dissolve in ethanol |
| Fumitremorgin C | Sigma-Aldrich | F9054 | Dissolve in DMSO |
| 7-AAD (or propidium iodide - PI) | BioLegend | 420403 | Ready to use |
| Standard cell culture reagents (e.g., medium, FBS, L-glutamine, antibiotics, PBS, trypsin-EDTA, etc.) | Different suppliers | ||
| Sample/cells of interest (e.g., human or murine cancer cell line, human or murine tumor tissue) | Different suppliers | ||
| Flow cytometric instrument (FACS; analyzer or cell sorter) | Different suppliers | Violet laser source required | |
| FACS tubes (round-bottom) | Different suppliers | Tubes with cap recommended | |
| 70 µm cut-off strainers | Different suppliers | Optional but recommended | |
| Digestion enzyme mix (e.g., collagenase/dispase/Dnase) | Different suppliers | Only relevant for tissue dissociation | |
| Flurochrome-conjugated antibodies against surface markers of interest | Different suppliers | Optional | |
| ALDEFLUOR Kit | STEMCELL Technologies | 01700 | Optional |
References
- Pattabiraman, D. R., Weinberg, R. A. Tackling the cancer stem cells - what challenges do they pose? Nat Rev Drug Discov. 13 (7), 497-512 (2014).
- Boesch, M., et al. Heterogeneity of Cancer Stem Cells: Rationale for Targeting the Stem Cell Niche. Biochim Biophys Acta. 1866 (2), 276-289 (2016).
- Li, Y., et al. Suppression of cancer relapse and metastasis by inhibiting cancer stemness. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (6), 1839-1844 (2015).
- Greve, B., Kelsch, R., Spaniol, K., Eich, H. T., Götte, M. Flow cytometry in cancer stem cell analysis and separation. Cytometry A. 81 (4), 284-293 (2012).
- Marcato, P., Dean, C. A., Giacomantonio, C. A., Lee, P. W. Aldehyde dehydrogenase: its role as a cancer stem cell marker comes down to the specific isoform. Cell Cycle. 10 (9), 1378-1384 (2011).
- Golebiewska, A., Brons, N. H., Bjerkvig, R., Niclou, S. P. Critical appraisal of the side population assay in stem cell and cancer stem cell research. Cell Stem Cell. 8 (2), 136-147 (2011).
- Hirschmann-Jax, C., et al. A distinct "side population" of cells with high drug efflux capacity in human tumor cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (39), 14228-14233 (2004).
- Zhou, S., et al. The ABC transporter Bcrp1/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype. Nat Med. 7 (9), 1028-1034 (2001).
- Boesch, M., et al. The side population of ovarian cancer cells defines a heterogeneous compartment exhibiting stem cell characteristics. Oncotarget. 5 (16), 7027-7039 (2014).
- Szotek, P. P., et al. Ovarian cancer side population defines cells with stem cell-like characteristics and Mullerian Inhibiting Substance responsiveness. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (30), 11154-11159 (2006).
- Brown, M. D., et al. Characterization of benign and malignant prostate epithelial Hoechst 33342 side populations. Prostate. 67 (13), 1384-1396 (2007).
- Mathew, G., et al. ABCG2-mediated DyeCycle Violet efflux defined side population in benign and malignant prostate. Cell Cycle. 8 (7), 1053-1061 (2009).
- Engelmann, K., Shen, H., Finn, O. J. MCF7 side population cells with characteristics of cancer stem/progenitor cells express the tumor antigen MUC1. Cancer Res. 68 (7), 2419-2426 (2008).
- Ho, M. M., Ng, A. V., Lam, S., Hung, J. Y. Side population in human lung cancer cell lines and tumors is enriched with stem-like cancer cells. Cancer Res. 67 (10), 4827-4833 (2007).
- Kato, K., et al. Endometrial cancer side-population cells show prominent migration and have a potential to differentiate into the mesenchymal cell lineage. Am J Pathol. 176 (1), 381-392 (2010).
- Bleau, A. M., et al. PTEN/PI3K/Akt pathway regulates the side population phenotype and ABCG2 activity in glioma tumor stem-like cells. Cell Stem Cell. 4 (3), 226-235 (2009).
- Harris, M. A., et al. Cancer stem cells are enriched in the side population cells in a mouse model of glioma. Cancer Res. 68 (24), 10051-10059 (2008).
- Murase, M., et al. Side population cells have the characteristics of cancer stem-like cells/cancer-initiating cells in bone sarcomas. Br J Cancer. 101 (8), 1425-1432 (2009).
- Boesch, M., Wolf, D., Sopper, S. Optimized Stem Cell Detection Using the DyeCycle-Triggered Side Population Phenotype. Stem Cells Int. 2016, 1652389 (2016).
- Golebiewska, A., et al. Side population in human glioblastoma is non-tumorigenic and characterizes brain endothelial cells. Brain. 136 (PT 5), 1462-1475 (2013).
- Boesch, M., et al. Drug transporter-mediated protection of cancer stem cells from ionophore antibiotics. Stem Cells Transl Med. 4 (9), 1028-1032 (2015).
- Fukunaga-Kalabis, M., et al. Tenascin-C promotes melanoma progression by maintaining the ABCB5-positive side population. Oncogene. 29 (46), 6115-6124 (2010).
- Dean, M., Fojo, T., Bates, S. Tumour stem cells and drug resistance. Nat Rev Cancer. 5 (4), 275-284 (2005).
- Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J Exp Med. 183 (4), 1797-1806 (1996).
- Telford, W. G., Bradford, J., Godfrey, W., Robey, R. W., Bates, S. E. Side population analysis using a violet-excited cell-permeable DNA binding dye. Stem Cells. 25 (4), 1029-1036 (2007).
- Boesch, M., et al. High prevalence of side population in human cancer cell lines. Oncoscience. 3 (3-4), 85-87 (2016).
- Ali, M. Y., Anand, S. V., Tangella, K., Ramkumar, D., Saif, T. A. Isolation of Primary Human Colon Tumor Cells from Surgical Tissues and Culturing Them Directly on Soft Elastic Substrates for Traction Cytometry. J Vis Exp. (100), e52532 (2015).
- Azari, H., et al. Isolation and expansion of human glioblastoma multiforme tumor cells using the neurosphere assay. J Vis Exp. (56), e3633 (2011).
- Hasselbach, L. A., et al. Optimization of high grade glioma cell culture from surgical specimens for use in clinically relevant animal models and 3D immunochemistry. J Vis Exp. (83), e51088 (2014).
- Boesch, M., et al. DyeCycle Violet used for side population detection is a substrate of P-glycoprotein. Cytometry A. 81 (6), 517-522 (2012).
- Patrawala, L., et al. Side population is enriched in tumorigenic, stem-like cancer cells, whereas ABCG2+ and ABCG2- cancer cells are similarly tumorigenic. Cancer Res. 65 (14), 6207-6219 (2005).
- Guha, P., et al. Nicotine promotes apoptosis resistance of breast cancer cells and enrichment of side population cells with cancer stem cell-like properties via a signaling cascade involving galectin-3, alpha9 nicotinic acetylcholine receptor and STAT3. Breast Cancer Res Treat. 145 (1), 5-22 (2014).
