Summary
Metoder som möjliggör karakterisering och isolering av stamcellspopulationer från biologiska prover är avgörande för förskott av stamceller-riktade behandlingar i cancer och bortom. Här tillhandahåller vi ett detaljerat protokoll för isolering av cancerstamcellceller med användning av färgämneutlösad sidopopulation fenotyp.
Abstract
Cancer är en stamcellsdriven sjukdom och utrotning av dessa celler har blivit ett viktigt terapeutiskt mål. Dekryptera sårbarheter hos cancerstamceller (CSC) och identifiera lämpliga molekylära mål är beroende av metoder som tillåter deras specifika diskriminering i heterogena prover såsom cellinjer och ex vivo tumörvävnad. Flödescytometri / FACS är en kraftfull teknik för att multi-parametriskt dissekera biologiska prover på encellsnivå och är hittills den metod som valts för att återställa levande celler för nedströmsanalyser. Ytmarkörer såsom CD44 och CD133 samt detektion av aldehyddehydrogenasens enzymatisk aktivitet har ofta använts för att definiera och sortera ut CSC från tumörprover av FACS. Ett komplementärt tillvägagångssätt, som beskrivs här i metodologisk detalj, utnyttjar funktionell färgämnekrossning av ABC-läkemedelstransportörer, som identifierar en distinkt population av fluorescensdimma celler som vanligtvis kallas sidopopulation (SP). SPCancerceller uppvisar kanoniska stamcellskarakteristika och kan upphävas och funktionellt bekräftas med användning av medel som hämmar färgämnextruderande läkemedelstransportören (oftast ABCB1 / P-glykoprotein / MDRl / CD243 och ABCG2 / Bcrp1 / CD338). Vidare är SP-analysen kompatibel med andra flödescytometriska utvärderingar såsom färgning av ytantigener, aldehyddehydrogenasdetektering och dödcellsdiskriminering ( t.ex. med 7-AAD eller propidiumjodid (PI)). Således beskriver vi en värdefull och allmänt tillämplig metod för CSC-identifiering, isolering och delkarakterisering mekaniskt baserat på en funktionell, snarare än en fenotypisk parameter. Även om det ursprungligen utfördes med Hoechst 33342 som utlösande färgämne fokuserar vi här på den senaste Violet-färgbaserade SP-fenotypen som är lösbar på vilken flödescytometer som är utrustad med en violett laserkälla.
Introduction
Effekten av primära cancerterapier har förbättrats väsentligt under det senaste decenniet på grund av tvingande framsteg i den genetiska och molekylära förståelsen av sjukdomen och tillkomsten av riktade läkemedel, såsom terapeutiska antikroppar och småmolekylhämmare. Däremot är metastatisk och återkommande sjukdom fortfarande vanligen oåterkalllig, och sjukligheten och dödligheten förblir höga i dessa kliniska inställningar. CSC: er representerar en distinkt subpopulation inom tumörer och är utrustade med kanoniska stamcellsegenskaper, såsom klonogenicitet / tumorigenicitet, resistens mot flera läkemedel och asymmetrisk celldelning 1 , 2 . Sålunda driver CSC inte bara metastatisk progression och tumör heterogenitet, men fortsätter även under behandling för att predisponera patienten att återfalla. Terapeutisk CSC-eliminering är därför ett viktigt medicinskt behov för att förhindra återkommande sjukdom och tillåta långvarig behandling av cancer 3
Identifiering av sårbarheter och belysande av strategier för att utplåna CSC: er kraftigt beror på metoder som tillåter deras rening från biologiska prover för efterföljande expressionsprofilering och / eller funktionell undersökning. I sin tur är sådana metoder beroende av yt-, intracellulära eller funktionella markörer som är specifika för dessa celler. CSC-specifika ytmarkörer inkluderar, men är inte begränsade till, CD44, CD133, CD24 och CD90 och har använts för att identifiera CSC-populationer i en mängd olika tumörenheter inklusive bröstcancer och koloncancer 4 . En annan markör, aldehyddehydrogenas (ALDH), visar intracellulär lokalisering och kan detekteras funktionellt, vilket ger ett respektive substrat, vars enzymatiska omvandling ger ljus. Med hjälp av detta test har CSC-populationer också identifierats i olika tumörenheter 5 . En komplementär metod som vanligen kallas SP-analys och porträttad här i m Etodologisk detalj, utnyttjar aktiv färgämneutflöde av ABC-läkemedelstransportörer för att identifiera små populationer av fluorescensdimma stamliknande celler 6 , 7 , 8 . För att uppnå detta inkuberas ett givet prov i närvaro av en lipofil DNA-bindande fluorofor som går in i alla celler genom passiv diffusion och inriktar kärn- och mitokondriellt DNA för bindning. Icke-CSCs som saknar ABC-läkemedelstransportörsuttryck ackumulerar färgämnet som resulterar i stark fluorescens, medan CSC: er aktivt extruderar färgämnet som reducerar fluorescens. Farmakologisk inhibering av läkemedelstransportaktivitet upphäver och funktionellt bekräftar SP-fenotypen och bör användas för kontrolländamål. CSC-populationer som uppvisar SP-egenskaper har blivit beskrivna bland annat i äggstockscancer 9 , 10 , prostatacancer 11 ,> 12, bröstcancer 13 , lungcancer 14 , endometriecancer 15 , gliom 16 , 17 och bensarkom 18 . Viktigt är att SP-analysen är kompatibel med både cancercellinjer och primärtumörvävnad, även om primärmaterialet utgör ytterligare utmaningar, såsom kravet på en specifik strategi för tumörcellsdiskriminering (vissa värdcellspopulationer kan också uppvisa SP-egenskaper) 19 , 20 .
De två mest etablerade SP-givande läkemedelstransportörerna är ABCB1 / P-glykoprotein / MDRl / CD243 och ABCG2 / Bcrp1 / CD338 8 , 9 , 21 ; Andra läkemedelstransportörer kan emellertid också vara en molekylär determinant av SP-fenotypen ( t.ex. ABCB5) 22 . ABCB1Kan effektivt blockeras med verapamil medan aktiviteten hos ABCG2 kan upphävas specifikt med fumitremorgin C (FTC) 6 , 19 . En särskild styrka för SP-analys är att den kan kombineras med andra färgämnen ( t.ex. ytmarkörer och ALDH) och att det möjliggör återställning av levande celler, vilket är förenligt med nedströms funktionella undersökningar. Dessutom är SP-detektering i stor utsträckning tillämplig på grund av den höga bevarande av ABC-läkemedelstransportörer bland CSC-populationer 9 , 23 .
Ursprungligen har SP-detektering utförts med användning av Hoechst 33342 som en utlösande färgämne 24 . Detta färgämne uppnår utmärkt upplösning men kräver ultraviolett laser excitation; Därför är dess tillämplighet naturligt begränsad till avancerade flödescytometriska instrument. Ankomsten av DyeCycle Violet (DCV) 25 har öppnat ny avenuEs för SP-analys och utvidgade tillämpligheten av denna metod till standardflödescytometriska instrument som saknar en ultraviolett laserkälla (en violett laserkälla är tillräcklig för att lösa DCV-SP-celler). Viktigt är att Hoechst 33342 och DCV delar gemensamma pumpspecifikationer, vilket indikerar att antingen färgämnen ska identifiera samma cellpopulationer.
Här tillhandahåller vi ett detaljerat försöksprotokoll med DCV-baserad SP-analys för snabb och enkel reproduktion i oberoende laboratorier. Vi uppfattar sålunda vår artikel som en resurs för CSC-forskare som borde bidra till optimering och standardisering av denna användbara cellbiologiska metod.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Detta protokoll är i full överensstämmelse med standardinstitutionella etiska granskningsrådets riktlinjer. Om mänsklig eller animalisk vävnad undersöks med det protokoll som beskrivs här, är forskare skyldiga att ha godkännande från den berörda granskningskommittén i deras institution eller land.
Varning: Standardföreskrifter för säker hantering av biologiska prover gäller för detta protokoll. Detta inkluderar bärande handskar och lab coat, och utför arbetet under ett biosäkerhetsskåp när det är möjligt.
1. Framställning av celler
- Cancercellinjer
- Kultur en respektive human eller murin cancercellslinje vid 37 ° C i 10-30 ml lämpligt medium ( t ex RPMI 1640 kompletterat med 10% ( volym / volym ) FBS, 2 mM L-glutamin och 1x penicillin / streptomycin) och skörd Cellerna vid sub-konfluens ( dvs 70-90%) med användning av digestion med 0,05% trypsin-EDTA eller någon annan de-attAchment procedur. Bestäm cellantalet och kontrollera lönsamheten med hjälp av en räkningskammare och trypanblåfärgning. Fraktionen av levande celler ska överstiga 85%.
OBS! Exempel på humana cancercellinjer som innehåller SP-fack innehåller MCF7 / HTB-22 och SKBR3 / HTB-30 (bröstcancer), A2780 och SKOV-3 / HTB-77 (äggstockscancer) och A549 (lungcancer) 26 .
- Kultur en respektive human eller murin cancercellslinje vid 37 ° C i 10-30 ml lämpligt medium ( t ex RPMI 1640 kompletterat med 10% ( volym / volym ) FBS, 2 mM L-glutamin och 1x penicillin / streptomycin) och skörd Cellerna vid sub-konfluens ( dvs 70-90%) med användning av digestion med 0,05% trypsin-EDTA eller någon annan de-attAchment procedur. Bestäm cellantalet och kontrollera lönsamheten med hjälp av en räkningskammare och trypanblåfärgning. Fraktionen av levande celler ska överstiga 85%.
- Ex vivo tumörvävnad
- Ta ett nytt kirurgiskt tumörprov eller alternativt skörda tumörvävnad från en transplantabel eller genetiskt manipulerad mustumörsmodell. Ta 200-1000 mg vävnad och generera en enkelcellssuspension genom mekanisk disaggregation ( t.ex. med användning av sax eller en skalpell) och enzymatisk digestion ( t.ex. med hjälp av en kollagenas / dispas / DNase-cocktail).
- Filtrera provet genom en 70 μm cut-off filter. Bestäm cellantalet och kontrollera efterlevnad med hjälp av en räknekammare och trypan blUe färgning.
OBS: Digestionscocktails innehåller ofta 200 μg / ml kollagenas P, 0,8 U / mL dispas och 25 μg / ml DNase I, och inkubationstiderna ligger vanligen inom 20-50 min. Helst utföres vävnadsdisaggering enligt ett protokoll optimerat för vävnaden som undersöks 27 , 28 , 29 .
2. Provprover
- Justera cellkoncentrationen till 1 x 106 celler / ml i färskt odlingsmedium (ett näringsinnehållande vehikel är viktigt eftersom färgsprutning är en aktiv energikrävande process). Slutligen överför 1 ml prov till ett vanligt flödescytometri / FACS runda bottenrör (märkt "test").
OBS! För optimala resultat kan det vara nödvändigt att cellkoncentrationen titreras (t ex 5 x 10 5 -1 x 10 6 -2,5 x 10 6 celler / ml), men en lägre cellkoncentrationsgeneralLy ger en högre upplösning 19 . Endast för sortering av applikationer där ett maximalt antal SP-celler ska återvinnas. Det rekommenderas att öka cellkoncentrationen till upp till 1 x 107 celler / ml. - Tillsätt 10 μM DCV i provet och blanda väl, antingen genom försiktig vortexing eller resuspendering i 3-5x. Fortsätt till inhibitionskontroller.
OBS: Optimala resultat kan bero på titrering av utlösande färgämne (t.ex. 2,5; 5; 10; 20 ^ M), men en högre färgkoncentration ger i allmänhet en högre upplösning 19 .
3. Inhiberingskontroller
- Överför 250 μL av den färgämnehaltiga cellsuspensionen till ett nytt flödescytometri / FACS runda bottenrör (märkt "kontroll"). Tillsätt 50 μM verapamil eller 20 μM FTC och blanda väl genom pipettering.
OBS: Verapamil och FTC är de mest väletablerade hämmarna för SP-analys men har olika effluxpumpspecifikitetY: Verapamil hämmar flera ABC-läkemedelstransportörer inklusive ABCB1 och ABCB5, medan FTC är specifik för ABCG2 6 , 19 . Om SP-status för ett enskilt prov är okänt rekommenderas därför att använda både verapamil och FTC i separata rör.
4. Färgning
- Kepsa både "test" och "kontroll" -rören och inkubera dem vid 37 ° C i mörkret i 90 minuter, med försiktig omröring var 15: e minut. Det mesta av färgämnextrusion i SP-celler kommer att inträffa inom de första 45 min, men färgämnesackumulering i icke-SP-celler (som bidrar till upplösning) är endast maximal efter 75-90 min 19 .
- Efter det att färgningen är klar tvättar du cellerna i 3-4 ml iskall PBS och resuspenderar pelleten i en volym av 100 μl (även PBS). Håll cellerna i mörkret och kylt på is och fortsätt till färgning av ytterligare markörer. Alternativt kan du direkt utföra flödescytometrisk analys.
5. Costaining för andra markörer
- Lägg till en önskad panel av fluorokrom-konjugerade antikroppar mot DCV-färgade celler, blanda väl och inkubera cellerna vid 4 ° C i mörkret i 20-30 min. Tvätta cellerna i 3-4 ml iskall PBS och fortsätt till dödcellsdiskriminering.
OBS: Antikroppsformat som är lättkompatibla med DCV och som nästan inte kräver kompensation är PerCP eller PerCP-Cy5.5, PE-Cy7, APC, Alexa Fluor 647, APC-Cy7, APC-H7, BV711, Alexa Fluor 750 och BV786 . Formater som är kompatibla med DCV men kan kräva ersättning inkluderar FITC, Alexa Fluor 488, PE och BV650. Format som är nästan inte kompatibla med DCV inkluderar BV421, V450 och V500. - Lägg till 7-AAD (eller PI) i DCV-färgade celler vid den koncentration som rekommenderas av den särskilda tillverkaren och inkubera proverna i 5-10 min i mörkret. Filtrera proverna genom 70 μm avskärningsavlastare och fortsätt till flödescytometrisk analys.
6. Flödescytometrisk analys
OBS! Det rekommenderas att man sätter på respektive flödescytometriska instrument under färgprocessen redan så att allt är inställt så snart provet är klart. Detta inkluderar även vanliga underhållsprocedurer som systemprestandespårning och tankpåfyllning.
- Hämta cellerna på flödescytometern och grind dem på ett bivariat FSC / SSC punktpunktsplot (Figur 1B). Exkludera dubbletter och aggregat genom att jämföra de olika signalerna från FSC ( dvs höjd, bredd, areal) (Figur 1C).
- Om en dödcellmarkör har inkluderats, grind på den livskraftiga cellfraktionen ( t.ex. 7-AAD-negativ) ( Figur 1D ). Visualisera de livskraftiga singletcellerna på en bivariate punktrit för "blå" och "röd" DCV-utsläpp. För detta ändamål, visa "blå" fluorescenskanalen på y-axeln ( t.ex. 450/50) och "Röd "fluorescenskanal på x-axeln ( t.ex. 525/50).
- Växla båda kanalerna till linjärt läge och justera detektorspänningarna motsvarande så att SP lokaliseras till sidan av plottet i den nedre vänstra kvadranten. Omvänt lokaliseras icke-SP till den övre högra kvadranten av plottet som återspeglar cellcykelfördelningen (G1 och G2). Gå in i SP och sluta förvärvet ( Figur 1E ).
OBS: DCV-definierade SP-celler kan detekteras med hjälp av flödescytometriska instrument utrustade med en violett laser excitationskälla ( dvs. en 405 nm laserlinje). Det är ett specifikt för SP-analys att den emitterade fluorescensen mäts i linjärt läge och i två separata kanaler som visas på en bivariat punktpunkt. Den "blåa" emissionen av DCV mäts vid ca 450 nm ( t.ex. med ett 450/40 standardfilter) och den "röda" emissionen av DCV mäts vid ungefär 510 - 585 nm ( t.ex. med en 510/50, en 525/50 eller ett 585/15 filter) 19 . På grund av analysens särskilda kemi är separationen mellan SP och icke-SP-celler i allmänhet högre i den "röda" fluorescenskanalen 19 .
- Ladda in inhibitorkontrollen (erna) och skaffa data. SP-cellerna har nu försvunnit eller reducerats väsentligt ( Figur 1F ). Om det behövs, förstärka SP-porten baserat på dessa data.
- För att undersöka ytmarkörsexpression med SP-celler, lämna den "röda" fluorescensen av DCV på x-axeln och visa en respektive fluorescenskanal på y-axeln i logaritmiskt läge ( t.ex. APC). Justera detektorspänningarna motsvarande och grind fraktionen av SP-celler som färgar positivt för den undersökta markören (s) ( Figur 1G ). Samuttryck av en viss markör med SP-celler ger en respektive signal i diagrammets 30 övre vänstra kvadrant.
- Spela inData och / eller sortera SP-cellerna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tillhandahålles en representativ SP-analys av A2780-celler, en human ovariecancercellslinje som tidigare visat sig ha en SP-redovisning för mindre än 1% av cellerna 9 . Celler odlades vid 37 ° C i RPMI 1640 kompletterad med 10% ( volym / volym ) FBS, 2 mM L-glutamin och 1x penicillin / streptomycin och skördades vid 85% konfluens med användning av behandling med 0,05% trypsin-EDTA. Cellerna tvättades i PBS och filtrerades genom 70 | im avskurna simmar. Cellantalet bestämdes med användning av en räkningskammare och trypanblåfärgning och 1 x 106 celler / ml (färskt medium) färgades med 10 ^ M DCV under 90 minuter vid 37 ° C i mörkret. Parallellt inkuberades en alikvot därav i närvaro av 20 | im FTC under exakt samma betingelser. Cellerna tvättades i 4 ml PBS och en APC-konjugerad antikropp mot ABCG2 tillsattes till "test" -röret vid en förtitrerad koncentration. Efter inkubatiPå i 25 min vid 4 ° C tvättades cellerna i PBS och 7-AAD tillsattes för att märka döda celler. Proverna kyldes på is och analyserades på ett FACS-instrument. Den avbildade gatingstrategin är mer eller mindre universellt tillämplig på andra prover, även om högt heterogent material såsom prov från vävnadsprover kan kräva fördefinition av målcellfraktionen med användning av specifika ytmarkörer ( t ex EpCAM, CD45, CD31). De visade resultaten är avsedda att fungera som referens för DCV-baserad SP-detektering i andra laboratorier. Följaktligen bör de relativa lokaliseringarna av de undersökta cellpopulationerna vara ungefär jämförbara men säkert inte identiska med de som erhållits av andra forskare med oberoende biologiska prover.
Figur 1: Arbetsflöde och representativa resultat. (A) Huvuddiagram för SP-detektering med användning av DCV-färgg. Costaining för ytterligare markörer är frivilligt, men dödceller diskriminering rekommenderas starkt. ( BG ) Representativ SP-analys av A2780 humana ovariecancerceller som utförts på ett FACS-instrument. Celler är gated enligt FSC / SSC egenskaper (B) och dubletter och aggregat utesluts genom att jämföra de olika parametrarna för FSC ( t.ex. höjd och bredd) ( C ). Därefter diskrimineras döda celler genom att gata på den 7-AAD-negativa (eller PI-negativa) cellfraktionen ( D ). Levande enskilda celler visas sedan på en linjär bivariat punktpunkt för blått och rött DCV-utsläpp och SP (och motsvarande icke-SP) är gated ( E ). Samma analys görs nu med en respektive inhiberingskontroll (i detta fall användes FTC), och detta bör leda till nästan fullständig försvinnande av celler i SP-porten ( F ). Slutligen kan den identifierade SP-karaktären mer noggrant präglas, t.ex. av deteRmining av ABC-läkemedelstransportören som kan vara ansvarig för färgutsträngning och därigenom ge SP-fenotypen (i detta fall ABCG2, i linje med FTC-känsligheten). ( G ). FTC, fumitremorgin C; ALDH, aldehyddehydrogenas. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Framsteg i klinisk hantering av cancer beror också på utvecklingen av behandlingsmodaliteter som riktar sig mot CSC. Metoder som möjliggör tillförlitlig isolering av CSC från biologiska prover kommer att påskynda identifieringen av lämpliga mål och är därför av avgörande betydelse i detta försök. SP-analys är en etablerad och värdefull teknik för att identifiera CSC-populationer som uttrycker ABC-läkemedelstransportörer och implementeringen av DCV har utökat användbarheten till standardflödescytometriska instrument. Mekaniskt utnyttjar SP-diskriminering aktiv färgutsläpp av ABC-läkemedelstransportörer för att detektera CSC-baser på låg fluorescens, vilket medför en karakteristisk lokalisering vid sidan av plottbotten vänster till motsvarande icke-SP. Det är viktigt att DCV-baserad SP-detektering är en robust och enkel metod, med de mest kritiska stegen att (i) beredningen av cellerna (ii) färgprocessen (iii) valet av en lämplig inhibitorItor och (iv) flödescytometrisk analys. Eftersom färgsprutträngning är en aktiv energikrävande process är det särskilt relevant att börja med en bra celllönsamhet. Endast livskraftiga (läkemedelstransporter-uttryckande) celler kan producera en SP. Dessutom är det ofta meningsfullt att optimera förhållandet mellan färgkoncentration och celltäthet och därigenom förbättra separationen av SP-celler (i sin tur kräver detta titrering av både DCV och celler). En allmän regel är att både en högre färgkoncentration och en lägre cellkoncentration resulterar i förbättrad separation 19 . Nyckeln till ett framgångsrikt DCV-experiment är den funktionella valideringen av SP med användning av farmakologiska hämmare för ABC-läkemedelstransporteraktivitet. Som tidigare nämnts är verapamil och FTC bland de mest etablerade inhibitorerna för SP-analys och har olika pumpspecifikationer (FTC är specifik för ABCG2, medan verapamil hämmar flera pumpar). För prov med okänd SP-status rekommenderas därför att använda bådaHämmare i separata rör. Ett annat alternativ är användningen av pan-ABC-läkemedelstransporterhämmaren reserpin 4 . Forskare bör dock vara medvetna om att autofluorescens av denna förening potentiellt kan störa DCV-signalen 19 . När cellerna analyseras för blått och rött DCV-utsläpp bör detektorspänningarna justeras så att båda populationerna ( dvs. SP och icke-SP) är synliga med maximal separation. Om bilden ser konstig ut, kan logaritmisk skalning vara anledningen till att (i så fall byta båda kanalerna tillbaka till linjärt läge).
Det är också viktigt att notera att den DCV-baserade SP-analysen varken är specifik för cancer eller har den ursprungligen utvecklats för applicering i onkologi. I stället är det specifikt för ABC-läkemedelstransportörer och därigenom underlättar detekteringen och isoleringen av fysiologiska (vävnad) stamceller, såsom linjering - Sca-1 + c-kit +Hematopoietiska stamceller 25 . Dessutom kan differentierade celltyper som etablerar dedikerade barriärer vid viktiga kroppsplatser uppvisa SP-egenskaper 20 . Att tillämpa DCV-baserad SP-detektering på primära vävnader kräver därför specifik diskriminering av målcellspopulationen med användning av lämpliga markörer.
Med tanke på den höga bevarande av läkemedelsutloppspumpar bland CSC-populationer 9 , 23 är DCV-baserad SP-detektering i stor utsträckning tillämplig, ett faktum som också exemplifieras av dess framgångsrika användning över tumörenheter innefattande enheter med olika könskiktets ursprung 9 , 17 , 18 . Andra fördelar innefattar att (i) celler med direkta implikationer i läkemedelsresistens identifieras (särskilt viktigt för att klara av kliniskt relevanta cancercellsundergrupper som medierar sjukdomsupprepningRence) och att (ii) detekteringen av en funktionell, snarare än en statisk parameter kan ge mer analysspecificitet och förbättra upplösningen 19 , 31 , 32 . Ur den konceptuella / tekniska sidan är DCV-baserad SP-detektering klart distinkt från antikroppsmedierade ytfärgningar: (i) Målstrukturen visar intracellulär lokalisering och representerar nukleinsyra, inte protein. (Ii) Analysen detekterar proteinaktivitet, inte enbart närvaro eller densitet. (Iii) Målcellerna definieras på grund av låg fluorescens, inte av en positiv signal. (Iv) DCV är som ett DNA-bindande färgämne känsligt för även små variationer i cell- eller färgkoncentrationen under färgning 19 . (V) DCV-fluorescens mäts i linjärt läge, inte logaritmiskt. (Vi) DCV-fluorescens ( dvs fluorescensen genererad av en enda fluorofor) mäts i två separata kanaler, nOt i ett enda våglängdsintervall. Trots dessa särdrag är DCV-baserad SP-analys lätt att utföra och uppenbarligen sträcker den flödescytometriska verktygslådan för CSC-forskning.
DCV-baserad SP-analys erbjuder också många möjligheter till kostnadsåtgärder för andra markörer, vilka är kompatibla med både konventionella antikroppsmedierade ytfärgningar (många möjliga format) och den kommersiella analysen som detekterar ALDH-enzymatisk aktivitet. Men vi fokuserade här på ytfärgning och läsaren hänvisas till publicerad litteratur 4 för att se metodiska detaljer om kodning av ALDH-aktivitet. I vilket fall som helst bör DCV-utlösad SP-analys kombineras med dödcellsdiskriminering och uppenbara reagenser för detta ändamål är 7-AAD och PI.
OBS: DCV-definierade SP-celler (och icke-SP-kontrollceller) kan renas med hjälp av sorteringsapplikationen för motsvarande flödescytometriska instrument. Eftersom SP-analysen detekterar en funktionell paRameter som endast livskraftiga celler kan producera, kan livskraften hos de återvunna SP-cellerna i allmänhet förväntas vara hög (ibland ungefär 100%). Om det skulle uppstå problem med efterlevnadsevnen, kan olika tekniska parametrar kontrolleras, t.ex. sorteringsmunstyckets storlek, buffertmedlets natur och temperaturen vid sortering (med ett 70 μm munstycke har vi aldrig haft problem med Livskraft, men ett större munstycke kan fortfarande hjälpa till med mycket känsliga celler). De utvunna cellerna kan utsättas för nedströmsanalyser såsom qRT-PCR, Western blotting och global expressionsprofilering ( t.ex. genom att använda genmatris eller den senaste RNASeq-tekniken). Vidare kan isolerade SP-celler undersökas för funktionella stamcellsegenskaper ( t.ex. singelcellklonogenicitet och seriell transplantation) eller subkultureras för att fastställa cellinjer av berikade eller till och med rena SP-celler som kan vara stabila under månaderna 9 . I vårStudien använde vi vanliga medium- och konventionella 2D-plastflaskor till DCV-definierade CSC 9 -odlingar, men stamceller-selektiva modaliteter som förankringsoberoende / 3D-odlingsförhållanden och specialmedier är också möjliga. Vi föreslår att de mest gynnsamma förutsättningarna för in vitro- expansion av ett givet SP-fack måste kontrolleras individuellt.
Sammanfattningsvis beskriver vi här det detaljerade experimentella arbetsflödet för CSC-identifiering / isolering med hjälp av DCV-baserad SP-analys. Vårt papper ska hjälpa CSC-forskare att genomföra och upprätta denna användbara metod i sina egna laboratorier, vilket ytterligare bör främja belysningen av terapeutiska anti-CSC-strategier för förbättrad klinisk hantering av cancer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att förklara. Det finns också ingen författare involvering i förberedelsen av manuskriptet.
Acknowledgments
Maximilian Boesch stöds av ett Erwin Schrödinger-stipendium från den österrikiska vetenskapsfonden FWF (bidragsnummer J-3807).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vybrant DyeCycle Violet | Thermo Fisher Scientific | V35003 | Ready to use |
| Verapamil hydrochloride | Sigma-Aldrich | V4629 | Dissolve in ethanol |
| Fumitremorgin C | Sigma-Aldrich | F9054 | Dissolve in DMSO |
| 7-AAD (or propidium iodide - PI) | BioLegend | 420403 | Ready to use |
| Standard cell culture reagents (e.g., medium, FBS, L-glutamine, antibiotics, PBS, trypsin-EDTA, etc.) | Different suppliers | ||
| Sample/cells of interest (e.g., human or murine cancer cell line, human or murine tumor tissue) | Different suppliers | ||
| Flow cytometric instrument (FACS; analyzer or cell sorter) | Different suppliers | Violet laser source required | |
| FACS tubes (round-bottom) | Different suppliers | Tubes with cap recommended | |
| 70 µm cut-off strainers | Different suppliers | Optional but recommended | |
| Digestion enzyme mix (e.g., collagenase/dispase/Dnase) | Different suppliers | Only relevant for tissue dissociation | |
| Flurochrome-conjugated antibodies against surface markers of interest | Different suppliers | Optional | |
| ALDEFLUOR Kit | STEMCELL Technologies | 01700 | Optional |
References
- Pattabiraman, D. R., Weinberg, R. A. Tackling the cancer stem cells - what challenges do they pose? Nat Rev Drug Discov. 13 (7), 497-512 (2014).
- Boesch, M., et al. Heterogeneity of Cancer Stem Cells: Rationale for Targeting the Stem Cell Niche. Biochim Biophys Acta. 1866 (2), 276-289 (2016).
- Li, Y., et al. Suppression of cancer relapse and metastasis by inhibiting cancer stemness. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (6), 1839-1844 (2015).
- Greve, B., Kelsch, R., Spaniol, K., Eich, H. T., Götte, M. Flow cytometry in cancer stem cell analysis and separation. Cytometry A. 81 (4), 284-293 (2012).
- Marcato, P., Dean, C. A., Giacomantonio, C. A., Lee, P. W. Aldehyde dehydrogenase: its role as a cancer stem cell marker comes down to the specific isoform. Cell Cycle. 10 (9), 1378-1384 (2011).
- Golebiewska, A., Brons, N. H., Bjerkvig, R., Niclou, S. P. Critical appraisal of the side population assay in stem cell and cancer stem cell research. Cell Stem Cell. 8 (2), 136-147 (2011).
- Hirschmann-Jax, C., et al. A distinct "side population" of cells with high drug efflux capacity in human tumor cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (39), 14228-14233 (2004).
- Zhou, S., et al. The ABC transporter Bcrp1/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype. Nat Med. 7 (9), 1028-1034 (2001).
- Boesch, M., et al. The side population of ovarian cancer cells defines a heterogeneous compartment exhibiting stem cell characteristics. Oncotarget. 5 (16), 7027-7039 (2014).
- Szotek, P. P., et al. Ovarian cancer side population defines cells with stem cell-like characteristics and Mullerian Inhibiting Substance responsiveness. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (30), 11154-11159 (2006).
- Brown, M. D., et al. Characterization of benign and malignant prostate epithelial Hoechst 33342 side populations. Prostate. 67 (13), 1384-1396 (2007).
- Mathew, G., et al. ABCG2-mediated DyeCycle Violet efflux defined side population in benign and malignant prostate. Cell Cycle. 8 (7), 1053-1061 (2009).
- Engelmann, K., Shen, H., Finn, O. J. MCF7 side population cells with characteristics of cancer stem/progenitor cells express the tumor antigen MUC1. Cancer Res. 68 (7), 2419-2426 (2008).
- Ho, M. M., Ng, A. V., Lam, S., Hung, J. Y. Side population in human lung cancer cell lines and tumors is enriched with stem-like cancer cells. Cancer Res. 67 (10), 4827-4833 (2007).
- Kato, K., et al. Endometrial cancer side-population cells show prominent migration and have a potential to differentiate into the mesenchymal cell lineage. Am J Pathol. 176 (1), 381-392 (2010).
- Bleau, A. M., et al. PTEN/PI3K/Akt pathway regulates the side population phenotype and ABCG2 activity in glioma tumor stem-like cells. Cell Stem Cell. 4 (3), 226-235 (2009).
- Harris, M. A., et al. Cancer stem cells are enriched in the side population cells in a mouse model of glioma. Cancer Res. 68 (24), 10051-10059 (2008).
- Murase, M., et al. Side population cells have the characteristics of cancer stem-like cells/cancer-initiating cells in bone sarcomas. Br J Cancer. 101 (8), 1425-1432 (2009).
- Boesch, M., Wolf, D., Sopper, S. Optimized Stem Cell Detection Using the DyeCycle-Triggered Side Population Phenotype. Stem Cells Int. 2016, 1652389 (2016).
- Golebiewska, A., et al. Side population in human glioblastoma is non-tumorigenic and characterizes brain endothelial cells. Brain. 136 (PT 5), 1462-1475 (2013).
- Boesch, M., et al. Drug transporter-mediated protection of cancer stem cells from ionophore antibiotics. Stem Cells Transl Med. 4 (9), 1028-1032 (2015).
- Fukunaga-Kalabis, M., et al. Tenascin-C promotes melanoma progression by maintaining the ABCB5-positive side population. Oncogene. 29 (46), 6115-6124 (2010).
- Dean, M., Fojo, T., Bates, S. Tumour stem cells and drug resistance. Nat Rev Cancer. 5 (4), 275-284 (2005).
- Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J Exp Med. 183 (4), 1797-1806 (1996).
- Telford, W. G., Bradford, J., Godfrey, W., Robey, R. W., Bates, S. E. Side population analysis using a violet-excited cell-permeable DNA binding dye. Stem Cells. 25 (4), 1029-1036 (2007).
- Boesch, M., et al. High prevalence of side population in human cancer cell lines. Oncoscience. 3 (3-4), 85-87 (2016).
- Ali, M. Y., Anand, S. V., Tangella, K., Ramkumar, D., Saif, T. A. Isolation of Primary Human Colon Tumor Cells from Surgical Tissues and Culturing Them Directly on Soft Elastic Substrates for Traction Cytometry. J Vis Exp. (100), e52532 (2015).
- Azari, H., et al. Isolation and expansion of human glioblastoma multiforme tumor cells using the neurosphere assay. J Vis Exp. (56), e3633 (2011).
- Hasselbach, L. A., et al. Optimization of high grade glioma cell culture from surgical specimens for use in clinically relevant animal models and 3D immunochemistry. J Vis Exp. (83), e51088 (2014).
- Boesch, M., et al. DyeCycle Violet used for side population detection is a substrate of P-glycoprotein. Cytometry A. 81 (6), 517-522 (2012).
- Patrawala, L., et al. Side population is enriched in tumorigenic, stem-like cancer cells, whereas ABCG2+ and ABCG2- cancer cells are similarly tumorigenic. Cancer Res. 65 (14), 6207-6219 (2005).
- Guha, P., et al. Nicotine promotes apoptosis resistance of breast cancer cells and enrichment of side population cells with cancer stem cell-like properties via a signaling cascade involving galectin-3, alpha9 nicotinic acetylcholine receptor and STAT3. Breast Cancer Res Treat. 145 (1), 5-22 (2014).
