Summary
Metoder som tillater karakterisering og isolering av stamcellepopulasjoner fra biologiske prøver, er kritiske for fremveksten av stamcelle-målrettede behandlinger i kreft og utover. Her gir vi en detaljert protokoll for kreft-stamcelleisolasjon ved hjelp av fargestoff-utløst sidepopulasjonsfenotype.
Abstract
Kreft er en stamcelle-drevet sykdom, og utrydding av disse cellene har blitt et stort terapeutisk mål. Dekryptere sårbarheter av kreftstamceller (CSCs) og identifisere passende molekylære mål er avhengig av metoder som tillater deres spesifikke diskriminering i heterogene prøver som cellelinjer og ex vivo tumorvev. Flowcytometri / FACS er en kraftig teknologi for å multi-parametrisk dissekere biologiske prøver på enkeltcellenivå og er til dato den valgte metoden for å gjenopprette levende celler for nedstrømsanalyser. Overflate markører som CD44 og CD133 samt deteksjon av aldehyd dehydrogenase enzymatisk aktivitet har ofte blitt brukt til å definere og sortere CSCer fra tumorprøver av FACS. En komplementær tilnærming, som er avbildet her i metodologisk detalj, benytter funksjonell fargekstrudering av ABC-legemiddeltransportører, som identifiserer en distinkt populasjon av fluorescensdimceller som vanligvis refereres til som sidepopulasjon (SP). SP; Kreftceller utviser kanoniske stamcelleegenskaper og kan oppheves og funksjonelt bekreftet ved anvendelse av midler som hemmer fargestrekkende legemiddeltransportør (oftest ABCB1 / P-glykoprotein / MDR1 / CD243 og ABCG2 / Bcrp1 / CD338). Videre er SP-analysen kompatibel med andre strømningscytometriske evalueringer som farging av overflateantigener, aldehyddehydrogenase-deteksjon og dødcelle-diskriminering ( f.eks . Med 7-AAD eller propidiumjodid (PI)). Dermed beskriver vi en verdifull og bredt anvendelig metode for CSC-identifikasjon, isolasjon og underkarakterisering mekanisk basert på en funksjonell, snarere enn en fenotypisk parameter. Selv om det opprinnelig ble utført med Hoechst 33342 som utløsende fargestoff, fokuserer vi her på den nyere Violet-fargebasert SP-fenotypen som kan løses på et hvilket som helst flow-cytometer utstyrt med en violet laser kilde.
Introduction
Effekten av primære kreftterapier har forbedret seg vesentlig i løpet av det siste tiåret på grunn av overbevisende fremskritt i den genetiske og molekylære forståelsen av sykdommen og tilkomsten av målrettede stoffer som terapeutiske antistoffer og små molekylhemmere. I motsetning er metastatisk og tilbakevendende sykdom fortsatt vanligvis uhelbredelig, og sykelighet og dødelighet forblir høye i disse kliniske innstillingene. CSCer representerer en distinkt subpopulasjon i tumorer og er utstyrt med kanoniske stamcelleegenskaper som klonogenitet / tumoregenisitet, multidrugsresistens og asymmetrisk celledeling 1 , 2 . Dermed CSC driver ikke bare metastatisk progresjon og tumor-heterogenitet, men fortsetter også under behandling for å predisponere pasienten for å gå tilbake. Terapeutisk CSC-eliminering er derfor et viktig medisinsk behov for å forhindre sykdomstilfelle og tillate langsiktig kurbehandling 3
Identifisering av sårbarheter og belysning av strategier for å utrydde CSCs tungt, avhenger av metoder som tillater rensing fra biologiske prøver for påfølgende uttrykksprofilering og / eller funksjonell undersøkelse. I slike tilfeller stole slike metoder på overflate-, intracellulære eller funksjonelle markører som er spesifikke for disse cellene. CSC-spesifikke overflate markører inkluderer, men er ikke begrenset til, CD44, CD133, CD24 og CD90, og har blitt brukt til å identifisere CSC-populasjoner i en rekke tumor-enheter, inkludert brystkreft og tykktarmskreft 4 . En annen markør, aldehyd dehydrogenase (ALDH), viser intracellulær lokalisering og kan påvises funksjonelt ved å gi et respektivt substrat hvis enzymatisk konvertering gir lys. Ved hjelp av denne testen, har CSC-populasjoner blitt identifisert i forskjellige tumor-enheter også 5 . En komplementær metode, ofte referert til som SP analyse og portrayed her i m Etodologisk detalj, utnytter aktivt farvestoffutstrømning av ABC-legemiddeltransportører for å identifisere små populasjoner av fluorescensdimne stamlignende celler 6 , 7 , 8 . For å oppnå dette inkuberes en gitt prøve i nærvær av en lipofil DNA-bindende fluorofor som kommer inn i alle celler gjennom passiv diffusjon og målretter kjernefysisk og mitokondriell DNA for binding. Ikke-CSCs uten ABC-stofftransportør uttrykker akkumulere fargestoffet som resulterer i lys fluorescens, mens CSCer ekstruderer aktivt fargestoffet som reduserer fluorescens. Farmakologisk inhibering av stofftransportaktivitet abrogates og funksjonelt bekrefter SP-fenotypen og bør brukes til kontrollformål. CSC-populasjoner som har SP-karakteristika er blitt beskrevet blant annet i eggstokkreft 9 , 10 , prostatakreft 11 ,> 12, brystkreft 13 , lungekreft 14 , endometriecancer 15 , gliom 16 , 17 og bensarkom 18 . Det er viktig at SP-analysen er kompatibel med både kreftcellelinjer og primær tumorvev, selv om primærmaterialet utgjør ytterligere utfordringer, for eksempel kravet til en spesifikk tumorcellerdisponeringsstrategi (visse vertscellepopulasjoner kan også utvise SP-karakteristika) 19 , 20 .
De to mest etablerte SP-overførende legemiddeltransportørene er ABCB1 / P-glykoprotein / MDR1 / CD243 og ABCG2 / Bcrp1 / CD338 8 , 9 , 21 ; Andre legemiddeltransportører kan imidlertid også være en molekylær determinant av SP-fenotypen ( f.eks . ABCB5) 22 . ABCB1Kan blokkeres effektivt med verapamil, mens aktiviteten til ABCG2 kan spesifiseres spesifikt med fumitremorgin C (FTC) 6 , 19 . En bestemt styrke i SP-analyse er at den kan kombineres med andre fargestoffer ( f.eks . Overflate markører og ALDH), og at det gjør at livcelleutvinning er kompatibel med nedstrøms funksjonelle undersøkelser. Videre er SP-deteksjon stort sett anvendelig på grunn av høye bevaring av ABC-legemiddeltransportører blant CSC-populasjoner 9 , 23 .
Opprinnelig har SP-deteksjon blitt utført ved anvendelse av Hoechst 33342 som utløsende fargestoff 24 . Dette fargestoffet oppnår utmerket oppløsning, men krever ultrafiolett laser excitasjon; Derfor er dets anvendelighet naturlig begrenset til high-end flytcytometriske instrumenter. Adventen av DyeCycle Violet (DCV) 25 har åpnet ny avenuEs for SP analyse og utvidet anvendeligheten av denne metoden til standard flow-cytometriske instrumenter som mangler en ultrafiolett laser kilde (en violet laser kilde er tilstrekkelig til å løse DCV-SP celler). Det er viktig at Hoechst 33342 og DCV deler vanlige pumpespesifikasjoner, noe som indikerer at enten fargestoffer skal identifisere de samme cellepopulasjonene.
Her gir vi en detaljert eksperimentell protokoll for DCV-basert SP-analyse for rask og enkel gjengivelse i uavhengige laboratorier. Vi ser dermed vår artikkel som en ressurs for CSC-forskere som skal bidra til optimalisering og standardisering av denne nyttige cellebiologiske metoden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokollen er i full overensstemmelse med standardinstitusjonens retningslinjer for institusjonell etisk gjennomgang. Hvis menneskelig eller dyrt vev undersøkes ved hjelp av protokollen som er avbildet her, er forskerne pliktige til å ha godkjenning fra det aktuelle kontrollpanelet i deres institusjon eller land.
Forsiktig: Standard forholdsregler for sikker håndtering av biologiske prøver gjelder for denne protokollen. Dette inkluderer slitasjehansker og laboratoriejakke, og utfører arbeidet under et biosikkerhetsskap når det er mulig.
1. Fremstilling av celler
- Kreftcellelinjer
- Kultur en respektiv human eller murin kreftcellelinje ved 37 ° C i 10-30 ml egnet medium ( f.eks . RPMI 1640 tilsatt 10% ( v / v ) FBS, 2 mM L-glutamin og 1x penicillin / streptomycin) og høsting Cellene ved subkonfluens ( dvs. 70-90%) ved å bruke fordøyelsen med 0,05% trypsin-EDTA eller noen annen de-attSmerteprosedyre. Bestem celletallet og kontroller for levedyktighet ved å bruke et tellekammer og trypanblå flekker. Fraksjonen av levedyktige celler skal overstige 85%.
MERK: Eksempler på humane kreftcellelinjer som inneholder SP-rom inkluderer MCF7 / HTB-22 og SKBR3 / HTB-30 (brystkreft), A2780 og SKOV-3 / HTB-77 (eggstokkreft) og A549 (lungekreft) 26 .
- Kultur en respektiv human eller murin kreftcellelinje ved 37 ° C i 10-30 ml egnet medium ( f.eks . RPMI 1640 tilsatt 10% ( v / v ) FBS, 2 mM L-glutamin og 1x penicillin / streptomycin) og høsting Cellene ved subkonfluens ( dvs. 70-90%) ved å bruke fordøyelsen med 0,05% trypsin-EDTA eller noen annen de-attSmerteprosedyre. Bestem celletallet og kontroller for levedyktighet ved å bruke et tellekammer og trypanblå flekker. Fraksjonen av levedyktige celler skal overstige 85%.
- Ex vivo tumorvev
- Ta en frisk kirurgisk svulstprøve eller alternativt høst tumorvev fra en transplanterbar eller genetisk utviklet musetumormodell. Ta 200-1 000 mg vev og generer en enkeltcellesuspensjon ved mekanisk disaggregasjon ( f.eks . Bruk av saks eller en skalpell) og enzymatisk fordøyelse ( f.eks . Ved bruk av en kollagenase / dispase / DNase-cocktail).
- Filtrer prøven gjennom en 70 μm cut-off filter. Bestem celletallet og kontroller for levedyktighet ved å bruke et tellekammer og trypan blUe farging.
MERK: Digestion cocktails inneholder ofte 200 μg / ml kollagenase P, 0,8 U / ml dispase og 25 μg / ml DNase I, og inkubasjonstider ligger vanligvis i området fra 20 til 50 minutter. Ideelt sett utføres væskedisaggering i henhold til en protokoll optimalisert for vevet under undersøkelse 27 , 28 og 29 .
2. Testprøver
- Juster cellekonsentrasjonen til 1 x 106 celler / ml i fersk dyrkningsmedium (et næringsholdig kjøretøy er viktig da fargekstrudering er en aktiv energikrevende prosess). Endelig overfør 1 ml prøve til et vanlig flowcytometri / FACS rundbunnsrør (merket "test").
MERK: For optimal resultater kan det være nødvendig at cellekonsentrasjonen er titrert (for eksempel 5 x 10 5 -1 x 10 6 -2,5 x 10 6 celler / ml), men en lavere cellekonsentrasjon genereltLy gir en høyere oppløsning 19 . Bare for sortering av applikasjoner der maksimalt antall SP-celler skal utvinnes, anbefales det å øke cellekonsentrasjonen til opptil 1 x 107 celler / ml. - Tilsett 10 μM DCV i prøven og bland godt, enten ved forsiktig vortexing eller resuspensjon i 3-5x. Fortsett til inhiberingskontroller.
MERK: Optimale resultater kan avhenge av titrering av utløsende fargestoff (for eksempel 2,5; 5; 10; 20 μM), men en høyere fargekonsentrasjon gir generelt en høyere oppløsning 19 .
3. Inhiberingskontroller
- Overfør 250 μL av den fargestoffholdige cellesuspensjonen til et nytt flow-cytometri / FACS rundbunnsrør (merket 'kontroll'). Tilsett 50 μM verapamil eller 20 μM FTC og bland godt ved pipetting.
MERK: Verapamil og FTC er de mest veletablerte hemmere for SP-analyse, men har forskjellige efflukspumpespesifikasjonerY: Verapamil hemmer flere ABC-legemiddeltransportører, inkludert ABCB1 og ABCB5, mens FTC er spesifikk for ABCG2 6 , 19 . Hvis SP-statusen til en enkelt prøve er ukjent, anbefales det derfor å bruke både verapamil og FTC i separate rør.
4. Farging
- Hett både test- og kontrollrørene og inkuber dem ved 37 ° C i mørket i 90 minutter, med forsiktig omrøring hvert 15. minutt. Det meste av fargekroppen i SP-celler vil forekomme innen de første 45 minutter, men fargestoffsammensetning i ikke-SP-celler (som bidrar til oppløsning) er bare maksimal etter 75-90 min. 19 .
- Etter at farvingen er fullført, vask cellene i 3-4 ml iskald PBS og resuspender pelleten i et volum på 100 μl (også PBS). Hold cellene i mørket og kjølt på is, og fortsett til flekker av ekstra markører. Alternativt kan du direkte utføre flow-cytometrisk analyse.
5. Costaining for andre markører
- Tilsett et ønsket panel av fluorokrom-konjugerte antistoffer mot DCV-fargede celler, bland godt og inkuber cellene ved 4 ° C i mørket i 20-30 minutter. Vask cellene i 3 - 4 ml iskald PBS og fortsett til dødcelle diskriminering.
MERK: Antistoffformater som er lett kompatible med DCV, og som nesten ikke krever kompensasjon, inkluderer PerCP eller PerCP-Cy5.5, PE-Cy7, APC, Alexa Fluor 647, APC-Cy7, APC-H7, BV711, Alexa Fluor 750 og BV786 . Formater som er kompatible med DCV, men som kan kreve kompensasjon, inkluderer FITC, Alexa Fluor 488, PE og BV650. Formater som er praktisk talt ikke kompatible med DCV inkluderer BV421, V450 og V500. - Legg til 7-AAD (eller PI) til DCV-fargede celler ved konsentrasjonen anbefalt av den spesielle produsenten og inkuber prøvene i 5-10 minutter i mørket. Filtrer prøvene gjennom 70 μm avskjæringsspoler og fortsett til strømningscytometrisk analyse.
6. Flowcytometrisk analyse
MERK: Det anbefales å slå på det respektive flowcytometriske instrumentet under fargeprosessen allerede, slik at alt settes så snart prøvene er klare. Dette inkluderer også standard vedlikeholdsprosedyrer som systemytelsessporing og tankpåfylling.
- Oppbevar cellene på strømningscytometeret og grind dem på en bivariant FSC / SSC punktpunktsdiagram (Figur 1B). Ekskluder dubletter og aggregater ved å sammenligne de forskjellige signalene til FSC ( dvs. høyde, bredde, areal) (figur 1C).
- Hvis en dødcelle markør er inkludert, gate på den levedyktige cellefraksjon ( f.eks . 7-AAD-negativ) ( Figur 1D ). Visualiser de levedyktige singletcellene på en bivariate punktplot for "blå" og "rød" DCV-utslipp. Til dette formål, vis den "blå" fluorescenskanalen på y-aksen ( f.eks . 450/50) og "Rød fluorescenskanal på x-aksen ( f.eks . 525/50).
- Bytt begge kanalene til lineær modus og juster detektorspenningene tilsvarende, slik at SP lokaliserer til siden av plottet i nedre venstre kvadrant. Omvendt lokaliserer ikke-SP-posisjonen til øvre høyre kvadrant av plottet som reflekterer cellesyklusfordelingen (G1 og G2). Port SP og stopp oppkjøpet ( Figur 1E ).
MERK: DCV-definerte SP-celler kan detekteres ved hjelp av strømningscytometriske instrumenter utstyrt med en violett lasereksitasjonskilde ( dvs. en 405 nm laserlinje). Det er en spesifikk av SP-analyse at emittert fluorescens måles i lineær modus og i to separate kanaler som vises på en bivariate punktplot. Den "blå" emisjonen av DCV måles ved ca. 450 nm ( f.eks . Med et 450/40 standardfilter) og den "røde" emisjonen av DCV måles ved ca. 510 - 585 nm ( f.eks . Med en 510/50, en 525/50 eller 585/15 filter) 19 . På grunn av den spesifikke kjemi for analysen er separasjonen mellom SP og ikke-SP-celler generelt høyere i den "røde" fluorescenskanal 19 .
- Last inn inhiberingskontrollen (e) og kjøp dataene. SP-cellene har nå forsvunnet eller reduseres vesentlig ( figur 1F ). Om nødvendig, avgrens SP-porten basert på disse dataene.
- For å undersøke overflatemarkørspresjon med SP-celler, la den "røde" fluorescensen av DCV på x-aksen og vise en respektive fluorescenskanal på y-aksen i logaritmisk modus ( f.eks . APC). Juster detektorspenningene tilsvarende og gate brøkdelen av SP-celler som farger positivt for den undersøkte markøren (e) ( Figur 1G ). Samuttrykk av en bestemt markør med SP-celler gir et respektivt signal i den øvre venstre kvadrant av plottet 30 .
- Ta oppData og / eller sortere SP-cellene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Forutsatt er en representativ SP-analyse av A2780-celler, har en human ovariecancercellelinje tidligere vist seg å ha en SP-regnskap for mindre enn 1% av cellene 9 . Celler ble dyrket ved 37 ° C i RPMI 1640 tilsatt 10% ( v / v ) FBS, 2 mM L-glutamin og 1x penicillin / streptomycin og høstet ved 85% konfluens ved bruk av behandling med 0,05% trypsin-EDTA. Celler ble vasket i PBS og filtrert gjennom 70 μm avskårne avstivningsmidler. Celletallet ble bestemt ved bruk av et tellekammer og trypanblå flekker og 1 x 106 celler / ml (friskt medium) ble farget med 10 uM DCV i 90 minutter ved 37 ° C i mørket. Parallelt ble en alikvot derav inkubert i nærvær av 20 pM FTC under nøyaktig de samme betingelser. Celler ble vasket i 4 ml PBS og et APC-konjugert antistoff mot ABCG2 ble tilsatt til "test" -røret ved en pre-titrert konsentrasjon. Etter inkubatiPå i 25 minutter ved 4 ° C ble celler vasket i PBS, og 7-AAD ble tilsatt til merking av døde celler. Prøver ble avkjølt på is og analysert på et FACS-instrument. Den avbildede gatingstrategien er mer eller mindre universelt anvendelig for andre prøver, selv om svært heterogent materiale som prøver fra vevsprøver kan kreve forhåndsdefinisjon av målcellefraksjonen ved bruk av spesifikke overflate markører ( f.eks . EpCAM, CD45, CD31). Resultatene som vises er ment å være referanse for DCV-basert SP-deteksjon i andre laboratorier. Derfor bør de relative lokaliseringene av de undersøkte cellepopulasjonene være omtrent sammenlignbare, men sikkert ikke identiske, med de som er oppnådd av andre forskere med uavhengige biologiske prøver.
Figur 1: Arbeidsflyt og representasjonsresultater. (A) Hoveddiagram for SP-deteksjon ved bruk av DCV-flekkeng. Costaining for ekstra markører er valgfritt, men diskriminering av dødceller anbefales sterkt. ( BG ) Representativ SP analyse av A2780 humane eggstokkreftceller utført på et FACS-instrument. Celler er inngjerdet i henhold til FSC / SSC egenskaper (B) og dubletter og aggregater er utelukket ved å sammenligne de forskjellige parametrene til FSC ( f.eks . Høyde og bredde) ( C ). Deretter diskrimineres døde celler ved å gating på den 7-AAD-negative (eller PI-negative) cellefraksjonen ( D ). Levende enkeltceller blir deretter vist på en lineær bivariate punktplot for blå og rød DCV-utslipp, og SP (og tilsvarende ikke-SP) er inngjerdet ( E ). Den samme analysen er nå gjort med en respektiv inhiberingskontroll (i dette tilfellet FTC ble brukt), og dette skulle føre til nesten fullstendig forsvunnelse av celler i SP-porten ( F ). Til slutt kan den identifiserte SP karakteriseres nærmere, f.eks . Av deteRmining av ABC-stofftransportøren (er) som kan være ansvarlig for fargeekstrudering, og dermed gi SP-fenotypen (i dette tilfellet ABCG2, i tråd med FTC-følsomheten). ( G ). FTC, fumitremorgin C; ALDH, aldehyd dehydrogenase. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fremdrift i klinisk styring av kreft er også avhengig av utviklingen av behandlingsmodaliteter som retter seg mot CSCs. Metoder som tillater pålitelig isolering av CSCs fra biologiske prøver, vil akselerere identifiseringen av egnede mål og er derfor av kritisk betydning i dette forsøket. SP-analyse er en etablert og verdifull teknikk for å identifisere CSC-populasjoner som uttrykker ABC-legemiddeltransportører, og implementeringen av DCV har utvidet sin anvendelighet til standard flowcytometriske instrumenter. Mekanisk reduserer SP-diskriminering aktiv fargestrømning av ABC-legemiddeltransportører for å oppdage CSCs basert på lav fluorescens med en karakteristisk lokalisering ved siden av plottbunnen til venstre for den tilsvarende ikke-SP. Viktig er at DCV-basert SP-deteksjon er en robust og grei metode, med de mest kritiske trinnene å være (i) fremstilling av celler (ii) fargingsprosessen (iii) valget av en passende inhibitorItor og (iv) strømningscytometrisk analyse. Fordi farge ekstrudering er en aktiv energikrevende prosess, er det spesielt relevant å starte med en god celle levedyktighet; Bare levedyktige (medikamenttransportør-uttrykkende) celler kan produsere en SP. Videre er det ofte fornuftig å optimalisere forholdet mellom fargekonsentrasjon og celletetthet og derved forsterke separasjonen av SP-celler (i sin tur krever dette titrering av både DCV og celler). En generell regel er at både en høyere fargekonsentrasjon og en lavere cellekonsentrasjon resulterer i forbedret separasjon 19 . Nøkkelen til et vellykket DCV-eksperiment er funksjonell validering av SP ved bruk av farmakologiske hemmere av ABC-medikamenttransportaktivitet. Som tidligere nevnt er verapamil og FTC blant de mest etablerte inhibitorer for SP-analyse og har forskjellige pumpespesifikasjoner (FTC er spesifikk for ABCG2, mens verapamil hemmer flere pumper). For prøver med ukjent SP-status anbefales det derfor å bruke beggeHemmere i separate rør. Et annet alternativ er bruken av pan-ABC medikamenttransport inhibitor reserpin 4 . Forskerne bør imidlertid være oppmerksomme på at autofluorescens av denne forbindelsen potensielt kan forstyrre DCV-signalet 19 . Når cellene er analysert for blå og rød DCV-utslipp, bør detektorspenningene justeres slik at begge populasjoner ( dvs. SP og ikke-SP) er synlige med maksimal separasjon. Hvis bildet ser merkelig ut, kan logaritmisk skalering være grunnen til at (i så fall bytt begge kanalene tilbake til lineær modus).
Det er også viktig å merke seg at den DCV-baserte SP-analysen ikke er spesifikk for kreft, eller den er opprinnelig utviklet for anvendelse i onkologi. I stedet er det spesifikt for ABC-legemiddeltransportører, og dermed letter det også deteksjon og isolasjon av fysiologiske (vev) stamceller, som for eksempel linjer - Sca-1 + c-kit +Hematopoietiske stamceller 25 . I tillegg kan differensierte celletyper som etablerer dedikerte barrierer på viktige kroppssider, også vise SP egenskaper 20 . Anvendelse av DCV-basert SP-deteksjon til primære vev krever derfor spesifikk diskriminering av målcellepopulasjonen ved bruk av egnede markører.
I lys av den høye bevaring av narkotikautløpspumper blant CSC-populasjoner 9 , 23 er DCV-basert SP-deteksjon i stor grad anvendelig, et faktum som også er eksemplifisert ved sin vellykkede bruk på tvers av tumor-enheter, inkludert enheter med forskjellig kimlags-opprinnelse 9 , 17 , 18 . Andre fordeler er at (i) celler med direkte implikasjoner i stoffresistens er identifisert (spesielt viktig for å takle klinisk relevante kreftcellesubsetter mediating disease recurRens) og at (ii) deteksjon av en funksjonell, i stedet for en statisk parameter kunne gi mer analysespesifisitet og forbedre oppløsningen 19 , 31 , 32 . Fra den konseptuelle / teknologiske siden er DCV-basert SP-deteksjon tydelig forskjellig fra antistoff-medierte overflatefarginger: (i) Målstrukturen viser intracellulær lokalisering og representerer nukleinsyre, ikke protein. (Ii) Analysen oppdager proteinaktivitet, ikke bare nærvær eller tetthet. (Iii) Målceller er definert på grunn av lav fluorescens, ikke ved et positivt signal. (Iv) Som et DNA-bindende fargestoff er DCV følsom for selv små variasjoner i celle- eller fargekonsentrasjonen under farging 19 . (V) DCV-fluorescens måles i lineær modus, ikke logaritmisk. (Vi) DCV-fluorescens ( dvs. fluorescensen generert av en enkelt fluorofor) måles i to separate kanaler, nOt i et enkelt bølgelengdeområde. Til tross for disse spesifikasjonene, er DCV-basert SP-analyse enkel å utføre og tydeligvis utvider den flytende cytometriske verktøykassen for CSC-forskning.
DCV-basert SP-analyse gir også mange muligheter for kostnadsbesparelser for andre markører, som er kompatible med både konvensjonelle antistoff-medierte overflatefarginger (mange mulige formater) og den kommersielle analysen som oppdager ALDH-enzymatisk aktivitet. Imidlertid fokuserte vi her på overflatefarging, og leseren refereres til publisert litteratur 4 for å se metodologiske detaljer om koding av ALDH-aktivitet. I alle fall bør DCV-utløst SP-analyse kombineres med dødcelle diskriminering og åpenbare reagenser for dette formålet er 7-AAD og PI.
Uansett kan DCV-definerte SP-celler (og ikke-SP-kontrollceller) være levenderenset ved hjelp av sorteringsapplikasjonen for tilsvarende strømningscytometriske instrumenter. Fordi SP-analysen oppdager en funksjonell paRameter som bare levedyktige celler kan produsere, kan levedyktigheten av de gjenvunnede SP-cellene generelt forventes å være høye (noen ganger omtrentlig 100%). Hvis det skulle oppstå problemer med etterlevbarheten, kan det imidlertid kontrolleres forskjellige tekniske parametere, for eksempel størrelsen på sorteringsdysen, buffermiddelets natur og temperaturen under sorteringen (ved hjelp av en 70 μm dyse har vi aldri hatt problemer med Levedyktighet, men en større dyse kan fortsatt hjelpe for svært delikate celler). De gjenvunnede cellene kan underkastes nedstrømsanalyser som qRT-PCR, Western blotting og global uttrykksprofilering ( f.eks . Ved bruk av genarray eller nyere RNASeq-teknologi). Videre kan isolerte SP-celler undersøkes for funksjonelle stamcelleegenskaper ( f.eks . Enkeltcelleklonogenicitet og seriell transplantasjon), eller subkultivert for å etablere cellelinjer av berikede eller til og med rene SP-celler som kan være stabile i måneder 9 . I vårStudie brukte vi vanlige medium- og konvensjonelle 2D-plastflasker til sub-kultur DCV-definerte CSC 9 , men også stamceller-selektive modaliteter som forankringsuavhengig / 3D-kulturbetingelser og spesialiserte medier vil også være mulige. Vi foreslår at de gunstigste forholdene for in vitro ekspansjon av et gitt SP-rom må kontrolleres på individuell basis.
I sammendraget skildrer vi her den detaljerte eksperimentelle arbeidsflyten for CSC-identifikasjon / isolasjon ved hjelp av DCV-basert SP-analyse. Papiret vårt skal hjelpe CSC-forskere til å implementere og etablere denne nyttige metoden i sine egne laboratorier, som ytterligere bør fremme avklaringen av terapeutiske anti-CSC-strategier for forbedret klinisk styring av kreft.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å erklære. Det er heller ingen involvering av forfattere i utarbeidelsen av manuskriptet.
Acknowledgments
Maximilian Boesch støttes av et Erwin Schrödinger-fellesskap av det østrigske vitenskapsfondet FWF (bevilgningsnummer J-3807).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vybrant DyeCycle Violet | Thermo Fisher Scientific | V35003 | Ready to use |
| Verapamil hydrochloride | Sigma-Aldrich | V4629 | Dissolve in ethanol |
| Fumitremorgin C | Sigma-Aldrich | F9054 | Dissolve in DMSO |
| 7-AAD (or propidium iodide - PI) | BioLegend | 420403 | Ready to use |
| Standard cell culture reagents (e.g., medium, FBS, L-glutamine, antibiotics, PBS, trypsin-EDTA, etc.) | Different suppliers | ||
| Sample/cells of interest (e.g., human or murine cancer cell line, human or murine tumor tissue) | Different suppliers | ||
| Flow cytometric instrument (FACS; analyzer or cell sorter) | Different suppliers | Violet laser source required | |
| FACS tubes (round-bottom) | Different suppliers | Tubes with cap recommended | |
| 70 µm cut-off strainers | Different suppliers | Optional but recommended | |
| Digestion enzyme mix (e.g., collagenase/dispase/Dnase) | Different suppliers | Only relevant for tissue dissociation | |
| Flurochrome-conjugated antibodies against surface markers of interest | Different suppliers | Optional | |
| ALDEFLUOR Kit | STEMCELL Technologies | 01700 | Optional |
References
- Pattabiraman, D. R., Weinberg, R. A. Tackling the cancer stem cells - what challenges do they pose? Nat Rev Drug Discov. 13 (7), 497-512 (2014).
- Boesch, M., et al. Heterogeneity of Cancer Stem Cells: Rationale for Targeting the Stem Cell Niche. Biochim Biophys Acta. 1866 (2), 276-289 (2016).
- Li, Y., et al. Suppression of cancer relapse and metastasis by inhibiting cancer stemness. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (6), 1839-1844 (2015).
- Greve, B., Kelsch, R., Spaniol, K., Eich, H. T., Götte, M. Flow cytometry in cancer stem cell analysis and separation. Cytometry A. 81 (4), 284-293 (2012).
- Marcato, P., Dean, C. A., Giacomantonio, C. A., Lee, P. W. Aldehyde dehydrogenase: its role as a cancer stem cell marker comes down to the specific isoform. Cell Cycle. 10 (9), 1378-1384 (2011).
- Golebiewska, A., Brons, N. H., Bjerkvig, R., Niclou, S. P. Critical appraisal of the side population assay in stem cell and cancer stem cell research. Cell Stem Cell. 8 (2), 136-147 (2011).
- Hirschmann-Jax, C., et al. A distinct "side population" of cells with high drug efflux capacity in human tumor cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (39), 14228-14233 (2004).
- Zhou, S., et al. The ABC transporter Bcrp1/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype. Nat Med. 7 (9), 1028-1034 (2001).
- Boesch, M., et al. The side population of ovarian cancer cells defines a heterogeneous compartment exhibiting stem cell characteristics. Oncotarget. 5 (16), 7027-7039 (2014).
- Szotek, P. P., et al. Ovarian cancer side population defines cells with stem cell-like characteristics and Mullerian Inhibiting Substance responsiveness. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (30), 11154-11159 (2006).
- Brown, M. D., et al. Characterization of benign and malignant prostate epithelial Hoechst 33342 side populations. Prostate. 67 (13), 1384-1396 (2007).
- Mathew, G., et al. ABCG2-mediated DyeCycle Violet efflux defined side population in benign and malignant prostate. Cell Cycle. 8 (7), 1053-1061 (2009).
- Engelmann, K., Shen, H., Finn, O. J. MCF7 side population cells with characteristics of cancer stem/progenitor cells express the tumor antigen MUC1. Cancer Res. 68 (7), 2419-2426 (2008).
- Ho, M. M., Ng, A. V., Lam, S., Hung, J. Y. Side population in human lung cancer cell lines and tumors is enriched with stem-like cancer cells. Cancer Res. 67 (10), 4827-4833 (2007).
- Kato, K., et al. Endometrial cancer side-population cells show prominent migration and have a potential to differentiate into the mesenchymal cell lineage. Am J Pathol. 176 (1), 381-392 (2010).
- Bleau, A. M., et al. PTEN/PI3K/Akt pathway regulates the side population phenotype and ABCG2 activity in glioma tumor stem-like cells. Cell Stem Cell. 4 (3), 226-235 (2009).
- Harris, M. A., et al. Cancer stem cells are enriched in the side population cells in a mouse model of glioma. Cancer Res. 68 (24), 10051-10059 (2008).
- Murase, M., et al. Side population cells have the characteristics of cancer stem-like cells/cancer-initiating cells in bone sarcomas. Br J Cancer. 101 (8), 1425-1432 (2009).
- Boesch, M., Wolf, D., Sopper, S. Optimized Stem Cell Detection Using the DyeCycle-Triggered Side Population Phenotype. Stem Cells Int. 2016, 1652389 (2016).
- Golebiewska, A., et al. Side population in human glioblastoma is non-tumorigenic and characterizes brain endothelial cells. Brain. 136 (PT 5), 1462-1475 (2013).
- Boesch, M., et al. Drug transporter-mediated protection of cancer stem cells from ionophore antibiotics. Stem Cells Transl Med. 4 (9), 1028-1032 (2015).
- Fukunaga-Kalabis, M., et al. Tenascin-C promotes melanoma progression by maintaining the ABCB5-positive side population. Oncogene. 29 (46), 6115-6124 (2010).
- Dean, M., Fojo, T., Bates, S. Tumour stem cells and drug resistance. Nat Rev Cancer. 5 (4), 275-284 (2005).
- Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J Exp Med. 183 (4), 1797-1806 (1996).
- Telford, W. G., Bradford, J., Godfrey, W., Robey, R. W., Bates, S. E. Side population analysis using a violet-excited cell-permeable DNA binding dye. Stem Cells. 25 (4), 1029-1036 (2007).
- Boesch, M., et al. High prevalence of side population in human cancer cell lines. Oncoscience. 3 (3-4), 85-87 (2016).
- Ali, M. Y., Anand, S. V., Tangella, K., Ramkumar, D., Saif, T. A. Isolation of Primary Human Colon Tumor Cells from Surgical Tissues and Culturing Them Directly on Soft Elastic Substrates for Traction Cytometry. J Vis Exp. (100), e52532 (2015).
- Azari, H., et al. Isolation and expansion of human glioblastoma multiforme tumor cells using the neurosphere assay. J Vis Exp. (56), e3633 (2011).
- Hasselbach, L. A., et al. Optimization of high grade glioma cell culture from surgical specimens for use in clinically relevant animal models and 3D immunochemistry. J Vis Exp. (83), e51088 (2014).
- Boesch, M., et al. DyeCycle Violet used for side population detection is a substrate of P-glycoprotein. Cytometry A. 81 (6), 517-522 (2012).
- Patrawala, L., et al. Side population is enriched in tumorigenic, stem-like cancer cells, whereas ABCG2+ and ABCG2- cancer cells are similarly tumorigenic. Cancer Res. 65 (14), 6207-6219 (2005).
- Guha, P., et al. Nicotine promotes apoptosis resistance of breast cancer cells and enrichment of side population cells with cancer stem cell-like properties via a signaling cascade involving galectin-3, alpha9 nicotinic acetylcholine receptor and STAT3. Breast Cancer Res Treat. 145 (1), 5-22 (2014).
