निस्र्पक रिसेप्टर्स के समारोह deorphanization प्रक्रिया में एक अपरिहार्य हिस्सा कार्य करता है. हम एक शिविर परख का उपयोग कर वास्तविक समय में सुगंधित रिसेप्टर्स के सक्रियकरण को मापने के लिए एक विधि का वर्णन ।
स्तनधारी सुगंधित रिसेप्टर के विशाल आकार (या) परिवारों को कई अस्थिर रसायनों के बीच अपने cognate लाइगैंडों खोजने के लिए उपस्थित कठिनाइयों । करने के लिए कुशलतापूर्वक और सही deorphanize ओआरएस, हम एक heterologous सेल लाइन का उपयोग करने के लिए स्तनधारी ओआरएस एक्सप्रेस और एक आनुवंशिक रूप से संशोधित प्लाज्मिड के शिविर उत्पादन बहाव को मापने के लिए और वास्तविक समय में सक्रियण । इस परख के लिए ओआरएस और इसके विपरीतodorants स्क्रीन इस्तेमाल किया जा सकता है । स्क्रीन से सकारात्मक गंध रिसेप्टर बातचीत बाद में विभिन्न गंध सांद्रता के खिलाफ परीक्षण द्वारा पुष्टि की जा सकती है, पैदा एकाग्रता प्रतिक्रिया घटता. यहां हम इस विधि का इस्तेमाल किया एक मानव या Hana3A कोशिकाओं में व्यक्त पुस्तकालय के खिलाफ एक गंध यौगिक का एक उच्च प्रवाह स्क्रीनिंग प्रदर्शन और पुष्टि की है कि सकारात्मक प्रतिक्रिया रिसेप्टर ब्याज की यौगिक के लिए cognate रिसेप्टर है । हमने पाया है इस उच्च प्रवाह का पता लगाने के लिए विधि का आकलन या सक्रियण और हमारे डेटा में कुशल और विश्वसनीय होने के लिए या कार्यात्मक अध्ययन में अपने संभावित उपयोग का एक उदाहरण प्रदान करते हैं ।
गंध की भावना जानवरों के अस्तित्व में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है के रूप में वे भोजन प्राप्त करने के लिए अपने घ्राण क्षमताओं पर भरोसा करते हैं, शिकारियों और खतरे से बचने, प्रजातियों भेद, और चुनें मेट1,2. इन कार्यों की प्राप्ति गंध रिसेप्टर्स (ओआरएस), जो व्यक्तिगत रूप से घ्राण संवेदी न्यूरॉन्स (OSNs) घ्राण उपकला (ँ) में स्थित की सिलिअरी सतह पर व्यक्त कर रहे हैं पर निर्भर करता है । ओआरएस जी के सबसे बड़े परिवार का गठन-प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर (GPCR) superfamily के साथ लगभग ४०० और १२०० विविध या मानव और माउस में जीन, क्रमशः3,4,5. घ्राण जी प्रोटीन (golf) और प्रकार III adenylyl cyclase (ACIII) के अनुक्रमिक सक्रियण के माध्यम से वृद्धि हुई intracellular शिविर के स्तर को odorants नेतृत्व द्वारा सक्रिय ओआरएस । intracellular शिविर के परिणामस्वरूप वृद्धि का स्तर एक दूसरा दूत है, जो सेल की सतह पर न्यूक्लियोटाइड-gated चैनल खोलता है के रूप में कार्य कर सकता है, सीए सहित cations की आमद को ट्रिगर2 + और कार्रवाई की क्षमता है, और अंततः की शुरुआत न्यूरो-संभाव्य पारेषण और घ्राण बोध । ओआरएस द्वारा odorants की एक बड़ी संख्या का पता लगाने और भेदभाव करने की प्रक्रिया को घ्राण बोध6,7के पहले चरण के रूप में माना जाता है ।
के बाद से बक और एक्सल8 पहले सफलतापूर्वक सुगंधित रिसेप्टर्स क्लोन और घ्राण द्वारा शुरू की धारणा के तंत्र का आविर्भाव, deorphanization या परिवार के इस क्षेत्र में आकर्षण के हॉटस्पॉट में से एक बन गया । vivo मेंविभिन्न, पूर्व विवो और इन विट्रो तरीकों को मापने या सक्रियण के लिए9,10,11,12रिपोर्ट की गई है । OSNs पर एकल-कक्ष RT-पीसीआर द्वारा फ़ॉलो किए गए Ca2 + इमेजिंग का उपयोग करने वाली एक पारंपरिक विधि aliphatic odorants13,14,15को विभिंन ओआरएस की पहचान सक्षम करती है । हाल ही में, बड़े पैमाने पर transcriptome विश्लेषण के आगमन और अधिक उच्च vivo तरीकों में प्रवाह के विकास को बढ़ावा दिया । केंटुकी परख eugenol की पहचान-और muscone-उत्तरदाई माउस S100a5-tauGFP रिपोर्टर माउस तनाव और microarray विश्लेषण के उपयोग के साथ ओआरएस9। गंध जोखिम के बाद में या mRNA के स्तर में कमी के आधार पर, ड्रीम प्रौद्योगिकी निर्धारित करने के लिए एक transcriptomic दृष्टिकोण कार्यरत है या सक्रियकरण प्रोफाइल दोनों हड्डीवाला और गैर हड्डीवाला प्रजातियों में16। इसी तरह, न्यूरॉन सक्रियणों में S6 के फास्फारिलीकरण को देखते हुए, Matsunami समूह अनुक्रम mRNAs से phosphorylated ribosome immunoprecipitations के लिए उत्तरदायी ओआरएस की पहचान करने के लिए12. अंत में, Feinstein समूह सुपर सूंघा चूहों कि vivo मेंगंध कोडिंग, MouSensor प्रौद्योगिकी17के रूप में जाना जाता अध्ययन करने के लिए एक मंच के रूप में सेवा सकता है की सूचना दी ।
इन विट्रो दायरे में, संवर्धन OSNs की चुनौती एक heterologous अभिव्यक्ति प्रणाली है कि नकल या vivo में कार्यात्मक अभिव्यक्ति एक आदर्श समाधान के लिए ओआरएस के लिए सुगंधित रसायनों की बड़े पैमाने पर स्क्रीनिंग आचरण बनाता है । फिर भी, के बाद से गैर घ्राण मूल के प्रसंस्कृत सेल लाइनों देशी OSNs से अलग है, या प्रोटीन endoplasmic जालिका में बनाए रखा और प्लाज्मा झिल्ली के लिए यातायात में असमर्थ हैं, जिसके परिणामस्वरूप या क्षरण और रिसेप्टर समारोह के नुकसान18 , 19. इस समस्या को हल करने के लिए, heterologous कक्ष रेखाओं में सेल झिल्ली पर प्रतिकृति या कार्यात्मक अभिव्यक्ति के लिए व्यापक कार्य किए गए हैं । Krautwurst एट अल. पहले rhodopsin के पहले 20 एमिनो एसिड (Rho-टैग) के एन-टर्मिनल या प्रोटीन के लिए संलग्न है और यह सेल-मानव भ्रूण गुर्दे (HEK) कोशिकाओं में कुछ ओआरएस की सतह अभिव्यक्ति को बढ़ावा20। एकल OSNs, साइतो एट अलसे जीन अभिव्यक्ति (ऋषि) पुस्तकालय विश्लेषण का एक धारावाहिक विश्लेषण आयोजित करके । पहले रिसेप्टर-परिवहन प्रोटीन (RTP) परिवार के सदस्यों, RTP1 और RTP2, और रिसेप्टर एक्सप्रेशन बढ़ाने प्रोटीन 1 (REEP1) कि सुविधा या सेल झिल्ली के लिए तस्करी और बढ़ाया गंध-HEK293T कोशिकाओं में ओआरएस के मध्यस्थता प्रतिक्रियाओं का 21. इन निष्कर्षों के आधार पर, Matsunami समूह सफलतापूर्वक Hana3A सेल लाइन की स्थापना की, RTP2 में RTP1, REEP1, Gα, और olfHEK293T के साथ छुरा transfected, और क्षणिक transfected के साथ Rho-टैग ओआरएस, कुशल या कार्यात्मक के लिए अभिव्यक्ति. बाद के अध्ययनों से पता चला 1) RTP1, RTP1S के एक छोटे फार्म, कि अधिक मजबूती से बढ़ावा देने या मूल RTP1 प्रोटीन और 2) प्रकार 3 मस्करीनिक acetylcholine रिसेप्टर (M3R) है कि बढ़ाने या गतिविधि के निषेध के माध्यम से हो सकता है समारोह में β-arrestin-2 भर्ती, दोनों जिनमें से heterologous अभिव्यक्ति प्रणाली के लिए प्रायोगिक उत्पादन22,23अनुकूलित करने के लिए पेश किया गया ।
कई तरीकों का पता लगाने के लिए heterologous प्रणालियों में रिसेप्टर सक्रियकरण मात्रा का इस्तेमाल किया गया है । गुप्त अपरा alkaline फॉस्फेट (SEAP) परख एक रिपोर्टर एंजाइम शिविर प्रतिक्रिया तत्वों (CREs) द्वारा विनियमित transcriptionally के साथ काम करता है, यह आकलन या सक्रियण के लिए एक आकर्षक विकल्प बना । प्रतिदीप्ति आसानी से SEAP डिटेक्शन रिएजेंट24के साथ मशीन के बाद संस्कृति माध्यम का एक नमूना में पाया जाता है । इस विधि का प्रयोग, ओआरएस के कार्य के साथ-साथ chemosensory रिसेप्टर्स के एक माध्यमिक वर्ग ँ-स्ट्रेस अमीन-संबद्ध रिसेप्टर्स (TAARs) में व्यक्त किया गया है25,26,27की विशेषता है । एक अंय आम विधि, luciferase परख, शिविर प्रतिक्रिया तत्व (CRE) के नियंत्रण में एक जुगनू luciferase रिपोर्टर जीन का उपयोग करता है । luciferase उत्पादन द्वारा उत्पंन luminescence को मापने के एक कुशल और मजबूत साधन बढ़ाता है या सक्रियण के10,11,28प्रदान करता है ।
वास्तविक समय शिविर परख भी व्यापक रूप से गतिशील heterologous या अंतर्जात GPCRs के समारोह की निगरानी में इस्तेमाल किया गया है । इस तरह के उंनत परख का एक उदाहरण के एक आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग संवेदी संस्करण है, जो एक शिविर-बाध्यकारी luciferase के एक उत्परिवर्ती फार्म से जुड़े डोमेन के पास का लाभ लेता है । जब शिविर बांध, गठन परिवर्तन luciferase, luminescence, जिसमें से तो एक chemiluminescence रीडर29,30के साथ मापा जा सकता है सक्रियण की ओर जाता है । वास्तविक समय शिविर प्रौद्योगिकी HEK293 और NxG 108CC15 कोशिकाओं में मानव गंध रिसेप्टर्स के de-अनाथ के लिए उपयुक्त बताया गया है= xref > 31,३२,३३, साथ ही HEK293T-व्युत्पन्न Hana3A कोशिकाओं में३४,३५. Krautwurst समूह भी विस्तार से वास्तविक समय शिविर प्रौद्योगिकी द्वि-दिशात्मक बड़े पैमाने पर या स्क्रीनिंग दृष्टिकोण३२,३३के लिए उपयुक्त होना बताया ।
यहां हम मापने या सक्रियण Hana3A कोशिकाओं में एक वास्तविक समय शिविर परख का उपयोग करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन । इस प्रोटोकॉल में, पूर्व equilibrated लाइव कोशिकाओं के luminescence के लिए विशेष वाष्पशील यौगिकों के साथ 30 मिनट के बाद उपचार के लिए काइनेटिक मापा जाता है, का एक अधिक कुशल और सटीक विश्लेषण का प्रतिनिधित्व या सक्रियण कि कम करने के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं कलाकृतियों है कि लंबे समय तक और गंध प्रेरित सेल विषाक्तता के साथ सेलुलर वातावरण में होते हैं । इस वास्तविक समय माप दोनों ओआरएस और लाइगैंडों, साथ ही ब्याज की विशिष्ट या-ligand जोड़ों के लक्षण वर्णन के एक बड़े पैमाने पर स्क्रीनिंग के लिए अनुमति देता है । इस विधि का प्रयोग, हम सफलतापूर्वक कस्तूरी यौगिक muscone के लिए रिसेप्टर के रूप में OR5AN1 की पहचान की ३७९ मानव ओआरएस के खिलाफ एक स्क्रीनिंग प्रदर्शन और बाद में सकारात्मक स्क्रीनिंग परिणाम की पुष्टि ।
1. संवर्धन और Hana3A कोशिकाओं के रखरखाव न्यूनतम आवश्यक माध्यम के 10 मिलीलीटर में कोशिकाओं को बनाए रखने (मेम) 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), १०० & #181; g/ml पेनिसिलिन-streptomycin, और १.२५ & #181; g/ml amphotericin B में १००-mm सेल एक ३७ में संस्?…
सही एक निश्चित गंध को जोखिम पर एक या सक्रियण मापने घ्राण जानकारी के कोडिंग का गूढ़ रहस्य में पहला कदम है । इस अध्ययन में दिखाया प्रयोगों के एक उदाहरण का प्रतिनिधित्व कैसे एक की पहचान कर सकते हैं, एक में…
The authors have nothing to disclose.
काम चीनी राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (३१०७०९७२), शंघाई नगर पालिका (16ZR1418300) के विज्ञान और प्रौद्योगिकी आयोग, शंघाई नगर शिक्षा आयोग, शंघाई पूर्वी के अभिनव अनुसंधान टीम के लिए कार्यक्रम के द्वारा समर्थित किया गया विद्वान कार्यक्रम (J50201), और चीन के राष्ट्रीय बुनियादी अनुसंधान कार्यक्रम (2012CB910401) ।
Amphotericin B | Sigma | A2942 | |
DMSO | Sigma | D2650 | |
FBS | Gibco | 10099-141 | |
GloSensor cAMP reagent | Promega | E1290 | |
pGloSensor-20F cAMP plasmid | Promega | E1171 | |
Hana3A cells | available from authors upon request | ||
HBSS, w/o calcium chloride and magnesium chloride | GIBCO | 14175095 | |
HEPES | Hyclone | SH30237 | |
Lipofectamine2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
M3R plasmid | cloned into a mammalian expression vector such as pCI | ||
MEM, w/EBSS and w/L-glutamine | Hyclone | SH30024 | |
Muscone | Santa Cruz | sc-200528 | |
Musk tibetene | Sigma-Aldrich | S359165 | |
OR plasmids | cloned with a Rho-tag into a mammalian expression vector such as pCI | ||
PBS, w/o calcium or magnesium | Cellgro | 21-040-CV | |
Penicillin-streptomycin | Hyclone | SV30010 | |
Plasmid miniprep kit | Tiangen | DP103-03 | |
Puromycin | Sigma | P8833 | |
RTP1S plasmid | cloned into a mammalian expression vector such as pCI | ||
Trypsin-EDTA | Hyclone | SH30236 | |
0.2-mL PCR tube | Axygen | PCR-02-C | |
1.5-mL Eppendorf tube | Eppendorf | ||
15-mL 17 mm x 120 mm conical tube | BD Falcon | 352096 | |
8-well and/or 12-well multichannel pipetman | Eppendorf | ||
96-well flat-bottomed white cell culture plate | Greiner | 655098 | |
100 mm x 20 mm cell culture dish | BD Falcon | 353003 | |
Class II biological safety cabinet with laminar flow | |||
Cell culture incubator, w/ 5% CO2 | |||
Centrifuge, with swinging bucket rotor for 15-ml conical tubes | |||
Infinite F200 plate reader | Tecan | ||
Phase-contrast microscope with x10 and x20 objectives | |||
Spectrophotometer | |||
Sterile reagent reservoirs for multichannel distribution | |||
Sterile paper towel |