Summary
특정 대상 프로브 질병 (예를 들어, 염증, 감염, 및 tumorigenesis)의 다양 한 종류의 단백질 표정 등의 분자 메커니즘을 분석 하기 위한 혁신적인 도구를 나타냅니다. 이 연구에서 우리는 murine 모델 f 4/80 전용 형광 중재 단층 촬영을 사용 하 여 대 장 염의 장 대 식 세포 침투의 양적 차원 단층 평가 설명 합니다.
Abstract
질병의 murine 모델은 과학적 연구에 불가결. 그러나, 내 시경 검사 나 컴퓨터 단층 촬영 영상 등 많은 진단 도구는 정기적으로 동물 모델에서 채택 하지. 기존의 실험 판독 자주 내 개별 후속 시험을 방지 하 고 필요한 연구 동물의 수를 증가 하는 사후 고 비보 전 분석에 의존 합니다. 형광-중재 단층 형광 프로브의 비-침략 적, 반복, 양적, 3 차원 평가 수 있습니다. 매우 중요 한 특정 검색 및 고유한 분자 대상의 특성에 대 한 수 있는 분자 제조 업체의 사용 허가 하 고. 특히, 타겟된 프로브 염증, 자가 면역 질환, 감염, 혈관 질환, 셀 마이그레이션, tumorigenesis, 등에서 유전자 활성화 및 단백질 발현을 분석 하기 위한 혁신적인 도구를 나타냅니다. 이 문서에서는, 우리 단계별 지침을 제공이 정교한 이미징 기술에 vivo에서 탐지 및 (즉, f 4/80-긍정적인 대 식 세포 침투)의 널리 murine 모델에서 염증의 특성에 대 한 장 염증입니다. 이 기술은 또한 면역 세포 또는 줄기 세포 추적 같은 다른 연구 분야에서 사용할 수 있습니다.
Introduction
동물 모델 연구에서 널리 이용 된다 그리고 모니터 질병 활동과 활력, 몸 무게 변경의 정량화 등 혈액, 소변, 배설물의 분석에 많은 비-침략 적 절차 존재 한다. 그러나, 이들은 또한 간 개별 다양성에 적용 되는 간접 대리 매개 변수만 있습니다. 그들은 자주 조직 표본, 반복 시간 지점에서 직렬 관찰 방지의 사후 분석으로 보완 해야 한다 고 에 비보를 처리 하는 생리 적 또는 병 적인 관찰. 정교한 이미징 기술에 작은 동물 등장, 교차 단면 영상, 광학 이미징 및 내 시경, 이러한 프로세스의 직접적인 시각화를 가능 하 게 하 고 또한 같은 동물1 의 반복적인 분석에 대 한 허용을 포함 한 , 2 , 3. 또한, 반복적으로 같은 동물에 있는 질병의 다양 한 상태 모니터링에 동물 윤리의 관점에서 것 필요한 하는 동물의 수 저하 될 수 있습니다.
여러 다른 광학 이미징 기술을 형광 이미징 vivo에서 존재 한다. 원래, confocal 영상 표면과 표면 아래 형광 이벤트4,5공부를 고용 했다. 그러나 최근에,, 양적 3 차원 조직 평가 대 한 허용 하는 단층 촬영 시스템 개발된6되었습니다. 이 낮은 흡수, 민감한 탐지기와 단색 광원7근처-적외선 (NIR) 스펙트럼에서 빛을 방출 하는 형광 프로브 개발을 통해 성취 되었습니다. 전통적인 에칭한 이미징 기술을, 동안 같은 컴퓨터 단층 촬영 (CT), 자기 공명 영상 (MRI) 또는 초음파 (미국), 물리적에 주로 의존 하 고 시각화 형태학, 광학 이미징 제공할 수 있습니다 추가 정보 기본 분자 프로세스에8을프로브 생 또는 외 인 형광을 사용 합니다.
분자 생물학에서의 발전 목표의 증가 수에 대 한 스마트 하 고 타겟 형광 분자 프로브의 생성을 촉진 하기 위하여 왔다. 예를 들어 수용 체-중재 통풍 관 및 지정된 대상 지역에 배포 수 구상 될 carbocyanine 파생 표시 된 항 체9를 사용 하 여. 신체의 그렇지 않으면 액세스할 수 없는 영역에 특정 추적기 기능을 붙일 수는 사용 가능한 항 체의 풍부한 tumorigenesis, 신경의 모델에서 분자 및 세포 프로세스에 전례 없는 통찰력을 제공 심혈 관, 면 역학적, 그리고 염증 성 질병7.
이 연구에서 우리는 murine 모델 colitis의 단층 형광 중재를 사용 하 여를 설명합니다. Dextran 황산 나트륨 (DSS)-유도 대 장 염은 선 동적인 장 질병 (IBD)10유사한 창 자 염증의 화학적으로 유도 된 마우스 표준형. 특히 창 자 염증11의 개발에 타고 난 면역 체계의 기여를 평가 하기 위해 유용 합니다. 모집, 활성화, 및 monocytes 그리고 대 식 세포의 침투 IBD의 병 인에 중요 한 단계를 나타냅니다, 이후 그들의 신규 모집의 시각화 및 침투의 활동 모니터링, 예를 들어의 효과에 필수적입니다. 전 임상 설정12에 잠재적인 치료 물질. 우리는 DSS colitis의 유도 설명 하 고 monocyte/대 식 세포 마커 F4/80의 특정 시각화에 대 한 형광 분자 단층 촬영을 사용 하 여 창 자 점 막으로 대 식 세포 침투의 단층 촬영-중재 특성을 보여 13. 또한, 우리는 항 체 라벨; 등 보조 및 보완 절차를 설명 실험적인 체제; 그리고 분석 및 질병 활동 지 수 등 기존의 판독 상관 관계에서 얻은 이미지의 해석을 cytometry 및 조직학 분석과 immunohistochemistry 흐름. 우리는이 기술과 다른 이미지 형식에 대 한 비교의 한계를 논의.
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Protocol
모든 동물 실험 Landesamt 위한 Natur, Umwelt und Verbraucherschutz (LANUV) 노르 트 베스트 팔 렌 독일 동물 보호 법률 (Tierschutzgesetz)에 의해 승인 되었다.
1. 재료 및 실험 설치
- 동물 케어입니다.
- (예를 들어, C57BL/6) 어떤 DSS 취약 긴장의 성별 및 나이 일치 마우스를 사용 하 여 20 ~ 25 g bodyweight에.
- 현지 동물 보호 지침에 따라 마우스 실험 그룹과 집 당 적어도 5 개 이상의 마우스를 계획 합니다.
- 다이어트 및 압력가 음료수 광고 libitum표준 설치류 차를 제공 합니다.
- 표준 차를 제거 하 고 파 무료 차 우와 최소 3 일 전에 endoluminal 자동 형광을 줄이기 위해 검색 합니다.
- DSS 유발 급성 대 장 염의 감 응 작용입니다.
- DSS의 2 세대 분해 (분자량 40000 ~ 다)의 2% (w/v 솔루션)를 얻기 위해 압력가 마로 소독 식 수 100 ml.
- DSS 솔루션으로 독점적으로 쥐의 마시는 공급을 마우스 하루 당 액체의 5 mL을 추정. 컨트롤 마우스10DSS 없이 같은 식 수를 제공 합니다.
참고: 실험의 끝까지 매일 쥐를 모니터링 합니다. 하는 그들의 초기 체중의 20% 보다 큰 잃거나 죽어가는 되는 마우스를 안락사 (즉, 자세, 운동 감소를 지속적으로 hunched, 보람 호흡, 현저 하 게 코트를 세우 다) 동물에 로컬 해당 지침에 따라 복지입니다.
- 형광-중재 단층 촬영의 준비입니다.
- 형광 염료와 원하는 항 체 (예: 쥐 반대로 마우스 f 4/80) 레이블 (예: Cyanine7, λ여기: 750 nm, λ방출: 776 nm) 제조 업체의 프로토콜에 설명 된 대로. 적절 한 투 석 막에 순화 된 항 체를 dialyze (기 공 크기 < 50-100 kDa) 0.15 M 이상 2 시간 또는 하룻밤에 대 한 염화 나트륨의 1 L에 대 한.
- 0.1 m M NaHCO3 의 1 L에 항 체를 전송 하 고 적어도 2 시간에 대 한 dialyze.
- 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)에 형광 염료의 필요한 금액을 해산 (항 체의 10.8 µ L/mg) 항 체 솔루션에 추가. 20-fold 어 금 니 과잉에 형광 염료를 사용 하 여 1: 3의 염료 단백질 비율을 달성 하기 위해.
- 1 헤 0.15 M 나트륨의 1 L에 대 한 투 석 또는 PD-10 염 열을 사용 하 여 레이블이 없는 항 체 제거에 4 ° C에서 어둠 속에서 incubate 고 vivo에서 응용 프로그램에 대 한 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)에서 해결 합니다.
- 분 광 광도 법에 의해 최종 항 체 농도 및 라벨 비율을 결정 합니다.
- 250-330 nm의 흡수에서 단백질 농도 측정 하 고 염료에 의해 추가 흡수를 고려. 280에서 최대 흡수를 수정 nm (단백질) 750에서 최대 흡수의 11 %nm (다음 단계) Cyanine7 라벨에 대 한.
- 250-800 nm에 화합물 (일반적으로 1:10)의 희석을 측정 하 고 750에서 Cyanine7의 농도 추출 nm.
- 염료-단백질 비율을 결정: 염료/항 체 = 750에서 최대 흡수 nm / 200000 / (280에서 최대 흡수 nm-750에서 최대 흡수 x 0.11 nm) / 170000.
- 4 ° C에서 항 체 솔루션을 유지 하 고 주입 하기 전에 표백 피하기 위해 빛에서 그것을 보호.
- 그것은 사용 될 때까지 주입 및 빛에서 방패 직전 무 균 주사기에 필요한 항 체 솔루션 볼륨을 로드 합니다.
- 프로브 주입의 최적의 타이밍 및 트레이 서 약 동학에 따라 스캐닝 절차를 결정 합니다.
- 산소에서 흡입 1.5-2.5 %isoflurane 사용 하 여 마우스를 anesthetize 또는 레이블이 지정 된 항 체의 꼬리 정 맥 주사에 대 한 전용된 restrainer에 안전 하 게 넣어.
- 전체 길이 항 체에 대 한 분류 항 체 이상 24 h 검색, 이전 murine colitis에 반대로 마우스 F4/80 macrophage 시각화 등을 주입. 마우스를 정 맥 주사 (i.v.) 꼬리를 통해 염료의 2.0 nmol에 해당 하는 금액에 레이블이 지정 된 항 체와 정 맥.
- 사용 동일 하 게 표시 난다 항 체 (예: 쥐 IgG 또는 해당 기본 항 체 유산 하 다른 isotype) 복용량에 isotype 컨트롤로 특정 조사에 해당.
참고: vivo에서 의 결과 검색 후 주입 제어 화합물의 특정 조사 데이터 이미징의 해석에 대 한 참조로 사용할 수 있습니다. - 전기 면도기를 사용 하 여 빛의 반사와 흡수를 최소화 하기 위해 복 부에 동물 모피를 면도.
- 형광 염료와 원하는 항 체 (예: 쥐 반대로 마우스 f 4/80) 레이블 (예: Cyanine7, λ여기: 750 nm, λ방출: 776 nm) 제조 업체의 프로토콜에 설명 된 대로. 적절 한 투 석 막에 순화 된 항 체를 dialyze (기 공 크기 < 50-100 kDa) 0.15 M 이상 2 시간 또는 하룻밤에 대 한 염화 나트륨의 1 L에 대 한.
2. 기술 장비
- 수의 형광 중재 단층 (FMT) 장치를 사용 하 여 작은 동물 형광 ( 그림 4)에 대 한.
- "새로운 연구 결과"를 클릭 하 여 각 프로젝트에 대 한 새로운 연구를 만듭니다 단추 및 이미징 매개 변수 및 나중에 참조할 수에 대 한 복용량을 포함 하 여 관련 추적기 연구 설명에 포함 됩니다.
- 이 연구에서 "새로운 연구 그룹"을 클릭 하 여 각각 연구 설계 (예를 들어, 특정 추적 프로그램 및 불특정 isotype 제어에 대 한)에 따르면 연구 그룹 만들기 버튼. 동물의 각 번호와 각 연구 그룹을 장비.
- 추적 프로그램 구문에 대 한 시스템 보정.
- 라벨에 변화에 대 한 정상화 하 고 오이 데이터에서 양적 측정을 가능 하 게 하는 추적기의 각 일괄 처리에 대 한 보정을 수행 합니다.
- 각 개별 시스템의 교정에 대 한 악기 제조 업체의 지침에 따라 "추가 새 추적 프로그램"을 선택, 시스템 단계를 통해 가이드를 제공 합니다. 적용 된 항 체 솔루션의 희석 및 프로브에 추적 프로그램의 계산 된 절대 농도 제공 합니다.
- FMT, 정의 된 두께 및 흡수 특성 (중요 한 조직 닮은)의 조직 흉내 낸 팬텀을 사용 하 여 및 사용 되는 항 체 솔루션의 특정 볼륨 작성. FMT 장치에 이것을 측정 합니다.
참고: 시스템 미래 vivo에서 측정에서 절대 추적 농도 계산 하 주어진된 농도 함께 제공 조사의 기준 측정을 사용 합니다.
- 42 ° C의 온도 heatable 시험 카세트를 사용 하 여
참고:이 시험 기간 동안 저체온증이 되기에서 쥐를 방지할 수 있습니다.
3. 동물 마 취
- 1.5-2% vol %isoflurane ([2-chloro-2-(difluoromethoxy)-1,1,1-trifluoro-ethane])와 anesthetize는 마우스를 1.5 L O2/min의 지속적인 흐름을 사용 하 여.
4. 형광 중재 단층 촬영 검사
참고: 적응이 사용 되는 FMT 시스템 관련 다음과 같은 세부 사항이 필요에 따라 대체 형광 반사율 이미징 장치 또는 FMT 시스템에 대 한 참조 테이블의 재료연구.
- 시험 카세트에 그것의 뒤에 마 취 마우스를 놓습니다.
- 스캐닝 절차를 수행 합니다.
- 이미징 시스템에는 카세트 삽입 하 고 즉시 연속 마 취를 위해 그것을 닫습니다. 이전에 만든 연구 그룹에서 적절 한 샘플을 선택 합니다. 추적 프로그램 농도 대 한 값이 제대로 계산 되도록 드롭다운 메뉴에서 관리 추적 프로그램을 선택 합니다.
- 적절 한 파장에서 형광 반사율 이미지 획득 (720 Cyanine7에 대 한 nm) 검사 계획 및 개요 "이미지 획득" 버튼을 클릭 하 여 검색 필드에 대 한.
- 검색 필드에 형광 반사율 이미지 오버레이로 나타납니다를 참조 하십시오. (예를 들어, 콜론 또는 복 부), 관심 영역을 조정 공기 또는 나머지 모피의 영역을 피하고. 이미지 대상에 따라 이미지의 숫자 데이터 요소 내 설정 검색 필드 오른쪽에 있는 메뉴에서 중간 및 스캔-필드 해상도 거친에서 선택 하 여.
참고: 명심 좋은 검색 필드 이상 크게 스캔 시간 비용 더 나은 공간적 해상도 제공할 수 있습니다. - "검색."를 클릭 하 여 선택 된 파장에서 데이터/이미지 수집 시작
참고: 전체 복 부의 중간 벌금 스캔에 대 한 검색 시간 약 5 분; 수 있습니다. 이 시간에서 각 데이터 요소는 별도로 여기 레이저 조명 하 고 결과 형광 기록 됩니다. - 스캔의 끝에 이미징 카세트에서 동물을 제거 하 고 케이지에 다시 배치 하기 전에 완전히 복구할 수 동물 허용.
- 실험 기간 동안 다양 한 시간 지점에서 필요 하다 고 인정 하는 경우는 FMT를 반복 (예를 들어, 0, 5, 9-10 일 (실험의 끝)), 따라서 배경 형광 신호를 증가 하는 본문에 항 체의 축적을 고려 하지만.
5입니다. 사후 검사
- 레드 라이트 지구 온난화 램프 아래 종이 타월에 별도 장에 마우스를 놓고 전체 복구까지 고민 또는 불편의 흔적에 대 한 마우스를 모니터링 합니다. 다시으로 그것의 각각 완전히 깨어 있을 때 마우스를 놓습니다.
- 100% (v/v)의 복용량에 아이 솔 레이 터에 CO2 의 전달에 의해 실험의 끝에 쥐, 100 vol %, 그리고 3 L/min를 안락사. 마십시오 하지 미리 채울 챔버 CO2 로 CO2 의 높은 농도에 갑자기 노출 조 난을 일으킬 수 있습니다. 마우스 안락사 급속 한 자 궁 경관 탈 구 등의 후속 보조 모드에 의해 호흡을 멈춘 후 죽음을 확인 합니다.
- 복 부 개복 술에 의해 결 explant 고 단계 4.2.1-4.2.4에에서 설명 된 대로 explanted 콜론의 비보 전 검사를 수행 합니다. 각 대 장 경도 Metzenbaum 수술가 위를 사용 하 여 열고 염 추가 분석을 위해 그것을 준비 하기 전에 철저 하 게 린스.
- 메스를 사용 하 여 원심 결에서 0.5 cm 조각 잘라내어 즉시 극저온 1.5 mL 튜브에. 액체 질소와-70 ° C에서 저장소에 추가 사용 (예:myeloperoxidase (MPO) 측정)까지 동결.
- 나무 막대기를 사용 하 고 조직학 분석에 대 한 점 막 바깥쪽 ("스위스 롤 기법")와 함께 근 위 끝에는 원심에서 나머지 경도 열린된 콜론을 롤. 준비는 정착 액에 장소 ( 테이블의 자료를 참조)-80 ° C14에 고정 하 고.
6. 데이터 재구성 및 해석
- 각각 이미징 소프트웨어의 재구성 도구를 사용 하 여 원시 이미지 데이터; 형광 분포의 3 차원 지도 만들 검사 때 검사 시 재구성 도구에 자동으로 추가 됩니다, 함수 "대기열에 추가 개조" 선택 됩니다.
- 그렇지 않으면 스캔 각각 연구 아래에 있는 드롭다운 메뉴에서 및 연구 선택 그룹, 검색을 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 고 "재건에 추가 합니다." 선택
- 추가 분석을 위해 분석 소프트웨어를 데이터 집합을 로드 합니다. 메뉴 표시줄의 드롭다운 메뉴에서 각각 연구 선택한 후 연구 그룹 및 개별 동물; 오른쪽에 있는 메뉴에서 이 동물에 대 한 수행 하는 모든 검사 표시 됩니다. 정확한 검사를 선택 하 고 "로드." 클릭
참고: 추적 프로그램 배포의 3D 개조 왼쪽에 처음 인수 형광 반사율 이미지의 오버레이로 표시 됩니다. 모델 회전 고 쉽게 분석을 위해 확대 될 수 있습니다. - 재건축된 3D 지도에 난다 레이블 축적 (예를 들어, 간 또는 소변 방광)의 포커스를 식별 하 고 대상 조직 (예: 창 자 또는 창 자)에서 차별화 합니다.
- 상단 바에서 대상에 대 한 가장 적절 한 투자 수익 모양을 선택 합니다. (ROI) 분석 소프트웨어;에서 각각 측정 도구를 배치 하 여 관심의 영역으로 레이블 대상 조직 소프트웨어 제공할 것입니다 형광 강도 투자 수익로 (피코-)에 대 한 어 금 니 양의 추적 프로그램을 스캔에 대 한 조정 되었습니다.
- 질병 활동 (조직학) 선 동적인 침투와 상관 관계에서의 평가 대 한 가장 적합 한 상응 ROI 크기에 대 한 정규화 된 적절 한 투자 수익에 추적 프로그램의 총 금액을 선택 합니다.
참고: 경우 특정 모델의 대표로 서 적절 한 투자 수익의 다른 기능을 선택할 수 있습니다.
7입니다.전 비보 분석
- 되며 오신 얼룩과 면역 형광 염색 법입니다.
- 2 분;에 대 한 70% 에탄올 (EtOH)에 배치 하 여 섹션을 deparaffinize 증류수로 씻어 나중. 5 분 동안 되며 솔루션 stain 그리고 그 후 10 분 동안 따뜻한 수돗물으로 씻어.
- 증류수, 2 분, 오신 솔루션 counterstain와 헹 구 고 다시 증류수로 씻어.
- 70 %EtOH, 96 %EtOH, 99 %EtOH, 및 크 실 렌 (2 회) 2 분 각각 탈수와 섹션의 선택을 취소. 수 지 장착 매체와 탑재 합니다.
- 면역 형광 검사 얼룩입니다.
- 면역 형광 염색 법에 대 한 이전 획득된 조직 단면도 ("스위스 롤")를 사용 하 고 7 µ m의 cryo 컷 섹션을 준비.
- 10 분 동안 5.0% 쥐 혈 청에서 아세톤 고정 및 냉동 콜론 섹션을 차단 하 고 희석된 (1/500 v/v) biotinylated 주 쥐 반대로 마우스 F4/80 항 체와 함께 밤새 품 어. 섹션 Tris 버퍼 염 분 (TBS)에 세 번 세척 하 고 PBS/BSA에 Streptavidin FITC (1: 100 v/v)와 품 어 (0.1 %w / v) 4 ° c.에서 하룻밤
- TBS에 섹션을 세척 하 고 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 1:1000 v/v) 대비 달성 하기와 얼룩. Confocal 현미경 형광 이미지 분석 ( 테이블의 재료; 40 x 확대 필터 큐브 N2.1 여기 필터 515-560 참조)와 고 전력 분야 당 F4/80-긍정적인 세포.
참고: vivo에서 FMT 및 사후 조직학 분석 immunohistochemistry 또는 의도 된 대상에 따라 면역 형광 염색 등을 결합 하는 때 동일한 복제 및 서식의 항 체를 사용 하 여 보십시오. F4/80-긍정적인 세포에서 vivo에서 와 ex vivo의검출에 대 한 다른 형식은 사용 했다.
- 콜론 샘플에서 MPO 측량입니다.
- 콜론 샘플 PBS 씻어 서 또는 MPO 측정에 대 한 해 동된 견본 취득 갓을 사용 합니다. 모든 샘플 무게와 균질 조직 세포의 용 해 버퍼는 ELISA에 제공에서 키트 ( 재료의 표참조) 조직의 mg 당 세포의 용 해 버퍼의 20 µ L의 볼륨에서.
- 15 sonicate s (쥡니다 주파수: 20khz, 전력: 70 W)와 g와 4 ° C x 200에서 10 분에 대 한 샘플을 원심
- 상용 ELISA 키트 ( 재료의 표참조)를 사용 하 여 제조 설명에 따르면. 중복에 테스트를 실시 합니다.
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Representative Results
Colitis의 평가:
DSS 유도 colitis 인간의 IBD를 닮 고 체중 감소, 직장 출혈, 표면 궤, 그리고 취약 쥐15점 막 손상에 이르게 하는 창 자 염증의 화학적으로 유도 된 murine 모델입니다. 타고 난 면역 체계가 장내 염증10,11의 발전에의 기여를 연구 특히 유용 합니다. Potently colitic 염증 유도, 쥐 들이 지속적으로 실험 통해 DSS를 관리. 체중 감소와 지저분한 신비로운 혈액 염증의 임상 색인으로 사용 되었다. 그림 1A에서 같이, 마우스 제어 동물 물 혼자 받고 몸 무게에 중요 한 변경 보여준 반면 체중 4 다음날 colitis의 유도에서 시작 시작 했다. 또한, colitic 동물 배설물 (그림 1B), 신비로운 혈액의 증가 배설 보여준 다음 hemoccult 득점 시스템을 사용 하 여 평가: 0 (혈액), 1 (hemoccult 양성), 2 (hemoccult 긍정적인 시각과 펠 릿 출혈), 및 4 ( 출혈, 항문 주위 혈액 총)16. 결 장 길이 염증 유발 저 승 단축, colitic 쥐 혼자 물 (그림 1C) 수신 제어 마우스에 비해 크게 단축된 콜론 공개 평가를 측정 했다. 직접 저 승 손상 평가, 조직학 분석은 실험의 끝에 수행 되었다. 조직학 손상의 정량적 평가 저 승에 수행한 & 전체 부상 코어를 사용 하 여 전자 스테인드 섹션 정도와 염증, 토 굴, 손상과 % 참여17의 범위에 따라. Colitic 마우스 컨트롤 마우스 아무 DSS 받는 했다 조직학 손상 (그림 1D) 동안 심한 증세를 보였다. 이미지는 DSS 유도 대 장 염, 파괴에 의해 상피 구조의 잔 셀, 토 굴, 손상과 반대로 크게 보존 점 막 궤의 손실와 함께 막 특징에 특징적인 염증 성 변화를 보여 컨트롤 마우스18건축입니다. 그룹 간의 통계적 차이 (n = 그룹 당 5) 분산 분석 (ANOVA) 학생-뉴 먼-Keuls (S.N.K.)에 의해 다음에 의해 계산 되었다 게시물 임시 테스트 또는 웰 치의 테스트 하 여 뒤에 중요 한 분산 이질성의 경우 게임 하 웰 특별 게시물 테스트. P-값이 < 0.05 중요 하 게 고려 되었다.
Monocyte와 대 식 세포 신규 모집의 평가:
DSS 유도 대 장 염은 점 막과 콜론, submucosa monocytes, 대 식 세포 등 면역 세포의 침투와 관련 우리 사용 monocyte/대 식 세포 마커 F4/80 immunofluorescent 얼룩이 지는 침투를 계량 하기. DSS를 받는 colitic 쥐 monocytes 비 colitic 제어 마우스 (그림 2A)에 비해 결 장 벽을 침투의 상당히 높은 숫자를 보여주었다. 백혈구 침투 또한 공개 제어 마우스 (그림 2B)에 비해 염증된 결에 호 중구의 크게 증가 이민 호 중구 마커 GR1, immunofluorescent 얼룩을 사용 하 여 정량 했다. 확인, MPO 모두 호 중구 수 및 염증 성 활동을 반영 하는 수준 크게 colitic 마우스 (그림 2C)의 결 조직에 상승 했다. ANOVA와 S.N.K. 게시물 임시 테스트 그룹 사이 통계적 의미를 계산 하기 위해 사용 되었다 (n = 그룹 당 5). 통계적 의미가 p에서 설정 < 0.05.
대 식 세포 부분 모집단에 조직의 변화:
마우스 monocytes 성숙 상태 및 그들의 능력을 그들은 시작 하 고 영 속 염증 반응을19 참여할 염증 성 사이트에 보충 될 다른 별개 부분 모집단의 이질적인 그룹 포함 . 따라서, 우리는 CD11b의 차동 식 분석 하 여 혈액 monocytes 특징 그리고 cytometry 흐름 Ly6C를 사용 하 여. 급성 DSS colitis의 염증 성 조건에서 염증 성 CD11b높은Ly6C높은 monocytes 사전 실험 조건에 비해 상당한 증가 관찰합니다. 대조적으로,이 변화는 DSS (그림 3A) 없이 비 colitic 통제 쥐에 있는 발생 하지 않았다. 데이터 (n = 그룹 당 5) ANOVA와 S.N.K.를 사용 하 여 분석 했다 조직의 염증에 대 한 추가 대리 매개 변수로 우리 DSS 취급 생쥐 (그림 3C)에서 크게 증가 공개 비 colitic 컨트롤에 비해 colitic 생쥐의 비장에 F4/80-긍정적인 세포의 존재를 평가.
형광-중재 단층 촬영 검사:
우리는 monocyte/대 식 세포 신규 모집 및 창 자 점 막으로 침투 측정 하 단층 형광 중재를 사용. Murine F4/80에 대 한 항 체 형광 표시 직접 생체에 활성화 된 대 식 세포를 시각화 하기 위해 고용 되었다. 레이블, 난다 쥐 IgG 항 체 isotype 컨트롤으로 사용 되었다. 스캔, 쥐 모피에 의해 빛의 반사를 최소화 하기 위해 복 부에 면도, 연속 isoflurane 공급에 의해 취 되었고 작은 동물 형광. 에 대 한 수의 FMT 장치 검사 그림 4A, 비 colitic 컨트롤에 비해 colitic 쥐의 콜론에 형광 추적의 상당히 높은 축적에 주도 colitis의 유도에 표시 된 대로 나타내는 monocyte 침투와 차별화 증가 colitic 동물에 대 하 식 활성 세포로 난다 형광 표시 된 IgG의 응용 복 부에 내장, colitic (DSS)도 검색 대상의 특이성을 보여주는 비 colitic (물) 그룹도 감지 형광 응답을 유도 하지 않았다 F4/80 항 체 (그림 4A)의 상호 작용. 복 부 영역의 대표 이미지 표시 됩니다. 색상 코드의 형광 강도, 선 동적인 침투(그림 4B 의 범위 및 4 C에 해당 하는 수준을 나타냅니다).Explanted 콜론에 추적 축적 F4/80-감독의 비보 전 측정 확인 F4/80 추적 축적 (그림 5A 와 5B)의 비보에 감지 신호의 저 승 기원 합니다. 계산 된 양의 바인딩된 항 체 잘 상관 (R2 = 0.52) (그림 5C 및 5d) 대 식 세포 침투의 조직학 결정 숫자, 특정 추적기와 이미징 vivo에서 그를 확인 하실 수 있습니다 로컬 질병 활동. 의 지표 데이터 통계 의미 수준 p 설정 ANOVA와 S.N.K. 특별 게시물 테스트에 의해 분석 되었다 < 0.05. 상관 관계는 선형 회귀로 계산 되었다.
그림 1 . 임상 매개 변수 및 급성 DSS colitis의 과정을 통해 조직학 부상.
C57BL/6 마우스 DSS와 도전 (2 %w / v) 8 일 동안 식용 수에서. 컨트롤 마우스 DSS 없이 식 수를 제공 했다. 동물 일 9에 안락사 되었다. 한 실험에서 데이터는 표시 (n = 그룹 당 5) ± 표준 오차 (SEM) 의미의. (A) bodyweight에 변화는 초기 무게를 기준으로 표시 됩니다. (B) 혈액, 대변에 배설 guaiac 종이 시험에 의해 결정 된 대로 (hemoccult, 0 부정, 4 = 혈액을 거시적 =). (C) 사후 콜론 길이입니다. (D) 암호 손상의 정도와 염증의 정도 의해 평가로 조직학 부상. 대표 조직학 심상은 (haematoxylin/오신 얼룩; 배율: 10 배 (상단 패널), (낮은 패널) x 20) colitic (왼쪽된 패널) 또는 컨트롤 (오른쪽 패널) 쥐의. 상피 구조의 깊은 파괴 및 염증 성 침투 (화살촉). 막대 그래프: 상해 점수. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 . 장 monocyte와 대 식 세포 침투.
DSS colitis는 DSS의 응용 프로그램에 의해 C57BL/6에서 유도 되었다 (2 %w / v) 식용 수에. 컨트롤 마우스 혼자 음료수를 받았다. N에서 데이터 = 5 그룹 당 마우스는 점 막에서 대 식 세포 침입의 ± SEM. (A) Immunofluorescent 시각화 표시 됩니다. 안티-f 4/80 colitic에 얼룩의 대표 이미지는 표시 및 마우스 제어. 막대 그래프: 셀 수/높은 전력 분야 (HPF). (B) 점 막 호 중구 침입의 Immunofluorescent 시각화. 안티-Gr-1 colitic 동물 및 컨트롤에 얼룩의 대표적인 이미지입니다. 막대 그래프: 수/HPF 셀. (C) colitic 및 colitic 비 쥐의 저 승 조직에 MPO 농도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 . 장 실에 monocyte 모집입니다.
Colitic 마우스 컨트롤 마우스에서 말 초 혈액 monocytes (n = 그룹 당 5) cytometry 식의 정-6 C CD11b-긍정적인 세포에 의해 분석 되었다. 셀은 SSC와 CD11b 식에 따라 정렬 했다. 마우스 monocytes SSC낮은CD11b높은 세포로 확인 되었다 하 고 그들의 Ly6C 식 분석 했다. (A) 비례높은 monocytes 사전 실험 조건 (% 변경 ± sem의)를 기준으로 묘사 하는 염증 성 Ly6C로 변경 합니다. (B) FACS 점 구획 Ly6C 식의 SSCl유량CD11b높은 세포에 colitic 동물의 전과 후 colitis 유도 (낮은 패널) 및 컨트롤 사전 및 사후 실험 (상위 패널). (C) colitic 및 colitic 비 쥐에서 Splenocytes cytometry (평균 형광 강도 ± SEM) 의해 F4/80의 표현에 대 한 평가 됐다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 . 단층 시각화 murine colitis. 에서 대 식 세포 침투의
FMT colitic 마우스에 스캔 및 비 colitic 컨트롤 murine F4/80에 대 한 Cyanine7 활용 된 항 체를 투여 (n = 그룹 당 5). (A) 막대 그래프: 총 형광 염료의 pmol 강도 ROI에 결정 했다 고 묘사 ± SEM. 대표 이미지 색된 형광 강도 주입 한 쥐에 선 동적인 침투의 범위에 해당 표시 됩니다 특정 조사 (반대로 마우스 f 4/80)와 (B) 와 난다 제어 (쥐 IgG) (C). 두 경우 모두에 동일한 크기의 ROI는 추가 분석을 위해 상단 복 부에 가로 배치 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 . 비보 전 murine colitis에 추적 특이성의 유효성 검사.
Vivo에서 특정 조사 (반대로 마우스 f 4/80)을 주사 하는 colitic 마우스에 FMT 검사 추적 신호 취득의 저 승 기원 보여 explanted 내장의 평면 형광 검사 vivo ex 에 선행 되었다 vivo에서. N의 총 2 실험에서 데이터 = 8 동물 표시 됩니다. 대표 이미지 색된 형광으로 FMT 스캔 colitic 쥐의 비보에 묘사 같습니다 염증 성 침투의 범위에 해당 하는 강도 (A).Explanted 장의 형광 반사율 영상 추적 프로그램 누적 된 특정 지역의 식별을 위해 허용 (B). Vivo에서 결과 확인 하는 대표적인 사후 얼룩 등의 분야에서 F4/80-긍정적인 세포에 대 한 immunofluorescent (C). 대 식 세포, 침투 수 면역 형광 염색 법, 정한 추적 프로그램 누적에서 vivo에서 측정 된 상관 했다 (D). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
의료 이미징 기술을 최근 몇 년 동안에서 급속 하 게 진화, 비록 우리는 여전히 개발의 그들의 초기 단계에서 염증 성 프로세스 또는 종양, 뿐만 아니라 다른 질병을 감지 하는 우리의 능력에 제한 됩니다. 그러나, 이것은 이해 종양 성장, 침략, 또는 전이 개발 및 염증 성 질환 및 퇴행 성, 심장 혈관과 면역 질병의 발달에서 세포 프로세스에 매우 중요. 전통적인 이미징 기술을 신체적 또는 생리 적 매개 변수에 의존, 분자 이미징 vivo에서특정 분자 마커20의 시각화 수 있습니다.
작은 동물 이미징, 방사성 핵 종 기반 접근 (예를 들어, s잉 글-광자 방출 계산 된 단층 촬영 (SPECT)과 양전자 방출 단층 촬영 (PET)), 초음파, 및 중재 하는 형광 이미징을 사용할 수 있는 특정 시각화 대상 분자 구조입니다. 대부분의 사용 가능한 추적 백본으로 전장 항 체를 사용 하 여 오랫동안 레이블을, 긴 순환 시간과 느린 조직 침투 지연 추적 프로그램 신청 후 화상의 시간으로 필요합니다. 일반적인 이미징 방사성 없습니다 따라서 항 체 분포의 비보에 영상에 적합. Cu64 또는 In111 같은 긴-생활 동위 원소를 사용 하 여 항 체 기반 추적기를 사용 하지만 동위 원소 세대, 방사선 안전 전과 라벨링 절차 동안에 걸친 복잡 한 인프라를 요구 하 고 조사 신청 후 동물 주택 차폐. 더 비용 효율적이 고 안전 하 게 이체 것 될 형광-중재 이미징.
여러 vivo에서 영상 감지 시스템, 생체에 형광 염료 분포의 측정 및 시각화, 지난 2 년간21이상 제시 되었습니다. 대부분의 시스템 사용 빠른 평면 영상 표면 병 변 영상에 적합 합니다. 빛을 흡수 및 산란, 신호에 깊은 조직 회피 평면 화상 진 찰. 이 문제에 대 한 가장 눈에 띄는 해결책은 형광 단층22이다. 수학적 모델링을 바탕으로, 이미지 신호 산란 및 광 흡수에 대 한 해결 하 고 가상 3D 데이터 집합8멀티 프로젝션 데이터 집합 계산 됩니다. 알고리즘은 완전히 양적 데이터를 대상 농도/식23의 특정 지역 대표에 추적 농도의 추정을 제공 합니다. FMT의 관련 제한 해 부 이미징 기술, 어떤 수도-에 따라 원하는 대상-타협의 분자 정보 특정 해 부 구조를 할당에 비해 빈약한 공간적 해상도 관련이 있습니다. 또 다른 한계는 프로브 흡수 하 고 NIR 스펙트럼 범위23레드에서 fluorescing의 사용을 필요로 하는 조직으로 빛의 제한 된 침투 깊이에 있다.
형태학 초음파의 장점과 형광 영상에서 분자 정보를 얻기의 가능성을 결합 하는 최근에 소개 된 이미징 형식 optoacoustic 영상입니다. 초기 연구에서 예비 결과-고 추가 기술 상세-optoacoustic 이미징 파악 큰 약속 분자 이미징 및 잠재적인 변환 응용 프로그램24에 대 한 필요를 건의 한다.
창 자 벽에 백혈구의 채용은 중요 한 단계는 개시 고 IBD, 감염이 나 자가 면역 질환 등 많은 면역 중재 질병, 염증의 사이트에 염증 세포의 채용 감염, 혈관 질병, tumorigenesis, 그리고 많은 더 많은25. Monocyte 활성화 및 장 점 막으로 침투 IBD의 병 인에서 필수적인 단계, monocyte 침투, 발산 및 integrin 세포질 접착 분자 상호 작용에 의해 조율 된의 억제는 유망한 치료 12,26에 접근. 따라서, 염증의 사이트에 매매 하는 백혈구를 모니터링 연구 약물의 항 염증 효과 시각화 하는 새로운 치료 옵션의 개발에서 결정적 이다. 이 때문에 백혈구 매매 대상으로 하는 에이전트 개발 되었습니다, 일부 안티 integrin 항 체 이미 IBD 치료에 사용할 수 있는 추가 구성 요소 근처 미래26에서 사용할 수 있을 것입니다 하는 동안 특별 한 관심의 수 있습니다. Vedolizumab, 용기 전용 α4β7 integrin 소 단위, 및 Etrolizumab, 장 α4β7 및 αEβ7 integrin heterodimers의 β7 소 단위를 바인딩하는 인간 답게 단일 클론 항 체 승인된27,28되었습니다. 다른 에이전트 (예를 들어, MAdCAM-1 PF-00547659 및 Ozanimod 같은 sphingosine 1 인산 염 (S1P) 수용 체 변조기) 현재 IBD29,30의 치료에 대 한 평가 겪고 있다.
FMT를 수행할 때 기술의 가능한 수정 다른 추적 프로그램-대상 조합으로 FMT 이미징 빈약한 공간적 해상도 대 한 보상에 접근 하는 구조와 결합의 선택을 포함 합니다. 다양 한 검색 대상 조합 설립 되어과 상용화. 특정 프로젝트, 사용자 지정 항 체의 라벨 수 키트 및 상기 설명 된 프로토콜 라벨 다 사용 하 여 상용 될. 항 체 또는 대상 moiety 선정 작은 펩 티 드, 따라 상업적인 공급 업체 다양 한 다른 레이블 제공 합니다. 응용 프로그램에 따라 원하는 염료를 고려: 깊은 조직 이미징, 적외선 스펙트럼에서 작동 하는 염료에 대 한 (예를 들어, Cy7, λex / em 750/780 nm) 전반적인 밝기와 효과적인 빛 염료의 공급 하는 동안 적절 한 수 있습니다 스펙트럼 (예를 들어, GFP 아날로그)의 근처에 보이는 범위에서 작동 하는 것이 좋습니다 수 있습니다. 거의 모든 염료 레이블로 대체 바인딩 moieties 뿐만 아니라 단백질의 리 진 잔류물 시스테인 바인딩 maleimides 등 biotin 특정 라벨 태그31 갖춘 단백질의 라벨에 대 한 활성 에스테 르로 얻어질 수 있다 . 라벨의 선택 원리 프로토콜 변경 되지 않습니다 하지만 단지 라벨 절차의 약간의 수정이 필요로 고 좋은 이미징 결과 대 한 중요 하다. 공간 해상도에 한계를 극복 하기 위해 또 다른 매력적인 수정 CT 또는 MRI, 분자 정보 해 부 구조의 주석 활성화 FMT 결합 하는 것입니다.구조 정보 수 중 취득 될 순차적으로 선험적으로 정보 또는 동시에, 하이브리드 이미징 계측32,33필요.
특정 프로토콜의 단계는 특별 한 관심을 받을 자격이. 이 기술은 다양 한 대상으로 다양 한 다른 분자 프로세스의 특정 분자 형광 photoprobes에 대 한 적응 될 수 있는, 그것은 프로브에 농축의 충분 한 분포 수 있도록 필수적입니다는 원하는 대상 지역입니다. 이미징에 대 한 이상적인 시간 포인트 검색 대상 조합에 따라 달라질 수 있습니다. 예를 들어 종양 수용 체의 항 체 타겟팅 종양, 통풍 관 및 간, 그리고 가능한 불리 한 면역성 반응34로 대사를 확산 속도 의해 좌우 될 수 있습니다. 또한 특정 이미징 접근에 대 한 관련 컨트롤을 고려 하십시오. 특정 추적기 isotype 컨트롤 관류 효과 난다 바인딩 (예를 들어, Fc 수용 체-중재 바인딩)에 대해 항상 확인 합니다. 대상-부정적인 동물 같은 녹아웃 모델 있으면 추적 특이성에 대 한 추가 제어 될 수 있습니다. 또는 차단 하는 실험 대상 항 체 상호 작용35의 특이성을 증명 하기 위해 수행할 수 있습니다.
다음은 프로시저의 실용성에 관한 중요 한 단계: (1) 신중 하 게 사용 되는 DSS 농도 결정, DSS 민감성 사이 다를 수 있습니다 다른 마우스 변종 및 제조/일괄36. (2) 신중 하 게 조사 대상 조합을 선택 합니다. (3) 전체 복 부의 충분 한 스캔을 위한 스캔 시간 약 5 분 수 있습니다. 최적의 시간 추적 응용 프로그램 및 이미징 절차 사이의 원하는 대상 지역에 추적 축적 수 있도록 신중 하 게 결정 될 포인트. 장 F4/80 검출 murine colitis에, 레이블이 지정 된 항 체 검사 전 24 시간 주입 한다. (4) 난다 레이블 축적 (예를 들어, 간에서) 발생할 수 있습니다, 그것은 중요 한 투자 수익으로 각각 측정 도구를 배치 하 여 적절 한 대상 조직을. 또한, 불특정 추적 프로그램 배포에 대 한 충분 한 컨트롤 수 포함-고려해 야 항 암 효과 녹아웃 또는 추적 대상 상호 작용을 확인 하기 위해 차단 연구를 배제 하기 위해 불특정 isotype 컨트롤.
스캐닝 절차 및 데이터 복구와 관련 된 오류의 일반적인 소스 부적절 한 동물 위치를 포함, 검색 필드, 그리고 노출 시간. 동물을 배치할 때 fluorescing 병 변 조직 재건 잡음을 최소화 하기 위해 모든 측면에 의해 포위 한다. 기포는 동물 및 이미징 카세트의 전면 유리 접시 사이 갇혀 또한 잡음을 늘릴 수 있습니다 그리고 약간 동물을 이동 하 여 제거 한다. 오버-또는 이미지의 노출 부족 검색 화면에서 찾을 수 있습니다 수정된 노출 설정으로 획득 검사를 요구할 수 있습니다 (반사율 이미지 블록: 전면 LED 강도와 노출 시간의 조정). 생체 내에서 항 체 기반 FMT 측정 immunohistochemistry 또는 immunofluorescent 얼룩 등 사후 조직학 분석을 결합 하는 때 동일한 복제 및 포맷의 항 체를 사용 하 여 고려 되어야 한다. 또한, 같은 동물에서 반복적인 FMT 측정을 수행할 때 동일한 형식 및 복제 가능한 분 또는 다른 epitopes의 대상으로 방지 하기 위해 사용 되어야 한다.
함께 찍은, 형광 유기 분자 단층 촬영은 질병 과정의 반복 모니터링 및 pathophysiological 프로세스를 기본 수 있습니다. 그것은 생물 의학 연구의 과다에 적용할 수 및 마약 테스트를 가속 화 하기 위해 유용할 수 있습니다 또는에 객관적인 끝점으로 개별 치료. FMT-F4/80-표현 대 식 세포의 염증 모델에서의 대상으로 시각화 하 고 침투와 또한 기존의 좋은 상관 관계를 보여주는 동안 염증 세포의 축적을 계량 귀중 한 비 침범 성 도구를 제공 합니다. 판독입니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
우리는 우수한 기술 지원에 대 한 양 소냐 Dufentester, 양 Elke 웨버와 부인 Klaudia Niepagenkämper 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Alfalfa-free diet | Harlan Laboritories, Madison, USA | 2014 | |
| Bepanthen eye ointment | Bayer, Leverkusen, Germany | 80469764 | |
| Dextran sulphate sodium (DSS) | TdB Consulatancy, Uppsala, Sweden | DB001 | |
| Eosin | Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany | E 4382 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany | E 9884 | |
| Florene 100V/V | Abbott, Wiesbaden, Germany | B506 | |
| Haematoxylin | Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany | HHS32-1L | |
| O.C.T. Tissue Tek compound | Sakura, Zoeterwonde, Netherlands | 4583 | fixative for histological analyses |
| Phosphate buffered saline, PBS | Lonza, Verviers, Belgium | 4629 | |
| Sodium Chloride 0,9% | Braun, Melsungen, Germany | 5/12211095/0411 | |
| Sodium bicarbonate powder | Sigma Aldrich Deisenhofen, Germany | S5761 | |
| Standard diet | Altromin, Lage, Germany | 1320 | |
| Tissue-Tek Cryomold | Sakura, Leiden, Netherlands | 4566 | |
| Hemoccult (guaiac paper test) | Beckmann Coulter, Germany | 3060 | |
| Biotin rat-anti-mouse anti-F4/80 antibody | Serotec, Oxford, UK | MCA497B | |
| Biotin rat-anti-mouse anti-GR-1 | BD Pharmingen, Heidelberg Germany | 553125 | |
| Streptavidin-Alexa546 | Molecular Probes, Darmstadt, Germany | S-11225 | excitation/emission maximum: 556/573nm |
| Anti-CD11b rat-anti-mouse antibody TC | Calteg, Burlingame, USA | R2b06 | |
| Purified anti-mouse F4/80 antibody | BioLegend, London, UK | 123102 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | D9542 | |
| FITC-conjugated anti-Ly6C rat-anti-mouse antibody | BD Pharmingen, Heidelberg, Germany | 553104 | |
| FACS buffer | BD Pharmingen, Heidelberg, Germany | 342003 | |
| Cy7 NHS Ester | GE Healthcare Europe, Freiburg, Germany | PA17104 | |
| MPO ELISA | Immundiagnostik AG, Bensheim, Germany | K 6631B | |
| Cy5.5 labeled anti-mouse F4/80 antibody | BioLegend, London, UK | 123127 | ready to use labelled Antibodies (alternative) |
| Anti-Mouse F4/80 Antigen PerCP-Cyanine5.5 | eBioscience, Waltham, USA | 45-4801-80 | ready to use labelled Antibodies (alternative) |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | 67-68-5 | |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | 792632 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | 64-17-5 | |
| Bovine Serum Albumins (BSA) | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | A4612 | |
| Tris Buffered Saline Solution (TBS) | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | SRE0032 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| FACS Calibur Flow Cytometry System | BD Biosciences GmbH, Heidelberg, Germany | ||
| FMT 2000 In Vivo Imaging System | PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA | FMT2000 | |
| True Quant 3.1 Imaging Analysis Software | PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA | included in FMT2000 | |
| Leica DMLB Fluorescent Microscope | Leica, 35578 Wetzlar, Germany | DMLB | |
| Bandelin Sonopuls HD 2070 | Bandelin, 12207 Berlin, Germany | HD 2070 | ultrasonic homogenizer |
| Disposable scalpel No 10 | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | Z692395-10EA | |
| Metzenbaum scissors 14cm | Ehrhardt Medizinprodukte GmbH, Geislingen, Germany | 22398330 | |
| luer lock syringe 5ml | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | Z248010 | |
| syringe needles | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | Z192368 | |
| Falcon Tube 50ml | BD Biosciences, Erembodegem, Belgium | 352070 |
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