Summary
Sondas específicas de objetivo representan una herramienta innovadora para el análisis de los mecanismos moleculares, como la expresión de proteínas en diversos tipos de enfermedad (p. ej., inflamación, infección y tumorigenesis). En este estudio, describimos una evaluación tomográfica tridimensional cuantitativa de la infiltración de macrófagos intestinales en un modelo murino de colitis con F4/80-específica mediada por fluorescencia tomografía.
Abstract
Modelos murinos de enfermedad son indispensables para la investigación científica. Sin embargo, muchas herramientas de diagnostico como la endoscopia o la proyección de imagen tomográfica no se emplean rutinariamente en modelos animales. Lecturas experimentales convencionales a menudo se basan en análisis post mortem y ex vivo , que evitar las citas de seguimiento intra individuales y aumentan el número de animales de estudio necesitada. Tomografía mediado fluorescencia permite la evaluación no invasiva, repetitiva, cuantitativa, tridimensional de sondas fluorescentes. Es muy sensible y permite el uso de los fabricantes de moleculares, que permite la detección específica y la caracterización de distintas dianas moleculares. En particular, las puntas de prueba específicas representan una herramienta innovadora para el análisis de genes de activación y de la proteína en inflamación, enfermedades autoinmunes, infección, enfermedad vascular, migración celular, tumorigénesis, etcetera. En este artículo, ofrecemos instrucciones paso a paso en esta sofisticada tecnología de proyección de imagen para el en vivo detección y caracterización de la inflamación (es decir, la infiltración de macrófagos F4/80-positivo) en un modelo murino utilizado de inflamación intestinal. Esta técnica podría utilizarse también en otras áreas de investigación, como seguimiento de la célula o células madre inmune.
Introduction
Los modelos animales son ampliamente utilizados en la investigación científica, y existen muchos procedimientos no invasivos para monitor actividad de la enfermedad y la vitalidad, como la cuantificación de los cambios de peso o el análisis de sangre, orina y heces. Sin embargo, estas son sólo parámetros de sustituto indirecto que también están sujetos a variabilidad interindividual. Con frecuencia deben complementarse análisis post mortem de muestras de tejido, que impide la observación serial en momentos repetitivos y dirigir los procesos de observación del fisiológico o patológico en vivo. Sofisticadas técnicas de imagen pequeños animales han surgido, incluyendo la proyección de imagen seccional, imágenes ópticas y endoscopia, que permite la visualización directa de estos procesos y también permite análisis repetitivos de los mismos animales1 , 2 , 3. Además, la posibilidad de repetitivas controlar diferentes Estados de la enfermedad en el mismo animal podría disminuir el número de animales necesarios, que podría ser deseable desde un punto de vista de la ética animal.
Existen varias técnicas de proyección de imagen ópticas en vivo imágenes de fluorescencia. Originalmente, la proyección de imagen confocal fue empleada para estudiar la superficie y subsuperficie eventos fluorescente4,5. Recientemente, sin embargo, sistemas tomográficos que permiten la evaluación cuantitativa del tejido tridimensional han sido desarrollados6. Esto se ha logrado mediante el desarrollo de sondas fluorescentes que emiten luz en el espectro de infrarrojo cercano (NIR), con baja absorción, detectores sensibles y fuentes de luz monocromáticas7. Mientras que las técnicas de imagen cross-sectioning tradicional, tales como la tomografía computada (CT), imágenes por resonancia magnética (MRI) o ultrasonido (US), en su mayoría dependen de parámetros físicos y visualizar la morfología, la proyección de imagen óptica puede proporcionar información adicional sobre los procesos moleculares subyacentes utilizando fluorescentes endógenos o exógenos sondas de8.
Avances en biología molecular han contribuido a facilitar la generación de sondas moleculares fluorescentes inteligentes y específicas para un número creciente de objetivos. Por ejemplo, captación mediada por receptor y la distribución en un área dada se pueden visualizar utilizando carbocyanine anticuerpos etiquetados derivado9. La abundancia de anticuerpos disponibles, que pueden ser etiquetadas como marcadores específicos en áreas de otra manera inaccesibles del cuerpo, proporciona penetraciones sin precedentes en los procesos moleculares y celulares en modelos de tumorigenesis y neurodegenerativas, enfermedades cardiovasculares, inmunológicas e inflamatorias7.
En este estudio, describimos el uso de la tomografía de fluorescencia-mediada en un modelo murino de la colitis. Dextrán sulfato de sodio (DSS)-colitis inducida es un modelo estándar del ratón inducida químicamente de la inflamación intestinal que se asemeja a inflamatoria intestinal (EII) de la enfermedad10. Es particularmente útil evaluar la contribución del sistema inmune innato para el desarrollo de la inflamación de intestino11. Puesto que el reclutamiento, activación y la infiltración de monocitos y macrófagos representan pasos cruciales en la patogenia de la EII, visualización de su contratación y la cinética de la infiltración son esenciales para monitorear, por ejemplo, el efecto de sustancias terapéuticas potenciales en un entorno preclínicos12. Describimos la inducción de colitis DSS y demostrar la caracterización de tomografía-mediada de la infiltración de macrófagos en la mucosa intestinal con fluorescencia molecular tomografía para la visualización específica del marcador de monocito/macrófago F4/80 13. Además, ilustramos procedimientos auxiliares y suplementarios, como anticuerpo etiquetado; la disposición experimental; y análisis e interpretación de las imágenes obtenidas, en correlación con lecturas convencionales tales como índices de actividad de la enfermedad, fluyen cytometry y análisis histológico e inmunohistoquímica. Se discuten las limitaciones de esta técnica y las comparaciones con otras modalidades de imágenes.
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Protocol
Todos los experimentos en animales fueron aprobados por el Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz (LANUV) Renania del Norte-Westfalia, según la ley de protección Animal (Tierschutzgesetz).
1. materiales y montaje Experimental
- Cuidado de los animales.
- Utilizar ratones pareados por edad y sexo de cualquier cepa DSS susceptibles (por ejemplo, C57BL/6) en el peso corporal de 20-25 g.
- Plan por lo menos cinco o más ratones por grupo experimental y la casa los ratones según las pautas de cuidado de los animales locales.
- Proporcionar un estándar roedor chow dieta y esterilizar el agua potable ad libitum.
- Retire el chow estándar y sustituirla por chow libre de alfalfa por lo menos tres días antes de la exploración para reducir endoluminal auto-fluorescencia.
- Inducción de la colitis inducida por DSS aguda.
- Disolver 2 g de DSS (peso molecular ~ 40.000 Da) en 100 mL de agua esterilizado para obtener un 2% (solución del peso/volumen).
- Llenar la fuente beber de los ratones exclusivamente con la solución DSS y estimar 5 mL de líquido por ratón por día. Proporcionar la misma agua potable sin DSS a los ratones de control10.
Nota: Vigile los ratones diariamente hasta el final del experimento. Eutanasia a los ratones que perder más de 20% de su peso corporal inicial o que se convierten en moribunda (es decir, persistente encorvada postura, movimiento disminuido, respiración forzada, notablemente erectos capa) según Directivas locales en animal bienestar.
- Preparación de la tomografía de fluorescencia-mediada.
- El anticuerpo deseado (por ejemplo, rata anti-ratón F4/80) con el colorante de la fluorescencia de la etiqueta (por ejemplo, Cyanine7, λexcitación: 750 nm, λ deemisión: 776 nm) como se describe en el protocolo del fabricante. Dializan anticuerpo purificado en una membrana de diálisis adecuada (tamaño de poro < 50-100 kDa) contra 1 L de cloruro de sodio de 0.15 M para por lo menos 2 horas o durante la noche.
- Transferencia de los anticuerpos a 1 L de 0,1 M NaHCO3 y dializo durante al menos 2 h.
- Disolver la cantidad necesaria de colorante fluorescente en dimetil sulfóxido (DMSO) (10.8 μl/mg de anticuerpo) y añadir a la solución de anticuerpo. Utilizar el tinte fluorescente en exceso molar 20-fold para lograr una relación de colorante a la proteína de 1:3.
- Incubar en la oscuridad a 4 ° C por 1 h. retirar el anticuerpo diálisis contra 1 L de sodio de 0.15 M o mediante una columna de desalación PD-10 y resolver en tampón fosfato salino (PBS) para aplicación en vivo .
- Determinar la concentración de anticuerpo final y etiquetado cociente por espectrofotometría.
- Medir la concentración de proteína en una absorción de 250-330 nm y considerar absorción adicional por el tinte. Corregir el máximo de absorción a 280 nm (proteína) en un 11% de la máxima absorción a 750 nm (siguiente paso) para el etiquetado de Cyanine7.
- Medir la dilución de la sustancia (típicamente 1:10) 250-800 nm y extraer la concentración de Cyanine7 en 750 nm.
- Determinar la proporción de proteína de tinte como: tinte anticuerpos = máxima absorción a 750 nm / 200.000 / (máxima absorción a 280 nm - 0,11 x máxima absorción a 750 nm) / 170.000.
- Mantener la solución de anticuerpo a 4 ° C y proteger de la luz para evitar la decoloración antes de la inyección.
- Cargar el volumen de la solución de anticuerpo necesario en una jeringa estéril inmediatamente antes de la inyección y el escudo de la luz hasta que se utiliza.
- Determinar el momento óptimo de la inyección de la punta de prueba y el procedimiento, dependiendo de la farmacocinética de trazador.
- Anestesiar los ratones usando 1.5-2.5% inhalado isoflurano en oxígeno o colocarlas firmemente en un limitador dedicado para la inyección de la vena de la cola de los anticuerpos etiquetados.
- Para los anticuerpos del cuerpo entero, inyectar el anticuerpo marcado por lo menos 24 h antes de la exploración, como visualización anti-ratón F4/80 macrófago murina colitis. Inyectar a ratones por vía intravenosa (i.v.) a través de la cola de la vena con anticuerpo marcado en un importe equivalente a 2.0 nmol de tinte.
- Uso igualmente etiquetado anticuerpos inespecíficos (p. ej., rat IgG u otro isotipo correspondiente a la herencia del anticuerpo primario) como control de isotipo en dosis equivalentes a las de la sonda específica.
Nota: Los resultados de en vivo exploraciones después de la inyección del compuesto de control puede servir como referencia para la interpretación de la sonda específica de datos. - Use una afeitadora eléctrica para afeitar la piel animal en la región abdominal para reducir al mínimo la absorción y reflexión de la luz.
- El anticuerpo deseado (por ejemplo, rata anti-ratón F4/80) con el colorante de la fluorescencia de la etiqueta (por ejemplo, Cyanine7, λexcitación: 750 nm, λ deemisión: 776 nm) como se describe en el protocolo del fabricante. Dializan anticuerpo purificado en una membrana de diálisis adecuada (tamaño de poro < 50-100 kDa) contra 1 L de cloruro de sodio de 0.15 M para por lo menos 2 horas o durante la noche.
2. técnicos
- Utilice un dispositivo de tomografía de fluorescencia-mediada veterinaria (FMT) para animal pequeño fluorescencia ( figura 4).
- Crear un nuevo estudio para cada proyecto haciendo clic en el "nuevo estudio" botón e incluir en la descripción del estudio de los marcadores relevantes, incluyendo los parámetros de imagen y dosis para referencia futura.
- Dentro de este estudio, crear grupos de estudio según el diseño del estudio respectivo (por ejemplo, para el control de isotipo inespecíficas y trazador específico) haciendo clic en el "nuevo grupo de estudio" botón. Equipar a cada grupo de estudio con el respectivo número de animales.
- Calibrar el sistema para las construcciones de trazador.
- Realizar la calibración para cada lote de marcadores para normalizar la variación en el etiquetado y permitir la medición cuantitativa de los datos de la OI.
- Seguir la dirección del fabricante del instrumento para la calibración de cada sistema individual; sobre la selección de "añadir nuevo rastreador", el sistema proporcionará a una guía a través de los pasos. Proporcionar la dilución de la solución de anticuerpo aplicado y la concentración absoluta calculada del trazador en la sonda.
- Para FMT, utilice un fantasma imitando tejido de características definidas del espesor y la absorción (que se asemejan a tejidos vitales) y llenarlo con un volumen específico de la solución de anticuerpo utilizado. Esta medida en el dispositivo de la FMT.
Nota: El sistema utiliza la medida de referencia de la sonda suministrada, junto con la concentración determinada para calcular las concentraciones de indicador absoluto de medidas futuras en vivo .
- Utilice un cassette de examen calentable con una temperatura de 42 ° C.
Nota: Esto evita que los ratones se hipotérmica durante el examen.
3. animal anestesia
- Utilizar un flujo continuo de 1.5-2% vol % isoflurano (2-chloro-2-(difluoromethoxy)-1,1,1-trifluoro-ethane]) y 1.5 L O2/min para anestesiar los ratones.
4. fluorescencia-mediada de la tomografía
Nota: Adaptar los datos siguientes, que son específicos para el sistema FMT utilizado en este estudio (véase la Tabla de materiales) para dispositivos de imágenes de reflectividad de fluorescencia alternativos o sistemas de FMT, según sea necesario.
- Coloque el ratón anestesiado en su parte posteriora en el cassette de la examinación.
- Realizar el procedimiento.
- Inserte el cartucho en el sistema de proyección de imagen y cierre inmediatamente para asegurar la anestesia continua. Seleccionar la muestra apropiada en el grupo de estudio creado previamente. Seleccionar el trazador administrado desde el menú desplegable para asegurar que los valores para la concentración del trazalíneas se calculan correctamente.
- Adquirir imagen de reflectancia de fluorescencia a la longitud de onda adecuada (720 nm de Cyanine7) para la planificación de la exploración y resumen el campo de exploración haciendo clic en el botón "adquirir imagen".
- Ver que el campo de análisis aparece como una superposición de la imagen de reflectancia de fluorescencia. Ajustar a la región de interés (por ejemplo, colon o abdomen), evitando el aire o las áreas de la piel restante. Dependiendo el destino de la imagen, establecer al número de imagen de puntos de datos dentro del campo de exploración, eligiendo entre la gruesa mediana y fina resolución de campo de exploración en el menú de la derecha.
Nota: Tenga en cuenta que un campo de exploración bien podría ofrecer mejor resolución espacial a costa de un tiempo significativamente largo análisis. - Iniciar la adquisición de datos/imagen a la longitud de onda seleccionada haciendo clic en "scan".
Nota: El tiempo de exploración para una exploración semifino del abdomen entero será alrededor de 5 min; en este tiempo, cada punto de datos por separado es iluminado por el laser de la excitación y la fluorescencia resultante se registra. - Retirar el animal del cassette de imágenes al final de la exploración y dejar el animal a recuperarse completamente antes de colocarlo en la jaula.
- Repita la FMT si se considera necesario en varios puntos del tiempo durante el experimento (por ejemplo, los días 0, 5 y 9-10 (final del experimento)), pero la acumulación de anticuerpos en el cuerpo, por lo tanto aumento de la señal de fluorescencia de fondo.
5. post-análisis
- Coloque el ratón en una jaula separada en una toalla de papel bajo una lámpara de calentamiento luz roja y controlar el ratón signos de malestar o angustia hasta recuperación completa. Coloque el ratón en su respectiva jaula cuando está totalmente despierto.
- Eutanasia a los ratones al final del experimento por la entrega de CO2 para el aislador a una dosis de 100% (v/v), 100% vol y 3 L/min. No la llene la cámara con CO2, como una súbita exposición a altas concentraciones de CO2 puede causar señal de socorro. Verificar la muerte después de que el ratón ha dejado de respirar de un modo secundario subsecuente de la eutanasia como rápida dislocación cervical.
- Explante el colon por laparotomía abdominal y realizar un análisis ex vivo de colon explanted, como se explica en pasos 4.2.1 - 4.2.4. Abra cada colon longitudinalmente con tijeras quirúrgicas Metzenbaum y enjuagar con solución salina antes de preparar para su análisis posterior.
- Utilice un bisturí para cortar un fragmento de 0.5 cm del colon distal y colocar inmediatamente en un tubo criogénico de 1,5 mL. Congelación en nitrógeno líquido y almacenar a-70 ° C hasta su uso posterior (por ejemplo,mieloperoxidasa (MPO) medidas).
- Utilizar un palo de madera y enrollar el colon longitudinalmente abierto restante de distal al extremo proximal, con la hacia fuera de la mucosa ("técnica de brazo de gitano"), para análisis histológicos. Colocar la preparación en un fijador (véase la Tabla de materiales) y congelar a-80 ° C14.
6. interpretación y reconstrucción de datos
- Utilice la herramienta reconstrucción del respectivo software imagen para crear mapas en 3D de la distribución de la fluorescencia a partir de los datos de imágenes raws; las exploraciones se agregan automáticamente a la herramienta de reconstrucción, cuando a la exploración, la función "Agregar a cola de reconstrucción" está seleccionada.
- De lo contrario, seleccione las imágenes en el menú desplegable bajo el respectivo estudio grupo de estudio, haga clic derecho en la exploración y seleccione "añadir a la reconstrucción".
- Para su posterior análisis, cargar un conjunto de datos en el software de análisis. En el menú desplegable en la barra superior, seleccionar el estudio correspondiente y luego seleccione el grupo de estudio y el animal individual en el menú de la derecha; se mostrarán todos los escaneos de este animal. Seleccione la correcta exploración y haga clic en "cargar".
Nota: La reconstrucción 3D de la distribución del indicador aparecerá en la izquierda como una superposición de la imagen de reflectancia de fluorescencia inicialmente adquirido. El modelo puede girar y magnifica para el análisis más fácil. - Identificar focos de acumulación de etiqueta inespecíficos (p. ej., hígado o la orina de la vejiga) en mapas 3D reconstruidos y distinguir de los tejidos diana (por ejemplo, del intestino o del intestino).
- De la barra superior, seleccione la forma de retorno de la inversión más adecuada para el destino. Tejido de la blanco de la etiqueta como regiones de interés (ROI) mediante la colocación de los respectivos instrumentos de medición en el software de análisis; el software proporcionará una intensidad de fluorescencia para el retorno de la inversión, así como (pico-) cantidades molares del trazador que la exploración ha sido calibrada para.
- Seleccione la cantidad total de trazador en el ROI adecuado, normalizado por el tamaño ROI, como el equivalente más adecuado para la evaluación de la actividad de la enfermedad en correlación con el infiltrado inflamatorio (histología).
Nota: Otras características del ROI pueden ser elegidos si es apropiado como representante del modelo en particular.
7.Ex Vivo Análisis
- Hematoxilina y eosina y tinción de inmunofluorescencia.
- Desparafinizar secciones colocándolas en 70% de etanol (EtOH) por 2 min; enjuague luego con agua destilada. Tinción con hematoxilina en solución por 5 minutos y posteriormente enjuagar con agua caliente del grifo durante 10 minutos.
- Enjuague con agua destilada, contratinción con solución de eosina durante 2 min. y enjuagar nuevamente con agua destilada.
- Lugar en el 70% EtOH, 96% EtOH, 99% EtOH y xileno (2 veces) de 2 minutos cada uno para deshidratar y para eliminar las secciones. Montar con medio de montaje resinosas.
- Tinción de inmunofluorescencia.
- Utilizar las secciones de tejido previamente obtenidos ("brazo de gitano") para la tinción de inmunofluorescencia y preparar cryo-corte secciones de 7 μm.
- Bloquear secciones colon acetona-fijos y congelados en suero de rata de 5.0% por 10 min e incubar durante una noche con diluido (1/500 v/v) biotinilado primaria rata anti-F4/80 anticuerpo del ratón. Las secciones de lavado tres veces en solución salina tamponada con Tris (TBS) e incubar con estreptavidina-FITC (1: 100 v/v) en PBS y la BSA (0.1% w/v) durante la noche a 4 ° C.
- Lávese las secciones en TBS y mancha con 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 1: 1000 v/v) para lograr contraste. Analizar las imágenes de fluorescencia debajo de un microscopio confocal (ver la Tabla de materiales, 40 aumentos; cubo N2.1 de filtro con filtro de excitación 515-560) y contar las células F4/80-positivas por campo de alta potencia.
Nota: Considerar el uso de anticuerpos del mismo clon y formato al combinar en vivo FMT y post mortem histología análisis como inmunohistoquímica o inmunofluorescencia, tinción, dependiendo el objetivo. Para la detección de macrófagos F4/80-positive en vivo y ex vivo, se utilizaron diferentes formatos.
- Mediciones en muestras de colon de MPO.
- Uso recién obtenidos, PBS-aclarado dos puntos muestras o muestras descongeladas para mediciones de MPO. Todas las muestras de pesar y homogeneizar el tejido en tampón de lisis en el ELISA kit (véase la Tabla de materiales) en un volumen de 20 μl de tampón de lisis por mg de tejido.
- Someter a ultrasonidos por 15 s (frecuencia de sonicación: 20 kHz, potencia: 70 W) y centrifugar las muestras durante 10 minutos a 200 x g a 4 ° C.
- Uso un ELISA disponible comercialmente kit (véase la Tabla de materiales) según la descripción de la fabrica. Llevar a cabo la prueba por duplicado.
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Representative Results
Evaluación de Colitis:
Colitis inducida por DSS es un químicamente inducido modelo murino de inflamación intestinal que se asemeja a la enfermedad inflamatoria intestinal humana y conduce a la pérdida de peso, sangrado rectal, ulceración superficial y daño de la mucosa en ratones susceptibles15. Es particularmente útil estudiar la contribución del sistema inmune innato para el desarrollo de inflamación intestinal10,11. Para potencialmente inducir inflamación colitic, ratones fueron continuamente administrado DSS durante todo el experimento. Disminución de peso y sangre oculta fecal fueron utilizados como índices clínicos de inflamación. Como se muestra en la figura 1A, ratones empezaron a perder peso a partir de cuarto día después de la inducción de la colitis, mientras que los animales control que recibieron agua sola no demostraron ningún cambio significativo en el peso corporal. Además, los animales colitic mostraron excreción creciente de sangre oculta en heces (figura 1B), evaluada mediante el siguiente sistema de puntuación de hemoccult: 0 (sin sangre), 1 (hemoccult positivo), 2 (hemoccult positiva y visual de la pelotilla sangrado) y () 4 gruesos del sangrado, sangre alrededor del ano)16. Se midió la longitud de colon para evaluar el acortamiento colónico inducida por inflamación, revelando dos puntos significativamente acortadas en ratones colitic en comparación con ratones control recibiendo agua sola (figura 1). Evaluar directamente daño colónico, el análisis histológico se realizó al final del experimento. Se realizó una evaluación cuantitativa del daño histológico en colon H & secciones manchadas de E usando una lesión global basan en el grado y el grado de inflamación, daño de la cripta y participación por ciento17. Colitic ratones mostraron signos de inflamación severa, mientras que los ratones control no recibiendo DSS no mostraron ningún daño histológico (figura 1). Las imágenes muestran cambios inflamatorios característicos en colitis inducida por DSS, caracterizada por la destrucción de la arquitectura epitelial, con la pérdida de células caliciformes, cripta daños y ulceración de la mucosa, a diferencia de en gran parte conservado mucosa arquitectura en ratones de control18. Diferencias estadísticas entre los grupos (n = 5 por grupo) fueron calculadas por análisis de varianza (ANOVA) seguido por Student-Newman-Keuls (S.N.K.) post hoc test o prueba de Welch seguido de juegos Howell prueba post hoc en el caso de homogeneidad de varianza significativo. Un p-valor de < 0.05 se consideró significativo.
Evaluación de reclutamiento de macrófagos y monocitos:
Como colitis inducida por DSS está asociada con la infiltración de células inmunes, como los monocitos y macrófagos en la mucosa y submucosa del colon, se utilizó coloración inmunofluorescente para el marcador de monocito/macrófago F4/80 para cuantificar la infiltración. Ratones colitic recibir DSS mostraron un número significativamente elevado de monocitos infiltran la pared del colon en comparación con ratones control no colitic (figura 2A). Infiltración leucocitaria además se cuantificó mediante la tinción inmunofluorescente para el marcador neutrófilo GR1, revelando la inmigración perceptiblemente creciente de neutrófilos dentro del colon inflamada en comparación con ratones control (figura 2B). Para confirmar, MPO niveles reflejando tanto actividad número e inflamatorias neutrófilos fueron elevados perceptiblemente en el tejido del colon de los ratones colitic (figura 2). ANOVA y prueba post hoc S.N.K. se utilizaron para calcular la significación estadística entre los grupos (n = 5 por grupo). Significación estadística fue fijado en p < 0.05.
Cambios sistémicos en la subpoblación de macrófagos:
Monocitos de ratón abarcan a un grupo heterogéneo de distintas subpoblaciones que se diferencian en el estado de maduración y su capacidad de ser reclutadas a sitios inflamatorios, donde participan en iniciar y perpetuar la respuesta inflamatoria19 . Por lo tanto, nos caracteriza monocitos sanguíneos mediante el análisis de la expresión diferencial de CD11b y Ly6C utilizando citometría de flujo. En condiciones inflamatorias aguda colitis DSS, observamos un aumento significativo en inflamatorio CD11b monocitosalto altoLy6C en comparación con las condiciones del pre-experimento. En cambio, este cambio no ocurrió en los ratones de control sin colitic sin DSS (Figura 3A). Los datos (n = 5 por grupo) se analizaron mediante ANOVA y S.N.K. Como un parámetro del sustituto adicional de inflamación sistémica, se evaluó la presencia de células F4/80-positivas en el bazo de ratones colitic en comparación con controles no colitic, que revelaron un aumento significativo en los ratones tratados con DSS (figura 3).
Exploración de la tomografía de fluorescencia-mediada:
Usamos tomografía mediado fluorescencia para medir reclutamiento de monocitos/macrófagos e infiltración en la mucosa intestinal. Un anticuerpo marcado con fluorescencia contra murino F4/80 fue empleado para visualizar directamente los macrófagos activados en animales vivos. Anticuerpos IgG de rata etiquetados, fueron utilizados como control de isotipo. Para exploración, ratones se afeita la piel en la región abdominal para minimizar la reflexión de la luz, anestesiados por la fuente de continua de isoflurano y examinados en un dispositivo FMT veterinaria para pequeños animales fluorescencia. Como se muestra en la Figura 4A, la inducción de colitis conducida a una acumulación significativamente elevada de trazador fluorescente en los dos puntos de los ratones colitic en comparación con controles no colitic, lo que indica un aumento en la infiltración de monocitos y la diferenciación en macrófagos activos en animales colitic. La aplicación de una IgG marcada con fluorescencia inespecífica no provocar una respuesta de la fluorescencia detectable en el abdomen y el intestino, ni en el colitic (DSS) ni el grupo no colitic (agua), demostrando la especificidad de la sonda-blanco interacción del anticuerpo F4/80 (Figura 4A). Se muestran imágenes representativas de la región abdominal. El código de colores indica el nivel de intensidad de fluorescencia, que corresponde a la extensión del infiltrado inflamatorio()Figura 4B y 4C).Mediciones ex vivo de acumulación de tracer F4/80-dirigida en colones explanted verificaron el origen colónico de la señal en vivo detectado acumulación del trazador del F4/80 (figura 5A y 5B). Cantidades calculadas de anticuerpo unido bien correlacionaron (R2 = 0,52) histológico determinado número de infiltración de los macrófagos (figura 5 y 5D), confirmando que en vivo la proyección de imagen con marcadores específicos puede ser indicativo de actividad de la enfermedad local. Los datos se analizaron por la prueba post hoc ANOVA y S.N.K. con un nivel de significación estadístico de p < 0.05. Se calculó la correlación como la regresión lineal.
Figura 1 . Parámetros clínicos y lesiones histológicas en el transcurso de la colitis aguda de DSS.
Ratones C57BL/6 fueron desafiados con DSS (2% p/v) en agua de bebida durante 8 días. Control de ratones recibieron agua potable sin DSS. Los animales fueron sacrificados el día 9. Se muestran los datos de un experimento (n = 5 por grupo) ± el error estándar de la media (SEM). (A) cambios en el peso corporal se presentan en relación con el peso inicial. La excreción en las heces, la sangre (B) según lo determinado por la prueba del papel de guayaco (hemoccult, 0 = negativo, 4 = sangre macroscópica). (C) Post mortem colon longitud. (D) lesión histológica evaluada por el grado de daño de la cripta y el grado de inflamación. Se muestran imágenes histológicas representativas (coloración hematoxilina/eosina; aumentos: 10 x (panel superior), 20 x (panel inferior)) de colitic (paneles de la izquierda) o los ratones control (paneles de la derecha). Tenga en cuenta la profunda destrucción de la arquitectura epitelial e inflamatorio infiltra (flecha). Gráfico de barras: puntuación de la lesión. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 . Intestinal monocitos y macrófagos infiltran.
La colitis DSS fue inducida en C57BL/6 por la aplicación del DSS (2% w/v) en el agua potable. Ratones control recibieron agua potable solamente. Los datos de n = 5 ratones por grupo se muestran ± SEM. (A) visualización inmunofluorescentes de la infiltración de macrófagos en la mucosa. Se muestran imágenes representativas de coloración anti-F4/80 en colitic y control de ratones. Gráfico de barras: campo de energía de alta cuenta de célula (HPF). (B) visualización inmunofluorescente de la infiltración de neutrófilos de la mucosa. Se muestran imágenes representativas de coloración anti-Gr-1 en los controles y los animales colitic. Gráfico de barras: cuenta/HPF de la célula. (C) concentración de MPO en el tejido del colon de los ratones colitic y no colitic. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 . Reclutamiento de monocitos en el compartimento intestinal.
Monocitos de sangre periférica de ratones colitic como ratones control (n = 5 por grupo) se analizaron por citometría de flujo para la expresión de Ly - 6C en células CD11b-positivas. Las células fueron ordenadas en base a la expresión de SSC y CD11b. Monocitos de ratón fueron identificados como lasalta bajacélulas CD11b SSC, y se analizó su expresión de Ly6C. Proporcional (A) cambios hacia Ly6C inflamatorias monocitosaltos son representados en relación con las condiciones del pre-experimento (% variación ± SEM). (B) diagramas de punto de FACS de Ly6C expresión en SSClujoCD11balta las células de los animales colitic antes y después de la inducción de colitis (paneles inferiores) y los controles previos y post-experimento (paneles superiores). (C) esplenocitos de ratones colitic y no colitic se evaluaron la expresión de F4/80 por citometría de flujo (intensidad de fluorescencia media ± SEM). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 . Visualización tomográfica del infiltrado de macrófagos murinos colitis.
FMT explora en ratones colitic y no colitic controles administraron anticuerpo Cyanine7 conjugado contra murino F4/80 (n = 5 por grupo). Gráfico de barras (A) : intensidad de la fluorescencia total en pmol de tinte se determinó en el ROI y representado ± SEM. representante imágenes aparecen con intensidad de fluorescencia con códigos de color correspondientes a la magnitud del infiltrado inflamatorio en los ratones inyectados con la sonda específica (anti-ratón F4/80) (B) y un control inespecífico (rat IgG) (C). En ambos casos, un ROI de igual tamaño se colocó transversal en el abdomen superior para su posterior análisis. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5 . Ex vivo validación de especificidad tracer en colitis murina.
En vivo Exploraciones de la FMT en colitic ratones inyectados con la sonda específica (anti-ratón F4/80) fueron seguidas por ex vivo análisis de fluorescencia planar de intestino explanted para demostrar el origen colónico de la señal de palpador obtenida en vivo. Datos de dos experimentos con un total de n = 8 se muestran los animales. Se muestran imágenes representativas que representan en vivo análisis de la FMT de los ratones colitic con código de color de la fluorescencia intensidad correspondiente a la magnitud del infiltrado inflamatorio (A).La proyección de imagen de reflectancia de la fluorescencia del intestino explanted permite la identificación de regiones específicas con la acumulación del trazador (B). Confirma representante post mortem inmunofluorescente para macrófagos F4/80-positivo de tales áreas los resultados en vivo (C). El número de macrófagos, la infiltración por tinción de inmunofluorescencia, se correlacionaron con en vivo medido tracer acumulación (D). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Aunque las técnicas médicas de imagen han evolucionado rápidamente en los últimos años, todavía estamos limitados en nuestra capacidad para detectar procesos inflamatorios o tumores, así como otras enfermedades, en sus primeras etapas de desarrollo. Sin embargo, esto es crucial para el crecimiento del tumor comprensión, invasión, metástasis desarrollo y procesos celulares en el desarrollo de trastornos inflamatorios y enfermedades degenerativas, cardiovasculares e inmunológicas. Mientras que las técnicas de imagen tradicionales dependen de los parámetros físicos o fisiológicos, la proyección de imagen molecular permite la visualización de los marcadores moleculares específicos en vivo20.
Para la proyección de imagen de animal pequeño, enfoques basados en radionúclidos (p. ej., single-fotón emisión computarizada tomografía (SPECT) y tomografía por emisión de positrones (PET)), ultrasonido e imagen mediada por fluorescencia pueden utilizarse para visualizar determinados estructuras diana molecular. El uso de anticuerpos de larga duración como la columna vertebral de tracer más disponible requiere etiquetas de larga duración, como tiempos de circulación largo y tejido lenta penetración retrasa el momento de la proyección de imagen después de la aplicación de trazadores. Típicas imagen radionúclidos por lo tanto no son adecuados para la proyección de imagen en vivo de la distribución de anticuerpos. El uso de isótopos de larga vida como Cu64 o In111 permite marcadores basados en anticuerpos, pero exige una infraestructura compleja que abarca la generación de isótopos, seguridad antes y durante el procedimiento de etiquetado y blindado alojamiento de los animales después de la aplicación de la sonda. La variante más rentable y más segura ser fluorescencia mediada por imágenes.
Varios en vivo sistemas para la detección de imágenes, la visualización y medición de la distribución de colorante fluorescente en animales vivos se han presentado en los últimos dos décadas21. Mayoría de los sistemas permite la rápida proyección de imagen planar adecuado para la proyección de imagen superficial de la lesión. Debido a la absorción de la luz y dispersión de las señales de profundidad en el tejido evadir la proyección de imagen planar. La solución más destacada para este problema es la tomografía de fluorescencia22. Basado en modelos matemáticos, la señal de la imagen se corrige para la absorción y dispersión de luz y un conjunto de datos 3D virtual se calcula a partir del dataset de proyección múltiple8. El algoritmo proporciona datos cuantitativos completamente, lo que permite la estimación de la concentración de trazador en el representante de regiones específicas de la concentración/expresión de destino23. Una limitación relevante de la FMT se relaciona con pobre resolución espacial en comparación con las técnicas de imagen anatómicas, que podría-según el deseado objetivo-compromiso la asignación de información molecular a estructuras anatómicas específicas. Otra limitación se encuentra en la profundidad de penetración limitada de la luz en el tejido, que requiere el uso de puntas de prueba de absorción y fluorescentes en el rojo a NIR espectro23.
Una modalidad de imagen recientemente introducida que combina las ventajas de la ecografía morfológica y la posibilidad de obtener información molecular de la proyección de imagen de la fluorescencia es la proyección de imagen optoacoustic. Los resultados preliminares de estudios tempranos sugieren que-a pesar de la necesidad de mayor refinamiento técnico-optoacoustic imagen tiene gran promesa para la proyección de imagen molecular y potenciales aplicaciones traslacional24.
El reclutamiento de los leucocitos a la pared intestinal es un paso crucial en la iniciación y perpetuación de la enfermedad inflamatoria intestinal, como el reclutamiento de células inflamatorias al sitio de infección o inflamación en muchas enfermedad inmune-mediada, como enfermedad autoinmune, infección, enfermedad vascular, tumorogénesis y muchos más de25. Activación de monocitos y la infiltración en la mucosa intestinal es un paso esencial en la patogenia de la enfermedad inflamatoria intestinal, inhibición de la infiltración de monocitos, orquestada por quimiocinas e interacción de la molécula de adhesión celular integrina, es una promesa terapéutica enfoque12,26. Por lo tanto, monitoreo de tráfico en el sitio de la inflamación leucocitaria es crucial en el desarrollo de nuevas opciones terapéuticas para visualizar los efectos antiinflamatorios de los fármacos estudiados. Esto puede ser de especial interés ya que se han desarrollado agentes contra el tráfico de leucocitos, y algunos anticuerpos anti-integrina ya están disponibles para el tratamiento de la EII, mientras que otros componentes estarán disponibles en el futuro próximo26. Vedolizumab, un anticuerpo monoclonal humanizado contra la subunidad de la integrina α4β7 específicos del intestino y Etrolizumab, que se une la subunidad β7 α4β7 intestinal los heterodímeros de integrina αEβ7, han sido aprobados27,28. Otros agentes (por ejemplo, el PF de MAdCAM-1-00547659 y moduladores de receptores esfingosina-1-fosfato (S1P) como Ozanimod) se encuentran en fase de evaluación para el tratamiento de IBD29,30.
Cuando se realiza el FMT, posibles modificaciones de la técnica incluyen la selección de combinaciones de palpador distinta, así como la combinación FMT con enfoques para compensar la pobre resolución espacial de la proyección de imagen estructural. Una amplia gama de combinaciones de sonda-Diana ha sido creada y comercializado. Para proyectos específicos, el etiquetado de anticuerpos personalizados pueden ser hecho uso comercial etiquetado kits y el protocolo anteriormente descrito. Dependiendo del anticuerpo o péptido más pequeño como la parte de la selección, proveedores comerciales ofrecen una amplia gama de etiquetas diferentes. Considerar el tinte deseado, dependiendo de la aplicación: para la proyección de imagen, un tinte en el espectro NIR de tejidos profundos (por ejemplo, Cy7, λex / em 750/780 nm) puede ser adecuado, mientras que el brillo total y luz eficaz fuente de colorantes funcionamiento en la gama cerca-visible del espectro (por ejemplo, análogos de la GFP) sería preferible. Casi todos los tintes se pueden obtener como un éster activo etiqueta los residuos de lisina de las proteínas, así como con partes de enlace alternativo, como maleimides para el enlace de cisteína o biotina para el etiquetado de proteínas equipadas con etiquetas específicas de etiquetado31 . La selección de la etiqueta no cambia el protocolo de principio pero requiere sólo ligeras modificaciones del procedimiento de etiquetado y es importante para un buen resultado de imagen. Otra atractiva modificación para superar las limitaciones de resolución espacial es combinar FMT con CT o MRI, permitiendo la anotación de las estructuras anatómicas con información molecular.La información estructural puede o bien ser adquirida secuencialmente como información a priori o al mismo tiempo, que requiere híbrido imágenes instrumentación32,33.
Ciertos pasos del protocolo merecen especial atención. Como esta técnica puede ser adaptada para una multitud de photoprobes fluorescentes dirigidos a una variedad de moléculas específicas representativas de los distintos procesos moleculares, es esencial para permitir la suficiente distribución de las sondas y enriquecimiento en la región de destino deseado. El momento ideal para la proyección de imagen puede variar según la combinación de sonda-Diana. Por ejemplo, anticuerpos contra receptores de tumor podría estar influida por la tasa de difusión a los tumores, la absorción y metabolismo por el hígado y posibles reacciones adversas inmunogénica34. También considere pertinentes controles específicos de enfoques. Marcadores específicos siempre deben validarse contra los controles de isotipo que refleja los efectos de la perfusión y vinculante (por ejemplo, Unión mediada por receptor de Fc). Animales de destino negativo pueden servir como un control adicional para especificidad de tracer, si existen estos modelos de octavos de final. Por otra parte, experimentos de bloqueo se puede realizar para demostrar la especificidad de las interacciones de anticuerpos objetivo35.
Los siguientes son pasos críticos sobre los aspectos prácticos del procedimiento: (1) determinar cuidadosamente las concentraciones de DSS que utilizan, como susceptibilidad DSS puede variar entre diferentes cepas y ratón fabrica/lotes36. (2) cuidadosamente seleccionar combinaciones de sonda-Diana. (3) permiten que alrededor de 5 minutos de tiempo de la exploración para un suficiente análisis del abdomen entero. El momento óptimo punto entre aplicación de trazador y el procedimiento imagenológico deben determinarse cuidadosamente para permitir la acumulación del trazador en la región de destino deseado. Para la detección de F4/80 intestinal colitis murino, el anticuerpo marcado se debe inyectar 24 h antes de la exploración. (4) como acumulación de etiqueta puede ocurrir (por ejemplo, en el hígado), es fundamental etiquetar el tejido objetivo apropiado como retorno de la inversión mediante la colocación de los instrumentos de medición respectivos. Además, suficientes controles para la distribución del trazalíneas inespecíficas debe ser incluido-considerar controles de isotipo inespecífica para descartar efectos de perfusión y nocaut o bloqueo estudios para validar la interacción tracer-objetivo.
Las fuentes típicas de errores relacionados con la reconstrucción de procedimiento y datos escaneo incluyen inadecuada posición animal, exploración de campo y tiempo de exposición. Cuando se coloca el animal, la lesión fluorescentes debe rodeada de tejido en todos los lados para reducir el ruido de la reconstrucción. Burbujas de aire atrapadas entre el animal y la placa de vidrio delantero del cartucho de proyección de imagen también pueden aumentar el ruido y deben eliminarse moviendo un poco el animal. Sobre o subexposición de la imagen puede requerir una exploración de readquisición con ajustes de exposición modificada, que puede encontrarse en la pantalla de exploración (bloque de imagen de reflectancia: ajustes del tiempo de intensidad y la exposición de frente LED). Cuando se combinan en vivo basados en anticuerpos FMT medidas post mortem análisis histológicos, como inmunohistoquímica o coloración inmunofluorescente, debe considerarse el uso de anticuerpos del mismo clon y formato. Además, al realizar mediciones repetitivas de FMT en los mismos animales, los mismos formatos y los clones puede usarse para prevenir la posible reactividad cruzada o los ataques contra diferentes epítopes.
Tomados en conjunto, tomografía molecular mediada por fluorescencia permite la vigilancia repetitiva de curso de la enfermedad y subyacente procesos fisiopatológicos. Se puede aplicar a una gran cantidad de estudios biomédicos y podría ser útil para acelerar las pruebas de drogas o como un objetivo final en individual terapias. FMT-targeting de macrófagos F4/80-expresar en modelos de inflamación proporciona una valiosa herramienta no invasiva para visualizar y cuantificar la infiltración y acumulación de células inflamatorias mientras que también demuestran buena correlación con convencional lecturas.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a la Sra. Sonja Dufentester, Sra. Elke Weber y Sra. Klaudia Niepagenkämper por la excelente asistencia técnica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Alfalfa-free diet | Harlan Laboritories, Madison, USA | 2014 | |
| Bepanthen eye ointment | Bayer, Leverkusen, Germany | 80469764 | |
| Dextran sulphate sodium (DSS) | TdB Consulatancy, Uppsala, Sweden | DB001 | |
| Eosin | Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany | E 4382 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany | E 9884 | |
| Florene 100V/V | Abbott, Wiesbaden, Germany | B506 | |
| Haematoxylin | Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany | HHS32-1L | |
| O.C.T. Tissue Tek compound | Sakura, Zoeterwonde, Netherlands | 4583 | fixative for histological analyses |
| Phosphate buffered saline, PBS | Lonza, Verviers, Belgium | 4629 | |
| Sodium Chloride 0,9% | Braun, Melsungen, Germany | 5/12211095/0411 | |
| Sodium bicarbonate powder | Sigma Aldrich Deisenhofen, Germany | S5761 | |
| Standard diet | Altromin, Lage, Germany | 1320 | |
| Tissue-Tek Cryomold | Sakura, Leiden, Netherlands | 4566 | |
| Hemoccult (guaiac paper test) | Beckmann Coulter, Germany | 3060 | |
| Biotin rat-anti-mouse anti-F4/80 antibody | Serotec, Oxford, UK | MCA497B | |
| Biotin rat-anti-mouse anti-GR-1 | BD Pharmingen, Heidelberg Germany | 553125 | |
| Streptavidin-Alexa546 | Molecular Probes, Darmstadt, Germany | S-11225 | excitation/emission maximum: 556/573nm |
| Anti-CD11b rat-anti-mouse antibody TC | Calteg, Burlingame, USA | R2b06 | |
| Purified anti-mouse F4/80 antibody | BioLegend, London, UK | 123102 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | D9542 | |
| FITC-conjugated anti-Ly6C rat-anti-mouse antibody | BD Pharmingen, Heidelberg, Germany | 553104 | |
| FACS buffer | BD Pharmingen, Heidelberg, Germany | 342003 | |
| Cy7 NHS Ester | GE Healthcare Europe, Freiburg, Germany | PA17104 | |
| MPO ELISA | Immundiagnostik AG, Bensheim, Germany | K 6631B | |
| Cy5.5 labeled anti-mouse F4/80 antibody | BioLegend, London, UK | 123127 | ready to use labelled Antibodies (alternative) |
| Anti-Mouse F4/80 Antigen PerCP-Cyanine5.5 | eBioscience, Waltham, USA | 45-4801-80 | ready to use labelled Antibodies (alternative) |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | 67-68-5 | |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | 792632 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | 64-17-5 | |
| Bovine Serum Albumins (BSA) | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | A4612 | |
| Tris Buffered Saline Solution (TBS) | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | SRE0032 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| FACS Calibur Flow Cytometry System | BD Biosciences GmbH, Heidelberg, Germany | ||
| FMT 2000 In Vivo Imaging System | PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA | FMT2000 | |
| True Quant 3.1 Imaging Analysis Software | PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA | included in FMT2000 | |
| Leica DMLB Fluorescent Microscope | Leica, 35578 Wetzlar, Germany | DMLB | |
| Bandelin Sonopuls HD 2070 | Bandelin, 12207 Berlin, Germany | HD 2070 | ultrasonic homogenizer |
| Disposable scalpel No 10 | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | Z692395-10EA | |
| Metzenbaum scissors 14cm | Ehrhardt Medizinprodukte GmbH, Geislingen, Germany | 22398330 | |
| luer lock syringe 5ml | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | Z248010 | |
| syringe needles | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | Z192368 | |
| Falcon Tube 50ml | BD Biosciences, Erembodegem, Belgium | 352070 |
References
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