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Medicine

प्रतिदीप्ति-मध्यस्थता टोमोग्राफी का पता लगाने और Macrophage-संबंधित Murine आंत्र सूजन के ठहराव के लिए

Published: December 15, 2017 doi: 10.3791/55942
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 2, 2, 2
1Department of Medicine B, University Hospital Münster, 2Translational Research Imaging Center, Department of Clinical Radiology, University Hospital Münster

Summary

लक्ष्य विशेष जांच आणविक तंत्र का विश्लेषण करने के लिए एक अभिनव उपकरण का प्रतिनिधित्व करते हैं, जैसे विभिन्न प्रकार के रोग (जैसे, सूजन, संक्रमण, और tumorigenesis) में प्रोटीन अभिव्यक्ति. इस अध्ययन में, हम एक मात्रात्मक तीन आयामी tomographic का आकलन आंत्र macrophage घुसपैठ की एक murine मॉडल में कोलाइटिस का उपयोग करते हुए F4/80-विशिष्ट प्रतिदीप्ति-मध्यस्थ टोमोग्राफी का वर्णन ।

Abstract

रोग के Murine मॉडल वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए अपरिहार्य हैं । हालांकि, कई नैदानिक उपकरण जैसे एंडोस्कोपी या tomographic इमेजिंग नियमित रूप से पशु मॉडलों में कार्यरत नहीं हैं । पारंपरिक प्रयोगात्मक readouts अक्सर पोस्ट मार्टम और पूर्व vivo विश्लेषण, जो अंतर-व्यक्तिगत अनुवर्ती परीक्षा को रोकने और अध्ययन जानवरों की जरूरत की संख्या में वृद्धि पर भरोसा करते हैं । प्रतिदीप्ति-मध्यस्थता टोमोग्राफी गैर इनवेसिव, दोहराए, मात्रात्मक, फ्लोरोसेंट जांच के तीन आयामी आकलन सक्षम बनाता है । यह बेहद संवेदनशील है और आणविक निर्माताओं, जो विशिष्ट का पता लगाने और अलग आणविक लक्ष्य के लक्षण वर्णन के लिए अनुमति देता है के उपयोग की इजाजत दी । विशेष रूप से, लक्षित जांच जीन सक्रियकरण और सूजन में प्रोटीन अभिव्यक्ति, स्व-प्रतिरक्षित रोग, संक्रमण, संवहनी रोग, सेल प्रवासन, tumorigenesis, आदिका विश्लेषण करने के लिए एक अभिनव उपकरण का प्रतिनिधित्व करते हैं । इस अनुच्छेद में, हम इस परिष्कृत इमेजिंग प्रौद्योगिकी पर vivo में पता लगाने और सूजन के लक्षण वर्णन के लिए कदम दर कदम निर्देश प्रदान (यानी, F4/80-सकारात्मक macrophage घुसपैठ) के एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया murine मॉडल में आंत्र सूजन । इस तकनीक का भी अंय अनुसंधान क्षेत्रों में इस्तेमाल किया जा सकता है, जैसे प्रतिरक्षा सेल या स्टेम सेल ट्रैकिंग ।

Introduction

पशु मॉडल व्यापक रूप से वैज्ञानिक अनुसंधान में उपयोग किया जाता है, और कई गैर इनवेसिव प्रक्रियाओं के शरीर के वजन में परिवर्तन या रक्त, मूत्र, और मल के विश्लेषण के ठहराव जैसे रोग गतिविधि और जीवन शक्ति, पर नजर रखने के लिए मौजूद हैं । हालांकि, इन केवल अप्रत्यक्ष किराए के मापदंडों कि भी अंतर के अधीन है व्यक्तिगत परिवर्तनशीलता । वे अक्सर vivo मेंशारीरिक या रोग प्रक्रियाओं का दोहराव समय अंक और प्रत्यक्ष अवलोकन पर धारावाहिक अवलोकन रोकता है, जो ऊतक नमूना के पोस्ट मार्टम विश्लेषण से पूरित किया जाना चाहिए । परिष्कृत छोटे पशु इमेजिंग तकनीक, क्रॉस अनुभागीय इमेजिंग, ऑप्टिकल इमेजिंग, और एंडोस्कोपी, जो इन प्रक्रियाओं के प्रत्यक्ष दृश्य में सक्षम बनाता है और भी एक ही जानवरों के दोहराव विश्लेषण के लिए अनुमति देता है सहित उभरा है1 , 2 , 3. इसके अतिरिक्त, एक ही जानवर में बीमारी के दोहराव से विभिन्न राज्यों की निगरानी की संभावना जानवरों की जरूरत है, जो देखने की एक पशु नैतिकता बिंदु से वांछनीय हो सकता है की संख्या में कमी हो सकती है ।

कई अलग ऑप्टिकल इमेजिंग तकनीक vivo प्रतिदीप्ति इमेजिंग में के लिए मौजूद है । मूलतः, फोकल इमेजिंग सतह और उपसतह फ्लोरोसेंट घटनाओं4,5का अध्ययन करने के लिए कार्यरत था । हाल ही में, तथापि, tomographic प्रणालियों कि मात्रात्मक तीन आयामी ऊतक आकलन के लिए अनुमति6विकसित किया गया है । इस फ्लोरोसेंट जांच है कि निकट अवरक्त (NIR) स्पेक्ट्रम में प्रकाश का उत्सर्जन, कम अवशोषण, संवेदनशील डिटेक्टरों की पेशकश के विकास के माध्यम से पूरा किया गया है, और रंग प्रकाश स्रोत7। जबकि पारंपरिक क्रॉस-खंड इमेजिंग तकनीक, जैसे कि गणना टोमोग्राफी (सीटी), चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई), या अल्ट्रासाउंड (अमेरिका), ज्यादातर शारीरिक मापदंडों और कल्पना आकृति विज्ञान पर निर्भर, ऑप्टिकल इमेजिंग अतिरिक्त जानकारी प्रदान कर सकते हैं अंतर्निहित आणविक अंतर्जात या exogenous फ्लोरोसेंट जांच8का उपयोग कर प्रक्रियाओं पर ।

आणविक जीवविज्ञान में अग्रिम लक्ष्य की बढ़ती संख्या के लिए स्मार्ट और लक्षित फ्लोरोसेंट आणविक जांच की पीढ़ी की सुविधा में मदद मिली है । उदाहरण के लिए, रिसेप्टर एक दिया लक्ष्य क्षेत्र में मध्यस्थता और वितरण-carbocyanine व्युत्पंन-9एंटीबॉडी लेबल का उपयोग कर visualized जा सकता है । उपलब्ध एंटीबॉडी की बहुतायत है, जो शरीर के अंयथा दुर्गम क्षेत्रों में विशिष्ट अनुरेखक के रूप में कार्य करने के लिए चिह्नित किया जा सकता है, tumorigenesis और neurodegenerative के मॉडलों में आणविक और सेलुलर प्रक्रियाओं में अभूतपूर्व अंतर्दृष्टि प्रदान करता है, हृदय, immunologic, और भड़काऊ रोगों7.

इस अध्ययन में, हम कोलाइटिस के एक murine मॉडल में प्रतिदीप्ति-मध्यस्थता टोमोग्राफी के उपयोग का वर्णन करते हैं । Dextran सोडियम सल्फेट (DSS)-प्रेरित कोलाइटिस आंत्र सूजन के एक मानक रासायनिक प्रेरित माउस मॉडल है कि भड़काऊ आंत्र रोग (आईबीडी)10जैसा दिखता है । यह विशेष रूप से आंत शोथ के विकास के लिए जन्मजात प्रतिरक्षा प्रणाली के योगदान का आकलन करने के लिए उपयोगी है11. भर्ती के बाद से, सक्रियण, और monocytes और मैक्रोफेज की घुसपैठ आईबीडी के रोगजनन में महत्वपूर्ण कदम का प्रतिनिधित्व करते हैं, उनकी भर्ती के दृश्य और घुसपैठ की कैनेटीक्स निगरानी के लिए आवश्यक हैं, उदाहरण के लिए, के प्रभाव एक नैदानिक स्थापना में संभावित चिकित्सीय तत्व12। हम DSS कोलाइटिस की प्रेरण का वर्णन और आंत म्यूकोसा में macrophage घुसपैठ के टोमोग्राफी मध्यस्थता विशेषता का प्रदर्शन monocyte के विशिष्ट दृश्य के लिए प्रतिदीप्ति आणविक टोमोग्राफी का उपयोग/macrophage मार्कर F4/ 13. इसके अतिरिक्त, हम सहायक और पूरक प्रक्रियाओं, जैसे एंटीबॉडी लेबलिंग का वर्णन; प्रायोगिक सेटअप; और विश्लेषण और प्राप्त छवियों की व्याख्या, इस तरह के रोग गतिविधि सूचकांक, प्रवाह cytometry और ऊतकीय विश्लेषण, और immunohistochemistry के रूप में पारंपरिक readouts के साथ संबंध में । हम इस तकनीक और अंय इमेजिंग मोडलों की तुलना की सीमाओं पर चर्चा ।

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Protocol

सभी पशु प्रयोगों को जर्मन पशु संरक्षण कानून (Verbraucherschutz) के अनुसार Landesamt फर नत्र, Umwelt und LANUV (Nordrhein) Westfalen-Tierschutzgesetz द्वारा अनुमोदित किया गया था ।

1. सामग्री और प्रयोगात्मक सेटअप

  1. जानवरों की देखभाल ।
    1. 20-25 ग्राम bodyweight पर किसी भी DSS-अतिसंवेदनशील तनाव (उदा., C57BL/6) के लिंग-और आयु मिलान वाले चूहों का प्रयोग करें ।
    2. प्रायोगिक समूह के अनुसार कम से कम पांच या अधिक चूहों की योजना बनाएँ और स्थानीय पशु देखभाल दिशानिर्देशों के मुताबिक चूहों को घर.
    3. एक मानक मूषक चाउ आहार और autoclaved पेयजल विज्ञापन libitumप्रदान करें ।
    4. मानक चाउ निकालें और यह अल्फला-मुक्त चाउ के साथ बदलने के कम तीन दिन से पहले endoluminal ऑटो प्रतिदीप्ति को कम करने स्कैनिंग के लिए ।
  2. तीव्र DSS-प्रेरित कोलाइटिस की प्रेरण ।
    1. DSS के 2 जी भंग (आणविक वजन ~ ४०,००० डीए) में autoclaved पीने के पानी की १०० मिलीलीटर एक 2% (डब्ल्यू/
    2. DSS समाधान के साथ विशेष रूप से चूहों की पीने की आपूर्ति भरें और प्रति माउस प्रति दिन तरल की 5 मिलीलीटर का अनुमान है । नियंत्रण चूहों को DSS बिना ही पीने का पानी10प्रदान करें ।
      नोट: प्रयोग के अंत तक प्रतिदिन चूहों पर नजर रखें । Euthanize चूहों कि उनके प्रारंभिक शरीर के वजन के 20% से अधिक खोने के लिए या कि मरणासन्न हो (यानी, लगातार कूबड़ मुद्रा, कमी आंदोलन, परिश्रम श्वास, स्पष्ट रूप से कोट खड़ा) पशु पर स्थानीय लागू दिशा निर्देशों के अनुसार कल्याण.
  3. प्रतिदीप्ति-मध्यस्थता टोमोग्राफी की तैयारी ।
    1. लेबल वांछित एंटीबॉडी (जैसे, चूहा विरोधी माउस F4/प्रतिदीप्ति डाई के साथ (जैसे, Cyanine7, λउत्तेजना: ७५० एनएम, λउत्सर्जन: ७७६ एनएम) के रूप में निर्माता के प्रोटोकॉल में वर्णित है । एक उपयुक्त डायलिसिस झिल्ली में Dialyze शुद्ध एंटीबॉडी (ताकना आकार & #60; 50-100 केडीए) के खिलाफ 1 एल के ०.१५ एम सोडियम क्लोराइड के लिए कम से 2 ज या रात भर.
      1. एंटीबॉडी को 1 L के ०.१ M NaHCO3 और dialyze को कम से 2 ज के लिए Transfer करें ।
      2. dimethyl sulfoxide (DMSO) में फ्लोरोसेंट डाई की आवश्यक मात्रा को भंग (१०.८ µ एल/एंटीबॉडी के मिलीग्राम) और एंटीबॉडी समाधान करने के लिए जोड़ें । 20-गुना दाढ़ अतिरिक्त में फ्लोरोसेंट डाई का प्रयोग करने के लिए एक डाई-1:3 के प्रोटीन अनुपात को प्राप्त करने के ।
      3. 1 एच के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में मशीन ०.१५ मीटर सोडियम के 1 एल के खिलाफ डायलिसिस द्वारा unलेबल्ड एंटीबॉडी निकालें या एक पीडी-10 नमक के स्तंभ का उपयोग करके और में हल फास्फेट-बफर खारा (पंजाब) के लिए vivo अनुप्रयोग में ।
      4. spectrophotometry द्वारा अंतिम एंटीबॉडी एकाग्रता और लेबलिंग अनुपात का निर्धारण ।
      5. 250-330 एनएम के एक अवशोषण पर प्रोटीन एकाग्रता को मापने और डाई द्वारा अतिरिक्त अवशोषण पर विचार करें । २८० एनएम (प्रोटीन) पर अधिकतम अवशोषण ७५० एनएम (अगले कदम) Cyanine7 लेबलिंग के लिए अधिकतम अवशोषण के 11% से कम सही ।
      6. यौगिक की एक कमजोर पड़ने को मापने (आमतौर पर 1:10) 250-800 एनएम पर और ७५० एनएम पर Cyanine7 की एकाग्रता निकालने ।
      7. डाई-टू-प्रोटीन अनुपात के रूप में निर्धारित: डाई/एंटीबॉडी = ७५० एनएम पर अधिकतम अवशोषण/२००,०००/(२८० एनएम पर अधिकतम अवशोषण-०.११ x अधिकतम अवशोषण पर ७५० एनएम)/१७०,००० ।
      8. 4 डिग्री सेल्सियस पर एंटीबॉडी समाधान रखें और इंजेक्शन से पहले ब्लीचिंग से बचने के लिए इसे प्रकाश से बढ़ाएंगे ।
    2. इंजेक्शन और प्रकाश से ढाल जब तक यह प्रयोग किया जाता है से पहले तुरंत एक बाँझ सिरिंज में आवश्यक एंटीबॉडी समाधान मात्रा लोड ।
    3. जांच इंजेक्शन और स्कैनिंग प्रक्रिया के इष्टतम समय निर्धारित करें, अनुरेखक फार्माकोकाइनेटिक्स के आधार पर.
    4. Anesthetize १.५-२.५% ऑक्सीजन में सांस isoflurane या उंहें सुरक्षित रूप से लेबल एंटीबॉडी के पूंछ नस इंजेक्शन के लिए एक समर्पित निरोधक में जगह का उपयोग कर चूहों ।
    5. पूर्ण लंबाई एंटीबॉडी के लिए, लेबल एंटीबॉडी के लिए सबसे कम 24 ज स्कैनिंग, जैसे विरोधी माउस F4/murine कोलाइटिस में 80 macrophage दृश्य के लिए पहले सुई । सुई चूहों नसों (i.v.) के माध्यम से पूंछ एंटीबॉडी डाई के २.० nmol करने के लिए इसी राशि में लेबल की नस ।
    6. विशिष्ट जांच के उन लोगों के बराबर खुराक में एक isotype नियंत्रण के रूप में समान रूप से विशिष्ट एंटीबॉडी (जैसे, चूहा आईजीजी या एक और प्राथमिक एंटीबॉडी विरासत के लिए इसी isotype) लेबल का प्रयोग करें ।
      नोट: नियंत्रण यौगिक के इंजेक्शन के बाद vivo में स्कैन के परिणाम विशिष्ट जांच इमेजिंग डेटा की व्याख्या के लिए एक संदर्भ के रूप में सेवा कर सकते हैं.
    7. एक बिजली के रेजर का प्रयोग करने के लिए उदर क्षेत्र में पशु फर दाढ़ी को प्रकाश प्रतिबिंब और अवशोषण को कम ।

2. तकनीकी उपकरण

  1. छोटे पशु प्रतिदीप्ति ( चित्रा 4) के लिए एक पशु चिकित्सा प्रतिदीप्ति-मध्यस्थता टोमोग्राफी (FMT) डिवाइस का उपयोग करें ।
  2. "नए अध्ययन" बटन पर क्लिक करके प्रत्येक परियोजना के लिए एक नए अध्ययन बनाएं और अध्ययन विवरण में शामिल प्रासंगिक अनुरेखकों, इमेजिंग मापदंडों और भविष्य के संदर्भ के लिए खुराक सहित.
  3. इस अध्ययन के भीतर, संबंधित अध्ययन डिजाइन के अनुसार अध्ययन समूह बनाने के लिए (उदा, विशिष्ट अनुरेखक और विशिष्ट isotype नियंत्रण के लिए) "नया अध्ययन समूह" बटन पर क्लिक करके. पशुओं के संबंधित संख्या के साथ प्रत्येक अध्ययन समूह से लैस ।
  4. अनुरेखक निर्माण के लिए प्रणाली जांचना ।
    1. tracers के प्रत्येक बैच के लिए अंशांकन लेबल में भिन्नता के लिए सामान्य करने के लिए प्रदर्शन और मात्रात्मक माप ओय डेटा से सक्षम करें ।
    2. प्रत्येक व्यक्ति प्रणाली के अंशांकन के लिए साधन निर्माता के मार्गदर्शन का पालन करें; के चयन पर "नए अनुरेखक जोड़ें," प्रणाली कदम के माध्यम से एक गाइड प्रदान करेगा. लागू एंटीबॉडी समाधान और जांच में अनुरेखक की गणना निरपेक्ष एकाग्रता के कमजोर पड़ने प्रदान करते हैं.
    3. FMT के लिए, परिभाषित मोटाई और अवशोषण विशेषताओं (महत्वपूर्ण ऊतक जैसी) के एक ऊतक नकल उतार प्रेत का उपयोग करें और इसे इस्तेमाल किया एंटीबॉडी समाधान की एक विशिष्ट मात्रा के साथ भरें । FMT डिवाइस पर यह उपाय ।
      नोट: प्रणाली प्रदान की जांच के संदर्भ माप का उपयोग करेगा, एक साथ दी एकाग्रता के साथ, vivo माप में भविष्य से निरपेक्ष अनुरेखक सांद्रता की गणना करने के लिए.
  5. ४२ डिग्री सेल्सियस के तापमान के साथ एक गर्म परीक्षा कैसेट का प्रयोग करें ।
    नोट: यह चूहों को परीक्षा के दौरान hypothermic बनने से रोकता है ।

3. पशु संज्ञाहरण

  1. १.५ के सतत प्रवाह का उपयोग करें-2% vol% isoflurane ([2-क्लोरोफ्लूरोकार्बन-2-(difluoromethoxy)-1, 1, 1-trifluoro-एतान]) और १.५ एल ओ2मिनट को चूहों anesthetize ।
आसानी से संवेदनाहारी गहराई को नियंत्रित करने के लिए और कर्मचारियों के जोखिम को कम करने के लिए कुतर संज्ञाहरण (isoflurane vaporizer) के लिए विशेष रूप से डिजाइन साँस लेना प्रणालियों का प्रयोग करें ।
  • रिसाव प्रूफ प्रेरण चैंबर में माउस प्लेस और isoflurane आपूर्ति के लिए vaporizer पर बारी (१००% (वी/वी), ऑक्सीजन में 5 vol%, 3 L/ माउस की निगरानी जब तक यह लेटा और बेहोश है ।
  • यह टोमोग्राफी के लिए परीक्षा कैसेट में प्लेस, नाक शंकु के माध्यम से सतत isoflurane सांस लेना के साथ १००% v/v की एक खुराक में, १.५ vol% ऑक्सीजन में, १.५ L/परीक्षा के दौरान आंदोलन कलाकृतियों को कम करने के लिए । 5 मिनट से अधिक समय तक टिकाऊ प्रक्रियाओं के लिए, corneal क्षति को रोकने के लिए माउस आंखों के लिए आंख मरहम लागू होते हैं ।
  • सजगता से जाँच करके संवेदनाहारी गहराई का आकलन करें. अपनी पीठ पर माउस रखना; यदि संज्ञाहरण पर्याप्त है, माउस के आसपास नहीं बारी चाहिए । इसके पंजे के बीच धीरे से माउस चुटकी; यदि संज्ञाहरण पर्याप्त है, पैर वापस नहीं किया जाएगा (शल्य सहिष्णुता की अवस्था) ।

    • 4. प्रतिदीप्ति-मध्यस्थता टोमोग्राफी स्कैन

    नोट: इस अध्ययन में प्रयुक्त FMT प्रणाली के लिए विशिष्ट हैं जो निम्न विवरण अनुकूलित करें ( सामग्री की तालिकादेखें) वैकल्पिक प्रतिदीप्ति चिंतनशील इमेजिंग डिवाइस या FMT सिस्टम के लिए, आवश्यकतानुसार.

    1. परीक्षा कैसेट में अपनी पीठ पर anesthetized माउस को रखें ।
    2. स्कैनिंग प्रक्रिया निष्पादित करें ।
      1. इमेजिंग प्रणाली में कैसेट डालें और इसे तुरंत बंद करने के लिए सतत संज्ञाहरण सुनिश्चित करते हैं । पहले बनाए गए अध्ययन समूह से उपयुक्त नमूने का चयन करें. का चयन करने के लिए ड्रॉपडाउन मेनू से प्रशासित अनुरेखक सुनिश्चित करें कि अनुरेखक एकाग्रता के लिए मान ठीक से गणना कर रहे हैं.
      2. उचित तरंग दैर्ध्य (Cyanine7 के लिए ७२० एनएम) पर प्रतिदीप्ति चिंतनशील छवि प्राप्त करने के लिए स्कैन की योजना बना और "छवि मोल" बटन पर क्लिक करके स्कैन क्षेत्र रूपरेखा ।
      3. देखें कि स्कैन फ़ील्ड प्रतिदीप्ति चिंतनशील छवि पर एक ओवरले के रूप में प्रकट होता है. इसे ब्याज के क्षेत्र (जैसे, बृहदांत्र या पेट) के लिए समायोजित करें, हवा या शेष फर के क्षेत्रों से परहेज । छवि लक्ष्य पर निर्भर करता है, सही पर मेनू में मध्यम और ठीक स्कैन क्षेत्र संकल्प करने के लिए मोटे से चुनने के द्वारा स्कैन क्षेत्र के भीतर छवि डेटा बिंदुओं की संख्या निर्धारित करें ।
        नोट: ध्यान रखें कि एक ठीक स्कैन फ़ील्ड एक महत्वपूर्ण लंबे समय तक स्कैनिंग की लागत पर बेहतर स्थानिक रिज़ॉल्यूशन ऑफ़र कर सकता है.
      4. "स्कैन." क्लिक करके चयनित तरंग दैर्ध्य पर डेटा/छवि प्राप्ति प्रारंभ करें
        नोट: पूरे पेट के एक मध्यम ठीक स्कैन के लिए स्कैन समय 5 मिनट के आसपास हो जाएगा; इस समय में, प्रत्येक डेटा बिंदु अलग से उत्तेजना लेजर द्वारा प्रबुद्ध है, और परिणामी प्रतिदीप्ति दर्ज की गई है ।
      5. स्कैन के अंत में इमेजिंग कैसेट से पशु निकालें और यह पिंजरे में वापस रखने से पहले जानवर पूरी तरह से ठीक करने के लिए अनुमति देते हैं ।
      6. प्रयोग के दौरान विभिन्न समय बिंदुओं पर आवश्यक समझी जाने वाली FMT को दोहराएँ (उदा., दिन 0, 5, और 9-10 (प्रयोग का अंत)), लेकिन शरीर में एंटीबॉडी के संचय पर विचार करें, इसलिए बैकग्राउंड प्रतिदीप्ति सिग्नल को बढ़ाना.

    5. पोस्ट-स्कैन

    1. एक अलग पिंजरे में एक लाल बत्ती वार्मिंग लैंप के तहत एक कागज तौलिया पर माउस प्लेस और पूरी वसूली जब तक असुविधा या संकट के संकेत के लिए माउस की निगरानी । माउस को अपने संबंधित पिंजरे में वापस रखें जब पूरी तरह से जाग ।
    2. १००% (v/v), १०० vol%, और 3 L/मिनट की एक खुराक पर अलग करने के लिए सह2 के वितरण द्वारा प्रयोग के अंत में चूहों Euthanize । पूर्व नहीं सह 2 के साथ चैंबर भरने, 2 के उच्च सांद्रता के लिए अचानक जोखिम के रूप में संकट का कारण हो सकता है । मौत की पुष्टि के बाद माउस तेजी से ग्रीवा विस्थापन जैसे इच्छामृत्यु के बाद माध्यमिक मोड द्वारा सांस लेना बंद कर दिया है ।
    3. पेट laparotomy द्वारा बृहदांत्र Explant और explanted बृहदांत्र के एक पूर्व vivo स्कैन करते हैं, के रूप में कदम 4.2.1-4.2.4 में बताया । Metzenbaum सर्जिकल कैंची का उपयोग कर longitudinally प्रत्येक बृहदांत्र खोलें और अच्छी तरह से इसे आगे विश्लेषण के लिए तैयार करने से पहले खारा समाधान के साथ कुल्ला ।
    4. एक स्केलपेल का प्रयोग करें बाहर बृहदांत्र से एक ०.५ सेमी टुकड़ा कटौती और तुरंत यह एक १.५ मिलीलीटर क्रायोजेनिक ट्यूब में जगह है । यह तरल नाइट्रोजन में फ्रीज और अधिक उपयोग (जैसे,myeloperoxidase (MPO) माप) तक-७० ° c पर स्टोर ।
    5. एक लकड़ी के छड़ी का प्रयोग करें और शेष longitudinally ऊपर से समीपस्थ अंत तक बृहदांत्र खोला रोल, म्यूकोसा के साथ बाहर ("स्विस रोल तकनीक"), ऊतकीय विश्लेषण के लिए । एक निर्धारण में तैयारी प्लेस ( सामग्री की तालिकादेखें) और पर स्थिर-८० डिग्री सेल्सियस14।

    6. डेटा पुनर्निर्माण और व्याख्या

    1. रॉ इमेजिंग डेटा से प्रतिदीप्ति वितरण के 3d मैप्स बनाने के लिए संबंधित इमेजिंग सॉफ्टवेयर के पुनर्निर्माण उपकरण का प्रयोग करें; स्कैन स्वचालित रूप से पुनर्निर्माण उपकरण में जोड़ा जाता है, जब स्कैनिंग पर, समारोह "पुनर्निर्माण कतार में जोड़ें" चयनित है ।
      1. अंयथा, संबंधित अध्ययन और अध्ययन समूह के अंतर्गत ड्रॉप-डाउन मेनू से स्कैन का चयन करें, स्कैन पर राइट-क्लिक करें, और "पुनर्निर्माण में जोड़ें" का चयन करें ।
    2. और विश्लेषण के लिए, विश्लेषण सॉफ़्टवेयर में कोई डेटा सेट लोड करें । ऊपर पट्टी में ड्रॉपडाउन मेनू से, संबंधित अध्ययन का चयन करें और फिर सही पर मेनू से अध्ययन समूह और व्यक्तिगत जानवर का चयन करें; इस जानवर के लिए प्रदर्शन किया सभी स्कैन दिखाया जाएगा । सही स्कैन का चयन करें और "लोड."
      नोट: अनुरेखक वितरण के 3 डी पुनर्निर्माण शुरू में अधिग्रहीत प्रतिदीप्ति चिंतनशील छवि के एक ओवरले के रूप में छोड़ दिया पर दिखाई देगा. मॉडल और घुमाया जा सकता है आसान विश्लेषण के लिए बढ़ाया ।
    3. (जैसे, जिगर या मूत्र मूत्राशय) को खंगाला 3 डी नक्शे पर विशिष्ट लेबल संचय के घावों की पहचान और लक्ष्य ऊतकों ( जैसे, आंत्र या आंत) से अलग ।
    4. ऊपर पट्टी से, लक्ष्य के लिए सबसे उपयुक्त ROI आकार का चयन करें. लेबल लक्ष्य ऊतक ब्याज के क्षेत्रों के रूप में (रॉय) विश्लेषण सॉफ्टवेयर में संबंधित मापने के उपकरण रखकर; सॉफ्टवेयर रॉय के लिए एक प्रतिदीप्ति तीव्रता प्रदान करेगा, साथ ही साथ (पिको-) अनुरेखक के दाढ़ मात्रा स्कैन किया गया है कि के लिए तुले हुए है.
    5. उचित रॉय में अनुरेखक की कुल राशि का चयन करें, रॉय आकार के लिए सामान्यीकृत, भड़काऊ घुसपैठ (प्रोटोकॉल) के साथ संबंध में रोग गतिविधि के मूल्यांकन के लिए सबसे उपयुक्त समकक्ष के रूप में.
      नोट: यदि विशेष मॉडल के प्रतिनिधि के रूप में उपयुक्त हो तो ROI की अन्य सुविधाओं को चुना जा सकता है.

    7.पूर्व वीवो िरा

    1. Hematoxylin आणि eosin दाग आणि इम्यूनोफ्लोरेसेंस दाग.
      1. Deparaffinize वर्गों उंहें 2 मिनट के लिए ७०% इथेनॉल (ेतोः) में रखकर; बाद में आसुत पानी के साथ कुल्ला । 5 मिनट के लिए hematoxylin समाधान के साथ दाग और बाद में 10 मिनट के लिए गर्म नल के पानी के साथ कुल्ला ।
      2. आसुत जल के साथ कुल्ला, 2 मिनट के लिए eosin समाधान के साथ counterstain, और फिर आसुत पानी से कुल्ला ।
      3. ७०% ेतोः में प्लेस, ९६% ेतोः, ९९% ेतोः, और xylene 2 मिनट के लिए (2 बार) प्रत्येक निर्जलीकरण और स्पष्ट वर्गों के लिए । माउंट राल बढ़ते माध्यम के साथ ।
    2. इम्यूनोफ्लोरेसेंस दाग ।
      1. इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला के लिए पहले से प्राप्त ऊतक वर्गों ("स्विस रोल") का प्रयोग करें और 7 µm के क्रायो-कट वर्गों तैयार करते हैं ।
      2. ब्लॉक एसीटोन-स्थिर और जमे हुए बृहदांत्र वर्गों में ५.०% 10 मिनट के लिए चूहा सीरम और पतला के साथ रात भर गर्मी (1/500 वी/biotinylated प्राथमिक चूहा विरोधी माउस F4/एंटीबॉडी । Tris-बफर खारा (टीबीएस) में तीन बार वर्गों धो और पंजाब में Streptavidin-FITC (1:100 v/वी) के साथ मशीन 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात (०.१% डब्ल्यू/
      3. टीबीएस में वर्गों धो और 4 ', 6 के साथ दाग-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 1:1000 v/ एक फोकल माइक्रोस्कोप के तहत प्रतिदीप्ति छवियों का विश्लेषण ( सामग्री की तालिकादेखें; 40x आवर्धन; फ़िल्टर घन n 2.1 उत्तेजना फ़िल्टर ५१५-५६० के साथ) और F4/80-धनात्मक कक्षों के प्रति उच्च-पावर फ़ील्ड की गणना करें ।
        नोट: एक ही क्लोन और प्रारूप के एंटीबॉडी का उपयोग कर जब vivo FMT और पोस्ट मार्टम प्रोटोकॉल विश्लेषण में ऐसे immunohistochemistry या इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला के रूप में संयोजन, इरादा लक्ष्य पर निर्भर करता है पर विचार करें । का पता लगाने के लिए F4/80-पॉजिटिव मैक्रोफेज में वीवो और पूर्व विवो, विभिन्न प्रारूपों का इस्तेमाल किया गया ।
    3. बृहदांत्र नमूनों में माप MPO ।
      1. MPO माप के लिए हौसले से प्राप्त, पंजाब-कुल्ला बृहदांत्र नमूनों या गल नमूना का उपयोग करें । सभी नमूनों वजन और एलिसा किट में प्रदान की lysis बफर में ऊतक homogenize ( सामग्री की मेज) ऊतक की मिलीग्राम प्रति lysis बफर के 20 µ एल की मात्रा में देखें ।
      2. 15 एस के लिए Sonicate (sonication आवृत्ति: 20 kHz, पावर: ७० डब्ल्यू) और २०० x g और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए नमूने केंद्रापसारक ।
      3. एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एलिसा किट का प्रयोग करें ( सामग्री की तालिकादेखें) के अनुसार विनिर्माण विवरण । डुप्लिकेट में परीक्षा ले ।

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    Representative Results

    कोलाइटिस का आकलन:

    DSS-प्रेरित कोलाइटिस आंत्र सूजन के एक रासायनिक प्रेरित murine मॉडल है कि मानव आईबीडी जैसा दिखता है और वजन घटाने के लिए सुराग, मलाशय रक्तस्राव, सतही अल्सर, और अतिसंवेदनशील चूहों में श्लैष्मिक क्षति15. यह विशेष रूप से आंतों की सूजन10,11के विकास के लिए सहज प्रतिरक्षा प्रणाली के योगदान का अध्ययन करने के लिए उपयोगी है । करने के लिए शक्तिशाली colitic सूजन प्रेरित, चूहों लगातार प्रयोग भर में DSS प्रशासित रहे थे । शरीर के वजन और मल मनोगत रक्त कम सूजन के नैदानिक सूचकांक के रूप में इस्तेमाल किया गया । के रूप में चित्रा 1aमें दिखाया गया है, चूहों वजन खोने के बाद चार दिन में शुरू करने के लिए, जबकि अकेले पानी प्राप्त पशुओं नियंत्रण शरीर के वजन में कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन नहीं दिखाया । इसके अलावा, colitic पशुओं मल (आंकड़ा 1b) के साथ मनोगत रक्त का बढ़ता उत्सर्जन दिखाया, के रूप में निंनलिखित hemoccult स्कोरिंग प्रणाली का उपयोग कर मूल्यांकन: 0 (कोई रक्त), 1 (hemoccult सकारात्मक), 2 (hemoccult सकारात्मक और दृश्य गोली रक्तस्राव), और 4 ( सकल रक्तस्राव, गुदा के आसपास रक्त)16। बृहदांत्र लंबाई सूजन प्रेरित बृहदांत्र छोटा मूल्यांकन करने के लिए मापा गया था, colitic चूहों में काफी छोटा के रूप में नियंत्रण अकेले पानी प्राप्त चूहों (चित्रा 1C) की तुलना में बृहदांत्र खुलासा । सीधे बृहदांत्र क्षति का आकलन करने के लिए, ऊतकीय विश्लेषण प्रयोग के अंत में किया गया था । ऊतकीय क्षति का एक मात्रात्मक आकलन बृहदांत्र ज & #38 पर किया गया था; E-सना हुआ एक समग्र चोट कोर का उपयोग कर वर्गों की डिग्री और सूजन, तहखाना नुकसान की हद के आधार पर, और प्रतिशत की भागीदारी17. Colitic चूहों गंभीर सूजन के लक्षण दिखाई दिया, जबकि नियंत्रण कोई DSS प्राप्त चूहों कोई ऊतकीय क्षति (चित्र 1 d) दिखाया. DSS-प्रेरित कोलाइटिस में विशेषता भड़काऊ परिवर्तन प्रदर्शित करता है, उपकला वास्तुकला के विनाश की विशेषता, प्याला कोशिकाओं के नुकसान के साथ, तहखाना क्षति, और श्लैष्मिक अल्सर, के रूप में काफी हद तक संरक्षित श्लैष्मिक का विरोध नियंत्रण में वास्तुकला18चूहों । समूह (n = 5 प्रति समूह) के बीच सांख्यिकीय अंतर प्रसरण का विश्लेषण द्वारा परिकलित किए गए (ANOVA) छात्र द्वारा अनुसरण किया गया-ंयूमैन-Keuls (S.N.K.) पोस्ट हॉक टेस्ट या वेल्च के परीक्षण द्वारा खेलों के बाद महत्वपूर्ण विचरण सजातीयता के मामले में हॉवेल पोस्ट हॉक परीक्षण । & #60; ०.०५ का पी-मान भरपुर माना जाता था ।

    Monocyte और Macrophage भर्ती का आकलन:

    के रूप में DSS-प्रेरित कोलाइटिस प्रतिरक्षा कोशिकाओं की घुसपैठ के साथ जुड़ा हुआ है, इस तरह के monocytes और मैक्रोफेज के रूप में, म्यूकोसा और पेट के म्यूकोसा में, हम monocyte/macrophage मार्कर F4 के लिए धुंधला immunofluorescent इस्तेमाल किया/ Colitic DSS प्राप्त चूहों के रूप में गैर Colitic नियंत्रण चूहों (चित्रा 2a) की तुलना में monocytes बृहदांत्र दीवार घुसपैठ की काफी ऊंचा संख्या दिखाया. ल्युकोसैट घुसपैठ इसके अतिरिक्त मात्रा न्युट्रोफिल मार्कर GR1 के लिए धुंधला immunofluorescent का उपयोग कर रहा था, सूजन बृहदांत्र में न्यूट्रोफिल के काफी बढ़ आप्रवास खुलासा करने के रूप में चूहों को नियंत्रित करने की तुलना में (चित्र b) । पुष्टि करने के लिए, MPO स्तर दोनों न्युट्रोफिल संख्या और भड़काऊ गतिविधि को दर्शाती काफी colitic चूहों (चित्रा 2c) के बृहदांत्र ऊतक में ऊपर उठाया गया था । ANOVA और S.N.K. पोस्ट हॉक परीक्षण समूहों (N = 5 प्रति समूह) के बीच सांख्यिकीय महत्व की गणना करने के लिए उपयोग किया गया । सांख्यिकीय महत्व p & #60; ०.०५ पर सेट किया गया था ।

    Macrophage उपजनसंख्या में प्रणालीगत परिवर्तन:

    माउस monocytes अलग उपजनसंख्या कि परिपक्वता राज्य और उनकी क्षमता में अलग भड़काऊ साइटों, जहां वे शुरू करने और भड़काऊ प्रतिक्रिया को बनाए रखने में भाग लेने के लिए भर्ती होने के एक विषम समूह शामिल19 . इसलिए, हम CD11b और Ly6C प्रवाह cytometry का उपयोग कर के अंतर अभिव्यक्ति का विश्लेषण करके रक्त monocytes की विशेषता । तीव्र DSS कोलाइटिस की भड़काऊ शर्तों के तहत, हम पूर्व प्रयोग की स्थिति की तुलना में भड़काऊ CD11bउच्चLy6Cउच्च monocytes में एक उल्लेखनीय वृद्धि मनाया । इसके विपरीत, यह बदलाव गैर-colitic नियंत्रण चूहों में DSS (चित्र 3ए) के बिना घटित नहीं हुआ था । डेटा (n = 5 प्रति समूह) ANOVA और S.N.K. का उपयोग कर विश्लेषण किया गया प्रणालीगत सूजन के लिए एक अतिरिक्त किराए के मानदंड के रूप में, हम colitic चूहों की तिल्ली में F4/80-सकारात्मक कोशिकाओं की उपस्थिति का आकलन गैर-colitic नियंत्रण है, जो DSS में एक उल्लेखनीय वृद्धि का पता चला की तुलना में चूहों (चित्रा 3सी) ।

    प्रतिदीप्ति-मध्यस्थता टोमोग्राफी स्कैन:

    हम आंत की श्लेष्मा झिल्ली में monocyte/macrophage भर्ती और घुसपैठ को मापने के लिए प्रतिदीप्ति-मध्यस्थता टोमोग्राफी का इस्तेमाल किया । murine F4/80 के खिलाफ एक प्रतिदीप्ति-लेबल एंटीबॉडी सीधे जीवित पशुओं में सक्रिय मैक्रोफेज कल्पना करने के लिए नियोजित किया गया था । लेबल, विशिष्ट चूहा आईजीजी एंटीबॉडी isotype नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया । स्कैनिंग के लिए, चूहों उदर क्षेत्र में मुंडा थे फर से प्रकाश प्रतिबिंब को कम करने के लिए, सतत isoflurane आपूर्ति द्वारा anesthetized, और छोटे पशु प्रतिदीप्ति के लिए एक पशु चिकित्सा FMT डिवाइस में जांच की। के रूप में चित्रा 4aमें दिखाया गया है, कोलाइटिस के प्रेरण colitic चूहों की कालोनियों में फ्लोरोसेंट अनुरेखक के एक काफी ऊंचा संचय करने के लिए नेतृत्व के रूप में गैर colitic नियंत्रण की तुलना में, monocyte घुसपैठ और भेदभाव में वृद्धि का संकेत colitic पशुओं में सक्रिय मैक्रोफेज में । एक विशिष्ट प्रतिदीप्ति-लेबल आईजीजी के आवेदन पेट और आंत में एक जासूसी प्रतिदीप्ति प्रतिक्रिया नहीं बटोरना था, न तो colitic (DSS) में और न ही गैर colitic (जल) समूह, जांच की विशिष्टता का प्रदर्शन-लक्ष्य F4/80 एंटीबॉडी (चित्रा 4a) के इंटरेक्शन । उदर क्षेत्र के प्रतिनिधि छवियों को दिखाया जाता है । रंग कोड प्रतिदीप्ति तीव्रता के स्तर को इंगित करता है, जो भड़काऊ घुसपैठ(फिगर 4B और 4c) की सीमा से मेल खाती है ।f4/80 के पूर्व vivo माप-निर्देशित अनुरेखक संचय explanted कालोनियों में vivo का पता लगाया संकेत f4/80 अनुरेखक संचय (चित्रा 5 ए और 5B) के बृहदांत्र मूल सत्यापित. सीमित एंटीबॉडी की गणना की मात्रा अच्छी तरह से (आर2 = ०.५२) घुसपैठ मैक्रोफेज (चित्रा 5C और 5d) की histologically निर्धारित संख्या के साथ, पुष्टि है कि विशिष्ट अनुरेखकों के साथ vivo इमेजिंग में हो सकता है स्थानीय रोग गतिविधि का संकेतहै । एक सांख्यिकीय महत्व स्तर के साथ ANOVA और S.N.K. पोस्ट हॉक परीक्षण द्वारा p & #60; ०.०५ पर निर्धारित डेटा का विश्लेषण किया गया । सहसंबंध रेखीय प्रतीपगमन के रूप में परिकलित किया गया था ।

    Figure 1
    चित्र 1 . नैदानिक मापदंडों और तीव्र DSS कोलाइटिस के दौरान ऊतकीय चोट ।
    C57BL/6 चूहों 8 दिनों के लिए पीने के पानी में DSS (2% डब्ल्यू/वी) के साथ चुनौती दी थी । कंट्रोल चूहों को DSS बिना पीने का पानी दिया गया । पशु दिन 9 पर euthanized थे । दिखाया एक प्रयोग (n = 5 प्रति समूह) से डेटा है ± मतलब (SEM) के मानक त्रुटि । (क) bodyweight में परिवर्तन प्रारंभिक भार के सापेक्ष प्रस्तुत किए गए हैं. (ख) मल में रक्त उत्सर्जन, के रूप में guaiac कागज परीक्षण द्वारा निर्धारित (hemoccult, 0 = नकारात्मक, 4 = रक्त macroscopically) । (ग) पोस्ट मार्टम बृहदांत्र लंबाई । (घ) ऊतकीय चोट तहखाना क्षति की डिग्री और सूजन की हद तक मूल्यांकन के रूप में । दिखाया गया है प्रतिनिधि ऊतकीय images (haematoxylin/eosin धुंधलाना; आवर्धन: 10x (ऊपरी पैनल), 20x (लोअर पैनल)) के colitic (बाएं पैनलों) या नियंत्रण (सही पैनलों) चूहों । उपकला वास्तुकला और भड़काऊ घुसपैठ (ऐरोहेड) के गहरा विनाश ध्यान दें । बार ग्राफ: चोट स्कोर । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

    Figure 2
    चित्र 2 . आंतों monocyte और macrophage घुसपैठ ।
    DSS कोलाइटिस को पीने के पानी में DSS (2% डब्ल्यू/वी) के आवेदन के द्वारा C57BL/6 में प्रेरित किया गया था । नियंत्रण चूहों अकेले पीने का पानी प्राप्त किया । n से डेटा = 5 प्रति समूह चूहों ± SEM दिखाए जाते हैं । (क) म्यूकोसा में macrophage घुसपैठ के Immunofluorescent दृश्य । colitic और नियंत्रण चूहों में विरोधी F4/80 धुंधला के प्रतिनिधि छवियों को दिखाया गया है । बार ग्राफ: सेल गणना/उच्च शक्ति क्षेत्र (HPF) । (ख) श्लेष्मा न्युट्रोफिल घुसपैठियों के Immunofluorescent दृश्य । दिखाया colitic जानवरों और नियंत्रण में विरोधी जीआर-1 धुंधला के प्रतिनिधि छवियों हैं । बार ग्राफ: सेल गणना HPF/ (ग) colitic और गैर-colitic चूहों के पेट के ऊतकों में एकाग्रता MPO. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

    Figure 3
    चित्र 3 . आंतों के डिब्बे में Monocyte भर्ती ।
    परिधीय रक्त monocytes से colitic चूहों के रूप में के रूप में अच्छी तरह से नियंत्रण चूहों (n = 5 प्रति समूह) CD11b-सकारात्मक कोशिकाओं पर 6C की अभिव्यक्ति के लिए प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण किया गया. एसएससी और CD11b एक्सप्रेशन के आधार पर कक्ष सॉर्ट किए गए । माउस monocytes एसएससीकमCD11bउच्च कोशिकाओं के रूप में पहचाने गए थे, और उनके Ly6C अभिव्यक्ति का विश्लेषण किया गया था । (क) भड़काऊ Ly6Cउच्च monocytes की दिशा में आनुपातिक परिवर्तन पूर्व प्रयोग की स्थिति (% परिवर्तन ± SEM) के सापेक्ष चित्रित कर रहे हैं । (ख) FACS डॉट भूखंडों पर Ly6C अभिव्यक्ति की SSCl CD11bउच्च कोशिकाओं से पहले और बाद में कोलाइटिस प्रेरण (कम पैनलों) और नियंत्रण पूर्व और बाद प्रयोग (ऊपरी पैनलों) colitic पशुओं । (ग) colitic और गैर-colitic चूहों से Splenocytes की अभिव्यक्ति के लिए मूल्यांकन किया गया F4/80 प्रवाह cytometry द्वारा (मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता ± SEM) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

    Figure 4
    चित्र 4 . murine कोलाइटिस में macrophage घुसपैठ के Tomographic दृश्य.
    colitic चूहों में FMT स्कैन और गैर colitic नियंत्रण प्रशासित Cyanine7-संयुग्मित एंटीबॉडी against murine F4/80 (n = 5 प्रति समूह). (क) बार ग्राफ: डाई के pmol में कुल प्रतिदीप्ति तीव्रता रॉय में निर्धारित किया गया था और ± SEM चित्रित । प्रतिनिधि छवियों रंग के साथ दिखाया जाता है कोडित प्रतिदीप्ति तीव्रता चूहों में भड़काऊ घुसपैठ की हद तक इसी इंजेक्शन के साथ विशिष्ट जांच (विरोधी माउस F4/ (ख) और एक विशिष्ट नियंत्रण (चूहा आईजीजी) (ग)। दोनों ही मामलों में, बराबर आकार के एक रॉय आगे विश्लेषण के लिए पेट के ऊपरी में अनुप्रस्थ रखा गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

    Figure 5
    चित्र 5 . पूर्व वीवो murine कोलाइटिस में अनुरेखक विशिष्टता का सत्यापन ।
    vivo में colitic चूहों में FMT स्कैन विशिष्ट जांच के साथ इंजेक्शन (विरोधी माउस F4/के बाद पूर्व vivo planar प्रतिदीप्ति स्कैन explanted आंतों के लिए अनुरेखक में प्राप्त की कॉलोनी मूल के प्रदर्शन के बाद किया गया संकेत vivo. कुल n = 8 पशुओं के साथ दो प्रयोगों से डेटा दिखाया जाता है । प्रतिनिधि छवियों भड़काऊ घुसपैठ (ए) की हद तक इसी रंग कोडित प्रतिदीप्ति तीव्रता के साथ colitic चूहों के vivo FMT स्कैन में चित्रित दिखाया गया है.explanted आंत्र के प्रतिदीप्ति चिंतनशील इमेजिंग अनुरेखक संचय के साथ विशिष्ट क्षेत्रों की पहचान के लिए अनुमति देता है (ख). प्रतिनिधि पोस्ट मार्टम immunofluorescent F4 के लिए दाग/ऐसे क्षेत्रों से पॉजिटिव मैक्रोफेज vivo results (C) में पुष्टि करता है. मैक्रोफेज घुसपैठ की संख्या, के रूप में इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला द्वारा निर्धारित की, के साथ vivo मापा अनुरेखक संचय (डी) में संबंधित थे. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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    Discussion

    हालांकि चिकित्सा इमेजिंग तकनीक तेजी से हाल के वर्षों में विकसित किया है, हम अभी भी हमारी क्षमता में सीमित है भड़काऊ प्रक्रियाओं या ट्यूमर का पता लगाने के लिए, साथ ही अंय बीमारियों, विकास के अपने जल्द चरणों में । हालांकि, इस भड़काऊ विकारों और अपक्षयी, हृदय और प्रतिरक्षा रोगों के विकास में ट्यूमर विकास, आक्रमण, या मेटास्टेसिस विकास और सेलुलर प्रक्रियाओं को समझने के लिए महत्वपूर्ण है । जबकि पारंपरिक इमेजिंग तकनीक शारीरिक या शारीरिक मापदंडों पर निर्भर करते हैं, आणविक इमेजिंग vivo मेंविशिष्ट आणविक मार्करों के दृश्य को सक्षम बनाता है20.

    छोटे-एनिमल इमेजिंग के लिए, रेडियोन्यूक्लाइड-चालित दृष्टिकोण (उदा., एसइंगले-फोटॉन उत्सर्जन गणना टोमोग्राफी (SPECT) और पोजीट्रान उत्सर्जन टोमोग्राफी (पीईटी)), अल्ट्रासाउंड, और प्रतिदीप्ति-मध्यस्थता इमेजिंग विशिष्ट कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता आणविक लक्ष्य संरचनाओं । सबसे अधिक उपलब्ध अनुरेखक रीढ़ की हड्डी के रूप में पूर्ण लंबाई एंटीबॉडी का उपयोग लंबे समय तक चलने वाले लेबल की आवश्यकता है, के रूप में लंबे समय परिसंचरण और धीमी गति से ऊतक प्रवेश अनुरेखक आवेदन के बाद इमेजिंग के समय में देरी. ठेठ इमेजिंग radionuclides इसलिए एंटीबॉडी वितरण के vivo में इमेजिंग के लिए उपयुक्त नहीं हैं । Cu64 या In111 तरह लंबे समय से रहने वाले आइसोटोप का उपयोग एंटीबॉडी आधारित अनुरेखकों सक्षम बनाता है लेकिन एक जटिल बुनियादी सुविधाओं में फैले आइसोटोप उत्पादन की मांग, विकिरण सुरक्षा से पहले और लेबलिंग प्रक्रिया के दौरान, और ढाल पशु आवास जांच आवेदन के बाद. अधिक लागत प्रभावी और सुरक्षित संस्करण प्रतिदीप्ति-मध्यस्थता इमेजिंग किया जाएगा ।

    पता लगाने, दृश्य के लिए vivo इमेजिंग सिस्टम में कई, और रहने वाले जानवरों में फ्लोरोसेंट डाई वितरण की माप पिछले दो दशकों21से अधिक प्रस्तुत किया गया है । अधिकांश प्रणालियों तीव्र planar इमेजिंग सतही घाव इमेजिंग के लिए उपयुक्त सक्षम करें । प्रकाश अवशोषण और बिखरने के कारण, ऊतक में गहरी संकेतों planar इमेजिंग से बचने । इस समस्या के लिए सबसे प्रमुख समाधान प्रतिदीप्ति टोमोग्राफी22है । गणितीय मॉडलिंग के आधार पर, छवि संकेत तितर बितर और प्रकाश अवशोषण के लिए सही है और एक आभासी 3 डी डेटासेट बहु प्रक्षेपण डेटासेट8से गणना की है । एल्गोरिथ्म पूरी तरह से मात्रात्मक डेटा प्रदान करता है, लक्ष्य एकाग्रता के विशिष्ट क्षेत्र प्रतिनिधि में अनुरेखक एकाग्रता के आकलन को सक्षम/23. FMT की एक प्रासंगिक सीमा के रूप में संरचनात्मक इमेजिंग तकनीक की तुलना में गरीब स्थानिक संकल्प से संबंधित है, जो शायद-वांछित लक्ष्य पर निर्भर करता है-विशिष्ट संरचनात्मक संरचनाओं के लिए आणविक जानकारी के आवंटन समझौता । एक और सीमा ऊतक है, जो जांच को अवशोषित और NIR वर्णक्रमीय रेंज23के लिए लाल रंग में fluorescing के उपयोग की आवश्यकता में प्रकाश की सीमित पैठ गहराई में निहित है ।

    एक हाल ही में शुरू की इमेजिंग रूपरेखा कि रूपात्मक अल्ट्रासाउंड के लाभों को जोड़ती है और प्रतिदीप्ति इमेजिंग से आणविक जानकारी प्राप्त करने की संभावना optoacoustic इमेजिंग है । शुरुआती अध्ययनों से प्रारंभिक परिणामों का सुझाव है कि-आगे तकनीकी शोधन के लिए एक की जरूरत के बावजूद-optoacoustic इमेजिंग आणविक इमेजिंग और संभावित अनुवाद अनुप्रयोगों के लिए महान वादा24रखती है ।

    आंतों की दीवार को ल्यूकोसाइट्स की भर्ती दीक्षा और आईबीडी के स्थायीकरण में एक महत्वपूर्ण कदम है, के रूप में संक्रमण या कई प्रतिरक्षा मध्यस्थता रोग में सूजन की साइट के लिए भड़काऊ कोशिकाओं की भर्ती है, इस तरह के स्व-प्रतिरक्षित रोग के रूप में, संक्रमण, संवहनी रोग, tumorigenesis, और कई और अधिक25। के रूप में monocyte सक्रियण और आंत्र म्यूकोसा में घुसपैठ आईबीडी के रोगजनन में एक आवश्यक कदम है, monocyte घुसपैठ के निषेध, chemokines और integrin द्वारा किया-सेलुलर आसंजन अणु बातचीत, एक होनहार चिकित्सकीय है 12,26दृष्टिकोण । इसलिए, निगरानी ल्युकोसैट सूजन की साइट के लिए नए चिकित्सीय विकल्पों के विकास में महत्वपूर्ण है के लिए अध्ययन दवाओं के विरोधी भड़काऊ प्रभाव कल्पना । यह विशेष रुचि का हो सकता है क्योंकि एजेंटों लक्ष्यीकरण ल्युकोसैट तस्करी विकसित किया गया है, और कुछ विरोधी integrin एंटीबॉडी पहले से ही आईबीडी चिकित्सा के लिए उपलब्ध हैं, जबकि आगे के घटक निकट भविष्य में उपलब्ध हो जाएगा26। Vedolizumab, आंत विशिष्ट α4β7 integrin उपइकाई, और Etrolizumab, जो आंतों β7 और α4β7 αEβ7 integrin के heterodimers उपइकाई बांध के खिलाफ एक मानव मोनोक्लोनल एंटीबॉडी,27,28अनुमोदित किया गया है । अन्य एजेंटों (जैसे, MAdCAM-1 पीएफ-००५४७६५९ और sphingosine-1-फॉस्फेट (S1P) Ozanimod के रूप में रिसेप्टर मॉडुलन) वर्तमान में आईबीडी29,30के उपचार के लिए मूल्यांकन के दौर से गुजर रहे हैं ।

    जब FMT प्रदर्शन, तकनीक के संभावित संशोधनों के विभिंन अनुरेखक के चयन लक्ष्य संयोजन, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से संरचनात्मक इमेजिंग दृष्टिकोण के साथ FMT संयोजन गरीब स्थानिक संकल्प के लिए क्षतिपूर्ति शामिल हैं । जांच की एक विस्तृत सरणी-लक्ष्य संयोजन स्थापित किया गया है और वाणिज्यिक । विशिष्ट परियोजनाओं के लिए, कस्टम एंटीबॉडी के लेबल वाणिज्यिक लेबलिंग किट और ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग किया जा सकता है । एंटीबॉडी या लक्ष्यीकरण moiety के रूप में चुने गए छोटे पेप्टाइड के आधार पर, वाणिज्यिक आपूर्तिकर्ता विभिन्न लेबल की एक विस्तृत सरणी प्रदान करते हैं. वांछित डाई पर विचार करें, आवेदन के आधार पर: डीप-टिशू इमेजिंग के लिए, NIR स्पेक्ट्रम में एक डाई ऑपरेटिंग (जैसे, Cy7, λपूर्व/ 750/780 एनएम) अच्छी तरह से अनुकूल हो सकता है, जबकि समग्र चमक और रंजक के प्रभावी प्रकाश की आपूर्ति स्पेक्ट्रम के निकट-दृश्यमान रेंज में ऑपरेटिंग (उदा., GFP एनालॉग) बेहतर हो सकता है । वस्तुतः सभी रंजक एक सक्रिय एस्टर के रूप में प्राप्त किया जा सकता है lysine लेबल करने के लिए प्रोटीन के अवशेषों, साथ ही साथ वैकल्पिक बाध्यकारी moieties, जैसे maleimides के लिए cysteine बाध्यकारी या प्रोटीन के लेबलिंग के लिए बायोटिन के साथ सुसज्जित विशेष लेबलिंग टैग31 . लेबल का चयन सिद्धांत प्रोटोकॉल नहीं बदलता है, लेकिन केवल लेबलिंग प्रक्रिया के मामूली संशोधनों की आवश्यकता है और एक अच्छा इमेजिंग परिणाम के लिए महत्वपूर्ण है । एक और आकर्षक संशोधन स्थानिक संकल्प में सीमाओं को दूर करने के लिए सीटी या एमआरआई के साथ FMT गठबंधन है, आणविक जानकारी के साथ संरचनात्मक संरचनाओं के एनोटेशन को सक्षम करने ।संरचनात्मक जानकारी या तो एक प्राथमिकताओं जानकारी के रूप में या एक साथ, जो हाइब्रिड इमेजिंग इंस्ट्रूमेंटेशन३२,३३की आवश्यकता है के रूप में प्राप्त कर सकते हैं ।

    प्रोटोकॉल के कुछ कदम विशेष ध्यान योग्य हैं । इस तकनीक के रूप में फ्लोरोसेंट photoprobes की एक भीड़ है कि लक्ष्य विभिंन आणविक प्रक्रियाओं के विशिष्ट अणुओं प्रतिनिधि की एक किस्म के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, यह जांच और संवर्धन के लिए पर्याप्त वितरण के लिए अनुमति देने के लिए आवश्यक है इच्छित लक्ष्य क्षेत्र । इमेजिंग के लिए आदर्श समय बिंदु जांच-लक्ष्य संयोजन के अनुसार भिंन हो सकते हैं । उदाहरण के लिए, ट्यूमर रिसेप्टर्स के लक्ष्यीकरण एंटीबॉडी ट्यूमर के लिए प्रसार दर से प्रभावित हो सकता है, जिगर द्वारा और चयापचय, और संभावित प्रतिकूल immunogenic प्रतिक्रियाओं३४। विशिष्ट इमेजिंग दृष्टिकोण के लिए भी प्रासंगिक नियंत्रण पर विचार करें । विशिष्ट अनुरेखक हमेशा isotype नियंत्रण छिड़काव प्रभाव और विशिष्ट बाइंडिंग (जैसे, एफसी रिसेप्टर मध्यस्थता बाध्यकारी) को प्रतिबिंबित करने के खिलाफ मान्य किया जाना चाहिए. लक्ष्य-नकारात्मक जानवरों अनुरेखक विशिष्टता के लिए एक अतिरिक्त नियंत्रण के रूप में सेवा कर सकते हैं, अगर ऐसी नॉकआउट मॉडल मौजूद हैं. वैकल्पिक रूप से, अवरुद्ध प्रयोगों एंटीबॉडी की विशिष्टता को साबित करने के लिए प्रदर्शन किया जा सकता है-लक्ष्य सहभागिता३५।

    निंनलिखित महत्वपूर्ण प्रक्रिया की व्यावहारिकताओं के विषय में कदम उठाए हैं: (1) ध्यान से DSS इस्तेमाल किया सांद्रता निर्धारित करते हैं, के रूप में DSS संवेदनशीलता अलग माउस उपभेदों और निर्माण के बीच भिंन हो सकता है/३६ (2) ध्यान से जांच-लक्ष्य संयोजन का चयन करें । (3) पूरे पेट के एक पर्याप्त स्कैन के लिए स्कैन समय के आसपास 5 मिनट की अनुमति दें । अनुरेखक अनुप्रयोग और इमेजिंग प्रक्रिया के बीच इष्टतम समय बिंदु को सावधानीपूर्वक वांछित लक्ष्य क्षेत्र में अनुरेखक संचय के लिए अनुमति देने के लिए निर्धारित किया जाना चाहिए. आंत्र F4/murine कोलाइटिस में 80 का पता लगाने के लिए, लेबल एंटीबॉडी स्कैनिंग करने से पहले 24 एच इंजेक्ट किया जाना चाहिए । (4) के रूप में विशिष्ट लेबल संचय (जैसे, जिगर में) हो सकता है, यह करने के लिए रॉय के रूप में उपयुक्त लक्ष्य ऊतक लेबल महत्वपूर्ण है संबंधित मापने के उपकरण रखकर । इसके अलावा, विशिष्ट अनुरेखक वितरण के लिए पर्याप्त नियंत्रण शामिल किया जाना चाहिए-विचार विशिष्ट isotype नियंत्रण बाहर छिड़काव प्रभाव और पीटा या अवरुद्ध अध्ययन के लिए अनुरेखक को मान्य करने के लिए शासन-लक्ष्य बातचीत.

    स्कैनिंग प्रक्रिया और डेटा पुनर्निर्माण से संबंधित त्रुटि के ठेठ स्रोतों अनुचित पशु स्थिति, स्कैन क्षेत्र, और जोखिम समय शामिल हैं । जब स्थिति जानवर, fluorescing घाव सभी पक्षों पर ऊतक से घिरा होना चाहिए पुनर्निर्माण शोर को कम करने के लिए । एयर बुलबुले और इमेजिंग कैसेट के सामने कांच की थाली जानवर के बीच फंस भी शोर बढ़ सकता है और जानवर थोड़ा ले जाकर हटाया जाना चाहिए । पर या छवि के जोखिम को संशोधित जोखिम सेटिंग्स, जो स्कैन स्क्रीन में पाया जा सकता है के साथ एक अधिग्रहण स्कैन की आवश्यकता होती है (चिंतनशील छवि ब्लॉक: सामने का समायोजन तीव्रता और जोखिम समय एलईडी) । जब पोस्ट मार्टम ऊतकीय विश्लेषण के साथ vivo एंटीबॉडी-based FMT मापन में संयोजन, जैसे immunohistochemistry या immunofluorescent धुंधलान, एक ही क्लोन और प्रारूप के एंटीबॉडी के उपयोग पर विचार किया जाना चाहिए । इसके अलावा, जब एक ही जानवरों में दोहराव FMT माप प्रदर्शन, एक ही प्रारूपों और क्लोनों के लिए संभव पार-जेट या अलग epitopes के लक्ष्यीकरण को रोकने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए ।

    एक साथ लिया, प्रतिदीप्ति मध्यस्थता-आणविक टोमोग्राफी रोग पाठ्यक्रम और अंतर्निहित pathophysiological प्रक्रियाओं की दोहराव निगरानी सक्षम बनाता है. यह जैव चिकित्सा अध्ययन के ढेर सारे के लिए लागू किया जा सकता है और दवा परीक्षण में तेजी लाने के लिए या व्यक्तिगत चिकित्सा में एक उद्देश्य समापन बिंदु के रूप में उपयोगी हो सकता है । F4/80-FMT के मॉडल में व्यक्त मैक्रोफेज की सूजन की कल्पना और घुसपैठ और भड़काऊ कोशिकाओं के संचय को बढ़ाता है, जबकि भी पारंपरिक करने के लिए अच्छा संबंध का प्रदर्शन करने के लिए एक मूल्यवान इनवेसिव उपकरण प्रदान करता है readouts.

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    Disclosures

    लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

    Acknowledgments

    हम सुश्री सोनिया Dufentester, सुश्री एलके वेबर, और श्रीमती Klaudia Niepagenkämper उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए धंयवाद ।

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Reagents
    Alfalfa-free diet Harlan Laboritories, Madison, USA 2014
    Bepanthen eye ointment Bayer, Leverkusen, Germany 80469764
    Dextran sulphate sodium (DSS) TdB Consulatancy, Uppsala, Sweden DB001
    Eosin Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany E 4382
    Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)                          Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany E 9884
    Florene 100V/V Abbott, Wiesbaden, Germany B506
    Haematoxylin                                                     Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany HHS32-1L
    O.C.T. Tissue Tek compound                                  Sakura, Zoeterwonde, Netherlands 4583 fixative for histological analyses
    Phosphate buffered saline, PBS Lonza, Verviers, Belgium 4629
    Sodium Chloride 0,9% Braun, Melsungen, Germany 5/12211095/0411
    Sodium bicarbonate powder Sigma Aldrich Deisenhofen, Germany S5761
    Standard diet Altromin, Lage, Germany 1320
    Tissue-Tek Cryomold Sakura, Leiden, Netherlands 4566
    Hemoccult (guaiac paper test) Beckmann Coulter, Germany 3060
    Biotin rat-anti-mouse anti-F4/80 antibody Serotec, Oxford, UK MCA497B
    Biotin rat-anti-mouse anti-GR-1  BD Pharmingen, Heidelberg Germany 553125
    Streptavidin-Alexa546 Molecular Probes, Darmstadt, Germany S-11225 excitation/emission maximum:  556/573nm
    Anti-CD11b rat-anti-mouse antibody TC Calteg, Burlingame, USA R2b06
    Purified anti-mouse F4/80 antibody BioLegend, London, UK 123102
    DAPI Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany D9542
    FITC-conjugated anti-Ly6C rat-anti-mouse antibody BD Pharmingen, Heidelberg, Germany 553104
    FACS buffer BD Pharmingen, Heidelberg, Germany 342003
    Cy7 NHS Ester GE Healthcare Europe, Freiburg, Germany PA17104
    MPO ELISA Immundiagnostik AG, Bensheim, Germany K 6631B
    Cy5.5 labeled anti-mouse F4/80 antibody BioLegend, London, UK 123127 ready to use labelled Antibodies (alternative)
    Anti-Mouse F4/80 Antigen PerCP-Cyanine5.5 eBioscience, Waltham, USA 45-4801-80 ready to use labelled Antibodies (alternative)
    DMSO (Dimethyl sulfoxide) Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany 67-68-5
    Isoflurane Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany 792632
    Ethanol Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany 64-17-5
    Bovine Serum Albumins (BSA) Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany A4612
    Tris Buffered Saline Solution (TBS) Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany SRE0032
    Name Company Catalog Number Comments
    Equipment
    FACS Calibur Flow Cytometry System BD Biosciences GmbH, Heidelberg, Germany
    FMT 2000 In Vivo Imaging System PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA FMT2000
    True Quant 3.1 Imaging Analysis Software PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA included in FMT2000
    Leica DMLB Fluorescent Microscope Leica,  35578 Wetzlar, Germany  DMLB
    Bandelin Sonopuls HD 2070 Bandelin, 12207 Berlin, Germany HD 2070 ultrasonic homogenizer
    Disposable scalpel No 10 Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany Z692395-10EA
    Metzenbaum scissors 14cm Ehrhardt Medizinprodukte GmbH, Geislingen, Germany 22398330
    luer lock syringe 5ml Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany Z248010
    syringe needles Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany Z192368 
    Falcon Tube 50ml BD Biosciences, Erembodegem, Belgium 352070

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    References

    1. Bruckner, M., et al. Murine endoscopy for in vivo multimodal imaging of carcinogenesis and assessment of intestinal wound healing and inflammation. J Vis Exp. (90), (2014).
    2. Lewis, J. S., Achilefu, S., Garbow, J. R., Laforest, R., Welch, M. J. Small animal imaging. current technology and perspectives for oncological imaging. Eur J Cancer. 38 (16), 2173-2188 (2002).
    3. Bettenworth, D., et al. Translational 18F-FDG PET/CT imaging to monitor lesion activity in intestinal inflammation. J Nucl Med. 54 (5), 748-755 (2013).
    4. Vowinkel, T., et al. Apolipoprotein A-IV inhibits experimental colitis. J Clin Invest. 114 (2), 260-269 (2004).
    5. Korlach, J., Schwille, P., Webb, W. W., Feigenson, G. W. Characterization of lipid bilayer phases by confocal microscopy and fluorescence correlation spectroscopy. Proc Natl Acad Sci USA. 96 (15), 8461-8466 (1999).
    6. Ntziachristos, V., Tung, C. H., Bremer, C., Weissleder, R. Fluorescence molecular tomography resolves protease activity in vivo. Nat Med. 8 (7), 757-760 (2002).
    7. Ntziachristos, V., Bremer, C., Weissleder, R. Fluorescence imaging with near-infrared light: new technological advances that enable in vivo molecular imaging. Eur Radiol. 13 (1), 195-208 (2003).
    8. Ntziachristos, V., Bremer, C., Graves, E. E., Ripoll, J., Weissleder, R. In vivo tomographic imaging of near-infrared fluorescent probes. Mol Imaging. 1 (2), 82-88 (2002).
    9. Ballou, B., et al. Tumor labeling in vivo using cyanine-conjugated monoclonal antibodies. Cancer Immunol Immunother. 41 (4), 257-263 (1995).
    10. Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nat Protoc. 2 (3), 541-546 (2007).
    11. Kawada, M., Arihiro, A., Mizoguchi, E. Insights from advances in research of chemically induced experimental models of human inflammatory bowel disease. World J Gastroenterol. 13 (42), 5581-5593 (2007).
    12. Nowacki, T. M., et al. The 5A apolipoprotein A-I (apoA-I) mimetic peptide ameliorates experimental colitis by regulating monocyte infiltration. Br J Pharmacol. 173 (18), 2780-2792 (2016).
    13. Hansch, A., et al. In vivo imaging of experimental arthritis with near-infrared fluorescence. Arthritis Rheum. 50 (3), 961-967 (2004).
    14. Bialkowska, A. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. Improved Swiss-rolling Technique for Intestinal Tissue Preparation for Immunohistochemical and Immunofluorescent Analyses. J Vis Exp. (113), (2016).
    15. Diaz-Granados, N., Howe, K., Lu, J., McKay, D. M. Dextran sulfate sodium-induced colonic histopathology, but not altered epithelial ion transport, is reduced by inhibition of phosphodiesterase activity. Am J Pathol. 156 (6), 2169-2177 (2000).
    16. Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. Investigating intestinal inflammation in DSS-induced model of IBD. J Vis Exp. (60), e3678 (2012).
    17. Dieleman, L. A., et al. Chronic experimental colitis induced by dextran sulphate sodium (DSS) is characterized by Th1 and Th2 cytokines. Clin Exp Immunol. 114 (3), 385-391 (1998).
    18. Kojouharoff, G., et al. Neutralization of tumour necrosis factor (TNF) but not of IL-1 reduces inflammation in chronic dextran sulphate sodium-induced colitis in mice. Clin Exp Immunol. 107 (2), 353-358 (1997).
    19. Sunderkotter, C., et al. Subpopulations of mouse blood monocytes differ in maturation stage and inflammatory response. J Immunol. 172 (7), 4410-4417 (2004).
    20. Willmann, J. K., van Bruggen, N., Dinkelborg, L. M., Gambhir, S. S. Molecular imaging in drug development. Nat Rev Drug Discov. 7 (7), 591-607 (2008).
    21. Ntziachristos, V., Ripoll, J., Wang, L. V., Weissleder, R. Looking and listening to light: the evolution of whole-body photonic imaging. Nat Biotechnol. 23 (3), 313-320 (2005).
    22. Ntziachristos, V. Going deeper than microscopy: the optical imaging frontier in biology. Nat Methods. 7 (8), 603-614 (2010).
    23. Stuker, F., Ripoll, J., Rudin, M. Fluorescence molecular tomography: principles and potential for pharmaceutical research. Pharmaceutics. 3 (2), 229-274 (2011).
    24. Beziere, N., Ntziachristos, V. Optoacoustic imaging: an emerging modality for the gastrointestinal tract. Gastroenterology. 141 (6), 1979-1985 (2011).
    25. Habtezion, A., Nguyen, L. P., Hadeiba, H., Butcher, E. C. Leukocyte Trafficking to the Small Intestine and Colon. Gastroenterology. 150 (2), 340-354 (2016).
    26. Ungar, B., Kopylov, U. Advances in the development of new biologics in inflammatory bowel disease. Ann Gastroenterol. 29 (3), 243-248 (2016).
    27. Sandborn, W. J., et al. Vedolizumab as induction and maintenance therapy for Crohn's disease. N Engl J Med. 369 (8), 711-721 (2013).
    28. Vermeire, S., et al. Etrolizumab as induction therapy for ulcerative colitis: a randomised, controlled, phase 2 trial. Lancet. 384 (9940), 309-318 (2014).
    29. Coskun, M., Vermeire, S., Nielsen, O. H. Novel Targeted Therapies for Inflammatory Bowel Disease. Trends Pharmacol Sci. , (2016).
    30. Vermeire, S., et al. The mucosal addressin cell adhesion molecule antibody PF-00547,659 in ulcerative colitis: a randomised study. Gut. 60 (8), 1068-1075 (2011).
    31. Terai, T., Nagano, T. Small-molecule fluorophores and fluorescent probes for bioimaging. Pflugers Arch. 465 (3), 347-359 (2013).
    32. Ren, W., et al. Dynamic Measurement of Tumor Vascular Permeability and Perfusion using a Hybrid System for Simultaneous Magnetic Resonance and Fluorescence Imaging. Mol Imaging Biol. 18 (2), 191-200 (2016).
    33. Ale, A., Ermolayev, V., Deliolanis, N. C., Ntziachristos, V. Fluorescence background subtraction technique for hybrid fluorescence molecular tomography/x-ray computed tomography imaging of a mouse model of early stage lung cancer. J Biomed Opt. 18 (5), 56006 (2013).
    34. Chames, P., Van Regenmortel, M., Weiss, E., Baty, D. Therapeutic antibodies: successes, limitations and hopes for the future. Br J Pharmacol. 157 (2), 220-233 (2009).
    35. Faust, A., Hermann, S., Schafers, M., Holtke, C. Optical imaging probes and their potential contribution to radiotracer development. Nuklearmedizin. 55 (2), 51-62 (2016).
    36. Mahler, M., et al. Differential susceptibility of inbred mouse strains to dextran sulfate sodium-induced colitis. Am J Physiol. 274 (3 Pt 1), G544-G551 (1998).

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