Summary
Hedef özgü probları protein ifade çeşitli hastalık (Örneğin, iltihap, enfeksiyon ve tumorigenesis) gibi moleküler mekanizmaları analiz etmek için yenilikçi bir araç temsil eder. Bu çalışmada, bağırsak makrofaj infiltrasyonu F4/80 özel tomografi Floresans aracılı kullanarak kolit, fare modeli üç boyutlu bir nicel tomografik değerlendirilmesi açıklar.
Abstract
Hastalığın fare modelleri bilimsel araştırma için vazgeçilmezdir. Ancak, endoskopi veya tomografik görüntüleme gibi birçok tanılama araçlarını düzenli olarak hayvan modellerinde istihdam değil. Geleneksel deneysel veriler çoğunlukla intra bireysel izleme sınavları önlemek ve çalışma hayvanların gerekli sayıda artışı post mortem ve ex vivo analizlere kullanır. Floresan-aracılı tomografi floresan problar non-invaziv, tekrarlayan, nicel, üç boyutlu bir değerlendirme sağlar. Son derece duyarlı ve özel algılama ve ayrı moleküler hedeflerin karakterizasyonu için izin veren moleküler yapımcıları, kullanımına izin verir. Özellikle, hedeflenen probları gen harekete geçirmek ve protein ekspresyonu inflamasyon, otoimmün hastalığı, enfeksiyon, damar hastalıkları, hücre göç, tumorigenesis, vbolarak analiz etmek için yenilikçi bir araç temsil eder. Vivo algılama ve inflamasyon (Yani, F4/80-pozitif makrofaj infiltrasyonu), yaygın olarak kullanılan bir fare modeli karakterizasyonu için bu makalede, biz bu sofistike görüntüleme teknolojisi üzerinde adım adım yönergeler sağlar bağırsak iltihabı. Bu teknik de bağışıklık hücre veya kök hücre izleme gibi diğer araştırma alanlarda kullanılabilir.
Introduction
Hayvan modelleri bilimsel araştırmalarda yaygın olarak kullanılır ve hastalık etkinliğini izleme ve canlılık, vücut ağırlığı değişiklikler miktar veya kan, idrar ve dışkı analizi gibi birçok non-invaziv prosedürleri var. Ancak, bu da tabi arası bireysel farklılıklarına sadece dolaylı temsilci parametre vardır. Onlar sık sık post mortem analizleri tekrarlanan zaman noktalarda seri gözlem engeller doku örnek tarafından tamamlanabilir gerekir ve gözlem fizyolojik veya patolojik içinde vivoişler doğrudan. Sofistike küçük hayvan görüntüleme teknikleri, çapraz kesit görüntüleme, optik görüntüleme ve Endoskopi, bu süreçlerin doğrudan görselleştirme ve ayrıca aynı hayvanlar1 tekrarlayan analizleri için sağlar bu da dahil olmak üzere ortaya çıkmıştır , 2 , 3. Ayrıca, sürekli aynı hayvan hastalığında çeşitli durumlarını izlemek için olasılık daha bir hayvan etik açıdan uygun olabilir gerekli, hayvan sayısını azaltmak.
Birkaç farklı optik görüntüleme teknikleri vivo içinde Floresans görüntüleme için mevcut. Aslında, confocal görüntüleme yüzey ve yeraltı floresan olayları4,5çalışmaya istihdam edildi. Son zamanlarda, ancak, nicel üç boyutlu doku değerlendirmeler için izin tomografik sistemleri gelişmiş6olmuştur. Bu düşük emilim, duyarlı detektörlerle ve monokromatik ışık kaynakları7sunan yakın kızılötesi (Nur) spektrumda ışık yayarlar floresan problar geliştirilmesi yoluyla gerçekleştirdi. Bilgisayarlı Tomografi (BT), manyetik rezonans görüntüleme (MRG) veya ultrason (ABD), çoğunlukla fiziksel parametrelere dayanan ve Morfoloji, görselleştirmek gibi geleneksel cross-sectioning görüntüleme teknikleri, ek bilgiler optik görüntüleme sağlar temel moleküler süreçleri endojen veya eksojen floresan kullanarak8sondalar.
Moleküler Biyoloji gelişmeler hedefler giderek artan sayıda için akıllı ve hedeflenen floresan moleküler probları nesil kolaylaştırmak için yardımcı oldu. Örneğin, reseptör aracılı alımı ve belirli hedef alan dağıtım carbocyanine türev etiketli antikorlar9kullanarak görüntülenmeyecektir. Vücudun aksi ulaşılmaz yerlerde belirli tarayıcıları olarak çalışmaya etiketli, mevcut antikorlar bolluk tumorigenesis ve nörodejeneratif modellerinin moleküler ve hücresel işlemlerinde benzersiz anlayışlar sağlar, kalp, immünolojik ve inflamatuar hastalıkları7.
Bu çalışmada, Floresans aracılı tomografi kolit, fare modeli nasıl kullanılacağını açıklar. Dextran sodyum sülfat (DSS)-bağlı kolit olan standart bir kimyasal olarak indüklenen fare modeli iltihabi bağırsak hastalığı (IBD)10benzer bağırsak iltihabı. Doğuştan gelen bağışıklık sistemi bağırsak iltihabı11gelişimine katkısını değerlendirmek özellikle yararlıdır. İşe alma, harekete geçirmek ve monosit ve makrofaj infiltrasyonu IBD patogenezinde önemli adımları temsil ettiğinden, onların işe alım görselleştirme ve Kinetik infiltrasyon, örneğin, etkisini kontrol için gerekli Preklinik ayarı12olası tedavi edici maddeler. DSS kolit indüksiyon tarif ve makrofaj infiltrasyon Floresans moleküler tomografi monosit/makrofaj işaretçiyi F4/80 belirli görselleştirme için kullanarak bağırsak mukozası içine tomografi-aracılı karakterizasyonu göstermek 13. Ayrıca, antikor etiketleme gibi; yardımcı ve tamamlayıcı yordamlara göstermek deneysel Kur; ve analizi ve yorumu elde edilen görüntülerin hastalık aktivite endeksi gibi geleneksel çıktıları ile korelasyon Akış Sitometresi ve histolojik analizi ve immünhistokimya. Biz bu tekniği ve karşılaştırmalar diğer görüntüleme yöntemleri için sınırlamalar tartışıyorlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan deneyleri Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz (LANUV) Nordrhein-Westfalen göre Alman hayvan koruma kanunu (Tierschutzgesetz) tarafından kabul edildi.
1. malzeme ve deneysel Kur
- Hayvan bakımı.
- Cinsiyet ve yaş uyumlu fare DSS-duyarlı herhangi bir baskı (Örneğin, C57BL/6) 20-25 g vücut ağırlığı kullanın.
- Deney grubu ve ev başına en az beş veya daha fazla fare fareler yerel hayvan bakımı esaslarına göre planlayın.
- Standart bir kemirgen chow diyet ve autoclaved içme suyu ad libitumsağlar.
- Standart chow kaldırmak ve en az üç gün önce endoluminal auto-floresan azaltmak için tarama yonca-Alerjik chow ile değiştirin.
- Akut DSS kaynaklı kolit indüksiyon.
- DSS 2 g dağıtılması (moleküler ağırlık ~ 40.000 Da) 100 ml autoclaved içme suyu %2 (w/v çözüm) elde etmek için.
- Fareler içme teminini sadece DSS çözüm ile doldurun ve 5 mL sıvı fare günlük ücret de tahmin ediyoruz. Denetim fare10DSS olmadan aynı içme suyu sağlar.
Not: fareler günlük deneme sonuna kadar izleyin. Bunu kaybetmek onların ilk vücut ağırlığının % 20'den büyük veya can çekişen haline fareler ötenazi (Yani, ısrarla Kambur duruş, azalan hareket, nefes çok çalışan, belirgin dik kat) hayvan üzerinde yerel ilgili yönergelere göre refah.
- Floresan-aracılı tomografi hazırlanması.
- Floresans boya ile istenen antikor (Örneğin, fare Anti-fare F4/80) etiket (Örneğin, Cyanine7, λuyarma: 750 nm, λemisyon: 776 nm) üreticinin iletişim kuralında tanımlandığı gibi. Bir uygun diyaliz zarda arıtılmış antikor Diyaliz (gözenek boyutu < 50-100 kDa) 0,15 M Sodyum Klorür için en az 2 h veya gecede 1 litre karşı.
- 1 litre 0.1 M NaHCO3 antikor transferi ve en az 2 h diyaliz.
- Dimetil sülfoksit (DMSO) floresan boya gerekli miktarda dağıtılması (10,8 µL/mg antikor) ve antikor ekleyin. Floresan boya 20-fold molar aşan bir boya protein oranı 1:3 elde etmek için kullanın.
- Karanlıkta 4 ° c için 1 h. çıkarmak diyaliz 0.15 M sodyum 1 L karşı veya PD-10 desalting sütun kullanarak etiketsiz antikor kuluçkaya ve fosfat tamponlu tuz (PBS) vivo uygulama için çözmek.
- Spectrophotometry tarafından son antikor konsantrasyon ve etiketleme oranı belirler.
- 250-330 nm bir emilimini protein konsantrasyonu ölçmek ve boya tarafından ek emme düşünün. 280 en fazla emme düzeltmek nm (protein) 750 maksimum emilim % 11'i tarafından nm (sonraki adım) Cyanine7 etiketleme için.
- 250-800 nm (genellikle 1:10) kampta seyreltme ölçmek ve hulâsa Cyanine7 konsantrasyonu 750 nm.
- Boya protein oranı olarak belirlemek: boya/antikor maksimum emilim 750 = nm / 200.000 / (en fazla emme 280 nm - max emme 750 x 0,11 nm) / 170.000.
- Antikor çözüm 4 ° C'de tutmak ve enjeksiyon önce beyazlatma önlemek için ışık kalkan.
- Bu kullanılana kadar steril enjektör gerekli antikor çözüm hacmindeki hemen önce enjeksiyon ve ışık kalkan yükleyin.
- En iyi zamanlama sonda enjeksiyon ve tarama yordama bağlı olarak izleyici farmakokinetik belirler.
- Oksijen inhale % 1.5-2.5 isoflurane kullanarak fare anestezi veya güvenli bir şekilde etiketlenmiş antikorlar kuyruk ven enjeksiyon için adanmış bir restrainer yer onları.
- Tam uzunlukta antikor tarama önce etiketli antikor en az 24 h Anti-fare F4/80 makrofaj görselleştirme fare kolit gibi enjekte. Fareler intravenöz enjekte (IV) yolu ile kuyruk damar etiketli antikor boya 2.0 nmol için karşılık gelen bir miktar ile.
- Kullanım aynı derecede belirsiz antikorlar (Örneğin, fare IgG veya başka bir izotip birincil antikor miras için karşılık gelen) bir izotip kontrol dozlarda belirli inceleyebilirsek eşdeğer etiket aynı derecede.
Not: Vivo sonuçları tarar sonra enjeksiyon kontrol bahçedeki veri görüntüleme belirli sonda yorumlanması için bir başvuru olarak hizmet verebilir. - Tıraş ışık yansıması ve emilimi en aza indirmek için karın bölgesinde hayvan kürk tıraş için kullanın.
- Floresans boya ile istenen antikor (Örneğin, fare Anti-fare F4/80) etiket (Örneğin, Cyanine7, λuyarma: 750 nm, λemisyon: 776 nm) üreticinin iletişim kuralında tanımlandığı gibi. Bir uygun diyaliz zarda arıtılmış antikor Diyaliz (gözenek boyutu < 50-100 kDa) 0,15 M Sodyum Klorür için en az 2 h veya gecede 1 litre karşı.
2. teknik ekipman
- Bir veteriner Floresans aracılı tomografi (FMT) aygıtı küçük hayvan floresan ( şekil 4) kullanın.
- Her proje için yeni bir çalışma "yeni çalışması" yi tıklatarak oluşturun düğmesini tıklatın ve çalışma açıklamasında görüntüleme parametreleri ve doz ileride de dahil olmak üzere ilgili izleyiciler içerir.
- Bu çalışma içinde "yeni çalışma grubu" yi tıklatarak çalışma grupları (Örneğin, belirli izleme ve belirsiz izotip kontrol için) ilgili çalışma tasarımına göre oluşturun düğmesini. Her çalışma grubu ile ilgili sayı hayvanların donatmak.
- İzleme yapıları için sistemi kalibre.
- Her dizi izleyicileri etiketleme varyasyon için normal duruma getirmeye ve nicel ölçüm OI verilerden etkinleştirmek için kalibrasyon gerçekleştirin.
- Her bireysel sistem kalibrasyonu için araç üreticisinin kılavuzunu izleyin; "yeni eklemesini" seçimi, sistem bir kılavuz sayesinde adımları sağlar. Uygulamalı antikor çözüm seyreltme ve izleyici sonda içinde hesaplanan mutlak konsantrasyon sağlar.
- FMT, doku taklit eden hayalet (hayati doku benzeyen) tanımlanmış kalınlığı ve emme özellikleri kullanın ve kullanılan antikor çözüm belirli bir ses ile doldurun. FMT aygıtta ölçmek.
Not: Sistem verilen konsantrasyonu ile birlikte sağlanan sonda referans ölçüm mutlak izleyici konsantrasyonları üzerinden gelecek vivo içinde ölçümleri hesaplamak için kullanır.
- Isıtılabilen muayene kaset 42 ° c sıcaklık ile kullanma
Not: Bu fareler muayene sırasında hipotermik olmasını engeller.
3. hayvan anestezi
- % 1.5-2 vol % isoflurane ([2-chloro-2-(difluoromethoxy)-1,1,1-trifluoro-ethane]) ve fareler anestezi için 1, 5 L O2/min., sürekli bir akış kullanın
4. floresan-aracılı tomografi taraması
Not: Bu kullanılan FMT sistemine özgü aşağıdaki ayrıntıları uyum ( Tablo reçetesigörmek) alternatif Floresans yansıma görüntüleme aygıtları veya FMT sistemleri için gerektiği gibi çalışma.
- Muayene kaset sırtında imzalat fareyi getirin.
- Tarama yordamı gerçekleştirin.
- Kaset görüntüleme sistemi yerleştirin ve hemen sürekli anestezi emin olmak için kapatın. Uygun örnek önceden oluşturulmuş çalışma grubundan seçin. Yönetilen izleyici izleyici konsantrasyon değerleri doğru hesaplanmasını sağlamak için açılır menüden seçin.
- Uygun dalga boyu Floresans yansıma görüntü elde etmek (720 nm Cyanine7 için) tarama planlamak ve anahat "elde görüntüsü" düğmesini tıklatarak tarama alanı için.
- Bkz: tarama alanı Floresans yansıma görüntü üzerinde bir kaplama olarak görüntülenir. Faiz (Örneğin, kolon veya karın), bölge için ayarlamak hava veya kalan kürk alanlarında kaçınarak. Görüntü hedef bağlı olarak görüntü sayısını orta ve ince tarama alanı çözünürlük sağdaki menüde kaba tercih ederek tarama alanı içinde veri noktaları ayarlayın.
Not: bir iyi tarama alanını önemli ölçüde uzun süre scanning zaman pahasına daha iyi Uzaysal çözünürlük sunuyor olabilir unutmayın. - Veri/resim alma seçili dalga boyu, "tarama" tıklayarak başlatın
Not: Tüm karın bir orta-ince tarama tarama süresi yaklaşık 5 dk olacak; Bu süre içinde her bir veri noktasını ayrı ayrı uyarma lazer tarafından aydınlatılmış ve elde edilen floresan kaydedilir. - Tarama sonunda görüntüleme kaset hayvan kaldırmak ve hayvan tamamen kafesin içine yerleştirmeden önce kurtarmak izin verir.
- FMT deneme sırasında çeşitli zaman noktalarda gerekli görüldüğü takdirde tekrar (Örneğin, 0, 5 ve 9-10 gün (son deneme)), ama bu nedenle arka plan Floresans sinyal artan vücutta antikor birikimi göz önünde bulundurun.
5. sonrası tarama
- Bir kağıt havlunun bir kırmızı ışık Isınma lamba altında ayrı bir kafeste fareyi getirin ve fareyi rahatsızlık veya sıkıntı belirtileri için tam kurtarma kadar izlemek. Fareyi geri onun kendi kafesin içine ne zaman tam olarak uyanık getirin.
- Fareler bir doz %100 (v/v), izolatör CO2 teslimini tarafından deney sonunda, 100 vol % ve 3 L/dak ötenazi. CO2 yüksek konsantrasyonda ani bir pozlama sıkıntıya neden gibi odası CO2 ile önceden doldurmayın. Fare ötenazi hızlı servikal çıkık gibi bir sonraki ikincil mod tarafından nefes durduktan sonra ölüm doğrulayın.
- Kolon karın laparotomi tarafından explant ve adımları 4.2.1 - 4.2.4 açıklanmıştır explanted iki nokta üstüste, bir ex vivo tarama gerçekleştirin. Her kolon boyuna Metzenbaum Cerrahi makas kullanarak açın ve tuzlu çözüm ile daha ayrıntılı bir çözümleme için hazırlamadan önce iyice durulayın.
- Bir neşter distal kolon bir 0,5 cm parçası keser ve hemen bir 1.5 mL kriyojenik tüpe yerleştirir için kullanın. Daha fazla kadar kullanmak (Örneğin,myeloperoxidase (MPO) ölçüler) sıvı azot ve-70 ° C'de store durdur.
- Tahta bir sopa kullanmak ve kalan boyuna kadar rulo mukoza dışa ("İsviçre rulo tekniği") ile proksimal sonuna iki nokta üst üste gelen distal histolojik analizler için açtı. Hazırlık bir sabitleştirici yerleştirin (bkz. Tablo reçetesi) ve-80 ° C14, Don.
6. veri yeniden yapılanma ve yorumu
- 3D maps-in Floresans dağıtım ham görüntü verilerinden oluşturma için ilgili düşsel bilgisayar yazılımı yeniden yapılandırma aracını kullanın; taramaları otomatik olarak tarama zaman üzerine imar aracına eklenir, işlev "Ekle yeniden yapılanma kuyruğuna" seçilir.
- Aksi takdirde, taramaları ilgili çalışma altında açılır menüden seçin ve grup çalışması, tarama sağ tıklatın ve seçin "yeniden yapılmasına ekleyin."
- Daha fazla çözümleme için bir veri kümesi analiz yazılımı yükleyin. Üst çubuğundaki açılır menüsünden ilgili çalışma seçin ve ardından çalışma grubu ve bireysel hayvan sağ taraftaki menüden seçin; Bu hayvan için gerçekleştirilen tüm inceden inceye gözden geçirmek-ecek var olmak göstermek. Doğru Tara öğesini seçin ve "Yükle" seçeneğini tıklatın
Not: İzleyici dağıtım 3D yeniden inşası başlangıçta alınan Floresans yansıma görüntü bir bindirme olarak sol tarafta görünür. Model döndürülmüş ve daha kolay çözümleme için büyütülmüş. - Yeniden oluşturulan 3D haritalar üzerinde (Örneğin, karaciğer ve idrar kesesi) belirsiz etiket birikimi Foci belirlemek ve hedef dokulardan (Örneğin, bağırsak veya bağırsak) ayırt etmek.
- Üst çubuğu'ndan hedef için en uygun yatırım Getirisi şekli seçin. Etiket hedef doku bölgeleri analiz yazılımı ilgili ölçü araçları yerleştirerek ilgi (ROI) olarak; yazılım bir floresan yoğunluğu tarama için kalibre izleyici molar miktarda yatırım Getirisi, aynı zamanda için (pico-) sağlayacaktır.
- Hastalık aktivitesi (Histoloji) enflamatuar infiltrat ile ilişki içinde değerlendirilmesi için en uygun eşdeğer olarak yatırım Getirisi boyutu için normalleştirilmiş uygun yatırım Getirisi, izleyici toplam miktarı seçin.
Not: Diğer şekil-in ROI uygunsa, belirli bir modeli temsilcisi olarak seçilebilir.
7.Ex Vivo Analizleri
- Hematoksilen ve Eozin boyama ve ayirt boyama.
- Bölüm 2 min için % 70 etanol (alkol) yerleştirerek deparaffinize; daha sonra distile su ile durulayın. 5 min için Hematoksilen çözüm ile leke ve daha sonra 10 dk sıcak musluk suyu ile yıkayın.
- Counterstain için 2 dk, Eozin çözüm ile distile su ile durulama ve tekrar distile su ile durulayın.
- Yer % 70 alkol, %96 alkol, %99 alkol ve Ksilen (2 kez) için 2 dk her kurutmak ve bölümü temizlemek için. Reçineli montaj orta ile bağlayın.
- Ayirt boyama.
- Cryo-kesme bölümleri 7 µm hazırlamak ve ayirt boyama için daha önce alınan doku bölümler ("İsviçre rulo") kullanın.
- Aseton-sabit ve donmuş iki nokta üst üste bölümler için 10 dk % 5.0 sıçan Serumda engellemek ve gecede seyreltilmiş (1/500 v/v) biotinylated birincil fare Anti-fare F4/80 antikor ile kuluçkaya. Üç kez Tris tamponlanmış salin (TBS) bölümleri yıkama ve Streptavidin-FITC ile (1: 100 v/v) PBS/BSA içinde kuluçkaya (% 0,1 w/v) gecede 4 ° C'de
- TBS bölümlerde yıkama ve'ile 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 1: 1000 v/v) kontrast elde etmek için leke. Confocal mikroskop altında floresan görüntü analiz (bakınız Tablo reçetesi; 40 x büyütme; filtre küp N2.1 uyarma filtreli 515-560) ve yüksek güç alan başına F4/80-pozitif hücreleri saymak.
Not: antikor aynı klon ve biçimi içinde vivo FMT ve post mortem Histoloji analizleri immünhistokimya veya hedef bağlı olarak ayirt, boyama gibi birleştirirken kullanmayı düşünün. F4/80-pozitif makrofajlar içinde vivo ve ex vivotespiti için farklı biçimlerde kullanılmıştır.
- MPO ölçümlerde kolon örnekleri.
- Taze elde, iki nokta üst üste örnekleri PBS durulanır ya da çözdürülen numune MPO ölçümler için kullanın. Tüm örneklerini tartmak ve doku homojenize ELISA içinde sağlanan lizis arabelleği ( Tablo reçetesigörmek) lizis arabelleği doku mg başına 20 µL hacmi, kit.
- 15 için solüsyon içeren temizleyicide s (sonication frekans: 20 kHz, güç: 70 W) ve örnekleri için 200 g ve 4 ° c x 10 dk santrifüj kapasitesi
- Piyasada bulunan bir ELISA kiti ( Tablo reçetesigörmek) kullanmak üretmektedir açıklama göre. Çoğaltmaları testinde yerine getirir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kolit değerlendirilmesi:
DSS kaynaklı kolit insan IBD benzer ve kilo kaybı, rektal kanama, yüzeysel ülserasyonun ve duyarlı fareler15Mukozal hasara yol açar bağırsak iltihabı kimyasal olarak indüklenen bir fare modeldir. Doğuştan gelen bağışıklık sistemi bağırsak iltihabı10,11gelişimine katkısını incelemek özellikle yararlıdır. Kuvvetli colitic iltihap ikna etmek için sürekli olarak fareler vardı DSS deney boyunca uygulandı. Azalan vücut ağırlığı ve fekal gizli kan iltihap klinik endeksi kullanılmıştır. Şekil 1A' gösterildiği gibi fare denetim hayvanlar su yalnız alma vücut ağırlığının önemli değişiklik gösterdi, ancak kolit, indüksiyon dört günden başlayan ağırlık kaybetme başladı. Buna ek olarak, colitic hayvanlar gösterdi dışkı (şekil 1B) ile gizli kan artış atılımı puanlama sistemi aşağıdaki hemoccult kullanarak değerlendirildi gibi: 0 (kan), 1 (hemoccult pozitif), 2 (hemoccult olumlu ve görsel Pelet kanama) ve 4 () Brüt kanama, anüs çevresinde kan)16. İki nokta üst üste uzunluğu önemli ölçüde kısaltılmış su yalnız (şekil 1 c) alma kontrol fare ile karşılaştırıldığında colitic fareler iki nokta üst üste açığa iltihap kaynaklı kolon kısalma değerlendirmek için ölçüldü. Doğrudan kolon zarar değerlendirmek için histolojik analiz deneme sonunda gerçekleştirildi. Histolojik hasar nicel bir değerlendirme kolon H üzerinde gerçekleştirilen & genel bir yaralanma çekirdek kullanma E-lekeli bölümlerine dayalı derecesi ve inflamasyon, crypt hasar ve yüzde katılımı17. Denetim fare yok DSS alma histolojik hasar (şekil 1 d) gösterdi colitic fareler şiddetli inflamasyon belirtileri gösterdi. Görüntüleri imha epitel mimarisi, tarafından goblet hücreleri, crypt hasar ve Mukozal ülserasyon karşı büyük ölçüde korunmuş kaybı ile Mukozal karakterize kolit, DSS kaynaklı karakteristik inflamatuar değişiklikler göstermektedir Denetim fare18mimarisinde. Gruplar arasında istatistiksel fark (n = 5 grup başına) öğrenci-Newman-Keuls (S.N.K. tarafından) takip Varyans analizi (ANOVA) tarafından hesaplanan Post hoc testi veya oyunlar-Howell post hoc testi önemli farkı inhomogeneity durumunda Welch testi ile izledi. Bir p-değeri < 0,05 olarak önemli kabul.
Monosit makrofaj işe alım ve değerlendirme:
DSS kaynaklı kolit monosit ve makrofajlar gibi bağışıklık hücrelerinin infiltrasyonu mukoza ve submukoza kolon içine ile ilişkili olduğu gibi biz immünfloresan monosit/makrofaj için F4/80 marker boyama infiltrat ölçmek için kullanılır. Colitic fareler DSS alma colitic kontrol fareler (şekil 2A) ile karşılaştırıldığında iki nokta üst üste duvar infiltre monosit önemli ölçüde yükseltilmiş sayıda gösterdi. Lökosit infiltrasyonu Ayrıca nötrofil önemli ölçüde artan göç içine kontrol fareler (şekil 2B) karşılaştırıldığında iltihaplı kolon açığa nötrofil marker GR1, immünfloresan boyama kullanarak sayısal. Onaylamak için MPO yansıtan nötrofil her iki sayı ve inflamatuvar aktivite düzeyleri önemli ölçüde colitic fareler (şekil 2C) kolon dokularında yüksek. S.N.K. post hoc testi ve ANOVA gruplar arasında istatistiksel anlamlılık hesaplamak için kullanılmıştır (n = 5 grup başına). İstatistiksel anlamlılık p kuruldu < 0,05.
Makrofaj Subpopulation sistemik değişiklikler:
Fare monosit olgunlaşma devlet ve kapasitelerini nerede başlatılıyor ve inflamatuar yanıt19 sürdürmekte katılmak inflamatuar sitelere işe farklı farklı altgrupları heterojen bir grup kapsayacak . Bu nedenle, biz kan monosit CD11b fark ifade analiz ederek karakterize ve Ly6C kullanarak Akış Sitometresi. Akut DSS kolit inflamatuar koşullar altında inflamatuar CD11byüksekLy6Cyüksek monosit ön deney koşullarına göre önemli bir artış görülmektedir. Buna ek olarak, bu değişim olmadan DSS (şekil 3A) colitic denetim farelerde meydana gelmedi. Verileri (n = 5 grup başına) kullanarak ANOVA ve S.N.K. analiz edildi Sistemik inflamasyon için bir ek vekil parametresi olarak dalak DSS tedavi fareler (şekil 3 c) önemli bir artış ortaya colitic denetimlere göre colitic farelerin F4/80-pozitif hücrelerinin varlığı değerlendirildi.
Floresan-aracılı tomografi taraması:
Floresan-aracılı tomografi monosit/makrofaj işe alım ve infiltrasyon bağırsak mukozası içine ölçmek için kullanılır. Floresans etiketli antikor fare F4/80 karşı doğrudan harekete geçirmek makrofajlar yaşayan hayvanlarda görselleştirmek için istihdam edildi. Etiketli, belirsiz bir fare IgG antikorlar izotip kontrol kullanılmıştır. Taramak için fareler ışık yansıması en aza indirmek için karın bölgesinin içinde kürk tarafından traş, sürekli isoflurane arz anestezi ve küçük hayvan Floresan. için bir veteriner FMT cihazın muayene Şekil 4A, iki nokta üst üste ile karşılaştırıldığında colitic olmayan denetimleri, colitic farelerin floresan izleyici önemli ölçüde yükseltilmiş bir birikimi yol açtı kolit indüksiyon gösterildiği gibi monosit infiltrasyon ve farklılaşma artış gösteren colitic hayvanlarda etkin makrofajlar. Belirsiz bir floresan etiketli IgG uygulama tespit Floresans yanıt karın ve bağırsak, ne colitic (DSS) ne de sonda hedef özgüllük gösteren sigara colitic (su) grup temin değil F4/80 antikor (şekil 4A) etkileşim. Karın bölgesinin temsilcisi görüntüleri gösterilir. Renk kodu ölçüde enflamatuar infiltrat()şekil 4B ve 4 Cnoktasına karşılık gelen Floresans yoğunluk düzeyini gösterir).Ex vivo ölçümleri F4/80-yönetmen izleyici birikimi explanted iki nokta üst üste (şekil 5A ve 5B) F4/80 izleyiciyi birikimi tespit vivo içinde sinyal kolon kökeni doğrulanmadı. Bağımlı antikor hesaplanan miktarda iyi korelasyon (R2 0,52 =) makrofajlar (şekil 5C ve 5 D) sızmak, histolojik olarak belirlenen numaraları ile belirli tarayıcıları ile bu içinde vivo görüntülemede teyit olabilir Gösterge. yerel hastalık aktivitesinin Veri ANOVA ve S.N.K. post hoc testi ile istatistiksel anlam düzeyinde set p ile analiz < 0,05. İlişki doğrusal regresyon hesaplanır.
Resim 1 . Klinik parametreler ve akut DSS kolit boyunca histolojik yaralanma.
C57BL/6 fareler DSS ile meydan (% 2 w/v) içme suyu için 8 gün. Denetim fareler içme suyu DSS olmadan verildi. Hayvanlar günde 9 euthanized. Bir deney verileri gösterilmiştir (n = 5 grup başına) ± (SEM) ortalama standart hatası. (A) göre ilk kilo vücut ağırlığı değişiklikler sunulmaktadır. (B) guaiac kağıt testi ile belirlenen atılımı dışkı, kan (hemoccult, 0 negatif, 4 = kan macroscopically =). (C) Post mortem kolon uzunluğu. (D) histolojik yaralanma olarak crypt hasar derecesini ve inflamasyon ölçüde tarafından değerlendirildi. Temsilcisi histolojik görüntüleri gösterilmiştir (haematoxylin/Eozin boyama; büyütme: 10 x (üst paneli), 20 (alt paneli) x) colitic (sol kapı aynası) ya da Denetim (doğru panelleri) fareler. Epitel mimari derin imha Not ve inflamatuar infiltratlar (ok başları). Çubuk grafik: yaralanma skor. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 . Bağırsak monosit ve sızmak makrofaj.
DSS kolit DSS uygulama tarafından C57BL/6'indüklenen (%2 w/v) içme suyu. Denetim fare içme suyu tek başına aldı. N verilerden = 5 fareler grup başına mukoza ± SEM (A) immünfloresan görselleştirme makrofaj sızmaları gösterilir. Anti-F4/80 colitic içinde boyama temsilcisi görüntüleri gösterilmiştir ve kontrol fareler. Çubuk grafik: hücre sayısı/yüksek güç alan (HPF). (B) mukoza nötrofil sızmaları immünfloresan görselleştirme. Gösterilen anti-Gr-1 colitic hayvanlar ve denetimleri boyama temsilcisi görüntülerdir. Çubuk grafik: Say/HPF hücre. (C) colitic ve colitic farelerin kolon doku MPO konsantrasyon. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 . Monosit işe bağırsak yuvası.
Periferik kan monosit colitic fareler yanı sıra kontrol fareler (n = 5 grup başına) Akış Sitometresi Ly - 6 C CD11b pozitif hücreleri üzerinde ifade tarafından analiz edildi. Hücreleri SSC ve CD11b ifade göre sıralanmış. Fare monosit SSCdüşükCD11byüksek hücreler olarak tespit edilmiştir ve onların Ly6C ifade analiz edildi. (A) orantılı inflamatuar Ly6Cyüksek monosit (% değiştirmek ± SEM) ön deney koşullarına göre tasvir edilmektedir doğru değiştirir. Ly6C SSClowCD11byüksek hücrelerde colitic hayvanların önce ve sonra ifade kolit indüksiyon (alt panelleri) ve kontrolleri öncesi ve sonrası deneme (üst panelleri) ve (B) FACS nokta araziler. (C) Splenocytes colitic ve colitic fare üzerinden F4/80 ifade için Akış Sitometresi (ortalama Floresans yoğunluğu ± SEM) tarafından değerlendirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 . Tomografik görselleştirme makrofaj infiltrat fare kolit. içinde
FMT inceden inceye gözden geçirmek colitic fareler ve sigara colitic denetimlerini yönetilen fare F4/80 karşı antikor Cyanine7 Birleşik (n = 5 grup başına). (A) çubuk grafik: boya pmol toplam floresan yoğunluğu yatırım Getirisini kararlı ve tasvir ± SEM temsilcisi görüntüleri enjekte farelerde enflamatuar infiltrat ölçüde karşılık gelen renk kodlu floresan yoğunluğu ile gösterilir belirli sonda (Anti-fare F4/80) ile (B) ve belirsiz bir denetimi (sıçan IgG) (C). Her iki durumda da, eşit büyüklükte bir yatırım Getirisi daha fazla çözümleme için üst karında enine yerleştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5 . Ex vivo fare kolit izleyici özgüllük doğrulanmasını.
Vivo FMT taramalar belirli sonda (Anti-fare F4/80) ile enjekte colitic farelerde elde edilen izleyici sinyal kolon kökenli göstermek için explanted bağırsak ex vivo düzlemsel Floresans taramaları tarafından takip içinde vivo. N toplam iki deney verileri = 8 hayvanlar gösterilir. Temsilcisi görüntüleri ile renk kodlu Floresans in vivo FMT inceden inceye gözden geçirmek colitic farelerin tasvir gösterilir enflamatuar infiltrat ölçüde karşılık gelen yoğunluk (A).Explanted bağırsak Floresans yansıma görüntüleme sağlar belirli bölgelerde Izleyici birikmesi ile tanımlanması için (B). Temsilcisi post mortem F4/80-pozitif makrofajlar gibi alanlarda üzerinden için boyama immünfloresan vivo sonuçları teyit (C). Makrofajlar, infiltre sayısını ayirt boyama tarafından belirlenen ölçülen vivo içinde izleyici birikimi ile ilişkili (D). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tıbbi görüntüleme teknikleri son yıllarda hızla geliştiğini rağmen biz hala bizim yetenek iltihabi süreçleri veya tümörler, hem de diğer hastalıklar erken onların geliştirme aşamalarında algılamak için sınırlıdır. Ancak, bu anlayış tümör büyüme, işgali, ya da metastaz kalkınma ve hücresel süreçler enflamatuar bozuklukları ve dejeneratif, kardiyovasküler ve immünolojik hastalıkların gelişiminde çok önemlidir. Geleneksel görüntüleme teknikleri fiziksel veya fizyolojik parametrelerine güveniyor olsa da, moleküler görüntüleme belirli moleküler işaretleyiciler vivo içinde20görselleştirme sağlar.
Küçük hayvan görüntüleme için belirli görselleştirmek için radyonüklid temelli yaklaşımlar (Örneğin, sOcak ateşi-foton emisyon tomografi (SPECT) ve Pozitron emisyon tomografisi (PET) hesaplanan), ultrason ve floresan-aracılı görüntüleme kullanılabilir Moleküler hedef yapıları. En çok kullanılan izleme omurga olarak tam uzunlukta antikor kullanımı uzun dolaşım süreleri ve yavaş doku penetrasyonu gecikme saat görüntüleme izleme uygulama sonrası gibi uzun süreli etiket gerektirir. Tipik görüntüleme radyonükleidler bu nedenle antikor dağıtım vivo içinde görüntüleme için uygun değildir. Cu64 veya In111 gibi uzun yaşam izotoplar kullanımı antikor tabanlı izleyiciler sağlar ama izotop üretimi, radyasyon güvenliği önce ve etiketleme işlemi sırasında kapsayan karmaşık bir altyapı talepleri ve sonda uygulamadan sonra hayvan konut korumalı. Daha düşük maliyetli ve güvenli değişken floresan-Imaging aracılı.
Birkaç vivo içinde görüntüleme sistemleri tespiti için görselleştirme ve floresan boya dağıtım yaşayan hayvanlarda ölçümü son yirmi yılda21sunulmuştur. En sistemleri düzlemsel görüntüleme yüzeysel lezyon görüntüleme için uygun hızlı etkinleştirin. Işık emilimi ve saçılma, sinyalleri içinde nedeniyle doku kaçmasına düzlemsel görüntüleme. En önde gelen eriyik için bu problem Floresans tomografi22yaşında. Matematiksel modelleme dayanarak, görüntü sinyali saçılmasını ve ışık emilimi için düzeltilmiş ve sanal 3D veri kümesi8Multi projeksiyon veri kümesi hesaplanır. Algoritma belirli bölgeler temsilcisi hedef konsantrasyon/deyim23izleyici konsantrasyon tahmini etkinleştirme tamamen nicel veriler sağlar. FMT ilgili bir sınırlama ile karşılaştırıldığında hangi might-bağlı olarak istenen hedef-uzlaşma belirli anatomik yapıların moleküler bilgi tahsisi anatomik görüntüleme teknikleri, zavallı Uzaysal çözünürlük ile ilgili. Başka bir sınırlama ışık emici ve kırmızı NIR spektral Aralık23Floresanda sondalar kullanılması gerekir doku içine sınırlı penetrasyon derinliği yatıyor.
Morfolojik ultrason avantajları ve floresan görüntüleme moleküler bilgi edinme imkanı birleştiren son zamanlarda tanıtılan bir görüntüleme yöntemidir optoacoustic görüntüleme var. Erken çalışmalar ilk sonuçlar bu rağmen daha fazla teknik arıtma-optoacoustic görüntüleme tutan büyük söz moleküler görüntüleme ve potansiyel translasyonel uygulamaları24ihtiyaç öneririz.
İşe Alım sitesine enfeksiyon veya inflamasyon otoimmün hastalığı gibi immün aracılı birçok hastalık inflamatuar hücrelerin olduğu gibi barsak duvarında lökositlerin işe başlama ve idame IBD, önemli bir adımdır, enfeksiyon, damar hastalıkları, tumorigenesis ve çok daha fazla25. Monosit harekete geçirmek ve infiltrasyon bağırsak mukozası içine IBD patogenezinde önemli bir adım olarak, monosit infiltrasyon, kemokinler ve integrin hücresel adezyon molekül etkileşim, tarafından düzenledi inhibisyonu bir tedavi umut verici olduğunu 12,26yaklaşım. Bu nedenle, iltihap siteye kaçakçılığı lökosit izleme okudu ilaçların anti-inflamatuar etkileri görselleştirmek için yeni tedavi olanakları gelişiminde çok önemlidir. Bunun nedeni lökosit kaçakçılığı hedefleme ajanlar geliştirilmiştir ve süre daha fazla bileşenleri-ecek var olmak elde edilebilir içinde yakın gelecek26bazı anti-integrin antikorlar zaten IBD tedavisi için kullanılabilir özel ilgi olabilir. Vedolizumab, gut özgü α4β7 integrin alt birim ve β7 alt birim bağırsak α4β7 ve αEβ7 integrin heterodimers bağlar, Etrolizumab karşı insanlaşmış Monoklonal antikor onaylanan27,28olmuştur. Diğer ajanlar (Örneğin, MAdCAM-1 PF-00547659 ve sphingosine-1-fosfat (S1P) reseptör Modülatörleri Ozanimod gibi) şu anda değerlendirme IBD29,30tedavisi için gören.
FMT gerçekleştirirken, olası değişimleri teknik arasında farklı izleyici-hedef kombinasyonları gibi yapısal yaklaşımlar yoksul uzamsal çözünürlük için telafi etmek için Imaging FMT birleştiren yelpazesi sayılabilir. Sonda-hedef kombinasyon geniş bir dizi kurulan ticari ve. Belirli projeler, özel antikorlar etiketleme için yapılan ticari kullanarak kitleri ve yukarıda açıklanan protokol etiketleme olmak. Antikor veya daha küçük peptid hedefleme yan seçilen bağlı olarak, ticari tedarikçiler farklı Etiketler geniş bir dizi sunuyoruz. Uygulamaya bağlı olarak istenilen boya düşünün: derin doku görüntüleme-NIR spektrumda çalışan bir boya için (Örneğin, Cy7, λex / em 750/780 nm) genel parlaklık ve etkili ışık boyalar tedarik ederken iyi uygun olabilir spektrum (Örneğin, GFP analogları) görünür aralığında çalışma tercih olabilir. Hemen hemen tüm boyalar için etiket lizin artıkları proteinlerin yanı sıra alternatif bağlama moieties, sistein bağlama için maleimides veya belirli etiketleme etiketleri31 ile donatılmış proteinler etiketleme için biotin gibi etkin bir ester olarak elde edilebilir . Etiket seçimi ilke iletişim kuralı değiştirmez ama sadece etiketleme yordam hafif değişiklikler gerektirir ve iyi bir görüntü sonuç için önemlidir. Uzaysal çözünürlük, kısıtlamaları aşmak için bir başka çekici değişiklik BT veya MRI, ek açıklama moleküler bilgi ile anatomik yapıların etkinleştirme ile FMT birleştirmektir.Yapısal bilgi de sırayla bir temanın bilgi olarak veya aynı anda, hibrid araçları32,33Imaging gerektiren elde edilebilir.
Belirli adımları iletişim kuralının özel dikkate değerdir. Bu teknik çok sayıda belirli molekülleri farklı moleküler süreçlerinin temsilcisi çeşitli hedef floresan photoprobes için adapte edilebilir gibi sonda ve zenginleştirme yeterli dağıtımı için izin vermek için önemlidir istenen hedef bölge. Görüntüleme için ideal zaman noktası sonda-hedef kasanın göre değişebilir. Örneğin, antikor tümör reseptörleri hedefleyen tümörler, alımı ve metabolizma karaciğer ve olası advers immünojenik34tarafından Difüzyon oranına göre etkisinde. Ayrıca ilgili denetimleri belirli görüntüleme yaklaşımlar için göz önünde bulundurun. Belirli tarayıcıları perfüzyon etkileri ve belirsiz bağlama (Örneğin, Fc reseptör aracılı bağlama) yansıtan izotip denetimleri karşı her zaman doğrulanması gerektiğini. Bu nakavt modelleri varsa hedef negatif hayvanlar için izleyici özgüllük, ek bir denetim olarak hizmet verebilir. Alternatif olarak, antikor-hedef etkileşimleri35özgüllük kanıtlamak için deneyler engelleme gerçekleştirilebilir.
Aşağıdaki yordam ve pratik ile ilgili kritik adımlar şunlardır: (1) dikkatle kullanılan DSS konsantrasyonu belirlemek için DSS duyarlılık arasında değişebilir gibi farklı fare suşları veüretici/36toplu işlemleri. (2) dikkatle sonda-hedef bileşimlerini seçin. (3) yaklaşık 5 dk inceden inceye gözden geçirmek zaman tüm karın yeterli bir tarama için izin verir. Uygun zaman izleme uygulama ve görüntüleme yordamı arasında dikkatli bir şekilde tracer biriktirme istenen hedef bölgede izin vermek için belirlenmesi gereken nokta. Fare kolit bağırsak F4/80 tespiti için etiketli antikor tarama önce 24 h enjekte. (4) gibi belirsiz etiket birikimi (Örneğin, karaciğerde) ortaya çıkabilir, bu uygun hedef doku ilgili ölçü araçları yerleştirerek YG etiketlemek çok önemlidir. Ayrıca, belirsiz izleyici dağıtım için yeterli denetimleri olmak dahil-düşünmelisiniz perfüzyon etkileri ve nakavt ya da izleyici hedef etkileşimi doğrulamak için engelleme çalışmaları için belirsiz izotip kontrol eder.
Tipik tarama prosedürü ve veri imar ile ilgili hata kaynaklarının uygun olmayan hayvan pozisyon dahil, alan ve çekim hızı inceden inceye gözden geçirmek. Hayvan yerleştirirken, Floresanda lezyon imar gürültü en aza indirmek için tüm tarafların doku tarafından çevrili. Hayvan ve görüntüleme kaset ön cam tabak arasında sıkışmış hava kabarcıkları da gürültü artırabilir ve hayvan kıpırdadığını tarafından kaldırılması gerekir. Aşırı veya pozlama görüntü tarama ekran bulunabilir değiştirilmiş Pozlama ayarları reacquisition taramasıyla gerektirebilir (yansıma görüntü blok: ayarlamalar ön LED yoğunluğu ve pozlama süresi). Vivo antikor tabanlı FMT ölçümleri immünhistokimya veya immünfloresan boyama, gibi post mortem histolojik analizler ile birleştirirken antikorlar aynı klon ve biçim kullanımı düşünülmelidir. Ayrıca, tekrarlanan FMT ölçüleri aynı hayvanlarda gerçekleştirirken, aynı biçim ve klonlar mümkün olan veya farklı epitopları hedefleme önlemek için kullanılmalıdır.
Birlikte ele alındığında, Floresans aracılı moleküler tomografi tekrarlayan hastalık seyri izleme ve patofizyolojik süreçlerin temel sağlar. Biyomedikal araştırmalar bir bolluk için uygulanabilir ve uyuşturucu testi hızlandırmak yararlı olabilir veya objektif bir son nokta olarak tedaviler bireyselleştirilmiş. FMT hedefleme F4/80-ifade makrofajlar inflamasyon modellerinde, görselleştirmek ve infiltrasyon ve inflamatuar hücre birikimi de konvansiyonel için iyi korelasyon gösteren süre ölçmek için değerli bir noninvaziv araç sağlar güzel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bayan Sonja Dufentester, Bayan Elke Weber ve Bayan Klaudia Niepagenkämper mükemmel teknik destek için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Alfalfa-free diet | Harlan Laboritories, Madison, USA | 2014 | |
| Bepanthen eye ointment | Bayer, Leverkusen, Germany | 80469764 | |
| Dextran sulphate sodium (DSS) | TdB Consulatancy, Uppsala, Sweden | DB001 | |
| Eosin | Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany | E 4382 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany | E 9884 | |
| Florene 100V/V | Abbott, Wiesbaden, Germany | B506 | |
| Haematoxylin | Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany | HHS32-1L | |
| O.C.T. Tissue Tek compound | Sakura, Zoeterwonde, Netherlands | 4583 | fixative for histological analyses |
| Phosphate buffered saline, PBS | Lonza, Verviers, Belgium | 4629 | |
| Sodium Chloride 0,9% | Braun, Melsungen, Germany | 5/12211095/0411 | |
| Sodium bicarbonate powder | Sigma Aldrich Deisenhofen, Germany | S5761 | |
| Standard diet | Altromin, Lage, Germany | 1320 | |
| Tissue-Tek Cryomold | Sakura, Leiden, Netherlands | 4566 | |
| Hemoccult (guaiac paper test) | Beckmann Coulter, Germany | 3060 | |
| Biotin rat-anti-mouse anti-F4/80 antibody | Serotec, Oxford, UK | MCA497B | |
| Biotin rat-anti-mouse anti-GR-1 | BD Pharmingen, Heidelberg Germany | 553125 | |
| Streptavidin-Alexa546 | Molecular Probes, Darmstadt, Germany | S-11225 | excitation/emission maximum: 556/573nm |
| Anti-CD11b rat-anti-mouse antibody TC | Calteg, Burlingame, USA | R2b06 | |
| Purified anti-mouse F4/80 antibody | BioLegend, London, UK | 123102 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | D9542 | |
| FITC-conjugated anti-Ly6C rat-anti-mouse antibody | BD Pharmingen, Heidelberg, Germany | 553104 | |
| FACS buffer | BD Pharmingen, Heidelberg, Germany | 342003 | |
| Cy7 NHS Ester | GE Healthcare Europe, Freiburg, Germany | PA17104 | |
| MPO ELISA | Immundiagnostik AG, Bensheim, Germany | K 6631B | |
| Cy5.5 labeled anti-mouse F4/80 antibody | BioLegend, London, UK | 123127 | ready to use labelled Antibodies (alternative) |
| Anti-Mouse F4/80 Antigen PerCP-Cyanine5.5 | eBioscience, Waltham, USA | 45-4801-80 | ready to use labelled Antibodies (alternative) |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | 67-68-5 | |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | 792632 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | 64-17-5 | |
| Bovine Serum Albumins (BSA) | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | A4612 | |
| Tris Buffered Saline Solution (TBS) | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | SRE0032 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| FACS Calibur Flow Cytometry System | BD Biosciences GmbH, Heidelberg, Germany | ||
| FMT 2000 In Vivo Imaging System | PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA | FMT2000 | |
| True Quant 3.1 Imaging Analysis Software | PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA | included in FMT2000 | |
| Leica DMLB Fluorescent Microscope | Leica, 35578 Wetzlar, Germany | DMLB | |
| Bandelin Sonopuls HD 2070 | Bandelin, 12207 Berlin, Germany | HD 2070 | ultrasonic homogenizer |
| Disposable scalpel No 10 | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | Z692395-10EA | |
| Metzenbaum scissors 14cm | Ehrhardt Medizinprodukte GmbH, Geislingen, Germany | 22398330 | |
| luer lock syringe 5ml | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | Z248010 | |
| syringe needles | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | Z192368 | |
| Falcon Tube 50ml | BD Biosciences, Erembodegem, Belgium | 352070 |
References
- Bruckner, M., et al. Murine endoscopy for in vivo multimodal imaging of carcinogenesis and assessment of intestinal wound healing and inflammation. J Vis Exp. (90), (2014).
- Lewis, J. S., Achilefu, S., Garbow, J. R., Laforest, R., Welch, M. J. Small animal imaging. current technology and perspectives for oncological imaging. Eur J Cancer. 38 (16), 2173-2188 (2002).
- Bettenworth, D., et al. Translational 18F-FDG PET/CT imaging to monitor lesion activity in intestinal inflammation. J Nucl Med. 54 (5), 748-755 (2013).
- Vowinkel, T., et al.
- Korlach, J., Schwille, P., Webb, W. W., Feigenson, G. W. Characterization of lipid bilayer phases by confocal microscopy and fluorescence correlation spectroscopy. Proc Natl Acad Sci USA. 96 (15), 8461-8466 (1999).
- Ntziachristos, V., Tung, C. H., Bremer, C., Weissleder, R. Fluorescence molecular tomography resolves protease activity in vivo. Nat Med. 8 (7), 757-760 (2002).
- Ntziachristos, V., Bremer, C., Weissleder, R. Fluorescence imaging with near-infrared light: new technological advances that enable in vivo molecular imaging. Eur Radiol. 13 (1), 195-208 (2003).
- Ntziachristos, V., Bremer, C., Graves, E. E., Ripoll, J., Weissleder, R. In vivo tomographic imaging of near-infrared fluorescent probes. Mol Imaging. 1 (2), 82-88 (2002).
- Ballou, B., et al. Tumor labeling in vivo using cyanine-conjugated monoclonal antibodies. Cancer Immunol Immunother. 41 (4), 257-263 (1995).
- Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nat Protoc. 2 (3), 541-546 (2007).
- Kawada, M., Arihiro, A., Mizoguchi, E. Insights from advances in research of chemically induced experimental models of human inflammatory bowel disease. World J Gastroenterol. 13 (42), 5581-5593 (2007).
- Nowacki, T. M., et al. The 5A apolipoprotein A-I (apoA-I) mimetic peptide ameliorates experimental colitis by regulating monocyte infiltration. Br J Pharmacol. 173 (18), 2780-2792 (2016).
- Hansch, A., et al. In vivo imaging of experimental arthritis with near-infrared fluorescence. Arthritis Rheum. 50 (3), 961-967 (2004).
- Bialkowska, A. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. Improved Swiss-rolling Technique for Intestinal Tissue Preparation for Immunohistochemical and Immunofluorescent Analyses. J Vis Exp. (113), (2016).
- Diaz-Granados, N., Howe, K., Lu, J., McKay, D. M. Dextran sulfate sodium-induced colonic histopathology, but not altered epithelial ion transport, is reduced by inhibition of phosphodiesterase activity. Am J Pathol. 156 (6), 2169-2177 (2000).
- Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. Investigating intestinal inflammation in DSS-induced model of IBD. J Vis Exp. (60), e3678 (2012).
- Dieleman, L. A., et al. Chronic experimental colitis induced by dextran sulphate sodium (DSS) is characterized by Th1 and Th2 cytokines. Clin Exp Immunol. 114 (3), 385-391 (1998).
- Kojouharoff, G., et al. Neutralization of tumour necrosis factor (TNF) but not of IL-1 reduces inflammation in chronic dextran sulphate sodium-induced colitis in mice. Clin Exp Immunol. 107 (2), 353-358 (1997).
- Sunderkotter, C., et al. Subpopulations of mouse blood monocytes differ in maturation stage and inflammatory response. J Immunol. 172 (7), 4410-4417 (2004).
- Willmann, J. K., van Bruggen, N., Dinkelborg, L. M., Gambhir, S. S.
- Ntziachristos, V., Ripoll, J., Wang, L. V., Weissleder, R. Looking and listening to light: the evolution of whole-body photonic imaging. Nat Biotechnol. 23 (3), 313-320 (2005).
- Ntziachristos, V. Going deeper than microscopy: the optical imaging frontier in biology. Nat Methods. 7 (8), 603-614 (2010).
- Stuker, F., Ripoll, J., Rudin, M. Fluorescence molecular tomography: principles and potential for pharmaceutical research. Pharmaceutics. 3 (2), 229-274 (2011).
- Beziere, N., Ntziachristos, V. Optoacoustic imaging: an emerging modality for the gastrointestinal tract. Gastroenterology. 141 (6), 1979-1985 (2011).
- Habtezion, A., Nguyen, L. P., Hadeiba, H., Butcher, E. C. Leukocyte Trafficking to the Small Intestine and Colon. Gastroenterology. 150 (2), 340-354 (2016).
- Ungar, B., Kopylov, U. Advances in the development of new biologics in inflammatory bowel disease. Ann Gastroenterol. 29 (3), 243-248 (2016).
- Sandborn, W. J., et al. Vedolizumab as induction and maintenance therapy for Crohn's disease. N Engl J Med. 369 (8), 711-721 (2013).
- Vermeire, S., et al. Etrolizumab as induction therapy for ulcerative colitis: a randomised, controlled, phase 2 trial. Lancet. 384 (9940), 309-318 (2014).
- Coskun, M., Vermeire, S., Nielsen, O. H. Novel Targeted Therapies for Inflammatory Bowel Disease. Trends Pharmacol Sci. , (2016).
- Vermeire, S., et al. The mucosal addressin cell adhesion molecule antibody PF-00547,659 in ulcerative colitis: a randomised study. Gut. 60 (8), 1068-1075 (2011).
- Terai, T., Nagano, T. Small-molecule fluorophores and fluorescent probes for bioimaging. Pflugers Arch. 465 (3), 347-359 (2013).
- Ren, W., et al. Dynamic Measurement of Tumor Vascular Permeability and Perfusion using a Hybrid System for Simultaneous Magnetic Resonance and Fluorescence Imaging. Mol Imaging Biol. 18 (2), 191-200 (2016).
- Ale, A., Ermolayev, V., Deliolanis, N. C., Ntziachristos, V. Fluorescence background subtraction technique for hybrid fluorescence molecular tomography/x-ray computed tomography imaging of a mouse model of early stage lung cancer. J Biomed Opt. 18 (5), 56006 (2013).
- Chames, P., Van Regenmortel, M., Weiss, E., Baty, D. Therapeutic antibodies: successes, limitations and hopes for the future. Br J Pharmacol. 157 (2), 220-233 (2009).
- Faust, A., Hermann, S., Schafers, M., Holtke, C. Optical imaging probes and their potential contribution to radiotracer development. Nuklearmedizin. 55 (2), 51-62 (2016).
- Mahler, M., et al. Differential susceptibility of inbred mouse strains to dextran sulfate sodium-induced colitis. Am J Physiol. 274 (3 Pt 1), G544-G551 (1998).
