Summary
Spécifique à la cible sondes représentent un outil innovant pour l’analyse des mécanismes moléculaires, comme expression de la protéine dans divers types de maladie (p. ex., inflammation, infection et tumorigenèse). Dans cette étude, les auteurs décrivent une évaluation quantitative de tomographie tridimensionnelle d’infiltration de macrophages intestinaux dans un modèle murin de colite en utilisant la tomographie de F4/80-spécifique induite par fluorescence.
Abstract
Les modèles murins de la maladie sont indispensables à la recherche scientifique. Cependant, nombreux outils de diagnostic telles que l’endoscopie ou d’imagerie tomographique ne sont pas employés couramment dans des modèles animaux. Afficheurs expérimentales classiques reposent souvent sur des analyses post-mortem et ex vivo , qui empêchent les examens de suivi intra-individuelle et augmentent le nombre d’animaux d’étude nécessaires. Fluorescence induite par la tomographie permet l’évaluation non invasive, répétitive, quantitative tridimensionnelle des sondes fluorescentes. Il est très sensible et permet l’utilisation de fabricants de moléculaires, qui permet la détection spécifique et la caractérisation des cibles moléculaires distinctes. En particulier, les sondes ciblées représentent un outil innovant permettant d’analyser l’expression des gènes d’activation et de protéine dans l’inflammation, maladie auto-immune, infection, maladies vasculaires, la migration cellulaire, tumorigenèse, etc.. Dans cet article, nous fournissons des instructions détaillées sur cette technologie d’imagerie sophistiquée de in vivo de détection et de caractérisation de l’inflammation (c.-à-d., infiltration de macrophages F4/80-positif) dans un modèle murin largement utilisé de inflammation intestinale. Cette technique peut également être utilisée dans d’autres domaines de recherche, comme suivi de cellule ou des cellules souches immunitaire.
Introduction
Modèles animaux sont largement utilisés dans la recherche scientifique, et de nombreuses méthodes non invasives existent pour moniteur activité de la maladie et de la vitalité, tels que la quantification des changements de poids corporel ou l’analyse de sang, urine et les fèces. Cependant, ce sont uniquement les paramètres de substitution indirecte qui sont également sujettes à la variabilité interindividuelle. Ils doivent souvent être complétées par des analyses post-mortem du spécimen de tissu, ce qui empêche la série observation aux périodes répétitives et dirigent observation de physiologique ou pathologique traite in vivo. Des techniques d’imagerie sophistiquées de petits animaux ont émergé, y compris les traverses sectionnelle imagerie, imagerie optique et endoscopie, qui permet la visualisation directe de ces processus et permet également aux analyses répétitives du même animaux1 , 2 , 3. en outre, la possibilité de surveiller continuellement divers États de la maladie chez le même animal peut diminuer le nombre d’animaux nécessaires, qui pourraient être souhaitables dans une perspective éthique animale.
Plusieurs techniques d’imagerie optiques existent pour l’imagerie de fluorescence in vivo . A l’origine, l’imagerie confocale a été employé pour étudier la surface et de subsurface événements fluorescent4,5. Récemment, cependant, les systèmes tomographiques qui permettent des évaluations quantitatives dimensions des tissus ont été développés6. Ceci a été accompli grâce au développement de sondes fluorescentes qui émettent de la lumière dans le spectre de proche infrarouge (NIR), offrant la faible absorption des détecteurs sensibles et sources de lumière monochromatique7. Alors que les techniques d’imagerie traditionnelle vues en coupe, comme la tomodensitométrie (TDM), imagerie de résonance magnétique (IRM) ou ultrasons (US), s’appuient principalement sur les paramètres physiques et visualiser la morphologie, imagerie optique peut fournir des renseignements supplémentaires sur les mécanismes moléculaires sous-jacents à l’aide de fluorescence endogène ou exogène sondes8.
Progrès en biologie moléculaire ont permis de faciliter la génération de sondes moléculaires fluorescentes intelligentes et ciblées pour un nombre croissant de cibles. Par exemple, médiée par les récepteurs l’absorption et la distribution dans une zone cible donnée peuvent être visualisées à l’aide d’anticorps marqués dérivé carbocyanine9. L’abondance des anticorps disponibles, qui peuvent être étiquetés à fonctionner comme des traceurs spécifiques dans des endroits inaccessibles autrement du corps, donne un aperçu sans précédent à des processus moléculaires et cellulaires dans les modèles de la tumorigenèse et neurodégénératives, maladies cardiovasculaires, inflammatoires et immunologiques7.
Dans cette étude, nous décrivons l’utilisation de la fluorescence induite par la tomographie dans un modèle murin de colite. Dextran sulfate de sodium (DSS)-colite induite est un modèle de souris induite chimiquement standard d’inflammation intestinale qui ressemble à inflammatoires de l’intestin (IBD) la maladie10. Il est particulièrement utile évaluer la contribution du système immunitaire inné pour le développement de l’inflammation intestinale11. Étant donné que le recrutement, l’activation et l’infiltration de monocytes et macrophages représentent des étapes cruciales dans la pathogenèse de l’EIA, visualisation de leur recrutement et de la cinétique d’infiltration sont essentiels à la surveillance, par exemple, l’effet de substances thérapeutiques potentielles dans un paramètre précliniques12. Nous décrivons l’induction d’une colite DSS et démontrer la caractérisation induite par la tomographie de l’infiltration de macrophages dans la muqueuse de l’intestin en utilisant la fluorescence moléculaire tomographie pour la visualisation spécifique du marqueur de monocytes/macrophages F4/80 13. en outre, nous illustrons les procédures auxiliaires et supplémentaires, tels que les anticorps étiquetage ; le montage expérimental ; et l’analyse et l’interprétation des images obtenues, en corrélation avec des lectures classiques tels que les indices de l’activité de la maladie, flow cytometry et analyse histologique et immunohistochimique. Nous discutons des limites de cette technique et les comparaisons avec les autres modalités d’imagerie.
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Protocol
Toutes les expériences animales ont été approuvées par le Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz (LANUV) Nordrhein-Westfalen, selon la loi allemande de Protection animale (Tierschutzgesetz).
1. les matériaux et montage expérimental
- Soins aux animaux.
- Utilisez souris sexe - et appariés selon l’âge de n’importe quelle contrainte DSS-sensibles (p. ex., C57BL/6) à 20-25 g de poids corporel.
- Plan d’au moins cinq ou plusieurs souris par groupe expérimental et maison les souris selon les lignes directrices locales de soins aux animaux.
- Fournir un chow rongeur standard alimentation et autoclavé eau potable ad libitum.
- Enlever la nourriture standard et remplacez-le par chow exempt de luzerne au moins trois jours avant l’analyse pour réduire endoluminal auto-fluorescence.
- Induction d’une colite aiguë induite par le DSS.
- Dissoudre 2 g de DSS (poids moléculaire ~ 40 000 Da) dans 100 mL de l’eau potable autoclavé pour obtenir un 2 % (solution w/v).
- Remplir l’alimentation boire des souris exclusivement avec la solution DSS et estimer les 5 mL de liquide par souris par jour. Fournir l’eau potable même sans DSS au contrôle souris10.
NOTE : Surveiller les souris tous les jours jusqu'à la fin de l’expérience. Euthanasier les souris qui perdent plus de 20 % de leur poids corporel initial ou qui deviennent moribonds (c.-à-d., constamment penché posture, mouvement, une respiration, dressés nettement manteau) conformément aux directives applicables locales sur animal protection sociale.
- Préparation de la fluorescence induite par la tomographie.
- L’anticorps désiré (par exemple, rat anti-souris F4/80) avec de la teinture de la fluorescence de l’étiquette (par exemple, Cyanine7, λexcitation: 750 nm, λémission: 776 nm) tel que décrit dans le protocole du fabricant. Dialyser anticorps purifiés dans une membrane de dialyse approprié (taille des pores < 50-100 kDa) contre 1 L de chlorure de sodium 0.15 M au moins 2 heures ou toute une nuit.
- Transférer l’anticorps dans 1 L de 0,1 M NaHCO3 et dialyser pendant au moins 2 h.
- Dissoudre la quantité nécessaire de colorant fluorescent dans le diméthylsulfoxyde (DMSO) (10,8 mg/µL d’anticorps) et l’ajouter à la solution d’anticorps. Utiliser le colorant fluorescent en excès molaire 20 fois pour atteindre un ratio de colorant-à-protéine de 1:3.
- Incuber dans l’obscurité à 4 ° C pendant 1 h. éliminer les anticorps non étiqueté en dialyse contre 1 L de 0,15 M de sodium ou en utilisant une colonne de dessalement PD-10 et résoudre dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pour in vivo de l’application.
- Déterminer la concentration en anticorps final et le ratio étiquetage par spectrophotométrie.
- Mesurer la concentration de protéine à une absorption de 250-330 nm et envisager une absorption supplémentaire de la teinture. Corriger le maximum d’absorption à 280 nm (protéine) de 11 % de l’absorption maximale à 750 nm (prochaine étape) pour l’étiquetage des Cyanine7.
- Mesurer une dilution du composé (typiquement 01:10) à 250-800 nm et extraire la concentration de Cyanine7 à 750 nm.
- Déterminer le ratio de colorant-à-protéine comme : colorant/anticorps = absorption maximale à 750 nm / 200 000 / (maximum d’absorption à 280 nm - 0,11 x maximum d’absorption à 750 nm) / 170 000.
- Conserver la solution d’anticorps à 4 ° C et protéger de la lumière pour éviter le blanchiment avant l’injection.
- Charger le volume de solution d’anticorps nécessaire dans une seringue stérile juste avant l’injection et le bouclier de lumière, jusqu'à ce qu’il est utilisé.
- Déterminer le moment optimal de l’injection de la sonde et la procédure de numérisation, selon pharmacocinétique de traceur.
- Anesthésier les souris à l’aide de 1,5 à 2,5 % par inhalation isoflurane en oxygène ou placer en toute sécurité dans une drisse dédié pour l’injection dans la veine queue des anticorps marqués.
- Pour les anticorps pleine longueur, injecter l’anticorps marqué au moins 24 h avant l’analyse, par exemple pour anti-souris F4/80 macrophage visualisation dans la colite murine. Injecter des souris par voie intraveineuse (i.v.) par l’intermédiaire de la queue de la veine avec des anticorps marqués d’un montant correspondant à 2,0 nmol de colorant.
- Utilisation tout aussi imprécises anticorps marqués (p. ex. rat IgG ou un autre isotype correspondant à l’héritage de l’anticorps primaire) comme un contrôle d’isotype à des doses équivalentes à celles de la sonde spécifique.
Remarque : Les résultats de in vivo analyse après que injection du contrôle composé peut servir de référence pour l’interprétation de la sonde spécifique de données d’imagerie. - Utilisez un rasoir électrique pour raser la fourrure animale dans la région abdominale afin de minimiser l’absorption et la réflexion de la lumière.
- L’anticorps désiré (par exemple, rat anti-souris F4/80) avec de la teinture de la fluorescence de l’étiquette (par exemple, Cyanine7, λexcitation: 750 nm, λémission: 776 nm) tel que décrit dans le protocole du fabricant. Dialyser anticorps purifiés dans une membrane de dialyse approprié (taille des pores < 50-100 kDa) contre 1 L de chlorure de sodium 0.15 M au moins 2 heures ou toute une nuit.
2. technique matériel
- Utiliser un dispositif de tomographie de fluorescence induite par la vétérinaire (FMT) pour petits animaux de fluorescence ( Figure 4).
- Créer une nouvelle étude pour chaque projet en cliquant sur la « nouvelle étude » bouton et inclure dans la description de l’étude les traceurs pertinentes, y compris les paramètres d’imagerie et les doses pour un usage ultérieur.
- Dans cette étude, créer des groupes d’études selon le plan d’étude respectifs (par exemple, pour le traceur spécifique et non-spécifique isotype contrôle) en cliquant sur le « groupe de la nouvelle étude » bouton. Équiper de chaque groupe d’étude avec le nombre respectif des animaux.
- Calibrer le système pour les constructions de traceur.
- Effectuer l’étalonnage pour chaque lot de traceurs pour normaliser la variation dans l’étiquetage et permettre des mesures quantitatives de données OI.
- Suivre les indications du fabricant de l’instrument pour l’étalonnage de chaque système individuel ; après la sélection de « ajouter un nouveau traceur », le système fournira un guide à travers les étapes. Fournir la dilution de la solution d’anticorps appliquée et de la concentration absolue calculée du traceur dans la sonde.
- Pour FMT, utilisez un tissu imitant le fantôme de caractéristiques définies de l’épaisseur et l’absorption (qui ressemble à tissu vital) et remplissez-le avec un volume spécifique de la solution d’anticorps utilisée. Mesurer sur le périphérique de la FMT.
Remarque : Le système utilise la mesure de référence de la sonde fournie, ainsi que la concentration donnée, pour calculer les concentrations de marqueurs absolue de future in vivo des mesures.
- Utiliser une cassette d’examen pouvant être chauffé à une température de 42 ° C.
Remarque : Cela évite les souris ne se hypothermie lors de l’examen.
3. animaux anesthésie
- Utiliser un flux continu de 1,5 à 2 % vol % isoflurane ([2-chloro-2-(difluoromethoxy)-1,1,1-trifluoro-ethane]) et 1,5 L O2/min à anesthésier les souris.
4. fluorescence induite par la tomographie Scan
NOTE : Adapter les informations suivantes, qui sont spécifiques au système FMT utilisé dans cette étude (voir la Table des matières) pour les appareils d’imagerie de fluorescence alternative réflectance ou systèmes FMT, selon les besoins.
- Placez votre souris anesthésiée sur son dos dans la cassette de l’examen.
- Effectuez la procédure de numérisation.
- Insérez la cassette dans le système d’imagerie et de fermer immédiatement pour assurer une anesthésie continue. Sélectionnez l’échantillon approprié dans le groupe d’étude créé précédemment. Sélectionnez le traceur administré dans le menu déroulant pour s’assurer que les valeurs de la concentration du traceur sont correctement calculés.
- Obtenir l’image de réflectance de fluorescence à la longueur d’onde appropriée (720 nm pour Cyanine7) pour la planification du scan et esquisse le domaine de l’analyse en cliquant sur le bouton « obtenir l’image ».
- Vérifier que le champ de balayage apparaît en surimpression sur l’image de réflectance de fluorescence. Ajuster à la zone d’intérêt (p. ex., du côlon ou l’abdomen), éviter air ou zones de fourrure restant. Selon la cible de l’image, définissez le nombre d’image points de données dans le domaine de la numérisation en choisissant de la grossière de moyenne et fine résolution de scan-champ dans le menu sur la droite.
Remarque : N’oubliez pas qu’un champ d’analyse fine pourrait offrir meilleure résolution spatiale au prix d’un temps de balayage nettement plus longtemps. - Démarrer l’acquisition de données/images à la longueur d’onde sélectionnée en cliquant sur « Rechercher ».
NOTE : Le temps de scan pour une analyse moyenne-fine de l’abdomen entier sera autour de 5 min ; pendant ce temps, chaque point de données est allumé séparément par le laser d’excitation et la fluorescence qui en résulte est enregistrée. - Retirez la cassette d’imagerie à la fin de l’analyse de l’animal et permettre à l’animal de récupérer entièrement avant de le placer dans la cage.
- Répéter le FMT si jugé nécessaire à divers moments au cours de l’expérience (par exemple, les jours 0, 5 et 9-10 (fin de l’expérience)), mais tenir compte de l’accumulation des anticorps dans le corps, augmentant ainsi le signal de fluorescence de fond.
5. après analyse
- Placez la souris dans une cage séparée sur une serviette en papier sous une lampe de réchauffement de la planète rouge-lumière et contrôler la souris des signes d’inconfort ou de détresse jusqu'à la guérison complète. Replacez la souris dans sa cage respective lorsqu’il est pleinement éveillé.
- Euthanasier la souris à la fin de l’expérience de la prestation de CO2 à l’isolateur à une dose de 100 % (v/v), 100 % en volume et 3 L/min. Ne pas pré remplir la chambre avec le CO2, comme une exposition soudaine à des concentrations élevées de CO2 peut-être causer une détresse. Vérifier la mort après que la souris a cessé de respirer par un mode secondaire subséquent de l’euthanasie comme rapide dislocation cervicale.
- Explantation du côlon par laparotomie abdominale et effectuer une analyse ex vivo du côlon explanté, comme cela est expliqué dans les étapes 4.2.1 - 4.2.4. Ouvrez chaque colon longitudinalement à l’aide de ciseaux chirurgicaux Metzenbaum et rincer avec du sérum physiologique avant de préparer pour une analyse plus approfondie.
- Utiliser un scalpel pour couper un fragment de 0,5 cm dans le côlon distal et le placer immédiatement dans un tube cryogénique de 1,5 mL. Congelez-la en azote liquide et le magasin à-70 ° C jusqu'à l’utilisation ultérieure (par exemple,les mesures contre la myéloperoxydase (MPO)).
- Utilisez un bâton en bois et retrousser le côlon restant ouvert longitudinalement de distale jusqu'à l’extrémité proximale, avec à l’extérieur la muqueuse (« technique de Swiss roll »), pour des analyses histologiques. Placer la préparation dans un fixateur (voir la Table des matières) et congeler à-80 ° C14.
6. interprétation et Reconstruction de données
- Utilisez l’outil de reconstruction du logiciel d’imagerie respectif pour créer des cartes 3D de la distribution de fluorescence à partir des données brutes d’imagerie ; balayages sont automatiquement ajoutés à l’outil reconstruction, quand à la numérisation, la fonction « ajouter à la file d’attente de la reconstruction » est sélectionné.
- Dans le cas contraire, sélectionnez les scans dans le menu déroulant sous l’étude respective et groupe d’étude, cliquez-droit sur le scan et sélectionnez « Ajouter à la reconstruction ».
- Pour une analyse ultérieure, charger un ensemble de données dans le logiciel d’analyse. Dans le menu déroulant dans la barre du haut, sélectionnez l’étude respective, puis sélectionnez le groupe d’étude et de l’animal dans le menu sur la droite ; tous les scans effectués pour cet animal seront montrés. Sélectionnez l’analyse correcte et cliquez sur « charger ».
Remarque : La reconstruction 3D de la distribution du traceur s’affiche sur la gauche en surimpression de l’image de réflectance de fluorescence initialement acquis. Le modèle peut être pivoté et amplifié pour une analyse plus facile. - Identifier les foyers d’accumulation d’étiquette non spécifique (p. ex., vessie de foie ou de l’urine) sur des cartes 3D reconstituées et différencier des tissus cibles (p. ex., l’intestin ou l’intestin).
- De la barre du haut, sélectionnez la forme ROI plus appropriée pour la cible. Tissu de cible d’étiquette en tant que région d’intérêt (ROI) en plaçant les outils de mesure respectifs dans le logiciel d’analyse ; le logiciel fournira une intensité de fluorescence pour le ROI, ainsi que (pico-) quantités molaires du traceur qui le scan a été étalonné pour.
- Sélectionnez la quantité totale de traceur dans le retour sur investissement approprié, normalisée pour la taille ROI, comme l’équivalent plus approprié pour l’évaluation de l’activité de la maladie en corrélation avec l’infiltrat inflammatoire (histologie).
Remarque : Autres caractéristiques du ROI peuvent être choisies si approprié comme représentant du modèle particulier.
7.Ex Vivo Analyses
- L’hématoxyline et éosine coloration et immunofluorescence souillant.
- Déparaffiner sections en les plaçant dans 70 % d’éthanol (EtOH) pendant 2 min ; Rincer à l’eau distillée. Tache avec la solution de l’hématoxyline pendant 5 min et ensuite rincer à l’eau chaude du robinet pendant 10 min.
- Rincer à l’eau distillée, contre-colorant avec solution d’éosine pendant 2 minutes et rincer à nouveau avec de l’eau distillée.
- Lieu à 70 % EtOH, 96 % EtOH, 99 % EtOH et xylène (2 fois) de 2 min chacun pour déshydrater et effacer les sections. Monter avec le milieu de montage résineuse.
- Immunofluorescence souillant.
- Utiliser les sections de tissus obtenus antérieurement (« Swiss roll ») pour immunofluorescence souillant et préparer des sections de cryo-coupe de 7 µm.
- Bloquer les sections colon-correction d’acétone et surgelés dans le sérum de rat de 5,0 % pendant 10 min et incuber pendant la nuit avec dilué (1/500 v/v) primaires de rat anti-souris F4/80 biotinylé. Laver trois fois les sections tampon Tris salin (SCT) et incuber avec streptavidine-FITC (au 1/100 v/v) dans PBS/BSA (0,1 % p/v) durant la nuit à 4 ° C.
- Laver les sections au SCT et tache au 4′, 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI, 1/1000 v/v) pour atteindre le contraste. Analyser les images de fluorescence sous un microscope confocal (voir la Table des matières, un grossissement de 40 x ; cube filtre N2.1 avec filtre d’excitation 515-560) et compter les cellules F4/80-positif par champ à haute puissance.
Remarque : Pensez à utiliser les anticorps du même clone et du format lors de la combinaison en vivo FMT et post-mortem histologie analyses comme immunohistochemistry ou immunofluorescence souillant, selon le but visé. Pour la détection des macrophages F4/80-positive in vivo et ex vivo, différents formats ont été utilisés.
- Mesures de MPO dans les échantillons du côlon.
- Utilisation fraîchement obtenue, préalablement rincé PBS des échantillons du côlon ou décongelé spécimen pour les mesures de la FTU. Peser tous les échantillons et homogénéiser les tissus dans le tampon de lyse fourni dans le test ELISA kit (voir la Table des matières) à un volume de 20 µL de tampon de lyse par milligramme de tissu.
- Laisser agir pendant 15 s (fréquence de sonication : 20 kHz, puissance : 70 W) et centrifuger les échantillons pendant 10 min à 200 x g et 4 ° C.
- Utiliser un ELISA commercial nécessaire (voir la Table des matières) selon la description de la fabrique. Effectuer l’essai en double.
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Representative Results
Évaluation de colite :
La colite induite par le DSS est un modèle murin induit chimiquement de l’inflammation intestinale qui ressemble à EIA humain et mène à la perte de poids, des saignements rectaux, ulcération superficielle et altération de la muqueuse dans des souris sensibles15. Il est particulièrement utile étudier la contribution du système immunitaire inné au développement de l’inflammation intestinale10,11. Pour provoquer l’inflammation colitic puissamment, les souris ont été continuellement administrés DSS tout au long de l’expérience. Baisse du poids corporel et sang occulte fécal ont servi d’indices cliniques de l’inflammation. Comme le montre la Figure 1 a, souris a commencé à perdre du poids à partir de quatrième jour après l’induction de la colite, considérant que les animaux témoins recevant l’eau seulement ont montré aucune variation significative du poids corporel. En outre, colitic animaux ont montré une excrétion accrue de sang occulte par les fèces (Figure 1 b), tel qu’évalué à l’aide de l’hemoccult suivant système de notation : 0 (pas de sang), 1 (hemoccult positif), 2 (hemoccult pellet positive et visuel saignement) et 4 () brut de saignement, sang autour anus)16. Longueur du côlon a été mesurée pour évaluer le raccourcissement colique induite par l’inflammation, révélant des points-virgules significativement réduites chez les souris colitic par rapport aux souris témoins recevant l’eau seulement (Figure 1). Pour évaluer directement les dommages du côlon, l’analyse histologique a été réalisée à la fin de l’expérience. Une évaluation quantitative des dommages histologiques a été réalisée sur la colique H & sections E teinté à l’aide d’un noyau de lésion globale basée sur le degré et l’étendue de l’inflammation, dommages de la crypte et pourcentage de participation17. Colitic souris a montré des signes de l’inflammation sévère, tandis que les souris témoins ne recevant aucuns DSS a montré aucun dommage histologique (Figure 1). Les images montrent des changements inflammatoires caractéristiques dans la colite induite par le DSS, caractérisée par la destruction de l’architecture épithéliale, avec la perte de cellules caliciformes, dommages de la crypte et ulcération de la muqueuse, par opposition à la conservé en grande partie muqueuse architecture de contrôle souris18. Des différences significatives entre les groupes (n = 5 par groupe) ont été calculés en analyse de variance (ANOVA) suivi par l’étudiant-Newman-Keuls (S.N.K.) post hoc test ou test de Welch suivie de test post hoc de jeux-Howell en cas d’hétérogénéité significative de la variance. Une p-valeur de < 0,05 était considérée comme significative.
Évaluation des monocytes et macrophages recrutement :
Comme la colite induite par le DSS est associée à l’infiltration de cellules immunitaires, comme les monocytes et macrophages, dans la muqueuse et la sous-muqueuse du côlon, nous avons utilisé la coloration par immunofluorescence pour le marqueur de monocytes/macrophages F4/80 pour quantifier l’infiltrat. Colitic souris recevant DSS ont montré un nombre significativement élevé de monocytes infiltrant la paroi du côlon par rapport aux souris contrôle non-colitic (Figure 2 a). En outre, l’infiltration leucocytaire a été quantifiée à l’aide immunofluorescence pour le marqueur de neutrophil GR1, révélant l’immigration une augmentation significative des neutrophiles dans le côlon enflammé par rapport aux souris témoins (Figure 2 b). Pour confirmer, FTU niveaux reflétant les deux activité numéro et inflammatoires neutrophiles étaient significativement élevées dans les tissus du côlon de souris colitic (Figure 2). Analyse de la variance et test post hoc S.N.K. ont servi à calculer la signification statistique entre les groupes (n = 5 par groupe). Signification statistique a été fixée à p < 0,05.
Changements systémiques dans la sous-population des macrophages :
Monocytes souris englobent un groupe hétérogène de sous-populations distinctes qui diffèrent par leur état de maturation et de leur capacité à recruter les sites inflammatoires, où ils participent à initier et à perpétuer la réponse inflammatoire19 . Par conséquent, nous avons caractérisé des monocytes sanguins en analysant l’expression différentielle de CD11b et Ly6C à l’aide de cytométrie en flux. Conditions inflammatoires de colite aiguë de DSS, nous avons observé une augmentation significative d’inflammatoire CD11bhauteLy6C des monocytesélevés par rapport aux conditions de l’expérience préalable. En revanche, ce changement ne se produit pas chez les souris non-colitic de contrôle sans DSS (Figure 3 a). Les données (n = 5 par groupe) ont été analysées à l’aide d’ANOVA et S.N.K. Comme un paramètre supplémentaire de substitution pour l’inflammation systémique, nous avons évalué la présence de cellules F4/80-positives dans la rate des souris colitic par rapport aux témoins non-colitic, qui a révélé une augmentation significative de souris traitées au DSS (Figure 3).
Fluorescence induite par la tomographie Scan :
Fluorescence induite par la tomographie nous permettant de mesurer le recrutement des monocytes/macrophages et infiltration de la muqueuse de l’intestin. Un anticorps marqués par fluorescence contre murine F4/80 a été utilisé pour visualiser directement les macrophages activés dans les animaux vivants. Anticorps IgG de rat marqués, non spécifique ont été utilisés sous le contrôle de l’isotype. Pour la numérisation, souris ont été rasés dans la région abdominale pour réduire au minimum la réflexion de la lumière par la fourrure, anesthésiés par l’approvisionnement continu isoflurane et examinés dans un dispositif FMT vétérinaire pour petits animaux fluorescence. Comme illustré à la Figure 4 a, l’induction d’une colite conduite à une accumulation significativement élevée de traceur fluorescent dans les points-virgules des souris colitic comparativement aux groupes témoins non-colitic, indiquant une augmentation de l’infiltration de monocytes et de différenciation en macrophages actifs chez les animaux colitic. L’application d’une IgG de fluorescence-étiquetée non-spécifique ne pas permis d’obtenir une réponse de fluorescence détectables dans l’abdomen et l’intestin, ni dans le colitic (DSS) ni le groupe non colitic (eau), démontrant la spécificité de la sonde-cible interaction de l’anticorps F4/80 (Figure 4 a). Des images représentatives de la région abdominale sont indiqués. Le code de couleur indique le niveau d’intensité de la fluorescence, ce qui correspond à l’étendue de l’infiltrat inflammatoire()Figure 4 b et 4C).Ex vivo les mensurations de l’accumulation de traceur F4/80-réalisé en colones explantés vérifié l’origine colique du signal en vivo a détecté de l’accumulation de traceur F4/80 (Figure 5 a et 5 b). Les montants calculés d’anticorps lié en corrélation bien (R2 = 0,52) avec un nombre déterminé sur le plan histologique d’infiltration de macrophages (Figure 5 et 5D), confirmant que l’imagerie in vivo à traceurs spécifiques peut être indicatif de l’activité de la maladie locale. Données ont été analysées par le test post hoc ANOVA et S.N.K. avec un seuil de signification statistique fixé à p < 0,05. La corrélation a été calculée comme la régression linéaire.
Figure 1 . Les paramètres cliniques et des lésions histologiques au cours de colite aiguë de DSS.
Les souris C57BL/6 ont été contestées avec DSS (2 % p/v) dans l’eau potable pendant 8 jours. Contrôle souris reçurent l’eau potable sans DSS. Animaux ont été euthanasiés le jour 9. Sont données d’une expérience (n = 5 par groupe) ± l’écart-type de la moyenne (SEM). (A) les changements de poids corporel sont présentés par rapport au poids initial. (B) du sang l’excrétion dans les fèces, tel que déterminé par le test sur papier gaïac (hemoccult, 0 = négatif, 4 = sang macroscopiquement). (C) Post-mortem longueur du côlon. (D) lésion histologique telle qu’évaluée par le degré de détérioration de la crypte et l’étendue de l’inflammation. Sont des images histologiques représentatives (coloration hématoxyline/éosine, grossissement : 10 x (panneau du haut), 20 x (panneau inférieur)) de colitic (panneaux de gauche) ou souris témoins (panneaux de droite). Notez la destruction profonde de l’architecture épithéliale et des infiltrats inflammatoires (pointes de flèche). Bargraphe : score de blessures. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 . Intestinale monocytes et macrophages infiltrer.
La colite DSS a été induite chez C57BL/6 par l’application du MAS (2 % p/v) dans l’eau potable. Contrôle souris ont reçu l’eau potable. Les données de n = 5 souris par groupe figurent ± SEM. (A) par immunofluorescence visualisation des infiltrations de macrophage dans la muqueuse. Sont des images représentatives des anti-F4/80 coloration chez colitic et contrôler la souris. Bargraphe : champ de puissance cell count/haut (HPF). (B) par immunofluorescence visualisation des infiltrations de neutrophiles muqueuse. Sont des images représentatives des anti-Gr-1 coloration chez les témoins et les animaux colitic. Bargraphe : cell count/HPF. (C) concentration de MPO dans les tissus du côlon chez des souris colitic et non colitic. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 . Recrutement de monocytes dans le compartiment de l’intestin.
Monocytes du sang périphérique de souris colitic ainsi que des souris témoins (n = 5 par groupe) ont été analysés par cytométrie de flux pour l’expression de Ly - 6C sur cellules CD11b positives. Les cellules ont été triés en fonction SSC et CD11b expression. Monocytes de souris ont été identifiés comme SSCfaibleCD11bélevée des cellules, et leur expression de Ly6C a été analysée. (A) proportionnelle modifie vers Ly6C inflammatoire monocytesélevés sont représentés par rapport aux conditions de l’expérience (variation en pourcentage ± SEM). (B) les parcelles de FACS dot de Ly6C expression SSClOECD11bélevée des cellules d’animaux colitic avant et après induction de colite (panneaux inférieurs) et les contrôles avant et après expérience (panneaux supérieurs). (C) splénocytes de souris colitic et non-colitic ont été évaluées pour l’expression de F4/80 par cytométrie en flux (intensité de fluorescence moyenne ± SEM). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 . Visualisation tomographique d’infiltrat macrophages murins colite.
FMT scanne chez la souris colitic et non colitic contrôles administré anticorps conjugué Cyanine7 contre F4/80 murin (n = 5 par groupe). Diagramme à barres (A) : intensité de la fluorescence totale en pmol de colorant a été déterminée dans le retour sur investissement et dépeinte ± SEM. représentant images sont affichées avec l’intensité de la fluorescence de couleur correspondant à l’étendue de l’infiltrat inflammatoire chez des souris injectées avec la sonde spécifique (anti-souris F4/80) (B) et un contrôle non spécifique (IgG de rat) (C). Dans les deux cas, un retour sur investissement de taille égale a été placé en transversale dans l’abdomen supérieur pour une analyse ultérieure. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 . Ex vivo validation de spécificité de traceur dans la colite murine.
In vivo Scans de la FMT en colitic souris injectées avec la sonde spécifique (anti-souris F4/80) ont été suivis par ex vivo analyse à fluorescence planaire des intestins explantés pour démontrer l’origine colique du signal traceur obtenu in vivo. Données provenant de deux expériences avec un total de n = 8 animaux apparaissent. Images représentatives sont affichées représentant in vivo des scans FMT de souris colitic avec code couleur fluorescence intensité correspondant à l’étendue de l’infiltrat inflammatoire (A).Imagerie de fluorescence réflectance de l’intestin explanté permet d’identifier des régions spécifiques avec une accumulation du traceur (B). Représentant- post-mortem par immunofluorescence souillant des macrophages F4/80-positif d’une telle superficie confirme les résultats in vivo (C). Le nombre d’infiltration de macrophages, tel que déterminé par immunofluorescence souillant, étaient corrélés avec in vivo mesuré l’accumulation de traceur (D). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Bien que les techniques d’imagerie médicale ont rapidement évolué ces dernières années, nous sommes encore limités dans notre capacité à détecter des processus inflammatoires ou tumeurs, ainsi que d’autres maladies, dans leurs premiers stades de développement. Cependant, c’est crucial pour la croissance tumorale compréhension, invasion, ou développement de métastases et des processus cellulaires dans le développement de troubles inflammatoires et maladies dégénératives, cardiovasculaires et immunologiques. Alors que les techniques d’imagerie traditionnelles s’appuient sur les paramètres physiques ou physiologiques, imagerie moléculaire permet la visualisation des marqueurs moléculaires spécifiques en vivo20.
Pour l’imagerie des petits animaux, les approches axées sur les radionucléides (p. ex., single-émission calculé tomographie (SPECT) et la tomographie par émission de positrons (PET)), échographie et l’imagerie véhiculée par fluorescence peuvent être utilisés pour visualiser spécifiques structures de la cible moléculaire. L’utilisation d’anticorps pleine longueur comme l’épine dorsale les traceurs plus disponible nécessite des étiquettes durables, circulation long temps et tissu lente pénétration délai le temps de l’imagerie après application de traceur. Radionucléides d’imagerie typiques ne sont donc pas appropriés pour l’imagerie in vivo de la distribution de l’anticorps. L’utilisation d’isotopes de longue durée de vie comme Cu64 ou In111 permet à traceurs à base d’anticorps, mais exige une infrastructure complexe s’étendant sur la génération de l’isotope, radioprotection avant et Pendant la procédure d’étiquetage et blindé au logement des animaux après l’application de la sonde. La variante la plus rentable et plus sûre serait être fluorescence induite par imagerie.
Plusieurs en vivo systèmes pour la détection d’imagerie, visualisation et la mesure de distribution de colorant fluorescent dans les animaux vivants ont été présentées pendant les dernières deux décennies21. La plupart des systèmes permettent l’imagerie planaire rapide approprié pour l’imagerie des lésions superficielles. Due à l’absorption de la lumière et de diffusion, de signaux profondément dans le tissu se soustraire imagerie planaire. La plus importante solution pour ce problème est la fluorescence tomographie22. Basé sur la modélisation mathématique, le signal image est corrigé pour l’absorption de diffusion et de lumière et un ensemble de données 3D virtuel est calculée à partir du dataset de multi-projection8. L’algorithme fournit des données quantitatives entièrement, ce qui permet l’estimation de la concentration du traceur en représentant des régions spécifiques de la cible concentration/expression23. Une prescription applicable de FMT est liée à la faible résolution spatiale par rapport aux techniques d’imagerie anatomiques, qui pourrait-selon la direction désirée cible-compromis la répartition de l’information moléculaire aux structures anatomiques spécifiques. Une autre limite réside dans la profondeur de pénétration restreinte de la lumière dans les tissus, qui exige l’utilisation de sondes absorbant et réagissant dans le rouge au NIR gamme spectrale23.
A récemment introduit un système d’imagerie qui combine les avantages de l’échographie morphologique et la possibilité d’obtenir des informations moléculaires de l’imagerie de fluorescence est l’imagerie opto-acoustique. Les résultats préliminaires d’études préliminaires suggèrent que, malgré un besoin pour davantage raffinement technique-opto-acoustique d’imagerie cales très prometteur pour l’imagerie moléculaire et potentielles applications translationnelle24.
Le recrutement des leucocytes à la paroi intestinale est une étape cruciale dans l’initiation et la perpétuation des MICI, comme c’est le recrutement des cellules inflammatoires au site d’infection ou d’inflammation dans les maladies auto-immune beaucoup, comme une maladie auto-immune, infection, maladies vasculaires, tumorigenèse et beaucoup plus25. Comme l’activation des monocytes et infiltration de la muqueuse intestinale est une étape essentielle dans la pathogénie de l’EIA, inhibition de l’infiltration de monocytes, orchestrée par les chémokines et interaction de molécule adhésion intégrine-cellulaire, est une thérapeutique prometteuse approcher le12,26. Surveillance des leucocytes trafic vers le site de l’inflammation est donc cruciale dans le développement de nouvelles options thérapeutiques pour visualiser les effets anti-inflammatoires des médicaments étudiés. Cela peut être d’intérêt spécial, parce que les agents ciblant traite des leucocytes ont été développés, et des anticorps anti-intégrine existent déjà pour la thérapie de l’EIA, tandis que les autres composantes sera disponibles dans le futur proche26. Vedolizumab, un anticorps monoclonal humanisé contre la sous-unité intégrine gut spécifiques α4β7 et Etrolizumab, qui se lie à la sous-unité β7 des hétérodimères intégrine αEβ7 et α4β7 intestinale, ont été approuvées27,28. Autres agents (p. ex., les MAdCAM-1 PF-00547659 et modulateurs du récepteur de sphingosine-1-phosphate (S1P) tels que Ozanimod) sont actuellement soumis à évaluation pour le traitement des MICI29,30.
Lorsque vous effectuez la FMT, modifications possibles de la technique comprennent la sélection des combinaisons différentes traceur-cible, ainsi qu’alliant FMT structural d’imagerie approches afin de compenser la faible résolution spatiale. Un large éventail de combinaisons de sonde-cible a été créé et commercialisé. Pour des projets spécifiques, l’étiquetage des anticorps personnalisés peuvent être fait en utilisant commercial étiquetage kits et le protocole décrit ci-dessus. Selon l’anticorps ou plus petit peptide choisie comme la portion de ciblage, fournisseurs commerciaux offrent un large éventail d’étiquettes différentes. Examiner le colorant désiré, selon l’application : pour deep-tissue imaging, un colorant fonctionnant dans le spectre NIR (p. ex., Cy7, λex / em 750/780 nm) peut être bien adapté, tandis que la luminosité globale et lumière efficace d’approvisionnement des colorants fonctionnant dans la gamme visible près du spectre (par exemple, les analogues de GFP) serait préférable. Pratiquement tous les colorants peuvent être obtenus comme ester actif à étiquette les lysine-résidus de protéines, ainsi qu’avec les moitiés de liaison alternative, par exemple maléimides pour la liaison de cystéine ou biotine pour le marquage des protéines équipés de balises de marquage spécifiques31 . La sélection du label ne change pas le protocole de principe, mais exige seulement de légères modifications de la procédure d’étiquetage et est importante pour un bon résultat d’imagerie. Une autre modification attrayante pour surmonter les limitations en résolution spatiale est de combiner FMT avec scanner ou IRM, ce qui permet l’annotation des structures anatomiques des informations moléculaires.Les informations structurelles peuvent soit être acquises séquentiellement comme information a priori ou simultanément, qui exige d’imagerie instrumentation32,33hybride.
Certaines étapes du protocole méritent une attention particulière. Comme cette technique peut être adaptée à une multitude de photoprobes fluorescent qui ciblent une variété de molécules spécifiques représentatifs des différents processus moléculaires, il est essentiel pour permettre la distribution suffisante des sondes et enrichissement dans la région de la cible souhaitée. Le moment idéal pour l’imagerie peut varier selon la combinaison de la sonde-cible. Par exemple, anticorps ciblant des récepteurs de la tumeur pourrait être influencé par la vitesse de diffusion de tumeurs, l’absorption et le métabolisme par le foie et les possibles effets indésirables immunogènes34. Également envisager les contrôles pertinents pour certaines méthodes d’imagerie. Traceurs spécifiques doivent toujours être validées contre isotype contrôles reflétant les effets de la perfusion et liaison non-spécifique (p. ex., liaison médiée par les récepteurs de Fc). Cible-négatif animaux peut servir comme un contrôle supplémentaire pour spécificité de traceur, si ces modèles knock-out existent. Alternativement, bloquant les expériences peut être effectuée pour prouver la spécificité des anticorps ciblés des interactions35.
Voici les étapes critiques concernant les aspects pratiques de la procédure : (1) soigneusement déterminer les concentrations de Mas utilisées, comme la susceptibilité DSS peut-être varier entre souris différente souches et d’une fabrique/lots36. (2) soigneusement sélectionner des combinaisons de sonde-cible. (3) permettre à environ 5 min de temps de numérisation pour une analyse suffisante de l’abdomen entier. Le moment optimal point entre application de traceur et la procédure d’imagerie doit être soigneusement déterminé permettant l’accumulation du traceur dans la région de la cible souhaitée. Pour la détection de F4/80 intestinale murine colite, l’anticorps marqué doit être injecté 24h avant l’analyse. (4) comme l’accumulation d’étiquette non spécifiques peut-être se produire (par exemple, dans le foie), il est crucial d’étiqueter le tissu cible approprié comme ROI en plaçant les outils de mesure respectifs. Par ailleurs, des contrôles suffisants pour distribution de traceur non spécifique devrait être inclus-considèrent non-spécifique isotype contrôles d’exclure les effets de la perfusion et masquage ou le blocage des études pour valider l’interaction traceur-cible.
Sources typiques d’erreur liés à la reconstruction de données et la procédure de numérisation comprennent une mauvaise position animale, scan champ et durée d’exposition. Lors du positionnement de l’animal, la lésion fluorescent doit être entourée de tissu sur les côtés pour minimiser le bruit de la reconstruction. Bulles d’air piégées entre l’animal et la plaque de verre à l’avant de la cassette d’imagerie pourraient également augmenter le bruit et devraient être retirés par le déplacement de l’animal un peu. Sur - ou sous-exposition de l’image peut nécessiter une analyse nouvelle acquisition avec des réglages d’exposition mis à jour le, qui se trouve dans l’écran numérisation (bloc d’image de réflectance : ajustements du temps avant LED intensité et exposition). Lors de la combinaison in vivo des mesures FMT anticorps-basée avec post-mortem des analyses histologiques, tels que l’immunohistochimie ou immunofluorescence, considérer l’utilisation d’anticorps du même clone et du format. Aussi, lorsque vous effectuez des mesures répétitives de FMT chez les mêmes animaux, le même format et les clones devraient être utilisés afin d’éviter de possibles réactions croisées ou le ciblage des épitopes différents.
Pris ensemble, tomographie moléculaire-négociée de fluorescence permet la surveillance répétitives de l’évolution de la maladie et qui sous-tendent les processus physiopathologiques. Il peut être appliqué à une pléthore d’études biomédicales et pourrait être utile pour accélérer le dépistage des drogues ou comme un point de terminaison objective en individualisé des thérapies. FMT-ciblage des macrophages F4/80-exprimant dans modèles d’inflammation fournit un précieux outil non invasif pour visualiser et quantifier l’infiltration et l’accumulation de cellules inflammatoires tout en démontrant également bonne corrélation aux classiques afficheurs.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous remercions Mme Sonja Dufentester, Mme Elke Weber et Mme Klaudia Niepagenkämper pour son aide technique.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Alfalfa-free diet | Harlan Laboritories, Madison, USA | 2014 | |
| Bepanthen eye ointment | Bayer, Leverkusen, Germany | 80469764 | |
| Dextran sulphate sodium (DSS) | TdB Consulatancy, Uppsala, Sweden | DB001 | |
| Eosin | Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany | E 4382 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany | E 9884 | |
| Florene 100V/V | Abbott, Wiesbaden, Germany | B506 | |
| Haematoxylin | Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany | HHS32-1L | |
| O.C.T. Tissue Tek compound | Sakura, Zoeterwonde, Netherlands | 4583 | fixative for histological analyses |
| Phosphate buffered saline, PBS | Lonza, Verviers, Belgium | 4629 | |
| Sodium Chloride 0,9% | Braun, Melsungen, Germany | 5/12211095/0411 | |
| Sodium bicarbonate powder | Sigma Aldrich Deisenhofen, Germany | S5761 | |
| Standard diet | Altromin, Lage, Germany | 1320 | |
| Tissue-Tek Cryomold | Sakura, Leiden, Netherlands | 4566 | |
| Hemoccult (guaiac paper test) | Beckmann Coulter, Germany | 3060 | |
| Biotin rat-anti-mouse anti-F4/80 antibody | Serotec, Oxford, UK | MCA497B | |
| Biotin rat-anti-mouse anti-GR-1 | BD Pharmingen, Heidelberg Germany | 553125 | |
| Streptavidin-Alexa546 | Molecular Probes, Darmstadt, Germany | S-11225 | excitation/emission maximum: 556/573nm |
| Anti-CD11b rat-anti-mouse antibody TC | Calteg, Burlingame, USA | R2b06 | |
| Purified anti-mouse F4/80 antibody | BioLegend, London, UK | 123102 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | D9542 | |
| FITC-conjugated anti-Ly6C rat-anti-mouse antibody | BD Pharmingen, Heidelberg, Germany | 553104 | |
| FACS buffer | BD Pharmingen, Heidelberg, Germany | 342003 | |
| Cy7 NHS Ester | GE Healthcare Europe, Freiburg, Germany | PA17104 | |
| MPO ELISA | Immundiagnostik AG, Bensheim, Germany | K 6631B | |
| Cy5.5 labeled anti-mouse F4/80 antibody | BioLegend, London, UK | 123127 | ready to use labelled Antibodies (alternative) |
| Anti-Mouse F4/80 Antigen PerCP-Cyanine5.5 | eBioscience, Waltham, USA | 45-4801-80 | ready to use labelled Antibodies (alternative) |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | 67-68-5 | |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | 792632 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | 64-17-5 | |
| Bovine Serum Albumins (BSA) | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | A4612 | |
| Tris Buffered Saline Solution (TBS) | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | SRE0032 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| FACS Calibur Flow Cytometry System | BD Biosciences GmbH, Heidelberg, Germany | ||
| FMT 2000 In Vivo Imaging System | PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA | FMT2000 | |
| True Quant 3.1 Imaging Analysis Software | PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA | included in FMT2000 | |
| Leica DMLB Fluorescent Microscope | Leica, 35578 Wetzlar, Germany | DMLB | |
| Bandelin Sonopuls HD 2070 | Bandelin, 12207 Berlin, Germany | HD 2070 | ultrasonic homogenizer |
| Disposable scalpel No 10 | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | Z692395-10EA | |
| Metzenbaum scissors 14cm | Ehrhardt Medizinprodukte GmbH, Geislingen, Germany | 22398330 | |
| luer lock syringe 5ml | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | Z248010 | |
| syringe needles | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | Z192368 | |
| Falcon Tube 50ml | BD Biosciences, Erembodegem, Belgium | 352070 |
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