Summary
Sondas de destino-específicos representam uma ferramenta inovadora para a análise de mecanismos moleculares, tais como a expressão da proteína em vários tipos de doença (por exemplo, inflamação, infecção e tumorigênese). Neste estudo, descrevemos uma avaliação tomográfica tridimensional quantitativa da infiltração de macrófagos intestinal em um modelo murino de colite usando tomografia computadorizada mediada por fluorescência de F4/80-específicos.
Abstract
Murino modelos da doença são indispensáveis para a investigação científica. No entanto, muitas ferramentas de diagnóstico como endoscopia ou imagem latente tomográfica não são rotineiramente empregadas em modelos animais. Leituras de experimentais convencionais muitas vezes dependem de análises post-mortem e ex vivo , que evitar exames de acompanhamento intra individuais e aumentam o número de animais de estudo necessário. Tomografia computadorizada mediada por fluorescência permite a avaliação não-invasiva, repetitiva, quantitativa, tridimensional de sondas fluorescentes. É altamente sensível e permite o uso de fabricantes moleculares, que permite a detecção específica e caracterização de alvos moleculares distintas. Em particular, sondas específicas representam uma ferramenta inovadora para a análise de expressão gênica de ativação e proteína na inflamação, doença auto-imune, infecção, doença vascular, migração celular, tumorigênese, etc. Neste artigo, nós fornecemos instruções passo a passo sobre essa tecnologia de imagem sofisticada para na vivo detecção e caracterização de inflamação (i.e., infiltração de macrófagos F4/80-positivo) em um modelo murino amplamente utilizado de inflamação intestinal. Esta técnica também pode ser usada em outras áreas de pesquisa, como o acompanhamento imune de célula ou células-tronco.
Introduction
Modelos animais são amplamente utilizados em investigação científica, e muitos procedimentos invasivos existem a atividade da doença de monitor e vitalidade, como a quantificação de alterações de peso do corpo ou a análise de sangue, urina e fezes. No entanto, estes são apenas os parâmetros indiretos substituto que também estão sujeitas a variabilidade inter-individual. Eles frequentemente devem ser complementados por análises post-mortem de amostra de tecido, que impede a observação serial em pontos de tempo repetitivo e direcionar a observação dos fisiológicos ou patológicos processa em vivo. Sofisticadas técnicas de imagem pequeno-animal surgiram, incluindo Cruz secional de imagem, imagem óptica e endoscopia, que permite a visualização directa destes processos e também permite análises repetitivas do mesmo animais1 , 2 , 3. Além disso, a possibilidade de monitorizar repetidamente vários Estados de doença no mesmo animal pode diminuir o número de animais necessários, que podem ser desejáveis do ponto de vista ética animal.
Várias técnicas de imagem ópticas diferentes existem para imagens de fluorescência na vivo . Originalmente, a imagem latente confocal foi empregado para estudar a superfície e subsuperfície eventos fluorescente4,5. Recentemente, entretanto, tomográficos sistemas que permitem avaliações quantitativas de tecido tridimensional foram desenvolvidos6. Isso foi feito através do desenvolvimento de sondas fluorescentes que emitem luz no espectro infravermelho próximo (NIR), oferecendo baixa absorção, detectores sensíveis e fontes de luz monocromática7. Enquanto técnicas de imagem cross-sectioning tradicionais, tais como a tomografia computadorizada (CT), ressonância magnética (MRI) ou ultra-som (US), dependem principalmente de parâmetros físicos e visualizar a morfologia, imagem latente ótica pode fornecer informações adicionais em processos moleculares subjacentes usar fluorescente endógena ou exógena sondas8.
Avanços na biologia molecular têm contribuído para facilitar a geração de inteligentes e alvo fluorescentes sondas moleculares para um número crescente de destinos. Por exemplo, absorção mediada e distribuição em uma área-alvo determinado podem ser visualizadas usando carbocyanine derivado-etiquetado anticorpos9. A abundância de anticorpos disponíveis, que podem ser rotulados para funcionar como marcadores específicos em áreas inacessíveis do corpo, fornece insights sem precedentes nos processos moleculares e celulares em modelos de tumorigênese e neurodegenerativas, doenças cardiovasculares, imunológicas e inflamatórias7.
Neste estudo, descrevemos o uso de tomografia computadorizada mediada por fluorescência em um modelo murino de colite. Sulfato de dextrano de sódio (DSS)-colite induzida é um modelo padrão de rato quimicamente induzida de inflamação intestinal que se assemelha a inflamatória intestinal (IBD) de doença10. É particularmente útil avaliar a contribuição do sistema imunológico inato para o desenvolvimento do intestino inflamação11. Desde o recrutamento, ativação e infiltração de monócitos e macrófagos representam passos cruciais na patogênese da IBD, visualização de seu recrutamento e cinética de infiltração são essenciais para o monitoramento, por exemplo, o efeito de potenciais substâncias terapêuticas em uma configuração pré-clínicos12. Descrevemos a indução de colite DSS e demonstrar a caracterização mediada por tomografia computadorizada da infiltração de macrófagos da mucosa do intestino utilizando tomografia computadorizada molecular de fluorescência para a visualização específica do marcador de monócitos/macrófagos F4/80 13. Além disso, podemos ilustrar procedimentos auxiliares e complementares, tais como anticorpos rotulagem; a instalação experimental; e análise e interpretação das imagens obtidas, em correlação com as leituras convencionais, tais como índices de atividade de doença, fluem cytometry e análise histológica e imunohistoquímica. Podemos discutir as limitações desta técnica e comparações com outras modalidades de imagem.
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Protocol
Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo turismo für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz (LANUV) Nordrhein-Westfalen, de acordo com a lei alemã de proteção Animal (Tierschutzgesetz).
1. materiais e instalação Experimental
- Cuidados com animais.
- Use ratos combinados por sexo e idade de qualquer estirpe DSS-sensíveis (por exemplo, C57BL/6) em 20-25 g de peso corporal.
- Plano de pelo menos cinco ou mais ratos por grupo experimental e casa os ratos de acordo com as orientações de cuidados de animais locais.
- Fornece um padrão chow roedor dieta e autoclavadas bebendo água ad libitum.
- Remover o chow padrão e substituí-lo com chow alfafa-livre pelo menos três dias antes da digitalização para reduzir endoluminal autofluorescência.
- Indução de colite aguda induzida em DSS.
- Dissolver 2 g de DSS (peso molecular ~ 40.000 Da) em 100 mL de água esterilizada para obter um 2% (solução p/v).
- Encher o fornecimento de bebida dos ratos exclusivamente com a solução DSS e estimar 5 mL de líquido por rato por dia. Fornece a mesma água potável sem DSS para o controle de ratos10.
Nota: Monitore os ratos diariamente até o final do experimento. Eutanásia nos ratos que perder maior que 20% do seu peso corporal inicial, ou que se tornam moribundo (i.e., persistentemente debruçado postura, diminuição dos movimentos, marcadamente com dificuldade de respiração, erectos casaco) de acordo com directrizes aplicáveis locais no animal bem-estar.
- Preparação do tomography mediada por fluorescência.
- Rotular o anticorpo desejado (por exemplo, rato anti-rato F4/80) com tintura de fluorescência (por exemplo, Cyanine7, λexcitação: 750 nm, λemissão: 776 nm) conforme descrito no protocolo do fabricante. Dialize anticorpo purificado em uma membrana de diálise adequada (tamanho de poros < 50-100 kDa) contra 1 L de cloreto de sódio 0,15 M pelo menos 2 h ou durante a noite.
- Transferir o anticorpo para 1 L de 0,1 M NaHCO3 e urinar pelo menos 2 h.
- Dissolver a quantidade necessária de corante fluorescente em dimetilsulfóxido (DMSO) (10,8 µ l/mg do anticorpo) e adicioná-lo para a solução de anticorpo. Use o corante fluorescente em 20-fold excesso molar para atingir uma taxa de tintura-para-proteína de 1:3.
- Incubar no escuro a 4 ° C por 1 h. Retire o anticorpo não-marcado pela diálise contra 1 L de sódio 0,15 M, ou usando uma coluna do desalting PD-10 e resolver em tampão fosfato salino (PBS) para aplicação em vivo .
- Determine a concentração de anticorpo final e relação de rotulagem por espectrofotometria.
- Medir a concentração de proteína em uma absorção de 250-330 nm e considerar absorção adicional pelo corante. Corrigir a absorção máxima em 280 nm (proteína), 11% da absorção máxima em 750 nm (próximo passo) para a rotulagem de Cyanine7.
- Medir uma diluição do composto (geralmente 01:10) 250-800 nm e extrair a concentração de Cyanine7 a 750 nm.
- Determinar a proporção de corante-para-proteína como: tintura/anticorpo = absorção máxima em 750 nm / 200.000 / (absorção máxima em 280 nm - 0,11 x absorção máxima em 750 nm) / 170.000.
- Manter a solução de anticorpo a 4 ° C e protegido da luz, para evitar o branqueamento antes da injeção.
- Carrega o volume de solução de anticorpos necessários em uma seringa estéril imediatamente antes da injeção e escudo de luz até que ele é usado.
- Determine o momento ideal de injeção de sonda e o procedimento de digitalização, dependendo da farmacocinética de traçador.
- Anestesiar os ratos utilizando isoflurano 1,5-2,5% inalado em oxigênio ou colocá-los de forma segura em uma retenção dedicada para a injeção de veia de cauda dos anticorpos etiquetados.
- Para anticorpos completos, injete o anticorpo marcado pelo menos 24 h antes da digitalização, tais como visualização de macrófago F4/80 anti-rato na colite murino. Injectar ratos por via intravenosa (IV) através da cauda da veia com anticorpo marcado em montante correspondente a 2,0 nmol de corante.
- Uso igualmente rotulado anticorpos inespecíficos (por exemplo, rato IgG ou outro isotipo correspondente à herança do anticorpo primário) como um isotipo controle em doses equivalentes da sonda específica.
Nota: Os resultados in vivo scans após injeção do controle composto pode servir como uma referência para a interpretação da sonda específica dados de imagem. - Use um barbeador elétrico para depilar o pelo de animal na região abdominal para minimizar a reflexão da luz e absorção.
- Rotular o anticorpo desejado (por exemplo, rato anti-rato F4/80) com tintura de fluorescência (por exemplo, Cyanine7, λexcitação: 750 nm, λemissão: 776 nm) conforme descrito no protocolo do fabricante. Dialize anticorpo purificado em uma membrana de diálise adequada (tamanho de poros < 50-100 kDa) contra 1 L de cloreto de sódio 0,15 M pelo menos 2 h ou durante a noite.
2. técnico equipamentos
- Use um dispositivo de tomografia computadorizada mediada por fluorescência veterinária (FMT) do pequeno animal fluorescência ( Figura 4).
- Criar um novo estudo para cada projeto, clicando em "novo estudo" botão e incluir na descrição do estudo, os marcadores pertinentes, incluindo os parâmetros de imagem e doses para referência futura.
- Dentro deste estudo, criar grupos de estudo, de acordo com o respectivo estudo de projeto (por exemplo, para o tracer específico e inespecíficos do isotipo controle), clicando em "novo grupo de estudos" botão. Equipe cada grupo de estudo com o respectivo número de animais.
- Calibre o sistema para as construções de traçador.
- Execute a calibração para cada lote de traçadores para normalizar para a variação na rotulagem e permitir a medição quantitativa de dados da OI.
- Siga a orientação do fabricante instrumento para a calibração de cada sistema individual; a selecção de "Adicionar novo tracer", o sistema dará um guia através dos passos. Fornece a diluição da solução anticorpo aplicada e a concentração absoluta calculada do tracer a sonda.
- Para FMT, use um tecido-imitando fantasma de características definidas de espessura e absorção (lembrando tecido vital) e preenchê-lo com um volume específico de solução anticorpo utilizado. Esta medida no dispositivo FMT.
Nota: O sistema usará a medição de referência da sonda fornecida, juntamente com a concentração determinada, para calcular as concentrações do marcador absoluto de medições futuras na vivo .
- Use uma gaveta de exame Aquecível com uma temperatura de 42 ° C.
Nota: Isso impede que os ratos se tornando hipotérmico durante o exame.
3. animal anestesia
- Usar um fluxo contínuo de 1,5-2% vol % de isoflurano ([2-chloro-2-(difluoromethoxy)-1,1,1-trifluoro-ethane]) e 1,5 L de O2/min para anestesiar os ratos.
4. tomografia computadorizada mediada por fluorescência Scan
Nota: Adaptar os seguintes detalhes, que são específicos para o sistema FMT utilizado neste estudo (ver a Tabela de materiais) para dispositivos de imagem de reflectância de fluorescência alternativos ou sistemas FMT, conforme necessário.
- Coloque o mouse anestesiado em suas costas na gaveta exame.
- Execute o procedimento de digitalização.
- Introduza a fita do sistema da imagem latente e fechá-lo imediatamente para garantir anestesia contínua. Selecione a amostra adequada do grupo de estudo criado anteriormente. Selecione o traçador administrado no menu suspenso para garantir que os valores de concentração de traçador são calculados corretamente.
- Adquirir a imagem de reflectância de fluorescência no comprimento de onda adequado (720 nm para Cyanine7) para o planejamento de varredura e contorno do campo de varredura clicando no botão "obter imagens".
- Verá que o campo de verificação aparece como uma sobreposição na imagem de reflectância de fluorescência. Ajustá-lo para a região de interesse (por exemplo, dois-pontos ou abdômen), evitando o ar ou áreas de pele restante. Dependendo do destino da imagem, defina o número de imagem pontos de dados dentro do campo de varredura escolhendo o grosseiro para a resolução de digitalização-campo média e fina no menu à direita.
Nota: Tenha em mente que um campo de varredura bem pode oferecer melhor resolução espacial, à custa de uma digitalização significativamente mais tempo. - Iniciar a aquisição de dados/imagens no comprimento de onda selecionado clicando em "verificar".
Nota: O tempo de verificação para uma varredura de médio-fino do abdômen inteiro será em torno de 5 min; nesta época, cada ponto de dados separadamente é iluminado pelo laser da excitação, e a fluorescência resultante é gravada. - Retire a gaveta de imagem no final da varredura do animal e permitir que o animal se recuperar completamente antes de colocá-lo de volta para a jaula.
- Repita a FMT, se consideradas necessárias em vários pontos de tempo durante o experimento (e.g., dias, 0, 5 e 9-10 (final do experimento)), mas considerar a acumulação de anticorpo no organismo, aumentando assim o sinal de fluorescência do fundo.
5. pós-scan
- Coloque o mouse em uma gaiola separada em uma toalha de papel sob uma lâmpada de aquecimento infravermelha e monitorar o mouse para sinais de desconforto ou sofrimento até recuperação completa. Coloque o mouse volta para seu respectiva jaula quando totalmente acordado.
- Eutanásia o ratos no final do experimento pela entrega de CO2 para o isolador na dose de 100% (v/v), 100% vol e 3 L/min. Não pre-encha a câmara com CO2, como uma súbita exposição a altas concentrações de CO2 pode causar desconforto. Verificar a morte depois que o mouse parou de respirar por um modo secundário subsequente de eutanásia como rápido deslocamento cervical.
- Explantes de cólon por laparotomia abdominal e realizar uma varredura ex vivo do cólon explantado, conforme explicado nas etapas 4.2.1 - 4.2.4. Abra cada cólon longitudinalmente usando a tesoura de Metzenbaum cirúrgica e enxaguar com solução salina antes de prepará-lo para posterior análise.
- Use um bisturi para cortar um fragmento de 0,5 cm do cólon distal e imediatamente colocá-lo em um tubo de 1,5 mL criogênico. Congelá-lo em nitrogênio líquido e loja a-70 ° C até nova utilização (por exemplo,mieloperoxidase (MPO) medições).
- Use uma vara de madeira e arregaçar o restante longitudinalmente abriu dois pontos da distal à extremidade proximal, para o exterior a mucosa ("técnica de rocambole"), para análise histológica. Coloque a preparação em um fixador (consulte a Tabela de materiais) e congelar a-80 ° C14.
6. interpretação e reconstrução de dados
- Use a ferramenta de reconstrução do respectivo software de imagem para criar mapas 3D da distribuição da fluorescência a partir dos dados de imagem raw; exames são automaticamente adicionadas à ferramenta de reconstrução, quando, após a digitalização, a função "adicionar à fila de reconstrução" está selecionada.
- Caso contrário, selecione os exames no menu suspenso sob o respectivo estudo e grupo de estudo, a verificação com o botão direito e selecione "Adicionar para reconstrução."
- Para posterior análise, carrega um conjunto de dados para o software de análise. No menu suspenso na barra superior, selecione o respectivo estudo e, em seguida, selecione o grupo de estudo e cada animal no menu à direita; todos os exames realizados para este animal serão mostrados. Selecione a verificação correta e clique em "carregar".
Nota: A reconstrução 3D da distribuição do traçador aparecerá à esquerda como uma sobreposição da imagem de reflectância de fluorescência inicialmente adquirida. O modelo pode ser girado e ampliado para análise mais fácil. - Identificar os focos de acúmulo de rótulo inespecíficos (por exemplo, fígado ou a urina da bexiga) em mapas 3D reconstruídos e diferenciar os tecidos-alvo (por exemplo, do intestino ou intestino).
- Na barra superior, selecione a forma ROI mais adequada para o destino. Etiqueta tecido-alvo como regiões de interesse (ROI), colocando as respectivas ferramentas de medição do software de análise; o software irá fornecer uma intensidade de fluorescência para o ROI, bem como (pico-) quantidades molares do traçador que foi calibrada para a digitalização.
- Selecione a quantidade total de traçador no ROI adequado, normalizado para o tamanho ROI, como o equivalente mais adequado para a avaliação da atividade da doença em correlação com o infiltrado inflamatório (histologia).
Nota: Outras características do ROI podem ser escolhidas, se apropriado, como representante do modelo específico.
7.Ex Vivo Análises
- Hematoxilina e eosina mancha e mancha da imunofluorescência.
- Deparaffinize de seções, colocando-os em 70% etanol (EtOH) por 2 min; Enxágue com água destilada depois. Manchar com solução de hematoxilina por 5 min e posteriormente enxaguar com água morna da torneira por 10 min.
- Enxágue com água destilada, corante de contraste com solução de eosina por 2 min e lave novamente com água destilada.
- Lugar em 70% EtOH, 96% EtOH, 99% EtOH e xileno (2 vezes), por 2 min cada para desidratar e limpar as seções. Montar com meio de montagem resinoso.
- Mancha da imunofluorescência.
- Use os anteriormente obtidos cortes histologicos ("rocambole") para a mancha da imunofluorescência e preparar seções cryo-corte de 7 µm.
- Bloquear secções de cólon acetona-fixos e congelados no soro de rato de 5,0% por 10 min e incubar durante uma noite com diluído (1/500 v/v) rato primário anti-rato F4/80 biotinilado. Lave as seções três vezes em tampão salino Tris (TBS) e incube com Streptavidin-FITC (1: 100 v/v) em PBS/BSA (0,1% w/v) durante a noite a 4 ° C.
- Lave as seções em TBS e mancha com 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 1: 1000 v/v) para alcançar o contraste. Analisar as imagens de fluorescência sob um microscópio confocal (consulte a Tabela de materiais; ampliação de x 40; cubo filtro N2.1 com filtro de excitação 515-560) e contar as células F4/80-positivo por campo de alta potência.
Nota: Considere o uso de anticorpos do mesmo clone e formato ao combinar na vivo FMT e post-mortem histologia de análise como a imuno-histoquímica ou mancha da imunofluorescência, dependendo o alvo pretendido. Para a detecção de F4/80-positivo macrófagos na vivo e ex vivo, foram utilizados diferentes formatos.
- Medições de MPO em amostras de cólon.
- Uso recentemente obtidos, amostras de cólon PBS-lavado ou amostras descongeladas para medições de MPO. Pesar todas as amostras e homogeneizar o tecido em tampão de Lise fornecido no ELISA kit (veja a Tabela de materiais) em um volume de 20 µ l de tampão de Lise por mg de tecido.
- Proceda à sonicação durante 15 s (frequência sonication: 20 kHz, potência: 70 W) e centrifugar as amostras durante 10 minutos a 200 x g e 4 ° C.
- Uso um ELISA comercialmente disponível kit (veja a Tabela de materiais) de acordo com a descrição de fabrica. Efectuar o ensaio em duplicatas.
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Representative Results
Avaliação da colite:
Colite induzida por DSS é um modelo murino quimicamente induzido de inflamação intestinal que se assemelha a humana IBD e leva à perda de peso, sangramento retal, ulceração superficial e danos na mucosa em camundongos suscetíveis15. É particularmente útil estudar a contribuição do sistema imunológico inato para o desenvolvimento da inflamação intestinal10,11. Para induzir potente inflamação colitic, camundongos foram continuamente administrada DSS durante todo o experimento. Diminuição de peso corporal e sangue occult fecal foram usados como índices clínicos de inflamação. Como mostrado na figura 1A, ratos começaram a perder peso inicial no quarto dia após a indução da colite, Considerando que o controle de animais recebendo água sozinho não mostraram nenhuma mudança significativa no peso corporal. Além disso, colitic animais mostraram aumento da excreção de sangue oculto com fezes (figura 1B), avaliada usando o hemoccult seguinte sistema de Pontuação: 0 (sem sangue), 1 (hemoccult positivo), 2 (hemoccult positiva e visual da pelota sangramento) e 4 ( bruta, sangramento, sangue em torno do ânus)16. Comprimento do cólon foi medido para avaliar o encurtamento do cólon induzida por inflamação, revelando dois-pontos significativamente encurtados em ratos colitic em comparação com ratos controle recebendo água sozinho (Figura 1). Para avaliar directamente danos do cólon, a análise histológica foi realizada no final do experimento. Uma avaliação quantitativa do dano histológico foi realizada na H do cólon & seções manchadas E usando um núcleo geral de lesão baseiam o grau e a extensão da inflamação, danos de cripta e participação percentual17. Colitic ratos mostraram sinais de inflamação grave, enquanto ratos controle recebendo DSS não mostraram nenhum dano histológico (Figura 1). As imagens demonstram alterações inflamatórias características na colite induzida por DSS, caracterizada pela destruição da arquitetura epitelial, com a perda de células de goblet, danos de cripta e ulceração da mucosa, em oposição a em grande parte preservada da mucosa arquitetura no controle de ratos18. Diferenças estatísticas entre os grupos (n = 5 por grupo) foram calculados por análise de variância (ANOVA), seguido por Student-Newman-Keuls (S.N.K.) post hoc teste ou pelo teste de Welch, seguido pelo teste post hoc de jogos-Howell em caso de homogeneidade de variância significativa. Um p-valor de < 0,05 foi considerado significativo.
Avaliação de monócitos e macrófagos recrutamento:
Como colite induzida por DSS é associado com a infiltração de células do sistema imunológico, como monócitos e macrófagos, para a mucosa e submucosa do cólon, usamos coloração imunofluorescente para o marcador de monócitos/macrófagos F4/80 para quantificar o infiltrado. Colitic ratos recebendo DSS mostraram significativamente elevados números de monócitos, infiltrando-se na parede do cólon em comparação com ratos do controle não-colitic (Figura 2A). Infiltração leucocitária Adicionalmente foi quantificada utilizando coloração imunofluorescente para o marcador de neutrófilos GR1, revelando a imigração aumentou significativamente de neutrófilos para o cólon inflamado em comparação com ratos controle (Figura 2B). Para confirmar, MPO refletindo ambos os neutrófilos atividade inflamatória e número de níveis foram significativamente elevados no tecido do cólon de ratos colitic (Figura 2). ANOVA e teste post hoc S.N.K. foram usados para calcular a significância estatística entre os grupos (n = 5 por grupo). Significância estatística foi fixada em p < 0,05.
Mudanças sistémicas no macrófago subpopulação:
Os monócitos mouse englobam um grupo heterogêneo de subpopulações distintas que diferem em estado de maturação e sua capacidade de ser recrutado para sites inflamatórias, onde eles participam iniciar e perpetuar a resposta inflamatória19 . Portanto, nós caracterizado os monócitos do sangue, analisando a expressão diferencial de CD11b e Ly6C usando citometria de fluxo. Nas condições inflamatórias de colite aguda do DSS, observamos um aumento significativo no inflamatórios monócitos CD11balta altaLy6C em comparação com a pré-experiência de condições. Em contraste, essa mudança não ocorreu em ratos de controle não-colitic sem DSS (Figura 3A). Os dados (n = 5 por grupo) foram analisados utilizando ANOVA e S.N.K. Como um parâmetro adicional substituto para a inflamação sistêmica, avaliamos a presença de células F4/80-positivo no baço de ratos colitic comparados aos controles não-colitic, que revelou um aumento significativo nos ratos tratados com DSS (Figura 3).
Tomografia computadorizada mediada por fluorescência Scan:
Usamos a tomografia computadorizada mediada por fluorescência para medir o recrutamento de monócitos/macrófagos e infiltração da mucosa do intestino. Um fluorescência-etiquetada anticorpo contra murino F4/80 foi contratado para visualizar diretamente macrófagos ativados em animais vivos. Anticorpos de IgG de rato rotulado, inespecíficos foram usados como o isotipo controle. Para a digitalização, ratos foram raspou na região abdominal para minimizar a reflexão da luz pela pele, anestesiados pelo fornecimento contínuo de isoflurano e examinados em um dispositivo FMT veterinário para pequenos animais fluorescência. Como indicado na Figura 4A, a indução de colite levado a uma acumulação significativamente elevada de marcador fluorescente nos dois pontos de colitic ratos em comparação com controles não-colitic, indicando um aumento da infiltração de monócitos e diferenciação em ativos macrófagos nos animais colitic. A aplicação de um IgG de fluorescência-etiquetada inespecíficos não eliciar uma resposta de fluorescência detectável no abdômen e intestino, nem o colitic (DSS) nem o grupo não colitic (água), demonstrando a especificidade do teste-alvo interação do anticorpo F4/80 (Figura 4A). São mostradas imagens representativas da região abdominal. O código de cores indica o nível de intensidade de fluorescência, que corresponde à extensão do infiltrado inflamatório(Figura 4B e 4C).Ex vivo medições de acumulação de traçador F4/80-dirigido em cólons explantados verificada a origem Colônica na vivo detectado sinal de acúmulo de traçador F4/80 (Figura 5A e 5B). Quantidades calculadas de anticorpo ligado bem correlacionaram (R2 = 0,52) com histologicamente determinados números de infiltração de macrófagos (Figura 5 e 5D), confirmar essa imagem na vivo com marcadores específicos pode ser indicativo de atividade da doença local. Os dados foram analisados pelo teste post hoc ANOVA e S.N.K. com um nível de significância estatístico definida em p < 0,05. A correlação foi calculada como regressão linear.
Figura 1 . Parâmetros clínicos e lesões histológicas no decorrer da colite aguda do DSS.
Camundongos C57Bl/6 foram desafiados com DSS (2% p/v) em água potável por 8 dias. Controle de ratos receberam água potável sem DSS. Os animais foram sacrificados no dia 9. São mostrados dados de um experimento (n = 5 por grupo) ± erro padrão da média (SEM). (A) alterações no peso corporal são apresentadas em relação ao peso inicial. (B) a excreção nas fezes, de sangue, conforme determinado pelo teste de papel guaiac (hemoccult, 0 = negativo, 4 = sangue macroscopicamente). (C) Post-mortem comprimento de cólon. (D) lesão histológica como avaliados pelo grau de dano da cripta e a extensão da inflamação. São mostradas imagens histológicas representante (coloração de hematoxilina/eosina; ampliações: 10 x (painel superior), 20 x (painel inferior)) de colitic (painéis esquerdos) ou ratos controle (painéis de direito). Observe a profunda destruição da arquitetura epitelial e infiltrados inflamatórios (setas). Gráfico de barras: escore de lesão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 . Intestinais monócitos e macrófagos infiltrar-se.
Colite DSS foi induzida em C57BL/6, pela aplicação do DSS (2% p/v) em água potável. Controle de ratos receberam água potável sozinha. Os dados de n = 5 ratos por grupo são mostrados ± SEM. (A) visualização imunofluorescência de infiltrações de macrófagos na mucosa. São mostradas imagens representativas de anti-F4/80 coloração em colitic e controle de ratos. Gráfico de barras: campo de força célula contagem/alta (HPF). (B) visualização imunofluorescência de neutrófilos infiltrações de mucosa. São mostradas imagens representativas de anti-Gr-1 coloração em controles e colitic animais. Gráfico de barras: célula contagem/HPF. (C) concentração de MPO no tecido do cólon de ratos não-colitic e colitic. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 . Recrutamento de monócitos para o compartimento intestinal.
Os monócitos do sangue periférico de ratos colitic, bem como controle de ratos (n = 5 por grupo) foram analisados por citometria de fluxo para a expressão de Ly - 6C em células de CD11b-positivo. As células foram classificadas com base na expressão de SSC e CD11b. Os monócitos mouse foram identificados como SSCbaixaCD11balta as células, e sua expressão Ly6C foi analisado. Proporcional (A) muda para Ly6C inflamatório monócitoselevados são descritos em relação ao pré-experimento condições (% alterar ± SEM). (B) lotes FACS do ponto de Ly6C expressão na licençaaiCD11balta células de animais colitic antes e após a indução de colite (painéis inferiores) e controles pré e pós-experiência (painéis superiores). (C) Splenocytes de ratos não-colitic e colitic foram avaliados para a expressão de F4/80 por citometria de fluxo (fluorescência de média intensidade ± SEM). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 . Visualização tomográfica de infiltrado de macrófagos na colite murino.
FMT varreduras em camundongos colitic e não colitic controles administrado anticorpo conjugado Cyanine7 contra murino F4/80 (n = 5 por grupo). Gráfico de barras (A) : intensidade de fluorescência total em pmol de corante foi determinada no ROI e retratados ± SEM. representante imagens são mostradas com intensidade de fluorescência com códigos de cores, correspondente à extensão de infiltrado inflamatório em ratos injetados com a ponta de prova específica (anti-rato F4/80) um controle inespecíficos (rat IgG) e (B) (C). Em ambos os casos, um ROI de igual tamanho foi colocado transversal no abdômen superior para posterior análise. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 . Ex vivo validação da especificidade do marcador na colite murino.
Na vivo FMT scans em colitic ratos injetados com a ponta de prova específica (anti-rato F4/80) foram seguidos por ex vivo scans de fluorescência planar de intestinos explantados para demonstrar a origem do cólon do traçador sinal obtido in vivo. Dados de dois experimentos com um total de n = 8 animais são mostrados. Imagens representativas são mostradas retratando na vivo scans FMT de ratos colitic com fluorescência Color-coded intensidade correspondente à extensão de infiltrado inflamatório (A).Imagem de reflectância da fluorescência do intestino explantado permite a identificação de regiões específicas com acumulação de rastreamento (B). Representante- post-mortem imunofluorescência para macrófagos F4/80-positivo de tais áreas de coloração confirma os resultados na vivo (C). O número de macrófagos, infiltrando-se conforme determinado pela mancha da imunofluorescência, foram correlacionados com acúmulo de traçador no vivo medido (D). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Apesar de técnicas de imagem médicas têm evoluído rapidamente nos últimos anos, nós ainda somos limitados em nossa capacidade de detectar processos inflamatórios ou tumores, bem como outras doenças, em seus primeiros estágios de desenvolvimento. No entanto, isso é crucial para o crescimento do tumor de compreensão, invasão, ou desenvolvimento de metástases e processos celulares no desenvolvimento de doenças inflamatórias e doenças degenerativas, cardiovasculares e imunológicas. Enquanto as técnicas tradicionais de imagem dependem de parâmetros fisiológicos ou físicos, imagem molecular permite a visualização de marcadores moleculares específicos na vivo20.
Para a imagem latente de pequenos animais, abordagens orientado por radionuclídeos (emissão de ingle-fóton, por exemplo, scalculado a tomografia computadorizada (SPECT) e tomografia por emissão de pósitrons (PET)), ultrasom e imagem mediada por fluorescência podem ser usados para visualizar específicas estruturas de alvo molecular. A utilização de anticorpos completos como o backbone de rastreamento mais disponível exige rótulos de longa duração, como longa circulação vezes e demora de penetração de tecido lento o tempo de imagem após a aplicação do traçador. Radionuclidos de imagem típicos, portanto, não são adequados para a imagem no vivo da distribuição de anticorpo. O uso de isótopos de vida longa, como Cu64 ou In111 permite marcadores baseados em anticorpos mas exige uma infra-estrutura complexa, abrangendo geração isótopo, segurança da radiação antes e durante o processo de rotulagem e protegeu o alojamento dos animais após a aplicação da sonda. A variante mais rentável e mais segura seria ser fluorescência mediada por imagens.
Várias em vivo sistemas para a deteção de imagens, visualização e medição da distribuição de tintura fluorescente em animais vivos foram apresentadas durante as duas décadas passadas21. A maioria dos sistemas permitem rápida imagem planar apropriada para a imagem latente de lesão superficial. Devido à absorção de luz e dispersão, sinais profundamente no tecido evadir imagem planar. A mais proeminente solução para este problema é de tomografia computadorizada de fluorescência22. Baseado em modelagem matemática, o sinal de imagem é corrigido para absorção de espalhamento e luz e um conjunto de dados 3D virtual é calculado a partir do dataset de multi projeção8. O algoritmo fornece dados quantitativos totalmente, permitindo a estimativa da concentração de traçador no representante de regiões específicas da concentração/expressão alvo23. Uma limitação relevante de FMT está relacionada à resolução espacial pobre em comparação com técnicas de imagem anatômicas, que pode, dependendo o desejado destino inflexível a alocação da informação molecular de estruturas anatômicas específicas. Outra limitação reside na profundidade da penetração restrita de luz no tecido, o que requer o uso de sondas, absorvendo e fluoresce no vermelho para NIR faixa espectral23.
Uma modalidade de imagem recentemente introduzida que combina as vantagens do ultra-som morfológico e a possibilidade de obtenção de informação molecular da imagem latente da fluorescência é imagem latente optoacoustic. Os resultados preliminares de estudos iniciais sugerem que, apesar de uma necessidade de mais refinamento técnico-optoacoustic imagem detém grande promessa para imagiologia molecular e potenciais aplicações translacional24.
O recrutamento de leucócitos para a parede intestinal é um passo crucial na iniciação e na perpetuação do IBD, como é o recrutamento de células inflamatórias para o local de infecção ou inflamação na doença imune-mediada muitos, tais como doença auto-imune, infecção, doença vascular, tumorigênese e muitos mais25. Como a ativação de monócitos e infiltração na mucosa intestinal é um passo essencial na patogênese da IBD, inibição da infiltração de monócitos, orquestrada por quimiocinas e interação de molécula de adesão celular-integrina, é uma promissora terapêutica abordagem de12,26. Portanto, monitoramento de leucócitos tráfico ao site da inflamação é crucial no desenvolvimento de novas opções terapêuticas para visualizar os efeitos anti-inflamatórios das drogas estudadas. Isto pode ser de especial interesse porque agentes visando tráfico de leucócitos foram desenvolvidas, e alguns anticorpos anti-integrina já estão disponíveis para a terapia do IBD, enquanto componentes adicionais estarão disponíveis no futuro próximo26. Vedolizumab, um anticorpo monoclonal humanizado contra a subunidade de integrina α4β7 específicas do intestino e Etrolizumab, que liga o subunit β7 do α4β7 intestinal e heterodímeros de integrina αEβ7, foram aprovados27,28. Outros agentes (por exemplo, o PF MAdCAM-1-00547659 e moduladores de receptores esfingosina-1-fosfato (S1P) tais como Ozanimod) são actualmente objecto de avaliação para o tratamento da DII29,30.
Ao executar o FMT, possíveis modificações da técnica incluem a seleção de combinações traçador-alvo diferentes, assim como a combinação FMT com estrutural abordagens para compensar a pobre resolução espacial de imagem. Uma grande variedade de combinações de sonda-alvo tem sido estabelecida e comercializada. Para projetos específicos, a rotulagem dos anticorpos personalizados podem ser feito usando comercial rotulagem kits e o protocolo acima descritas. Dependendo do anticorpo ou menor peptídeo escolhido como o grupo alvo, fornecedores comerciais oferecem uma grande variedade de rótulos diferentes. Considere a tintura desejada, dependendo da aplicação: para tecidos profundos imaging, um corante que operam no espectro de NIR (por exemplo, Cy7, λex / em 750/780 nm) pode ser adequado, enquanto o brilho total e eficaz luz fornecimento de corantes operando na faixa de perto-visível do espectro (por exemplo, análogos GFP) pode ser preferível. Praticamente todos os corantes podem ser obtidos como um ativo éster para rotular os resíduos de lisina das proteínas, bem como com partes de ligação alternativos, tais como maleimides para ligação de cisteína ou biotina para a rotulagem de proteínas equipadas com tags específicas de rotulagem31 . A seleção do rótulo não altera o protocolo de princípio mas exige apenas pequenas modificações do processo de rotulagem e é importante para um bom resultado de imagens. Outra modificação atraente para superar as limitações na resolução espacial é combinar FMT com CT ou ressonância magnética, permitindo a anotação de estruturas anatômicas com informação molecular.As informações estruturais podem também ser adquiridas sequencialmente como informações apriorísticas ou simultaneamente, que requer híbrido de imagem instrumentação32,33.
Determinadas etapas do protocolo merecem atenção especial. Como esta técnica pode ser adaptada para uma infinidade de photoprobes fluorescentes que se destinam a uma variedade de moléculas específicas representativas dos diferentes processos moleculares, é essencial para permitir a distribuição suficiente das sondas e enriquecimento na região de destino desejado. Ponto de tempo ideal para a imagem latente pode variar de acordo com a combinação de sonda-alvo. Por exemplo, anticorpo direcionamento dos receptores do tumor pode ser influenciada pela taxa de difusão para tumores, absorção e metabolismo pelo fígado e possíveis reações imunogênicas34. Considere também controles relevantes para abordagens específicas da imagem latente. Marcadores específicos sempre devem ser validados contra controles isotype, refletindo efeitos de perfusão e inespecíficas ligação (por exemplo, ligação mediada por receptores de Fc). Alvo-negativo animais podem servir como um controle adicional para a especificidade do marcador, se existem tais modelos de nocaute. Alternativamente, bloquear as experiências pode ser executada para provar a especificidade do anticorpo-alvo interações35.
A seguir estão os passos críticos sobre os aspectos práticos do procedimento: (1) cuidadosamente determinar as concentrações de DSS usadas, como susceptibilidade DSS pode variar entre rato diferente cepas e fabrica/lotes36. (2) cuidadosamente selecione combinações de sonda-alvo. (3) permitir que cerca de 5 min de tempo de verificação para uma varredura suficiente do abdome inteiro. O tempo ideal ponto entre o aplicativo de rastreamento e o procedimento de imagem precisa ser cuidadosamente determinado para permitir a acumulação de rastreamento na região de destino desejado. Para a deteção de F4/80 intestinal na colite murino, o anticorpo marcado deve ser injetado 24 h antes da digitalização. (4) como acúmulo de rótulo inespecíficos pode ocorrer (por exemplo, no fígado), é crucial para rotular o tecido-alvo apropriado como ROI, colocando as respectivas ferramentas de medição. Além disso, controles suficientes para a distribuição do traçador inespecíficos deve ser incluído-considerar isotipo inespecíficos controles para descartar efeitos de perfusão e nocaute ou bloqueio estudos para validar a interação do marcador-alvo.
Fontes comuns de erro relacionadas com a reconstrução de dados e processo de digitalização incluem posição animal imprópria, verificação de campo e tempo de exposição. Quando o posicionamento do animal, a lesão fluorescentes deve estar rodeada por tecido por todos os lados para minimizar o ruído de reconstrução. Bolhas de ar aprisionadas entre o animal e a placa de vidro dianteiro da fita de imagem também podem aumentar o ruído e devem ser removidas, movendo o animal ligeiramente. Sobre ou subexposição da imagem pode exigir uma verificação de reaquisição com as configurações de exposição modificado, que pode ser encontrado na tela de verificação (bloco de imagem de reflectância: ajustes de tempo de exposição e intensidade o LED frontal). Ao combinar na vivo baseado em anticorpos de medições FMT com post-mortem de análise histológica, como imuno-histoquímica ou coloração imunofluorescente, deve ser considerado o uso dos anticorpos do mesmo clone e formato. Também, ao realizar medições repetitivas de FMT nos mesmos animais, os mesmos formatos e clones devem ser usados para evitar possível reatividade cruzada ou o direcionamento de epítopos diferentes.
Tomados em conjunto, tomografia computadorizada mediada-molecular de fluorescência permite o monitoramento repetitivas do curso da doença e subjacentes processos fisiopatológicos. Ele pode ser aplicado a uma infinidade de estudos biomédicos e pode ser útil para acelerar o teste de drogas ou como um ponto de extremidade objetivo em individualizado terapias. FMT-direcionamento de macrófagos F4/80-expressando em modelos de inflamação fornece uma ferramenta não-invasiva valiosa para visualizar e quantificar a infiltração e acúmulo de células inflamatórias, enquanto também demonstrando boa correlação para convencional leituras.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Agradecemos a Sra. Sonja Dufentester, Sra. Elke Weber e Sra. Klaudia Niepagenkämper pela excelente assistência técnica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Alfalfa-free diet | Harlan Laboritories, Madison, USA | 2014 | |
| Bepanthen eye ointment | Bayer, Leverkusen, Germany | 80469764 | |
| Dextran sulphate sodium (DSS) | TdB Consulatancy, Uppsala, Sweden | DB001 | |
| Eosin | Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany | E 4382 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany | E 9884 | |
| Florene 100V/V | Abbott, Wiesbaden, Germany | B506 | |
| Haematoxylin | Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany | HHS32-1L | |
| O.C.T. Tissue Tek compound | Sakura, Zoeterwonde, Netherlands | 4583 | fixative for histological analyses |
| Phosphate buffered saline, PBS | Lonza, Verviers, Belgium | 4629 | |
| Sodium Chloride 0,9% | Braun, Melsungen, Germany | 5/12211095/0411 | |
| Sodium bicarbonate powder | Sigma Aldrich Deisenhofen, Germany | S5761 | |
| Standard diet | Altromin, Lage, Germany | 1320 | |
| Tissue-Tek Cryomold | Sakura, Leiden, Netherlands | 4566 | |
| Hemoccult (guaiac paper test) | Beckmann Coulter, Germany | 3060 | |
| Biotin rat-anti-mouse anti-F4/80 antibody | Serotec, Oxford, UK | MCA497B | |
| Biotin rat-anti-mouse anti-GR-1 | BD Pharmingen, Heidelberg Germany | 553125 | |
| Streptavidin-Alexa546 | Molecular Probes, Darmstadt, Germany | S-11225 | excitation/emission maximum: 556/573nm |
| Anti-CD11b rat-anti-mouse antibody TC | Calteg, Burlingame, USA | R2b06 | |
| Purified anti-mouse F4/80 antibody | BioLegend, London, UK | 123102 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | D9542 | |
| FITC-conjugated anti-Ly6C rat-anti-mouse antibody | BD Pharmingen, Heidelberg, Germany | 553104 | |
| FACS buffer | BD Pharmingen, Heidelberg, Germany | 342003 | |
| Cy7 NHS Ester | GE Healthcare Europe, Freiburg, Germany | PA17104 | |
| MPO ELISA | Immundiagnostik AG, Bensheim, Germany | K 6631B | |
| Cy5.5 labeled anti-mouse F4/80 antibody | BioLegend, London, UK | 123127 | ready to use labelled Antibodies (alternative) |
| Anti-Mouse F4/80 Antigen PerCP-Cyanine5.5 | eBioscience, Waltham, USA | 45-4801-80 | ready to use labelled Antibodies (alternative) |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | 67-68-5 | |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | 792632 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | 64-17-5 | |
| Bovine Serum Albumins (BSA) | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | A4612 | |
| Tris Buffered Saline Solution (TBS) | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | SRE0032 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| FACS Calibur Flow Cytometry System | BD Biosciences GmbH, Heidelberg, Germany | ||
| FMT 2000 In Vivo Imaging System | PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA | FMT2000 | |
| True Quant 3.1 Imaging Analysis Software | PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA | included in FMT2000 | |
| Leica DMLB Fluorescent Microscope | Leica, 35578 Wetzlar, Germany | DMLB | |
| Bandelin Sonopuls HD 2070 | Bandelin, 12207 Berlin, Germany | HD 2070 | ultrasonic homogenizer |
| Disposable scalpel No 10 | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | Z692395-10EA | |
| Metzenbaum scissors 14cm | Ehrhardt Medizinprodukte GmbH, Geislingen, Germany | 22398330 | |
| luer lock syringe 5ml | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | Z248010 | |
| syringe needles | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | Z192368 | |
| Falcon Tube 50ml | BD Biosciences, Erembodegem, Belgium | 352070 |
References
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