Summary
目标特定的探针代表了一种用于分析分子机制的创新工具, 例如各种疾病的蛋白质表达 (例如,炎症、感染和肿瘤发生)。在这项研究中, 我们描述了一个定量的三维层析成像评估肠道巨噬细胞浸润的小鼠结肠炎模型使用 F4/80-specific 荧光介导的断层扫描。
Abstract
小鼠疾病模型对科学研究是必不可少的。然而, 许多诊断工具, 如内窥镜或断层成像, 在动物模型中并不经常使用。传统的实验读数通常依赖于宰后和前体分析, 从而防止个体的随访检查, 增加所需的研究动物数量。荧光介导的断层扫描使非侵入性的, 重复的, 定量的, 三维荧光探针的评估。它是高度敏感的, 并允许使用分子制造商, 这使得特定的检测和表征明确的分子目标。特别是, 有针对性的探针代表了一个创新的工具, 分析基因活化和蛋白表达在炎症, 自身免疫疾病, 感染, 血管疾病, 细胞迁移, 肿瘤,等。在这篇文章中, 我们提供了 step-by 的步骤说明, 对这种复杂的成像技术的在体内检测和定性的炎症 (即, F4/80-positive 巨噬细胞浸润) 在广泛使用的小鼠模型肠道炎症。该技术也可用于其他研究领域, 如免疫细胞或干细胞追踪。
Introduction
动物模型被广泛应用于科学研究, 许多非侵入性的程序都存在于监测疾病的活动和生命力, 如体重变化的量化或血液、尿液和粪便的分析。但是, 这些只是间接的代理参数, 也受个体的可变性。它们必须经常通过对组织标本的验尸分析来补充, 防止在重复的时间点进行连续观察, 并直接观察生理或病理过程在体内。成熟的小动物成像技术已经出现, 包括横断面成像, 光学成像和内窥镜, 这使这些过程的直接可视化, 也允许重复分析相同的动物1,2,3. 此外, 在同一动物中反复监测各种疾病的可能性可能会减少所需的动物数量, 从动物伦理学的角度来看, 这可能是可取的。
几种不同的光学成像技术存在于体内荧光成像。最初, 共聚焦成像被用来研究表面和地下荧光事件4,5。然而, 最近, 允许进行定量的三维组织评估的层析系统已经开发成6。这是通过开发荧光探针, 在近红外线 (近红外光谱) 频谱发出光, 提供低吸收, 灵敏的探测器, 单色光源7。虽然传统的切削成像技术, 如计算机断层扫描 (CT), 磁共振成像 (MRI), 或超声 (美国), 主要依赖于物理参数和可视化形态学, 光学成像可以提供额外的信息使用内生或外源荧光探针的基础分子过程8。
分子生物学的进步有助于为越来越多的目标提供智能和有针对性的荧光分子探针的生成。例如, 受体介导的摄取和分布在给定的目标区域可以可视化使用 carbocyanine 衍生物标记抗体9。大量可用的抗体, 可被标记为功能作为特定的示踪剂在其他无法进入的身体区域, 提供了前所未有的洞察力分子和细胞的过程中的模型的肿瘤和神经退行性,心血管、免疫学和炎症性疾病7。
在这项研究中, 我们描述了使用荧光介导的层析成像在小鼠结肠炎模型。葡聚糖硫酸钠 (DSS) 诱导结肠炎是一种标准的化学诱导的小鼠肠道炎症模型, 类似炎症性肠病 (IBD)10。这是特别有用的评估先天免疫系统对发展的肠道炎症的贡献11。由于单核和巨噬细胞的招募、活化和浸润是 IBD 发病机制的关键步骤, 因此它们的招募和渗透动力学的可视化是监测的关键, 例如, 影响潜在的治疗性药物在临床前设置12。我们描述了诱导的 DSS 结肠炎, 并演示了利用荧光分子层析成像技术对巨噬细胞浸润肠黏膜的特性, 为单核/巨噬细胞标记 F4/80 的具体可视化13. 此外, 我们还说明了辅助和补充程序, 如抗体标签;实验装置;对所获得的图像进行分析和解释, 与常规读数相关, 如疾病活动指数、流式细胞仪和组织学分析、免疫组织化学。我们讨论这项技术的局限性和与其他成像方式的比较。
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Protocol
根据德国动物保护法 (LANUV), 所有动物实验均经 Landesamt Natur、Umwelt 和 Verbraucherschutz (Nordrhein) Westfalen-Tierschutzgesetz。
1. 材料和实验装置
- 动物护理。
- 使用性别和年龄匹配的任何 DSS 敏感株 (例如, C57BL/6) 在20-25 克体重的小鼠。
- 根据当地的动物保育指南, 计划每组至少五只小鼠, 并将小鼠置于家中。
- 提供标准的鼠粮和蒸压饮用水ad 随意。
- 在扫描前至少三天去除标准的 chow, 并将其换成无苜蓿草, 以减少腔荧光。
- 急性 DSS 诱导的结肠炎。
- 溶解2克的 DSS (分子量〜 4万 Da) 在100毫升的蒸压饮用水中获得 2% (瓦特/v 溶液)。
- 只用 DSS 解决方案来填满小鼠的饮水供应, 并估计每只老鼠每天5毫升液体。提供相同的饮用水没有 DSS 的控制小鼠10。
注意: 每天监测老鼠直到实验结束。根据当地适用的动物指南, 安乐的老鼠会失去超过20% 的初始体重或变得奄奄一息 (即,持续驼背的姿势, 减少运动, 呼吸吃力, 明显直立的皮毛)福利.
- 荧光介导的层析成像的制备。
- 标签所需的抗体 (例如,大鼠 anti-mouse F4/80) 与荧光染料 (例如, Cyanine7, λ激发: 750 nm, λ发射: 776 nm), 如制造商的协议所述。透析纯化抗体在适当的透析膜 (孔大小和 #60; 50-100 kDa) 反对 1 L 0.15 M 氯化钠为至少 2 h 或隔夜。
- 将抗体转移到0.1 米 NaHCO 的 1 L,3 , 透析至少2小时。
- 在二甲基亚砜 (10.8 µL/毫克抗体) 中溶解所需数量的荧光染料, 并将其添加到抗体溶液中。使用荧光染料在20倍的摩尔过剩, 以达到 dye-to-protein 的比例为1:3。
- 在黑暗中孵育在4° c 为 1 h. 通过透析对1升0.15 米钠或使用 PD-10 脱盐柱和解决磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 中的体内应用去除未标记抗体。
- 用分光光度法测定最终抗体浓度和标记比值。
- 测量250-330 纳米吸收的蛋白质浓度, 并考虑染料的额外吸收。校正最大吸收在280毫微米 (蛋白质) 由11% 最大吸收在750毫微米 (下步) 为 Cyanine7 标记。
- 测量化合物 (通常为 1:10) 在 250-800 nm 的稀释量, 并提取 Cyanine7 在 750 nm 的浓度。
- 确定 dye-to-protein 比为: 染料或抗体 = 最大吸收在750毫微米/20万/(最大吸收在280毫微米-0.11 x 最大吸收在750毫微米)/17万。
- 将抗体溶液保持在4° c, 并将其从光中屏蔽以避免在注射前漂白。
- 在注射前立即将所需的抗体溶液容积装入无菌注射器中, 直至使用。
- 根据示踪药代动力学确定探针注射的最佳时机和扫描程序。
- 麻醉使用 1.5-2.5% 吸入的异氟醚在氧气中, 或将它们安全地放置在一个专门的抑制剂尾静脉注射的标记抗体的小鼠。
- 对于全长抗体, 在扫描前注入至少24小时的标记抗体, 如用于小鼠结肠炎的 anti-mouse F4/80 巨噬细胞可视化。通过尾静脉注射小鼠 (静脉注射) 与标记抗体的数量对应的 2.0 nmol 染料。
- 使用同样标记的不抗体 (例如,大鼠 IgG 或与主要抗体遗传相对应的另一种同种) 作为同种控制, 剂量相当于特定探针的量。
注: 在注射控制化合物后的体内扫描结果可以作为对特定探针成像数据的解释的参考。 - 使用电动剃须刀将动物皮毛剃毛在腹部区域, 以减少对光的反射和吸收。
- 标签所需的抗体 (例如,大鼠 anti-mouse F4/80) 与荧光染料 (例如, Cyanine7, λ激发: 750 nm, λ发射: 776 nm), 如制造商的协议所述。透析纯化抗体在适当的透析膜 (孔大小和 #60; 50-100 kDa) 反对 1 L 0.15 M 氯化钠为至少 2 h 或隔夜。
2. 技术设备
- 使用兽医荧光介导的层析成像 (裂变材料) 装置的小动物荧光 (图 4)。
- 通过点击 "新研究" 按钮为每个项目创建一个新的研究, 并在研究描述中包括相关的示踪剂, 包括成像参数和剂量供将来参考。
- 在本研究中, 通过单击 "新建学习组" 按钮, 根据各自的研究设计 (例如,为特定的跟踪器和不同种控件) 创建研究组。装备每个研究小组与动物的各自数量。
- 校准跟踪器构造的系统。
- 对每批示踪剂进行校准, 使标签的变化正常化, 并从 OI 数据中进行定量测量。
- 按照仪器制造商的指导, 对各个系统进行校准;在选择 "添加新的跟踪器" 时, 系统将通过步骤提供指南。在探针中提供了应用抗体溶液的稀释和示踪剂的绝对浓度。
- 对于裂变材料, 使用一种组织模仿的定义厚度和吸收特性 (类似于重要组织) 的幻像, 并用特定体积的抗体溶液填充。在裂变材料装置上测量这一点。
注: 系统将使用所提供探头的参考测量, 连同给定的浓度, 从未来的活体测量中计算绝对示踪剂浓度。
- 使用土炕检测盒, 温度为42° c。
注意: 这可以防止小鼠在检查过程中变得体温过低。
3. 动物麻醉
- 使用连续流动的 1.5-2%% 异氟醚 ([2-氯-2-(氟)-11, 1-中和--乙烷]) 和 1.5 L O2/分钟麻醉老鼠。
4. 荧光介导的断层扫描
注: 根据需要, 对本研究中使用的裂变材料体系 (见资料表) 中的替代荧光反射成像设备或裂变物质系统, 采用以下具体的细节进行调整。
- 将麻醉小鼠放回检查盒中。
- 执行扫描过程。
- 将卡带插入成像系统并立即关闭, 以确保连续麻醉。从以前创建的研究组中选择适当的示例。从下拉菜单中选择所管理的跟踪器, 以确保正确计算示踪剂浓度值。
- 在适当波长 (720 nm Cyanine7) 上获取荧光反射图像, 用于扫描规划, 并通过单击 "获取图像" 按钮来勾勒扫描字段。
- 请注意, 扫描字段显示为荧光反射图像上的叠加。将其调整到感兴趣的区域 (例如,冒号或腹部), 避免空气或剩余毛皮的区域。根据图像目标, 通过在右侧的菜单中选择 "粗到中" 和 "精细扫描-字段分辨率", 在扫描字段中设置图像数据点的数目。
注意: 请记住, 一个精细的扫描字段可能提供更好的空间分辨率, 其代价是扫描时间大大延长。 - 单击 "扫描", 在选定的波长处启动数据/图像采集。
注: 扫描时间为中细扫描整个腹部将约5分钟;在这段时间内, 每个数据点分别由激励激光照射, 并记录产生的荧光。 - 在扫描结束时从成像盒中取出动物, 让动物完全恢复, 然后再将其放回笼子。
- 在实验过程中, 如果认为需要在不同的时间点 (例如,天 0, 5, 和 9-10 (实验结束)), 重复的裂变材料, 但考虑体内抗体的积累, 因此增加了背景荧光信号。
5. 扫描后
- 将鼠标放在一个单独的笼子里, 放在一盏红光灯下的纸巾上, 监视鼠标是否有不适或苦恼的迹象, 直到完全恢复。当完全清醒时, 将鼠标放回各自的笼子里。
- 安乐在实验结束时, 通过将 CO2传递到隔离器, 剂量为 100% (v/v)、100% 和3升/分。不要填充的商会与 co2,作为一个突然暴露在高浓度 co2可能会导致遇险。验证死亡后, 鼠标停止呼吸由随后的第二模式的安乐死, 如快速颈椎脱位。
- 通过腹部剖腹术外植体结肠, 并对说明结肠进行活体扫描, 如步骤 4.2.1-4.2.4 所述。在准备进一步的分析之前, 用 Metzenbaum 的外科剪刀纵向打开每个结肠, 用生理盐水彻底冲洗。
- 使用手术刀切割从远端结肠0.5 厘米的片段, 并立即放置在1.5 毫升低温管。将其冷冻在液氮中, 贮存在-70 ° c, 直至进一步使用 (例如,过氧化物 (过氧化物酶) 测量)。
- 使用木棍和卷起剩余的纵向打开的结肠从远端到近端, 与黏膜向外 ("瑞士卷技术"), 为组织学分析。将准备工作放置在固定剂中 (请参见材料表), 并在-80 ° c14处冻结。
6. 数据重建和解释
- 使用各自成像软件的重建工具, 从原始成像数据中创建3D 荧光分布图;扫描将自动添加到重建工具中, 当扫描时, 会选择 "添加到重建队列" 功能。
- 否则, 从相应的学习和学习组下的下拉菜单中选择扫描, 右键单击扫描, 然后选择 "添加到重建"。
- 要进一步分析, 请将数据集加载到分析软件中。从顶栏的下拉菜单中选择相应的研究, 然后从右侧的菜单中选择学习组和单个动物;所有对此动物进行的扫描将显示。选择正确的扫描, 然后单击 "加载"。
注: 示踪剂分布的3D 重建将在左侧出现, 作为最初获得的荧光反射图像的叠加。该模型可以旋转和放大, 以便于分析。 - 在重建的3D 地图上确定不标签堆积 (例如,肝或尿囊) 的病灶, 并与靶组织 (如肠或肠道) 区分。
- 从顶部栏中选择最适合目标的 ROI 形状。通过在分析软件中放置相应的测量工具, 将目标组织标记为感兴趣的区域 (ROI);该软件将提供一个荧光强度的 ROI, 以及 (微微) 摩尔量的示踪剂, 扫描已被校准。
- 在适当的 roi 中选择跟踪器的总数量, 将其归为 roi 大小, 作为与炎症浸润 (组织学) 相关的疾病活动评估的最合适的等价物。
注: ROI 的其他功能可以在适当时作为特定模型的代表选择。
7。Ex 活体分析
- 苏木精和红素染色和免疫荧光染色。
- Deparaffinize 部分通过放置在70% 乙醇 (乙醇) 为2分钟;之后用蒸馏水冲洗。染色用苏木精溶液5分钟, 随后用温水冲洗10分钟。
- 用蒸馏水冲洗, counterstain 用曙红溶液2分钟, 再用蒸馏水冲洗。
- 放置在70% 乙醇, 96% 乙醇, 99% 乙醇, 和二甲苯 (2 次) 为2分钟, 以脱水和清除部分。装载树脂安装介质。
- 免疫荧光染色。
- 使用先前获得的组织切片 ("瑞士卷") 进行免疫荧光染色, 并准备7µm 的冷冻切片。
- 在5.0% 只大鼠血清中阻断丙酮固定和冰冻结肠切片10分钟, 并在夜间用稀释的 (1/500 伏/v) 化原 anti-mouse F4/80 抗体进行孵育。在三缓冲盐水 (TBS) 三次洗涤部分和孵育与亲和-FITC (1:100 v/v) 在 PBS 或 BSA (0.1% 瓦特/v) 隔夜在4° c。
- 用 4, 6-diamidino-2-吲 (DAPI, 1:1000 伏/v) 来洗涤 TBS 和染色的部分, 以达到对比。在共焦显微镜下分析荧光图像 (见材料表; 40x 放大倍率; 过滤器立方体 N2.1 与励磁过滤器 515-560) 和计数 F4/80-positive 细胞每个大功率领域。
注意: 考虑使用相同的克隆和格式的抗体结合在体内的裂变材料和验尸组织学分析, 如免疫组织化学或免疫荧光染色, 根据预期的目标。为检测 F4/80-positive 巨噬细胞在体内和ex 体内, 使用了不同的格式。
- 髓过氧化物酶在结肠样品中的测量。
- 使用新鲜获得的, PBS 冲洗的结肠样品或解冻的样品进行过氧化物酶测量。在 ELISA 试剂盒中提供的溶解缓冲液中, 称量所有样品和质组织 (见材料表), 每毫克组织的裂解缓冲液量为20µL。
- 几种为十五年代 (超声频率:20 赫, 力量:70 W) 和离心样品为10分钟在 200 x g 和4° c。
- 根据制造商的描述, 使用商业上可用的 ELISA 试剂盒 (参见材料表)。执行重复的测试。
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Representative Results
结肠炎的评估:
DSS 诱导的结肠炎是一种化学诱导的小鼠肠道炎症模型, 类似于人 IBD, 导致体重下降, 直肠出血, 表面溃疡, 和粘膜损害的敏感的老鼠15。研究先天免疫系统对肠道炎症发育的贡献特别有用10,11。为了能诱发 colitic 炎症, 小鼠在整个实验过程中都被连续地管理 DSS。降低体重和粪便潜血作为炎症的临床指标。如图 1A所示, 小鼠在结肠炎诱导后四天开始减肥, 而仅接受水的控制动物体重则没有明显的变化。此外, colitic 动物的粪便 (图 1B) 的排泄量增加, 使用以下 hemoccult 评分系统评估: 0 (无血), 1 (hemoccult 阳性), 2 (hemoccult 阳性和视觉颗粒出血), 4 (大出血, 肛门周围血)16。结肠长度测量, 以评估炎症诱导结肠缩短, 揭示显着缩短 colitic 小鼠的冒号相比, 单独接受水的控制小鼠 (图 1C)。为了直接评估结肠损伤, 在实验结束时进行了组织学分析。对结肠和 #38 进行了组织学损伤的定量评价; 根据炎症的程度和程度、地穴损伤和参与的百分比17, 使用整体损伤核心的 E 染色切片。Colitic 小鼠表现出严重炎症症状, 而对照组无 DSS 的小鼠无组织学损伤 (图 1D)。这些图像显示了 DSS 诱导的结肠炎的特征性炎症变化, 其特点是破坏了上皮结构, 失去了杯状细胞、地穴损伤和粘膜溃疡, 而与主要保存的粘膜控制小鼠的体系结构18。统计学上的差异 (n = 5 每组) 是通过方差分析计算 (方差), 其次是学生纽曼-Keuls (S.N.K.)过帐测试或由韦尔奇的测试, 后跟游戏--如果存在显著的方差不均匀, 则为post测试。p值 #60; 0.05 被认为是重要的。
单核和巨噬细胞招募评估:
由于 DSS 诱导的结肠炎与免疫细胞的浸润, 如单核和巨噬细胞, 进入结肠黏膜和黏膜下层, 我们使用荧光染色的单核/巨噬细胞标记 F4/80 来量化浸润。与 non-colitic 控制小鼠相比, 接受 DSS 的 Colitic 小鼠的单核细胞浸润结肠壁的数量显著升高 (图 2A)。白细胞浸润是另外量化使用荧光染色的中性粒细胞标记 GR1, 揭示明显增加的中性粒细胞进入发炎的结肠相比, 控制小鼠 (图 2B)。证实, 过氧化物酶水平反映中性粒细胞数和炎症活性显著升高 colitic 小鼠结肠组织 (图 2C)。方差分析和 S.N.K. post测试用于计算组之间的统计意义 (每组 N = 5)。统计学意义在 p 和 #60 设置; 0.05。
巨噬细胞亚群的系统性改变:
小鼠单核细胞包括一个不同于成熟状态的异种不同的亚群, 它们的能力被吸收到炎症部位, 在那里他们参与发起和延续炎症反应19.因此, 我们用流式细胞仪分析 CD11b 和 Ly6C 的差异表达, 以此来描述血单核。在急性 DSS 结肠炎的炎症条件下, 我们观察到炎症 CD11b高Ly6C高单核细胞与实验条件的显著增加。相比之下, 没有 DSS (图 3A) 的 non-colitic 控制小鼠没有发生这种转变。使用方差分析和 S.N.K. 对每组数据 (n = 5)作为全身炎症的一个额外的替代参数, 我们评估了 colitic 小鼠脾脏中 F4/80-positive 细胞的存在与 non-colitic 对照, 这表明 DSS 治疗小鼠 (图 3C) 明显增加。
荧光介导的断层扫描:
我们使用荧光介导的断层扫描测量单核/巨噬细胞的招募和渗入肠黏膜。荧光标记抗体对小鼠 F4/80 被使用直接地形象化激活巨噬细胞在活动物。标记, 不鼠 IgG 抗体被用作同种控制。为扫描, 小鼠被剃光在腹部区域, 以尽量减少光线反射的毛皮, 麻醉的连续异氟醚供应, 并检查了兽医的裂变材料的小动物荧光的设备.如图 4A所示, 与 non-colitic 对照相比, 结肠炎诱导的荧光示踪剂在 colitic 小鼠冒号中的积累显著升高, 表明单核细胞浸润和分化的增加colitic 动物的活性巨噬细胞。在 colitic (DSS) 和非 colitic (水) 组中, 应用不荧光标记的 IgG 并没有引起腹部和肠道的可检测的荧光反应, 从而证明了探针靶的特异性F4/80 抗体的相互作用 (图 4A)。显示腹部区域的代表性图像。颜色代码指示荧光强度的水平, 对应于炎症渗透的程度(图 4B和4C)。前体 F4/80-directed 示踪剂积累的测量说明冒号验证了体内检测到的 F4/80 示踪剂堆积 (图 5A和5B) 的结肠原点。计算量的结合抗体相关良好 (R2 = 0.52) 与组织学确定的浸润性巨噬细胞数量 (图 5C和5D), 确认在体内成像与特定的示踪剂可以当地疾病活动的指示.数据通过方差分析和 S.N.K. 的post测试, 并在 p 和 #60 上设置了统计意义级别; 0.05。该关联被计算为线性回归。
图 1.急性 DSS 结肠炎的临床参数及组织学损伤。
在饮用水中, C57BL/6 小鼠受到8天的 DSS (2% 瓦/五) 的挑战。对照组给予小鼠饮水, 无 DSS。9天, 动物被安乐死。显示的数据来自一个实验 (n = 5 每组) ±标准误差的平均值 (SEM)。(A)体重的变化是相对于初始重量的。(B)粪便中的血液排泄, 由 guaiac 试纸试验 (hemoccult, 0 = 阴性, 4 = 血液宏观) 决定。(C) 剖验后冒号长度。(D)组织学损伤, 由地穴损伤程度和炎症程度评估。显示有代表性的组织学图像 (苏木/曙红染色; 放大: 10x (上部面板), 20x (下部面板)) 的 colitic (左面板) 或控制 (右板) 小鼠。注意到上皮结构和炎症浸润 (箭头) 的深刻破坏。条形图: 损伤评分。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2.肠单核细胞和巨噬菌浸润.
在饮用水中应用 dss (2% 伏/v) 的 C57BL/6 诱导了 dss 结肠炎。控制小鼠单独接受饮用水。数据从 n = 5 老鼠每组显示± SEM. (A)荧光巨噬细胞渗透在粘膜中的可视化。显示了 colitic 和控制小鼠 anti-F4/80 染色的代表性图像。条形图: 单元数/高功率域 (HPF)。(B)荧光黏膜中性粒细胞渗透的可视化。显示的是 colitic 动物和对照 anti-Gr-1 染色的代表性图像。条形图: 单元格计数/HPF。(C) colitic 和 non-colitic 小鼠结肠组织中的髓过氧化物酶浓度。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3.单核细胞招募到肠道室。
用流式细胞术对 colitic 小鼠的外周血单核细胞以及对照组的小鼠进行了 Ly-6C 的表达。根据 SSC 和 CD11b 表达式对细胞进行分类。小鼠单核细胞被确定为 SSC低CD11b高单元, 并对其 Ly6C 表达进行了分析。(A)相对于实验条件 (% 变化± SEM), 向炎症 Ly6C 的高单核细胞的比例变化。(B)在 SSCl Ly6C CD11b高细胞 colitic 动物结肠炎前和后诱导 (下部板) 和控制前后 post-experiment (上部板) 的斑点地块。(C)用流式细胞仪 (平均荧光强度± SEM) 对 colitic 和 non-colitic 小鼠的 F4/80 表达进行了脾评价。请单击此处查看此图的较大版本.
图 4.小鼠结肠炎巨噬细胞浸润的断层影像可视化.
在 colitic 小鼠和非 colitic 控制 Cyanine7-conjugated 抗体对鼠 F4/80 (n = 5 每组) 的禁产扫描。(A)条形图: 在 pmol 中确定染料的总荧光强度, 并将其描绘成± SEM. color-coded 荧光强度与注射小鼠炎症浸润程度对应的代表性图像使用特定探针 (anti-mouse F4/80) (B)和不控制 (鼠 IgG) (C)。在这两种情况下, 相同大小的 ROI 被放置在上腹部横向, 进一步分析。请单击此处查看此图的较大版本.
图 5.Ex 活体小鼠结肠炎的示踪特异性验证
在体内用特定探针 (anti-mouse F4/80) 注射的 colitic 小鼠的裂变材料扫描后, 在说明肠道内进行了活体平面荧光扫描, 以显示在体内获得的示踪信号的结肠来源.数据从二个实验与共计 n = 8 动物被显示。有代表性的图像显示了描述在体内的 colitic 小鼠的 color-coded 荧光强度对应的炎症浸润程度的扫描, (A).荧光反射成像的说明肠道允许识别特定地区的示踪积累(B).代表性的宰后荧光染色 F4/80-positive 巨噬细胞从这些区域确认体内结果(C).经免疫荧光染色测定的浸润性巨噬细胞数量与体内测定的示踪剂聚集量相关, (D).请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
尽管近年来医学成像技术发展迅速, 但在早期的发育阶段, 我们在检测炎症过程或肿瘤以及其他疾病方面的能力仍然有限。然而, 这对于了解肿瘤的生长, 侵袭, 或转移的发展和细胞过程中的炎症性疾病和退化, 心血管和免疫疾病的发展至关重要。虽然传统的成像技术依赖于物理或生理参数, 分子成像使特定分子标记的可视化在体内20。
对于小动物的成像, 放射性核素驱动的方法 (例如, s单身光子发射计算机断层扫描 (SPECT) 和正电子发射断层扫描 (PET)), 超声, 和荧光介导的成像可以用来可视化特定分子靶结构。使用全长抗体作为最有效的示踪骨架, 需要持久的标签, 因为长循环时间和缓慢的组织穿透延迟成像的时间后, 示踪剂应用。因此, 典型的成像放射性核素不适合于体内的抗体分布成像。使用运行同位素, 如 Cu64 或 In111, 使抗体示踪剂, 但要求一个复杂的基础设施跨越同位素生成, 辐射安全之前和期间的标记程序, 和保护动物住房后, 探针的应用。更 cost-effective 和更安全的变种将是荧光介导的成像。
在过去20年中, 有几个活体成像系统用于活体动物中荧光染料分布的检测、可视化和测量, 这是21。大多数系统都能使快速平面成像适合于表面损伤成像。由于光的吸收和散射, 信号在组织的深处躲避平面成像。这个问题最突出的解决方法是荧光层析成像22。在数学建模的基础上, 对图像信号进行散射和光吸收校正, 并从 multi-projection 数据集8计算虚拟3D 数据集。该算法提供了充分的定量数据, 使目标浓度/表达式23的特定区域的示踪剂浓度的估计。与解剖学成像技术相比, 裂变材料禁产条约的一个相关限制是与较差的空间分辨率有关, 这可能取决于所期望的目标--破坏分子信息到特定解剖结构的分配。另一个限制是限制穿透深度的光进入组织, 这需要使用探针吸收和荧光在红色到近红外光谱范围23。
最近引入的成像模式, 结合了形态学超声的优点和从荧光成像获得分子信息的可能性是光成像。早期研究的初步结果表明, 尽管需要进一步的技术改进--光成像对分子成像和潜在的平移应用有很大的希望24。
招募白细胞到肠道壁是一个关键的步骤, 在启动和长期存在的 IBD, 是招募炎症细胞到感染或炎症的网站在许多免疫介导的疾病, 如自身免疫性疾病,感染, 血管疾病, 肿瘤发生, 和许多更多的25。由于单核细胞活化和肠黏膜浸润是 IBD 发病的重要一步, 抑制单个核浸润, 由趋化因子和整合素-细胞膜黏附分子相互作用, 是一种有前途的治疗接近12,26。因此, 监测白细胞贩运到炎症部位是发展新的治疗方案的关键, 以可视化的抗炎作用的研究药物。这可能是特殊的兴趣, 因为针对白细胞贩运的代理已经开发, 一些 anti-integrin 抗体已经可以用于 IBD 治疗, 而进一步的组成部分将在不久的将来26。Vedolizumab, 一种针对肠道特异α4β7整合素亚基的人性化单克隆抗体, 和 Etrolizumab, 它将肠道α4β7和αEβ7整合 heterodimers 的β7亚基结合在一起, 已被批准27,28。其他代理 (例如, MAdCAM-1 PF-00547659 和 sphingosine-1-phosphate (S1P) 受体调节剂, 如 Ozanimod) 目前正接受治疗 IBD 的评价2930。
在执行裂变材料时, 可能的技术修改包括选择不同的示踪剂-目标组合, 以及将裂变材料禁产与结构成像方法相结合, 以弥补空间分辨率差的问题。已建立和商业化了广泛的探头-目标组合。对于特定的项目, 可以使用商业标签包和上述协议对定制抗体进行标记。根据选择的抗体或更小的肽作为目标基团, 商业供应商提供了一系列不同的标签。考虑所需的染料, 根据应用: 对于深层成像, 在近红外光谱中操作的染料 (例如, Cy7, λex/em 750/780 nm) 可能非常适合, 而染料的整体亮度和有效光源在光谱的近可见范围内操作 (例如, GFP 类似物) 可能比较可取。几乎所有的染料都可以作为活性酯来标记蛋白质的赖氨酸-残留物, 以及替代的结合基, 如来的半胱氨酸结合物或生物素, 用于标记带有特定标签标签的蛋白质31.标签的选择不改变原则协议, 但仅仅需要对标记程序稍加修改, 对良好的成像效果很重要。另一个有吸引力的修改, 以克服空间分辨率的限制是将裂变材料与 CT 或 MRI 结合, 使解剖结构的诠释与分子信息。结构信息可以按先验信息或同时获取, 这需要混合成像工具32,33。
该议定书的某些步骤值得特别注意。由于这种技术可以适应众多的荧光 photoprobes, 针对不同分子过程的各种特定分子的代表, 这是至关重要的, 允许足够的分布的探针和丰富的所需的目标区域。理想的成像时间点可能会根据探针-目标组合而变化。例如, 肿瘤受体的抗体靶向可能受肿瘤扩散率、肝脏吸收和代谢的影响, 以及可能的不良免疫反应34。还要考虑特定成像方法的相关控制。具体的示踪剂应始终对反映灌注效应和不结合的同种控制进行验证 (例如, Fc 受体介导的结合)。如果存在这种击倒模型, 目标阴性动物可以作为追踪特异性的附加控制。另外, 还可以进行阻断实验, 以证明抗体-靶相互作用的特异性35。
以下是有关程序实用性的关键步骤: (1) 仔细确定使用的 dss 的浓度, 因为 dss 的易感性可能因不同的鼠标应变和制造/批次36而异。(2) 仔细选择探头-目标组合。(3) 允许大约5分钟的扫描时间, 充分扫描整个腹部。需要仔细确定跟踪器应用和成像过程之间的最佳时间点, 以便在所需的目标区域内进行示踪积累。对于小鼠结肠炎的肠道 F4/80 检测, 应在扫描前24小时注射标记抗体。(4) 随着不标签的积累可能会发生 (例如,在肝脏中), 把相应的测量工具贴上标签作为 ROI 是至关重要的。此外, 应该包括足够的控制不示踪剂分布-考虑不同种控制, 以排除灌注效果和击倒或阻断研究, 以验证示踪剂-目标的相互作用。
与扫描程序和数据重构相关的典型误差来源包括不适当的动物位置、扫描场和曝光时间。当定位的动物, 荧光病变应周围的组织的所有方面, 以尽量减少重建噪音。被困在动物和成像盒前玻璃板之间的气泡也会增加噪音, 应该通过稍微移动动物来去除。图像的过度或曝光可能需要使用修改过的曝光设置进行重新扫描, 可以在扫描屏幕 (反射图像块: 前 LED 强度和曝光时间的调整) 中找到。当将体内抗体的裂变材料测量与验尸组织学分析 (如免疫组织化学或荧光染色) 结合使用时, 应考虑采用相同克隆和格式的抗体。同样, 在同一动物中执行重复性的裂变材料测量时, 应使用相同的格式和克隆来防止可能的交叉或不同表位的靶向性。
在一起, 荧光介导的分子断层扫描能够重复监测疾病的过程和潜在的病理生理过程。它可以应用于过多的生物医学研究, 可能有助于加速药物测试或作为个体化治疗的客观终点。在炎症模型中 F4/80-expressing 巨噬细胞的靶向性提供了一种有价值的非侵入性工具, 可以可视化和量化炎症细胞的浸润和积聚, 同时也证明与常规读数.
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢 Ms. 索尼娅 Dufentester, Ms. Elke 韦伯和 Mrs. Klaudia Niepagenkämper 为优秀的技术援助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Alfalfa-free diet | Harlan Laboritories, Madison, USA | 2014 | |
| Bepanthen eye ointment | Bayer, Leverkusen, Germany | 80469764 | |
| Dextran sulphate sodium (DSS) | TdB Consulatancy, Uppsala, Sweden | DB001 | |
| Eosin | Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany | E 4382 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany | E 9884 | |
| Florene 100V/V | Abbott, Wiesbaden, Germany | B506 | |
| Haematoxylin | Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany | HHS32-1L | |
| O.C.T. Tissue Tek compound | Sakura, Zoeterwonde, Netherlands | 4583 | fixative for histological analyses |
| Phosphate buffered saline, PBS | Lonza, Verviers, Belgium | 4629 | |
| Sodium Chloride 0,9% | Braun, Melsungen, Germany | 5/12211095/0411 | |
| Sodium bicarbonate powder | Sigma Aldrich Deisenhofen, Germany | S5761 | |
| Standard diet | Altromin, Lage, Germany | 1320 | |
| Tissue-Tek Cryomold | Sakura, Leiden, Netherlands | 4566 | |
| Hemoccult (guaiac paper test) | Beckmann Coulter, Germany | 3060 | |
| Biotin rat-anti-mouse anti-F4/80 antibody | Serotec, Oxford, UK | MCA497B | |
| Biotin rat-anti-mouse anti-GR-1 | BD Pharmingen, Heidelberg Germany | 553125 | |
| Streptavidin-Alexa546 | Molecular Probes, Darmstadt, Germany | S-11225 | excitation/emission maximum: 556/573nm |
| Anti-CD11b rat-anti-mouse antibody TC | Calteg, Burlingame, USA | R2b06 | |
| Purified anti-mouse F4/80 antibody | BioLegend, London, UK | 123102 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | D9542 | |
| FITC-conjugated anti-Ly6C rat-anti-mouse antibody | BD Pharmingen, Heidelberg, Germany | 553104 | |
| FACS buffer | BD Pharmingen, Heidelberg, Germany | 342003 | |
| Cy7 NHS Ester | GE Healthcare Europe, Freiburg, Germany | PA17104 | |
| MPO ELISA | Immundiagnostik AG, Bensheim, Germany | K 6631B | |
| Cy5.5 labeled anti-mouse F4/80 antibody | BioLegend, London, UK | 123127 | ready to use labelled Antibodies (alternative) |
| Anti-Mouse F4/80 Antigen PerCP-Cyanine5.5 | eBioscience, Waltham, USA | 45-4801-80 | ready to use labelled Antibodies (alternative) |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | 67-68-5 | |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | 792632 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | 64-17-5 | |
| Bovine Serum Albumins (BSA) | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | A4612 | |
| Tris Buffered Saline Solution (TBS) | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | SRE0032 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| FACS Calibur Flow Cytometry System | BD Biosciences GmbH, Heidelberg, Germany | ||
| FMT 2000 In Vivo Imaging System | PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA | FMT2000 | |
| True Quant 3.1 Imaging Analysis Software | PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA | included in FMT2000 | |
| Leica DMLB Fluorescent Microscope | Leica, 35578 Wetzlar, Germany | DMLB | |
| Bandelin Sonopuls HD 2070 | Bandelin, 12207 Berlin, Germany | HD 2070 | ultrasonic homogenizer |
| Disposable scalpel No 10 | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | Z692395-10EA | |
| Metzenbaum scissors 14cm | Ehrhardt Medizinprodukte GmbH, Geislingen, Germany | 22398330 | |
| luer lock syringe 5ml | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | Z248010 | |
| syringe needles | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | Z192368 | |
| Falcon Tube 50ml | BD Biosciences, Erembodegem, Belgium | 352070 |
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