Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Fluorescens-mediert tomografi av kvantifisering av Macrophage-relaterte Murine intestinale betennelsen

Published: December 15, 2017 doi: 10.3791/55942
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 2, 2, 2
1Department of Medicine B, University Hospital Münster, 2Translational Research Imaging Center, Department of Clinical Radiology, University Hospital Münster

Summary

Mål-spesifikke sonder representerer et nyskapende verktøy for å analysere molekylære mekanismer som protein uttrykk i ulike typer sykdommer (f.eks betennelse, infeksjon og tumorigenesis). I denne studien beskriver vi en kvantitativ tredimensjonale tomographic vurdering av intestinal macrophage infiltrasjon i murine modell av kolitt med F4/80-spesifikke fluorescens-mediert tomografi.

Abstract

Murine modeller av sykdommen er uunnværlig til vitenskapelig forskning. Men ansatt mange diagnostiske verktøy som endoskopi eller tomographic imaging ikke rutinemessig i dyremodeller. Konvensjonelle eksperimentelle readouts er ofte avhengige av post mortem og ex vivo analyser, som hindrer intra personlige oppfølging undersøkelser og øke antall studie dyr nødvendig. Fluorescens-mediert tomografi kan ikke-invasiv, repeterende, kvantitativ, tredimensjonale vurdering av fluorescerende sonder. Det er svært følsomme og tillater bruk av molekylære beslutningstakere, som gjør at bestemte gjenkjenning og karakterisering av forskjellige molekylære mål. Spesielt representerer målrettet sonder et nyskapende verktøy for å analysere genet aktivisering og protein uttrykk i betennelse, autoimmune sykdommer, infeksjon, vaskulær sykdom, celle migrasjon, tumorigenesis, etc. I denne artikkelen gi vi instruksjoner på denne avansert bildeteknologi for i vivo gjenkjenning og karakterisering av betennelse (dvs. F4/80-positiv macrophage infiltrasjon) i en brukte murine modell av intestinal betennelser. Denne teknikken kan også brukes i forskningsområder som immun celle eller stilk cellen sporing.

Introduction

Dyr modeller er mye brukt i forskning, og mange ikke-invasiv prosedyrer eksisterer for å overvåke sykdomsaktivitet og vitalitet, som kvantifisering av kropp vekt endringer eller analyse av blod, urin og avføring. Dette er imidlertid bare indirekte surrogat parametere som også inter-individuelle variasjon. De må ofte suppleres av post mortem analyser av vev, som hindrer føljetong observasjon på repeterende tidspunkt og direkte observasjon av fysiologiske eller patologisk prosesser i vivo. Sofistikert liten-dyr Bildeteknikker har dukket opp, inkludert kryss seksjon bildebehandling og optisk tenkelig endoscopy, som kan direkte visualisering av prosessene og gir også mulighet for gjentatte analyser av samme dyr1 , 2 , 3. i tillegg muligheten til å full av gjentagelser overvåke ulike stater av sykdom i samme dyret kan redusere antall dyr nødvendig, som kan være ønskelig fra et dyreetikk synspunkt.

Det finnes flere forskjellige optiske imaging teknikker for i vivo fluorescens bildebehandling. Opprinnelig var AC confocal imaging ansatt å studere overflate og undergrunnen fluorescerende hendelser4,5. Nylig imidlertid har tomographic systemer som tillater kvantitative tredimensjonale vev vurderinger vært utviklet6. Dette er oppnådd gjennom utvikling av fluorescerende sonder som avgir lys i nær-infrarøde (NIR) spektrum, tilbyr lave absorpsjon, følsom detektorer og monokromatisk lyskilder7. Mens tradisjonelle tverrsnittet Bildeteknikker, som beregnet tomografi (CT), magnetisk resonans imaging (MRI) eller ultralyd (US), stole mest på fysisk parameterene og visualisere morfologi, kan optisk tenkelig gi mer informasjon på underliggende molekylære prosesser sonder bruker endogene eller eksogene fluorescerende8.

Fremskritt innen molekylærbiologi har bidratt til å forenkle generasjonen av smart og målrettet fluorescerende molekylær sonder for et økende antall mål. For eksempel kan reseptor-mediert opptak og distribusjon i et gitt mål visualiseres ved hjelp av carbocyanine derivat-merket antistoffer9. Overflod av tilgjengelige antistoffer, som kan være merket skal fungere som bestemte tracers i ellers utilgjengelige områder av kroppen, gir enestående innsikt i molekylære og cellulære prosesser i modeller av tumorigenesis og nevrodegenerative, hjerte, immunologiske og inflammatoriske sykdommer7.

I denne studien beskriver vi bruken av fluorescens-mediert tomografi i murine modell kolitt. Dekstran natrium sulfat (DSS)-indusert kolitt er en standard kjemisk indusert musemodell intestinale betennelsen som ligner inflammatorisk tarm sykdom (IBD)10. Det er spesielt nyttig å vurdere bidrag av det medfødte immunsystemet til utviklingen av gut betennelse11. Siden rekruttering, aktivisering og infiltrasjon av monocytter og makrofager representerer avgjørende skritt i patogenesen av IBD, er visualisering av rekruttering og the kinetics av infiltrasjon avgjørende for overvåking, for eksempel effekten av potensielle terapeutiske stoffer i en prekliniske innstillingen12. Vi beskriver induksjon av DSS kolitt og demonstrere tomografi-mediert karakterisering av macrophage infiltrasjon i tarmen mucosa bruker fluorescens molekylær tomografi for bestemte effekten av monocyte/macrophage merket F4/80 13. i tillegg vi illustrere ekstra og supplerende prosedyrer, for eksempel antistoff merking; Det eksperimentelle oppsettet; og analyse og fortolkning av fått bildene, i sammenheng med konvensjonelle readouts som sykdom aktivitet indekser, flow cytometri og histologiske analyse og immunohistochemistry. Vi diskutere begrensninger av denne teknikken og sammenlignet med andre tenkelig modaliteter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyreforsøk ble godkjent av Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz (LANUV) Nordrhein-Westfalen i henhold til tysk dyr beskyttelse loven (Tierschutzgesetz).

1. materialer og eksperimentelle oppsett

  1. Dyr omsorg.
    1. Bruk kjønn og alder-matchende mus i DSS-følsomme belastning (f.eks C57BL/6) på 20-25 g kroppsvekt.
    2. Planlegge minst fem eller flere mus per forsøksgruppen og huset musene i henhold til lokale dyr omsorg retningslinjer.
    3. Gir en standard gnager chow kosthold og autoklaveres drikkevann ad libitum.
    4. Fjern standard chow og erstatte den med alfalfa-fri chow minst tre dager før skanning for å redusere endoluminal auto-fluorescens.
  2. Induksjon av akutt DSS-indusert kolitt.
    1. Oppløse 2 g DSS (molekylvekt ~ 40.000 Da) i 100 mL autoklaveres drikkevann å få en 2% (w/v oppløsning).
    2. Fyll drikking tilførselen av mus med DSS løsningen og beregne 5 mL væske per musen per dag. Gi det samme drikkevannet uten DSS til kontroll mus10.
      Merk: Overvåke musene daglig til slutten av eksperimentet. Euthanize musene som mister mer enn 20% av kroppsvekten sin første eller som blir døende (dvs. vedvarende bøyd holdning, redusert bevegelighet, anstrengt puste, markert oppreist pels) ifølge lokale retningslinjer på dyr velferd.
  3. Utarbeidelse av fluorescens-mediert tomografi.
    1. Merk ønsket antistoffer (f.eks rotte anti-mus F4/80) med fluorescens fargestoff (f.eks Cyanine7, λeksitasjon: 750 nm, λutslipp: 776 nm) som beskrevet i produsentens protokollen. Dialyze renset antistoff en passende dialyse membran (pore størrelse < 50-100 kDa) mot 1 L 0,15 M natriumklorid for minst 2 timer eller over natten.
      1. Overføre antistoffer til 1 L 0.1 M NaHCO3 og dialyze minst 2 h.
      2. Oppløse den nødvendige mengden av fluorescerende fargestoff i dimethyl sulfoxide (DMSO) (10,8 µL/mg antistoff) og legge den til antistoff løsning. Bruke lysstoffrør fargestoff i 20-fold molar overflødig for å oppnå fargestoff-til-protein forholdet 1:3.
      3. Inkuber i mørket på 4 ° C for 1 h. fjerner umerkede antistoff ved dialyse mot 1 L 0,15 M natrium eller en PD-10 avsalting kolonne og løse i fosfat-bufret saltvann (PBS) i vivo programmet.
      4. Bestemme den endelige antistoff konsentrasjon og merking forholdet ved spectrophotometry.
      5. Måle protein konsentrasjonen på et absorpsjon av 250-330 nm og vurdere flere absorpsjon av fargestoff. Korrigere maksimal opptaket på 280 nm (protein) ved 11% av maksimal opptaket på 750 nm (neste trinn) for Cyanine7 merking.
      6. Måle en fortynning av sammensatt (vanligvis 1:10) på 250-800 nm og ekstra konsentrasjonen av Cyanine7 på 750 nm.
      7. Finn fargestoff-til-protein forholdet som: fargestoff/antistoff = maksimalt absorpsjon på 750 nm / 200.000 / (maksimal absorpsjon på 280 nm - 0,11 x maks absorpsjon på 750 nm) / 170 000.
      8. Holde antistoff løsningen på 4 ° C og skjerme det fra lys å unngå bleking før injeksjon.
    2. Laste inn nødvendig antistoff løsning volumet i sterile sprøyter umiddelbart før injeksjon og skjold fra lys før den brukes.
    3. Bestemme optimale tidspunktet for sonden injeksjon og skanning prosedyre, avhengig av tracer farmakokinetikken.
    4. Bedøve musene bruke 1.5-2.5% inhalert isoflurane i oksygen eller plassere dem trygt i en dedikert restrainer for hale blodåre injeksjon av merket antistoffer.
    5. For full lengde antistoffer, injisere merket antistoff minst 24 h før skanning, for eksempel for anti-musen F4/80 macrophage effekt i murine kolitt. Injisere mus intravenøst (IV) via halen vene med merket antistoff tilsvarende 2.0 nmol fargestoff.
    6. Bruk like merket uspesifikke antistoffer (f.eks rotte IgG eller en annen isotype tilsvarer den primære antistoff arv) som en isotype kontroll i doser tilsvarende de spesifikke sonden.
      Merk: Resultatene av in vivo skanner etter injeksjon av kontroll sammensatte kan tjene som en referanse for tolkningen av bestemte sonden bildebehandling data.
    7. Bruk en elektrisk barberhøvel til å barbere av animalske pels i mageregionen å minimere lyset refleksjon og absorpsjon.

2. teknisk utstyr

  1. Bruk en veterinær fluorescens-mediert tomografi (FMT) enhet for liten-dyr fluorescens ( Figur 4).
  2. Opprette en ny studie for hvert prosjekt ved å klikke den "nye studien" knappen og inkluderer studien beskrivelse av relevante tracers, inkludert tenkelig parametere og doser for fremtidig referanse.
  3. I denne studien, opprette kollokvier ifølge respektive studien design (f.eks for bestemt sporer og uspesifikke isotype kontroll) ved å velge "ny studie group" knappen. Utstyre hver kollokviegruppe med respektive antall dyr.
  4. Kalibrere systemet for tracer konstruksjoner.
    1. Utføre kalibrering for hvert sett med tracers normalisere for variasjonen i merking og aktivere kvantitativ måling fra OI data.
    2. Følg instrument produsentens veiledning for kalibrering av hvert individuelle system. etter valg av "Legg til ny tracer", vil systemet gi en guide gjennom trinnene. Gi fortynning av anvendt antistoff løsningen og beregnede absolutt konsentrasjonen av tracer i sonden.
    3. For FMT, bruke en vev-mimicking phantom av definerte tykkelse og absorpsjonen egenskaper (ligner viktig vev) og fyll den med et bestemt antall antistoff løsningen. Måle dette på FMT enheten.
      Merk: Systemet vil bruke referanse måling av angitte sonden, sammen med gitt konsentrasjonen, beregne absolutt tracer konsentrasjoner fra fremtidige i vivo målinger.
  5. Bruke en Oppvarmbar undersøkelse kassett med en temperatur på 42 ° C.
    Merk: Dette hindrer musene blir hypothermic under eksamen.

3. dyr anestesi

  1. Bruke en kontinuerlig strøm av 1,5-2% vol % isoflurane ([2-chloro-2-(difluoromethoxy)-1,1,1-trifluoro-ethane]) og 1,5 L O2/minutt til å bedøve musene.
Bruk spesialdesignet innånding systemer for gnager anestesi (isoflurane vaporizer) enkelt kontrollere bedøvende dybden og minimere ansatte eksponering.
  • Plasser musen i lekkasjefri induksjon kammeret og slå vaporizer for isoflurane forsyning (100% (v/v), 5 vol % i oksygen, 3 L/min). Dataskjerm musen til det er tilbakelent og ubevisste.
  • Legge den i eksamen kassetten stengte, med kontinuerlig isoflurane innånding via forpart på en dose av 100% v/v, 1,5 vol % i oksygen, 1,5 L/min å minimere bevegelse gjenstander under eksamen. For prosedyrer varer lenger enn 5 min gjelde øye ointment musen øynene å hindre hornhinnen skade.
  • Vurdere bedøvende dybde ved å sjekke reflekser. Plasser musen på ryggen; Hvis anestesi er tilstrekkelig, skal musen ikke slå. Knip musen sakte imellom toes; Hvis anestesi er tilstrekkelig, kan ikke beinet trukket (scenen kirurgisk toleranse).

    • 4. fluorescens-mediert tomografi skanning

    Merk: Tilpasse følgende detaljer, som er spesifikke for FMT systemet i denne studere (se Tabell for materiale) for alternativ fluorescens refleksjon tenkelig anordninger eller FMT systemer, etter behov.

    1. Plass bedøvet musen på ryggen i eksamen kassetten.
    2. Utføre skanning prosedyren.
      1. Sett kassetten inn i tenkelig system og Lukk umiddelbart for å sikre kontinuerlig anestesi. Velg passende prøven studiegruppen opprettet tidligere. Velg de administrerte tracer fra rullegardinmenyen for å sikre at verdiene for tracer konsentrasjon beregnes riktig.
      2. Hent fluorescens refleksjon bilde på riktige bølgelengden (720 nm for Cyanine7) for skanning planlegging og disposisjon feltet søk ved å klikke "Hent bilde".
      3. Se at feltet Søk vises som et overlegg på fluorescens refleksjon bildet. Juster den regionen av interesse (f.eks kolon eller mage), unngå luft eller områder av gjenværende pels. Avhengig av bilde målet, angi antall bildet datapunkter innen skanning ved å velge fra grov til middels og fin skanning-feltet oppløsning i menyen til høyre.
        Merk: Vær oppmerksom på at et fint skanning felt kan tilby bedre romlig oppløsning på bekostning av en betydelig lenger skanning tid.
      4. Start data/bildeopptak på valgte bølgelengden ved å klikke "Søk".
        Merk: Skanningen tid for en middels fint skanning av hele magen vil være rundt 5 min; i denne tiden hvert datapunkt er separat opplyst av eksitasjon laser, og den resulterende fluorescensen registreres.
      5. Fjern dyret fra tenkelig kassetten på slutten av søket og tillate dyr å gjenopprette helt før du plasserer det tilbake i buret.
      6. Gjenta FMT hvis anses nødvendig på ulike tidspunkt under eksperimentet (f.eks dager 0, 5 og 9-10 (slutten av eksperimentet)), men vurdere akkumulering av antistoff i kroppen, derfor øke bakgrunnen fluorescens signalet.

    5. etter skanning

    1. Plasser musen i separate bur på et papirhåndkle under en røde lys oppvarming lampe og overvåke musen for tegn på ubehag eller nød til full gjenoppretting. Plass musen tilbake i buret sitt respektive når fullt våken.
    2. Euthanize mus på slutten av eksperimentet av levering av CO2 til isolator på en dose av 100% (v/v), 100 vol % og 3 L/min. Ikke pre fyll kammeret med CO2, som en plutselig eksponering for høye konsentrasjoner av CO2 kunne forårsake lidelse. Kontrollere død etter musen har sluttet å puste påfølgende sekundære Mode av euthanasia som rask cervical forvridning.
    3. Explant kolon av abdominal laparotomy og utføre en ex vivo skanning av explanted kolon, som forklart i fremgangsmåten 4.2.1 - 4.2.4. Åpne hver kolon langs med Metzenbaum kirurgisk saks og rense med saltvann før du forbereder den for videre analyse.
    4. Bruk en skalpell å kutte en 0,5 cm fragment fra det distale kolonet og plasser det straks i en 1.5-mL kryogene rør. Fryse det i flytende nitrogen og store-70 ° c til videre bruk (f.eksmyeloperoxidase (MPO) mål).
    5. Bruke en trestav og rulle opp de resterende langs åpnet kolon fra den distale proksimale øye med mucosa utover ("Rullekake technique"), for histologiske analyser. Plasser forberedelse i et bindemiddel (se Tabell for materiale) og fryse-80 ° C14.

    6. data gjenoppbygging og tolkning

    1. Bruke rekonstrueringsverktøyet av respektive tenkelig programvare for å lage 3D kart fordelingens fluorescens fra tenkelig rådata; skanner legges automatisk til rekonstrueringsverktøyet, når på skanning, funksjonen "Legg til gjenoppbygging kø" er valgt.
      1. Ellers velger skanner fra dropdown menyen under respektive studien og kollokviegruppe, høyreklikk skanningen, og velg «Legg til gjenoppbygging».
    2. Laste inn et datasett i analyseprogramvare for videre analyse. Fra rullegardinmenyen øverst, Velg respektive studien og velg studiegruppen og personlige dyret på menyen til høyre; alle skanninger utført for dette dyret vises. Velg den riktige Skann og klikk "Last."
      Merk: 3D rekonstruksjon fordelingens tracer vises til venstre som et overlegg i utgangspunktet kjøpt fluorescens refleksjon bildet. Modellen kan roteres og forstørret enklere å analysere.
    3. Identifisere foci av uspesifikke etiketten opphopning (f.eks leveren eller urin blæren) på rekonstruerte 3D kart og skille fra målet vev (f.eks tarm eller tarmen).
    4. Fra verktøylinjen, Velg ROI figuren mest passende for målet. Etiketten vevet som områder av interesse (ROI) ved å plassere respektive måleverktøyene i analyseprogramvare; programvaren vil gi en fluorescens intensitet for av avkastning, samt (pico-) molar mengder tracer at skanningen er kalibrert for.
    5. Velg den totale mengden tracer i riktig Avkastningen, normalisert for avkastning størrelsen, som den mest passende for vurdering av sykdomsaktivitet i sammenheng med den inflammatoriske infiltrere (histology).
      Merk: Andre funksjoner av Avkastningen kan velges eventuelt som representant for modellen.

    7.Ex Vivo Analyser

    1. Hematoxylin og eosin flekker og immunofluorescence flekker.
      1. Deparaffinize inndelinger ved å plassere dem i 70% etanol (EtOH) i 2 minutter; Skyll med destillert vann etterpå. Flekker med hematoxylin løsning for 5 min og senere skyll med varmt vann fra springen i 10 min.
      2. Skyll med destillert vann, counterstain med eosin løsning i 2 minutter, og skyll igjen med destillert vann.
      3. Sted i 70% EtOH, 96% EtOH, 99% EtOH og xylen (2 ganger) i 2 minutter hver tørke og slette delene. Montere med resinous montering medium.
    2. Immunofluorescence flekker.
      1. Bruk avsnittene tidligere fått vev («sveitsisk roll") til immunofluorescence farging og forberede cryo-kutt deler av 7 µm.
      2. Blokkere aceton-fast og frosne kolon inndelinger i 5.0% rotten serum for 10 min og ruge over natten med fortynnet (1/500 v/v) biotinylated primære rotte anti-musen F4/80 antistoff. Vask delene tre ganger i Tris-bufret saltvann (SS) og ruge med Streptavidin-FITC (1: 100 v/v) i PBS/BSA (0,1% w/v) overnatting på 4 ° C.
      3. Vask avsnittene i SS og flekker med 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 1:1000 v/v) å oppnå kontrast. Analysere fluorescens bildene under AC confocal mikroskop (se Tabell av materialer, 40 x forstørrelse; filter kube N2.1 med eksitasjon filter 515-560) og telle F4/80-positiv celler per høyeffekts felt.
        Merk: Vurder å bruke antistoffer i samme klone og formater kombineres i vivo FMT og post mortem histology analyser som immunohistochemistry eller immunofluorescence flekker, avhengig av det tiltenkte målet. For påvisning av F4/80-positiv makrofager i vivo og ex vivo, ble ulike formater brukt.
    3. MPO målinger i kolon prøver.
      1. Bruk ferske innhentet, PBS-skylles kolon prøver eller tinte prøven for MPO målinger. Veie alle prøver og homogenize vevet i lyseringsbuffer i ELISA kit (se Tabell for materiale) på et volum på 20 µL av lyseringsbuffer per mg av vev.
      2. Sonicate for 15 s (sonication frekvens: 20 kHz, makt: 70 W) og sentrifuge prøvene i 10 min 200 x g og 4 ° C.
      3. Bruk en kommersielt tilgjengelig ELISA kit (se Tabell for materiale) ifølge produserer beskrivelsen. Utføre testen i duplikater.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Vurdering av kolitt:

    DSS-indusert kolitt er en kjemisk indusert murine intestinale betennelsen som ligner menneskelige IBD og fører til vekttap, rektal blødning, overfladiske sår og mucosal skade på følsomme mus15. Det er spesielt nyttig å studere bidrag av det medfødte immunsystemet til utviklingen av intestinale betennelsen10,11. Å potently indusere colitic betennelse, mus var kontinuerlig administrert DSS hele eksperimentet. Synkende kroppsvekt og fecal okkulte blod ble brukt som klinisk indekser av betennelse. Som vist i figur 1A, begynte mus å miste startvekt på dag 4 etter induksjon av kolitt, mens kontrollen dyr mottar vann alene viste ingen vesentlige endringer i kroppsvekt. I tillegg colitic dyr viste økt utskillelse av okkult blod med avføring (figur 1B), som vurdert ved hjelp av følgende hemoccult poengsystem: 0 (ingen blod), 1 (hemoccult positive), 2 (hemoccult positive og visuelle pellet blødning) og 4 ( brutto blødning, blod rundt anus)16. Kolon lengde ble målt for å evaluere betennelse-indusert colonic forkortelse, avslørende betydelig forkortet kolon i colitic mus mot kontroll mus mottar vann alene (figur 1 c). Å direkte vurdere colonic skade, var histologiske analyse utført på slutten av eksperimentet. En kvantitativ vurdering av histologiske skade ble utført på colonic H & E-farget seksjoner med en total skade core basert på grad og omfanget av betennelse, krypten skade og prosent engasjement17. Colitic mus viste tegn til alvorlig betennelse, mens kontroll mus mottar ingen DSS viste ingen histologiske skade (figur 1 d). Bildene viser karakteristiske inflammatoriske endringer i DSS-indusert kolitt, preget av ødeleggelsen av epitelial arkitektur, av fangen celler, krypten skade og mucosal sårdannelse, i motsetning til de i stor grad bevart mucosal arkitektur i kontroll mus18. Statistisk forskjellene mellom gruppene (n = 5 per gruppe) ble beregnet ved variansanalyse (ANOVA) etterfulgt av Student-Newman-Keuls (S.N.K.) innlegget hoc teste eller av Welch's test etterfulgt av spill-Howell legge hoc test ved betydelig avvik inhomogeneity. En p-verdien av < 0,05 ble ansett som viktig.

    Vurdering av Monocyte og Macrophage rekruttering:

    Som DSS-indusert kolitt er knyttet til infiltrasjon av immunceller, som monocytter og makrofager, i slimhinnene og submucosa av kolon, brukte vi immunofluorescent flekker for monocytt/macrophage markøren F4/80 for å kvantifisere infiltrere. Colitic mus mottar DSS viste betydelig opphøyet antall monocytter infiltrert i tykktarm veggen i forhold til ikke-colitic kontroll mus (figur 2A). Leukocytter infiltrasjon ble i tillegg kvantifisert bruker immunofluorescent flekker for nøytrofile markøren GR1, avslørende betydelig økt innvandring av nøytrofile inn i betente tykktarmen sammenlignet med kontroll mus (figur 2B). For å bekrefte, MPO var nivåer reflekterer både nøytrofile nummer og provoserende aktivitet betydelig opphøyet i kolon vevet colitic mus (figur 2C). ANOVA og S.N.K. innlegg hoc test ble brukt til å beregne den statistiske betydningen mellom gruppene (n = 5 per gruppe). Statistisk betydning ble satt på p < 0,05.

    Systemisk endringer i Macrophage Subpopulation:

    Musen monocytter omfatter en heterogen gruppe forskjellige subpopulasjoner som avviker i modning tilstand og deres evne til å bli rekruttert til inflammatorisk nettsteder, hvor de deltar i å initiere og perpetuating betennelsesreaksjon19 . Derfor vi preget blood reaksjoner ved å analysere differensial uttrykk for CD11b og Ly6C bruker flow cytometri. Under inflammatoriske tilstander av akutt DSS kolitt observerte vi en betydelig økning i inflammatorisk CD11bhøy. Ly6Chøy monocytter i forhold til før eksperimentet forhold. Dette skiftet derimot ikke skje i ikke-colitic kontroll mus uten DSS (figur 3A). Dataene (n = 5 per gruppe) ble analysert ANOVA og S.N.K. Som en ekstra surrogat parameter for systemisk betennelse vurdert vi tilstedeværelsen av F4/80-positiv celler i milten colitic mus sammenlignet med ikke-colitic kontroller, som viste en betydelig økning i DSS-behandlet mus (Figur 3 c).

    Fluorescens-mediert tomografi skanning:

    Vi brukte fluorescens-mediert tomografi måle monocytt/macrophage rekruttering og infiltrasjon i tarmen mucosa. En fluorescens-merket antistoff mot murine F4/80 var ansatt direkte visualisere aktivert makrofager i levende dyr. Merket, uspesifikke rotte IgG-antistoffer ble brukt som kontrollen isotype. For skanning, ble mus barbert i mageregionen å minimere lyset refleksjon av pelsen anesthetized av kontinuerlig isoflurane tilbud og undersøkt i en veterinær FMT enhet for liten-dyr fluorescens. Som vist i figur 4A, induksjon av kolitt førte til en betydelig opphøyet akkumulering av fluorescerende tracer i kolon colitic mus i forhold til ikke-colitic kontroller, som indikerer en økning i monocytt infiltrasjon og differensiering i aktive makrofager i colitic dyr. Anvendelsen av en uspesifikke fluorescens-merket IgG ikke framprovosere synlig fluorescens svar i magen og tarmen, verken i colitic (DSS) eller gruppen ikke colitic (vann) viser spesifisitet av sonden-målet samspillet av antistoffer F4/80 (figur 4A). Representant bilder av mageregionen vises. Fargekode angir fluorescens intensitet, som tilsvarer omfanget av inflammatoriske infiltrere()figur 4B og 4 C).Ex vivo målinger av F4/80-rettet tracer akkumulering i explanted kolon bekreftet colonic opprinnelsen av i vivo oppdaget F4/80 tracer opphopning (figur 5A og 5B). Beregnede beløpene bundet antistoff korrelert godt (R2 = 0.52) med histologisk bestemt antall infiltrere makrofager (figur 5C og 5 D), bekrefter at i vivo -bildebehandling med bestemte tracers kan være indikativ av lokale sykdomsaktivitet. Dataene ble analysert av ANOVA og S.N.K. legge hoc test med statistiske betydning nivå satt på p < 0,05. Korrelasjon ble beregnet som lineær regresjon.

    Figure 1
    Figur 1 . Klinisk parametere og histologiske skader i løpet av akutt DSS kolitt.
    C57BL/6 mus ble utfordret med DSS (2% w/v) i drikkevann i 8 dager. Kontroll mus fikk drikkevann uten DSS. Dyrene var euthanized på dag 9. Vises data fra et eksperiment (n = 5 per gruppe) ± standard feil av gjsnitt (SEM). (A) endringer i kroppsvekt presenteres i forhold til første vekten. (B) blod utskillelse i avføring, som bestemmes av guaiac papir testen (hemoccult, 0 = negativ, 4 = blod macroscopically). (C) Post mortem kolon lengde. (D) histologiske skade som vurdert av graden av crypt skade og omfanget av betennelse. Vises representant histologiske bilder (haematoxylin/eosin flekker; forstørrelse: 10 x (øvre panel), 20 x (nedre panel)) colitic (venstre panel) eller kontroll (høyre panel) mus. Merk dyp ødeleggelsen av epitelial arkitektur og provoserende infiltrerer (pilspisser). Stolpediagrammet: skade score. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figure 2
    Figur 2 . Intestinal monocytt og macrophage infiltrere.
    DSS kolitt ble indusert i C57BL/6 av anvendelsen av DSS (2% w/v) i drikkevannet. Kontroll mus fikk drikkevann alene. Dataene fra n = 5 mus per gruppe vises ± SEM. (A) Immunofluorescent visualisering av macrophage infiltrasjoner i mucosa. Vises representant bilder av anti-F4/80 farging i colitic og mus. Stolpediagrammet: cellen teller/høy makt feltet (HPF). (B) Immunofluorescent visualisering av mucosa nøytrofile infiltrasjoner. Vises representant bilder av anti-Gr-1 flekker i colitic dyr og kontroller. Stolpediagrammet: celle teller/HPF. (C) MPO konsentrasjon i colonic vevet colitic og ikke-colitic mus. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figure 3
    Figur 3 . Monocytt rekruttering intestinal rommet.
    Perifert blod monocytter fra colitic mus samt kontroll mus (n = 5 per gruppe) ble analysert av flowcytometri for uttrykket av Ly - 6C på CD11b-positive celler. Celler er sortert basert på SSC og CD11b. Musen monocytter ble identifisert som SSClavCD11bhøy celler, og deres Ly6C uttrykk ble analysert. (A) proporsjonal endres mot inflammatorisk Ly6Chøy monocytter er avbildet i forhold til før eksperimentet forhold (% endre ± SEM). (B) FACS dot plott av Ly6C uttrykk på SSClowCD11bhøy celler colitic dyr før og etter kolitt induksjon (nedre paneler) og kontroller pre og post eksperiment (øvre panel). (C) Splenocytes fra colitic og ikke-colitic mus ble vurdert for uttrykket av F4/80 av flowcytometri (mener fluorescens intensitet ± SEM). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figure 4
    Figur 4 . Tomographic visualisering av macrophage infiltrere i murine kolitt.
    FMT skanner i colitic mus og ikke colitic kontroller administrert Cyanine7-konjugerte antistoffer mot murine F4/80 (n = 5 per gruppe). Søylediagram for (A) : totalt fluorescens intensitet i pmol fargestoff ble bestemt i Avkastningen og avbildet ± SEM. representant bilder vises med fargekodet fluorescens intensitet tilsvarer omfanget av inflammatoriske infiltrere i mus injisert med bestemte sonden (anti-mus F4/80) (B) og en uspesifikke kontroll (rat IgG) (C). I begge tilfeller ble en avkastning like store plassert tverrgående i øvre magen for videre analyse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figure 5
    Figur 5 . Ex vivo validering av tracer spesifisitet i murine kolitt.
    I vivo FMT skanner i colitic mus injisert med bestemte sonden (anti-mus F4/80) ble fulgt av ex vivo planar fluorescens skanninger av explanted tarmen å demonstrere colonic opprinnelsen av tracer fikk i vivo. Data fra to eksperimenter med totalt n = 8 dyr vises. Representant bilder vises som viser i vivo FMT skanner colitic mus med fargekodet fluorescens intensitet tilsvarer omfanget av inflammatoriske infiltrere (A).Fluorescens refleksjon bildebehandling av explanted tarmen gir mulighet for identifisering av regioner med tracer akkumulering (B). Representant post mortem immunofluorescent flekker for F4/80-positiv makrofager fra områder bekrefter i vivo resultatene (C). Antall infiltrere makrofager, som bestemmes av immunofluorescence flekker, var korrelert med i vivo målt tracer akkumulering (D). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Selv om medisinske Bildeteknikker har utviklet seg raskt de siste årene, er vi fremdeles begrenset i vår evne til å oppdage inflammatoriske prosesser eller svulster, samt andre sykdommer, i deres tidligste stadiene av utviklingen. Dette er imidlertid avgjørende for å forstå tumor vekst, invasjon, eller metastaser utvikling og cellulære prosesser i utviklingen av inflammatoriske lidelser og degenerative, hjerte og immunologiske sykdommer. Mens tradisjonelle Bildeteknikker stole på fysisk eller fysiologiske parametere, kan molekylær bildebehandling visualisering av bestemte molekylære markører i vivo20.

    For liten-dyr bildebehandling, kan radionuklidenes-drevet tilnærminger (f.eks snoe-fotonet utslipp beregnet tomografi (SPECT) og fantes et positron utslipp tomografi (PET)), ultralyd og fluorescens-mediert bildebehandling brukes å visualisere bestemt molekylære mål strukturer. Langvarig etiketter, som lang sirkulasjon tider og langsom vev penetrasjon forsinkelse av avbildning etter tracer programmet krever bruk av full lengde antistoffer som mest tilgjengelige tracer ryggraden. Typisk tenkelig Radionuklider er derfor ikke egnet for i vivo avbilding av antistoff distribusjon. Bruk av lang-levende isotoper som Cu64 eller In111 kan antistoff-baserte tracers men krever en kompleks infrastruktur spenner isotop generasjon, stråling sikkerhet før og under merking prosedyren og skjermet dyr bolig etter sonde søknad. Mer kostnadseffektiv og tryggere varianten vil være fluorescens-mediert imaging.

    Flere i vivo imaging systemer for gjenkjenning, har visualisering og måling av fluorescerende fargestoff distribusjon i levende dyr blitt presentert over siste tiårene21. De fleste systemer aktiverer rask planar imaging egnet for overfladisk lesjon bildebehandling. Lys absorpsjon og spredning, signaler dypt i vevet unngå planar bildebehandling. Mest fremtredende oppløsningen for denne problem er fluorescens tomografi22. Basert på matematisk modellering, bildet signal er rettet for spredning og lys absorpsjon og virtuelle 3D dataset beregnes fra flere projeksjon dataset8. Algoritmen gir fullstendig kvantitative data, aktivere estimering av tracer konsentrasjonen i bestemte regioner representant for målet konsentrasjon/uttrykk23. En relevant begrensning av FMT knyttet til dårlig romlig oppløsning i forhold til anatomiske Bildeteknikker, som kan-avhengig av ønsket mål-kompromiss tildeling av molekylære informasjonen til bestemte anatomiske strukturer. En annen begrensning ligger i begrenset penetrasjon dybden av lys inn i vev, som krever bruk av sonder absorbere og fluorescing i rødt NIR spectral utvalg23.

    En nylig introdusert tenkelig modalitet som kombinerer fordelene med morfologiske ultralyd og muligheten for å skaffe molekylære informasjonen fra fluorescens imaging er optoacoustic bildebehandling. Foreløpige resultater fra studier tyder på at til tross behov for videre teknisk raffinement-optoacoustic imaging har store løftet for molekylær bildebehandling og potensielle translasjonsforskning programmer24.

    Rekruttering av leukocytter til tarmveggen er et viktig skritt i innvielsen og opprettholdelse av IBD som er rekruttering av inflammatoriske celler til området av infeksjon eller betennelse i mange immun-mediert sykdom, som autoimmun sykdom, infeksjon, vaskulær sykdom, tumorigenesis og mange flere25. Som monocytt aktivisering og infiltrasjon i tarmen er et viktig skritt i patogenesen av IBD, er hemming av monocyte infiltrasjon, orkestrert av chemokines og integrin-mobilnettet vedheft molekyl interaksjon, en lovende terapeutiske nærme12,26. Derfor er overvåking leukocytter smuglingen til området av betennelse viktig i utviklingen av nye behandlingsalternativer å visualisere de anti-inflammatoriske effektene av studerte narkotika. Dette kan være av spesiell interesse fordi agenter målretting leukocytter menneskehandel har blitt utviklet, og noen anti-integrin antistoffer er allerede tilgjengelig for IBD terapi, mens ytterligere komponenter blir tilgjengelig i nær fremtid26. Vedolizumab, et humanized monoklonalt antistoff mot gut-spesifikke α4β7 integrin delenhet og Etrolizumab, som binder β7 delenhet intestinal α4β7 og αEβ7 integrin heterodimerer, har vært godkjent27,28. Andre stoffer (f.eks MAdCAM-1 PF-00547659 og sphingosine-1-fosfat (S1P) reseptoren modulatorer som Ozanimod) er for tiden under evaluering for behandling av IBD29,30.

    Når du utfører FMT, omfatter endres av teknikken valg av forskjellige tracer mål kombinasjoner, samt kombinere FMT med strukturelle imaging tilnærminger til å kompensere for dårlig romlig oppløsning. En rekke sonde mål kombinasjoner er etablert og kommersialisert. For konkrete prosjekter, merking av egendefinerte antistoffer kan være gjort bruke kommersielle merking kits og ovenfor beskrevet protokollen. Avhengig av antistoff eller mindre peptid valgt som målretting moiety, tilbyr kommersielle leverandører en rekke forskjellige etiketter. Vurdere ønsket fargestoff, avhengig av programmet: for dyp-vev imaging, en farge i NIR spekteret (f.eks Cy7, λex / em 750/780 nm) kan være godt egnet, mens den generelle lysstyrken og effektiv lys tilførsel av fargestoffer opererer i området nær synlig av spekteret (f.eks GFP analoger) kan være å foretrekke. Nesten alle fargestoffer kan fås som en aktiv ester etiketten lysin-rester av proteiner, samt med alternative bindende moieties, som maleimides for cystein bindingen eller biotin for merking av proteiner utstyrt med bestemte merking koder31 . Valg av etiketten endres ikke prinsippet protokollen men krever liten endringer av merking prosedyren og er viktig for et godt tenkelig resultat. En annen attraktiv endring å overvinne begrensningene i romlig oppløsning er å kombinere FMT med CT eller Mr, slik at merknaden anatomiske strukturer med molekylære informasjonen.Strukturelle informasjonen kan enten ervervet sekvensielt som en priori informasjon eller samtidig som krever hybrid imaging instrumentering32,33.

    Enkelte trinn av protokollen fortjener spesiell oppmerksomhet. Som denne teknikken kan tilpasses for en rekke fluorescerende photoprobes som er rettet mot en rekke spesifikke molekyler representative for ulike molekylære prosesser, er det viktig å ha tilstrekkelig fordelingen av sonder og berikelse i den ønsket mål område. Ideelle tidspunktet for bildebehandling kan variere etter sonde mål kombinasjonen. For eksempel kan antistoff målretting av svulst reseptorer påvirkes av diffusjon hastigheten svulster, opptak og metabolisme av leveren og mulige bivirkninger immunogenic34. Også vurdere aktuelle kontroller for bestemte tenkelig tilnærminger. Bestemt tracers bør alltid valideres mot isotype kontroller reflekterer perfusjon effekter og uspesifikke binding (f.eks Fc reseptor-mediert bindende). Mål-negativ dyr kan tjene som en ekstra kontroll for tracer spesifisitet, hvis slike knockout modeller finnes. Eventuelt kan blokkere eksperimenter utføres for å bevise spesifisitet av antistoffer mål interaksjoner35.

    Følgende er avgjørende skritt om praktiske av prosedyren: (1) nøye bestemme DSS konsentrasjonen brukes, DSS mottakelighet kan variere mellom forskjellige musen stammer og produserer/kladder36. (2) Velg sonde mål kombinasjoner. (3) at rundt 5 min skanningen tid for en tilstrekkelig skanning av hele magen. Det optimale tidspunktet punkt mellom tracer program og tenkelig prosedyren må bestemmes nøye å tillate tracer akkumulering i regionen ønsket mål. For intestinal F4/80 deteksjon i murine kolitt, bør merket antistoffer injiseres 24 timer før skanning. (4) som uspesifikke etiketten opphopning kan oppstå (f.eks i leveren), er det avgjørende å merke riktige vevet som Avkastningen ved å plassere respektive måleverktøyene. Videre bør tilstrekkelig kontroller for uspesifikke tracer distribusjon være inkludert-vurdere uspesifikke isotype kontroller å utelukke perfusjon effekter og knockout eller blokkerer studier for å validere tracer mål interaksjon.

    Typisk feilkilder knyttet til skanning prosedyre og data gjenoppbygging ta feil dyr, avsøke feltet og eksponeringstid. Når posisjonering dyret, skal fluorescing lesjonen være omgitt av vev på alle sider å minimere rekonstruksjon støy. Luftbobler fanget mellom dyr og tenkelig kassetten foran glassplaten kan også øke støy og bør fjernes ved å flytte dyret litt. Over- eller undereksponering av bildet kan kreve et reacquisition søk med endrede eksponeringsinnstillinger, som finnes i skjermbildet Skann (refleksjon bildet blokk: justeringer av foran LED intensitet og eksponering tiden). Kombineres i vivo antistoff-baserte FMT målinger med post mortem histologiske analyser, som immunohistochemistry eller immunofluorescent flekker, bør bruk av antistoffer samme klone og format vurderes. Også, når du utfører gjentatte FMT målinger i de samme dyrene, samme formatene og kloner bør brukes å forhindre mulig kryssreaktivitet eller målretting av ulike epitopes.

    Samlet kan fluorescens mediert-molekylær tomografi repeterende overvåking selvfølgelig sykdom og underliggende patofysiologiske prosesser. Det kan brukes til en mengde biomedisinsk studier og kan være nyttig å akselerere narkotikatesting eller som et objektiv sluttpunkt i individualisert behandling. FMT-målretting av F4/80-uttrykke makrofager i modeller av betennelse gir et verdifullt noninvasive verktøy for å visualisere og kvantifisere infiltrasjon og akkumulering av inflammatoriske celler mens også demonstrere god sammenheng med konvensjonelle readouts.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Forfatterne ikke avsløre.

    Acknowledgments

    Vi takker Ms. Sonja Dufentester, Ms. Elke Weber og fru Klaudia Niepagenkämper for utmerket teknisk assistanse.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Reagents
    Alfalfa-free diet Harlan Laboritories, Madison, USA 2014
    Bepanthen eye ointment Bayer, Leverkusen, Germany 80469764
    Dextran sulphate sodium (DSS) TdB Consulatancy, Uppsala, Sweden DB001
    Eosin Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany E 4382
    Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)                          Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany E 9884
    Florene 100V/V Abbott, Wiesbaden, Germany B506
    Haematoxylin                                                     Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany HHS32-1L
    O.C.T. Tissue Tek compound                                  Sakura, Zoeterwonde, Netherlands 4583 fixative for histological analyses
    Phosphate buffered saline, PBS Lonza, Verviers, Belgium 4629
    Sodium Chloride 0,9% Braun, Melsungen, Germany 5/12211095/0411
    Sodium bicarbonate powder Sigma Aldrich Deisenhofen, Germany S5761
    Standard diet Altromin, Lage, Germany 1320
    Tissue-Tek Cryomold Sakura, Leiden, Netherlands 4566
    Hemoccult (guaiac paper test) Beckmann Coulter, Germany 3060
    Biotin rat-anti-mouse anti-F4/80 antibody Serotec, Oxford, UK MCA497B
    Biotin rat-anti-mouse anti-GR-1  BD Pharmingen, Heidelberg Germany 553125
    Streptavidin-Alexa546 Molecular Probes, Darmstadt, Germany S-11225 excitation/emission maximum:  556/573nm
    Anti-CD11b rat-anti-mouse antibody TC Calteg, Burlingame, USA R2b06
    Purified anti-mouse F4/80 antibody BioLegend, London, UK 123102
    DAPI Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany D9542
    FITC-conjugated anti-Ly6C rat-anti-mouse antibody BD Pharmingen, Heidelberg, Germany 553104
    FACS buffer BD Pharmingen, Heidelberg, Germany 342003
    Cy7 NHS Ester GE Healthcare Europe, Freiburg, Germany PA17104
    MPO ELISA Immundiagnostik AG, Bensheim, Germany K 6631B
    Cy5.5 labeled anti-mouse F4/80 antibody BioLegend, London, UK 123127 ready to use labelled Antibodies (alternative)
    Anti-Mouse F4/80 Antigen PerCP-Cyanine5.5 eBioscience, Waltham, USA 45-4801-80 ready to use labelled Antibodies (alternative)
    DMSO (Dimethyl sulfoxide) Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany 67-68-5
    Isoflurane Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany 792632
    Ethanol Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany 64-17-5
    Bovine Serum Albumins (BSA) Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany A4612
    Tris Buffered Saline Solution (TBS) Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany SRE0032
    Name Company Catalog Number Comments
    Equipment
    FACS Calibur Flow Cytometry System BD Biosciences GmbH, Heidelberg, Germany
    FMT 2000 In Vivo Imaging System PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA FMT2000
    True Quant 3.1 Imaging Analysis Software PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA included in FMT2000
    Leica DMLB Fluorescent Microscope Leica,  35578 Wetzlar, Germany  DMLB
    Bandelin Sonopuls HD 2070 Bandelin, 12207 Berlin, Germany HD 2070 ultrasonic homogenizer
    Disposable scalpel No 10 Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany Z692395-10EA
    Metzenbaum scissors 14cm Ehrhardt Medizinprodukte GmbH, Geislingen, Germany 22398330
    luer lock syringe 5ml Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany Z248010
    syringe needles Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany Z192368 
    Falcon Tube 50ml BD Biosciences, Erembodegem, Belgium 352070

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Bruckner, M., et al. Murine endoscopy for in vivo multimodal imaging of carcinogenesis and assessment of intestinal wound healing and inflammation. J Vis Exp. (90), (2014).
    2. Lewis, J. S., Achilefu, S., Garbow, J. R., Laforest, R., Welch, M. J. Small animal imaging. current technology and perspectives for oncological imaging. Eur J Cancer. 38 (16), 2173-2188 (2002).
    3. Bettenworth, D., et al. Translational 18F-FDG PET/CT imaging to monitor lesion activity in intestinal inflammation. J Nucl Med. 54 (5), 748-755 (2013).
    4. Vowinkel, T., et al. Apolipoprotein A-IV inhibits experimental colitis. J Clin Invest. 114 (2), 260-269 (2004).
    5. Korlach, J., Schwille, P., Webb, W. W., Feigenson, G. W. Characterization of lipid bilayer phases by confocal microscopy and fluorescence correlation spectroscopy. Proc Natl Acad Sci USA. 96 (15), 8461-8466 (1999).
    6. Ntziachristos, V., Tung, C. H., Bremer, C., Weissleder, R. Fluorescence molecular tomography resolves protease activity in vivo. Nat Med. 8 (7), 757-760 (2002).
    7. Ntziachristos, V., Bremer, C., Weissleder, R. Fluorescence imaging with near-infrared light: new technological advances that enable in vivo molecular imaging. Eur Radiol. 13 (1), 195-208 (2003).
    8. Ntziachristos, V., Bremer, C., Graves, E. E., Ripoll, J., Weissleder, R. In vivo tomographic imaging of near-infrared fluorescent probes. Mol Imaging. 1 (2), 82-88 (2002).
    9. Ballou, B., et al. Tumor labeling in vivo using cyanine-conjugated monoclonal antibodies. Cancer Immunol Immunother. 41 (4), 257-263 (1995).
    10. Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nat Protoc. 2 (3), 541-546 (2007).
    11. Kawada, M., Arihiro, A., Mizoguchi, E. Insights from advances in research of chemically induced experimental models of human inflammatory bowel disease. World J Gastroenterol. 13 (42), 5581-5593 (2007).
    12. Nowacki, T. M., et al. The 5A apolipoprotein A-I (apoA-I) mimetic peptide ameliorates experimental colitis by regulating monocyte infiltration. Br J Pharmacol. 173 (18), 2780-2792 (2016).
    13. Hansch, A., et al. In vivo imaging of experimental arthritis with near-infrared fluorescence. Arthritis Rheum. 50 (3), 961-967 (2004).
    14. Bialkowska, A. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. Improved Swiss-rolling Technique for Intestinal Tissue Preparation for Immunohistochemical and Immunofluorescent Analyses. J Vis Exp. (113), (2016).
    15. Diaz-Granados, N., Howe, K., Lu, J., McKay, D. M. Dextran sulfate sodium-induced colonic histopathology, but not altered epithelial ion transport, is reduced by inhibition of phosphodiesterase activity. Am J Pathol. 156 (6), 2169-2177 (2000).
    16. Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. Investigating intestinal inflammation in DSS-induced model of IBD. J Vis Exp. (60), e3678 (2012).
    17. Dieleman, L. A., et al. Chronic experimental colitis induced by dextran sulphate sodium (DSS) is characterized by Th1 and Th2 cytokines. Clin Exp Immunol. 114 (3), 385-391 (1998).
    18. Kojouharoff, G., et al. Neutralization of tumour necrosis factor (TNF) but not of IL-1 reduces inflammation in chronic dextran sulphate sodium-induced colitis in mice. Clin Exp Immunol. 107 (2), 353-358 (1997).
    19. Sunderkotter, C., et al. Subpopulations of mouse blood monocytes differ in maturation stage and inflammatory response. J Immunol. 172 (7), 4410-4417 (2004).
    20. Willmann, J. K., van Bruggen, N., Dinkelborg, L. M., Gambhir, S. S. Molecular imaging in drug development. Nat Rev Drug Discov. 7 (7), 591-607 (2008).
    21. Ntziachristos, V., Ripoll, J., Wang, L. V., Weissleder, R. Looking and listening to light: the evolution of whole-body photonic imaging. Nat Biotechnol. 23 (3), 313-320 (2005).
    22. Ntziachristos, V. Going deeper than microscopy: the optical imaging frontier in biology. Nat Methods. 7 (8), 603-614 (2010).
    23. Stuker, F., Ripoll, J., Rudin, M. Fluorescence molecular tomography: principles and potential for pharmaceutical research. Pharmaceutics. 3 (2), 229-274 (2011).
    24. Beziere, N., Ntziachristos, V. Optoacoustic imaging: an emerging modality for the gastrointestinal tract. Gastroenterology. 141 (6), 1979-1985 (2011).
    25. Habtezion, A., Nguyen, L. P., Hadeiba, H., Butcher, E. C. Leukocyte Trafficking to the Small Intestine and Colon. Gastroenterology. 150 (2), 340-354 (2016).
    26. Ungar, B., Kopylov, U. Advances in the development of new biologics in inflammatory bowel disease. Ann Gastroenterol. 29 (3), 243-248 (2016).
    27. Sandborn, W. J., et al. Vedolizumab as induction and maintenance therapy for Crohn's disease. N Engl J Med. 369 (8), 711-721 (2013).
    28. Vermeire, S., et al. Etrolizumab as induction therapy for ulcerative colitis: a randomised, controlled, phase 2 trial. Lancet. 384 (9940), 309-318 (2014).
    29. Coskun, M., Vermeire, S., Nielsen, O. H. Novel Targeted Therapies for Inflammatory Bowel Disease. Trends Pharmacol Sci. , (2016).
    30. Vermeire, S., et al. The mucosal addressin cell adhesion molecule antibody PF-00547,659 in ulcerative colitis: a randomised study. Gut. 60 (8), 1068-1075 (2011).
    31. Terai, T., Nagano, T. Small-molecule fluorophores and fluorescent probes for bioimaging. Pflugers Arch. 465 (3), 347-359 (2013).
    32. Ren, W., et al. Dynamic Measurement of Tumor Vascular Permeability and Perfusion using a Hybrid System for Simultaneous Magnetic Resonance and Fluorescence Imaging. Mol Imaging Biol. 18 (2), 191-200 (2016).
    33. Ale, A., Ermolayev, V., Deliolanis, N. C., Ntziachristos, V. Fluorescence background subtraction technique for hybrid fluorescence molecular tomography/x-ray computed tomography imaging of a mouse model of early stage lung cancer. J Biomed Opt. 18 (5), 56006 (2013).
    34. Chames, P., Van Regenmortel, M., Weiss, E., Baty, D. Therapeutic antibodies: successes, limitations and hopes for the future. Br J Pharmacol. 157 (2), 220-233 (2009).
    35. Faust, A., Hermann, S., Schafers, M., Holtke, C. Optical imaging probes and their potential contribution to radiotracer development. Nuklearmedizin. 55 (2), 51-62 (2016).
    36. Mahler, M., et al. Differential susceptibility of inbred mouse strains to dextran sulfate sodium-induced colitis. Am J Physiol. 274 (3 Pt 1), G544-G551 (1998).

    Tags

    Medisin problemet 130 medisin gastroenterologi i vivo bildebehandling diagnostic imaging eksperimentelle kolitt dekstran sulfat natrium kolitt inflammatorisk tarmsykdom fluorescens bildebehandling
    Fluorescens-mediert tomografi av kvantifisering av Macrophage-relaterte Murine intestinale betennelsen
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Nowacki, T. M., Bettenworth, D.,… More

    Nowacki, T. M., Bettenworth, D., Brückner, M., Cordes, F., Lenze, F., Becker, A., Wildgruber, M., Eisenblätter, M. Fluorescence-mediated Tomography for the Detection and Quantification of Macrophage-related Murine Intestinal Inflammation. J. Vis. Exp. (130), e55942, doi:10.3791/55942 (2017).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter