Summary
Här presenterar vi en pålitlig och enkel analys för att mäta glykogeninnehållet i cyanobakteriella celler. Förfarandet medför utfällning, selekterbar depolymerisation och detektering av glukosrester. Denna metod är lämplig för både vildtyp och genetiskt manipulerade stammar och kan underlätta den metaboliska verkningen av cyanobakterier.
Abstract
Cyanobakterier ackumulerar glykogen som ett stort intracellulärt kol- och energilagring under fotosyntesen. Den senaste utvecklingen inom forskning har framhävt komplexa mekanismer för glykogenmetabolism, inklusive dielcykeln för biosyntes och katabolism, redoxreglering och involvering av icke-kodande RNA. Samtidigt görs ansträngningar för att omdirigera kol från glykogen till önskvärda produkter i genetiskt manipulerade cyanobakterier för att förbättra produktutbytet. Flera metoder används för att bestämma glykogeninnehållet i cyanobakterier, med varierande noggrannhet och tekniska komplexiteter. Här tillhandahåller vi ett detaljerat protokoll för pålitlig bestämning av glykogenhalten i cyanobakterier som kan utföras i ett standardvetenskapligt laboratorium. Protokollet innefattar selektiv utfällning av glykogen från celllysatet och den enzymatiska depolymerisationen av glykogen för att alstra glukosmonomerer som detekteras av en glukosoxIdase-peroxidas (GOD-POD) enzymkopplad analys. Metoden har applicerats på Synechocystis sp. PCC 6803 och Synechococcus sp. PCC 7002, två modeller cyanobakteriella arter som används i stor utsträckning inom ämnesmetodik. Vidare visade metoden framgångsrikt skillnader i glykogeninnehållet mellan vildtypen och mutanterna defekta i regulatoriska element eller glykogenbiosyntetiska gener.
Introduction
Cyanobakterier ackumulerar glykogen som den största kolhydratlagret av kol från CO 2 fixerad i ljus genom fotosyntes. Glykogen är en glykan bestående av linjär a-1,4-kopplad glukan med grenar skapade av a-1,6-länkade glukosylbindningar. Glykogenbiosyntes i cyanobakterier börjar med omvandlingen av glukos-6-fosfat till ADP-glukos genom sekventiell verkan av fosfoglukomutas och ADP-glukospyrofosforylas. Glukosdelen i ADP-glukos överförs till den icke-reducerande änden av a-1,4-glukan-ryggraden av glykogen med en eller flera glykogensyntaser (GlgA). Därefter introducerar en förgreningsenzymer den a-1,6-bundna glukosylbindningen, vilken vidare förlängs för att generera glykogenpartikeln. I mörkret bryts ned glykogen av glykogenfosforylas, glykogenförgreningsenzymer, a-glukanotransferas och maltodextrinfosforylas i fosforylerad glukos och fri glukos. Dessa foder intO kataboliska vägar, inklusive oxidativ pentosfosfatvägen, Embden-Meyerhof-Parnas-vägen (glykolys) och Entner-Doudoroff-vägen 1 , 2 , 3 , 4 .
Glykogenmetabolism i cyanobakterier har ökat intresse för de senaste åren på grund av att cyanobakterierna kan utvecklas till mikrobiella cellfabriker drivna av solljus för att producera kemikalier och bränslen. Glykogenmetabolism kan modifieras för att öka utbytet av produkterna, eftersom glykogen är den största flexibla kolpumpen i dessa bakterier. Ett exempel är cyanobakteriet Synechococcus sp. PCC 7002, som har blivit genetiskt konstruerad för att producera mannitol; Den genetiska störningen av glykogensyntes ökar mannitolutbytet 3 gånger 5 . Ett annat exempel är produktionen av bioetanol från glykogenbelastad vildYpe Synechococcus sp. PCC 7002 6 . Glykogenhalten av vildtypscell kan vara upp till 60% av cellens torrvikt under kvävehushållning 6 .
Vår förståelse av glykogenmetabolism och reglering har också ökat de senaste åren. Medan glykogen är känd för att ackumuleras i ljuset och kataboliseras i mörker, avslöts detaljerad kinetik av glykogenmetabolism under dielcykeln först nyligen i Synechocystis sp. PCC 6803 7 . Dessutom har flera gener som påverkar ackumuleringen av glykogen identifierats. Ett anmärkningsvärt exempel är upptäckten att det förmodade histidinkinaset PmgA och det icke-kodande RNA PmgRl bildar en regulatorisk kaskad och kontrollerar ackumuleringen av glykogen. Intressant ackumulerar pmgA- och pmgRl- deletionsmutanterna dubbelt så mycket glykogen som vildtypstammen av Synechocystis sp. PCC 68038 , 9 . Andra regleringselement är också kända för att påverka ackumulationen av glykogen, inkluderande den alternativa sigmafaktorn E och transkriptionsfaktorn CyAbrB2 10 , 11 .
Eftersom intresset för glykogenreglering och metabolism växer, är ett detaljerat protokoll som beskriver bestämningen av glykogeninnehållet motiverat. Flera metoder används i litteraturen. Syrahydrolys följt av bestämning av monosackaridhalten genom högtrycksanjonbytningsvätskekromatografi kopplad med en pulserad amperometrisk detektor eller spektrometrisk bestämning efter behandlingar med syra och fenol är allmänt använda metoder för att approximera glykogenhalten 9 , 10 , 12 , 13 . Emellertid en högtrycksanjonbyte vätskekromatografiC-instrumentet är mycket dyrt och diskriminerar inte glukos härledd från glykogen från det som härrör från andra glukosinnehållande glykokonjugat, såsom sackaros 14 , glukosylglycerol 15 och cellulosa 16 , 17 , 18 , vilka är kända att ackumulera i vissa cyanobakteriella arter. Syra-fenolmetoden kan utföras med standard laboratorieutrustning. Det använder emellertid högtoxiska reagens och skiljer inte glukos härledd från olika glykokonjugat, och skiljer inte heller glukos från andra monosackarider som utgör cellulära material, såsom glykolipider, lipopolysackarider och extracellulära matriser 12 . Speciellt används den heta syren-fenolanalysen ofta för bestämning av total kolhydrathalt i stället för för bestämning av glukoshalt 12 . Enzymatisk hyDrolys av glykogen till glukos genom a-amyloglukosidas följt av detektering av glukos genom en enzymkopplad analys alstrar en kolorimetrisk avläsning som är mycket känslig och specifik för glukos härledd från glykogen. Specificiteten kan förbättras ytterligare med preferentiell utfällning av glykogen från celllysat med etanol 5 , 8 , 19 .
Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för en enzymbaserad analys av glykogenhalten i två av de mest studerade cyanobakteriella arterna, Synechocystis sp. PCC 6803 och Synechococcus sp. PCC 7002, i vildtyp och mutantstammar. För att säkerställa effektiv hydrolys användes en cocktail av a-amylas och a-amyloglukosidas 8 . Det endo-verkande a-amylaset hydrolyserar a-1,4-bindningarna i olika glukaner i dextrin, som vidare hydrolyseras tO glukos genom exo-verkande a-amyloglukosidas 20 . De synergistiska effekterna av dessa enzymer är välkända, och dessa enzymer används rutinmässigt för selektiv hydrolys av stärkelse, som är en a-bunden glukanliknande glykogen, utan att påverka andra glykokonjuganter, såsom cellulosa, i växtbiomassan 21 . Den frisatta glukosen detekteras kvantitativt efter en enzymkopplad analys bestående av glukosoxidas som katalyserar reduktionen av syre till väteperoxid och oxidationen av glukos till en lakton- och peroxidas-som ger ett rosa färgat kinoniminfärg från väteperoxid, En fenolförening och 4-aminoantipyrin 22 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Framställning
- Cyanobakteriella kulturer
- Växa Synechocystis sp. PCC 6803 vid 30 ° C i flytande BG11 mediet 8, med en konstant tillförsel av luft med tillsats av 1% (volym / volym) CO2. Upplys kulturerna kontinuerligt med ljus vid en fotosyntetisk fotonflödesdensitet på 50 μmol foton / m 2 / s.
- Växa Synechococcus sp. PCC 7002 i flytande A + medium 23 (BG11 medium kan också användas), med konstant tillförsel av luft kompletterad med 1% (volym / volym) CO 2 . Temperaturen bör vara 37 ° C. Lysa kulturerna kontinuerligt med ljus vid en fotosyntetisk fotonflödestäthet på 150 μmol foton / m 2 / s.
- Mäta kulturens optiska densitet (OD) vid 730 nm med användning av en kyvett med en ljusbana på 1 cm. Om OD-värdet är över 0,8, gör lämpliga utspädningar för att erhålla OD-mätningar som är proportionella mot thE-cellkoncentration.
OBS: De protokoll som presenteras nedan är lämpliga för flytande kulturer, med en celltäthet som motsvarar ett OD 730nm- värde av 2 eller högre. När kulturer i exponentiell tillväxtfas önskas, vilka typiskt har ett OD 730nm- värde under 1, koncentrerar celltätheten genom centrifugering och resuspendering i en buffert eller medium för att uppnå ett OD 730nm- värde av 2 eller högre.
- Buffertar och reagenser
- Gör 50 mM Tris-HCl-buffert vid pH 8.
- Gör 50 mM natriumacetatbuffert vid pH 5.
- Gör en stamlösning av 8 U / ml amyloglukosidas i 50 mM natriumacetatbuffert, pH 5.
- Gör en stamlösning av 2 U / ml a-amylas i 50 mM natriumacetatbuffert, pH 5.
- Användning av destillerat vatten, lösningar av makeglukos standard vid koncentrationer mellan 0 och 100 μg / ml.
- Förbered GOD-POD-reagens från D-glukosanalyssatsen (GODPOD Format), fEnligt tillverkarens instruktioner.
2. Bestämning av celltorkvikt (valfritt)
- Överför 2 ml av en kultur eller en cellresuspension (se steg 1.1) till ett 2,0 ml rör och centrifugera vid 6000 xg och 4 ° C i 5 min. Kassera supernatanten.
- Resuspendera pelleten i 1 ml vatten och centrifugera vid 6000 xg och 4 ° C under 5 min. Kassera supernatanten och resuspendera cellpelleten i 0,5 ml vatten.
- Överför suspensionen till en förvägd aluminiumfack. Överför brickan till en torkugn vid 105 ° C för över natten torkning (ca 18 h).
KRITISKA: Det är viktigt att brickan hanteras med tång för att undvika överföring av material från fingrarna. Torka ett tomt, förvägt aluminiumfack under samma förhållanden för att bestämma eventuell viktminskning från brickorna under torkning. - Efter torkning, ta bort brickan ur ugnen och låt den jämviktas vid omgivningstemperaturOns i 5 min innan den väger den med en noggrannhet på 0,0001 g.
OBS: Värdet kan användas för att normalisera glykogenhalten på cell-torrbasis.
3. Lysis av cyanobakteriella celler
- Överför 1 ml av en kultur eller en cellresuspension (se steg 1.1) till ett 1,5 ml rör och centrifugera vid 6000 xg och 4 ° C i 10 min. Kassera supernatanten.
- Resuspendera pelleten i 1 ml 50 mM Tris-HCl, pH 8, och centrifugera vid 6000 xg och 4 ° C i 10 min. Kassera supernatanten och resuspendera cellpelleten i 1 ml av Tris-HCl-bufferten. Upprepa processen.
- Resuspendera pelleten noggrant i 500 pl 50 mM Tris-HCl-buffert, pH 8.
KRITISKA: Resuspendera pelleten väl för en effektiv celllys. Håll resuspenningen i is. - Lyse de resuspenderade cellerna vid 4 ° C genom att utföra 30 cykler med ultraljud, varje cykel bestående av 30 s vid en frekvens av 20 kHz med maximal amplitud,Följt av 90 s utan.
OBS: Denna metod kan effektivt lysa Synechococcus sp. PCC 7002.- Alternativt, överför cellresuspendering till ett skruvkapsrör och tillsätt zirkoniumoxidpärlor till röret enligt tillverkarens instruktioner. Ställ röret i en vävnadshomogenisator och lyssna cellerna vid 4 ° C genom att utföra 2 cykler för att slå, varje cykel bestående av 5 min vid frekvensinställningen 5.
OBS: Denna metod kan effektivt lysa Synechocystis sp. PCC 6803 och Synechococcus sp. PCC 7002.
- Alternativt, överför cellresuspendering till ett skruvkapsrör och tillsätt zirkoniumoxidpärlor till röret enligt tillverkarens instruktioner. Ställ röret i en vävnadshomogenisator och lyssna cellerna vid 4 ° C genom att utföra 2 cykler för att slå, varje cykel bestående av 5 min vid frekvensinställningen 5.
- Centrifugera röret innehållande lysatet under 10 minuter vid 6 000 xg och 4 ° C.
ANMÄRKNING: Pelleten bör huvudsakligen bestå av storcellsavfall. Om det finns ett betydande antal obrutna celler, upprepa steg 3.4. Håll supernatanten på is. - Bestäm proteinkoncentrationen med användning av ett kommersiellt BCA Protein analys kit.
OBS: Värdet kan användas för att normalisera glykogeninnehålletPå proteininnehåll.
4. Glykogenutfällning
- Ta bort klorofyll a från celllysatet genom att blanda 900 | il 96% (volym / volym) etanol och 100 | il av supernatanten från steg 3.5 i ett 1,5 ml skruvkapsrör. Efter stängning av locket värms röret vid 90 ° C i 10 minuter med ett standardlaboratoriumuppvärmningsblock.
- Inkubera röret på is under 30 minuter.
- Centrifugera röret vid 20 000 xg och 4 ° C under 30 minuter och försiktigt avlägsna supernatanten; Pelleten innehåller glykogen. Torka lätt pelleten i luft för att avlägsna överskott av etanol.
KRITISK: Överdriven torkning av pelleten måste undvikas, annars blir det svårt att solubilisera i steg 5.1. - OPTIONAL: Mät absorbansen hos supernatanten erhållen i steg 4.3 vid 664 nm för bestämning av klorofyll a- halten. Använd en absorptionskoefficient på 84,6 L / g / cm 24 .
OBS: Värdet kan användas till normalizE glykogeninnehållet.
5. Enzymatisk hydrolys och glykogenbestämning
- Solubilisera pelleten erhållen i steg 4.3 i 100 | il 50 mM natriumacetat, pH 5, och tillsätt 50 | il 8 U / ml amyloglukosidas och 50 | il 2 U / ml a-amylas. Blanda dessa material väl med en virvel.
OBS: Blandning genom pipettering rekommenderas inte eftersom glykogenpelleten är viskös. - Inkubera blandningen vid 60 ° C på ett värmeblock i 2 h för att möjliggöra uppslutning av glykogen i glukosmolekyler.
- Centrifugera provet vid 10 000 xg under 5 min och överför supernatanten till ett nytt 1,5 ml rör.
6. Bestämning av total glukosinnehåll med hjälp av GOD-POD-reagenset
- Mät koncentrationen av glukos i supernatanten erhållen i steg 5.3 med användning av GOD-POD-reagenset. Överför 100 μL av supernatanten från steg 5.3 till en brunn i en 96-brunnsplatta. Som en negativ kontroll,Använd 100 μl 50 mM natriumacetat, pH 5. För att alstra en kalibreringskurva, mät också glukosstandardlösningarna.
- Tillsätt 150 μL GOD-POD-reagens till varje prov och blanda snabbt genom pipettering.
- Inkubera plattan statiskt vid 25 ° C under 30 minuter. Spela in absorbansvärdet vid 510 nm med hjälp av en plattläsare.
- Beräkna glukoskoncentrationen med hjälp av en kalibreringskurva som erhållits från glukosstandarden.
OBS: Glykogenkoncentrationen i celllysatet uttrycks som glukoskoncentrationen (μg / mL).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
10 ml vildtyp Synechocystis sp. PCC 6803 odlades under fotoautotrofa betingelser tills OD 730nm- värdet nådde approximativt 0,8. Cellerna skördades och resuspenderades i 50 mM Tris-HCl, pH 8. OD 730 nm- värdet justerades till 2-3. Glykogenhalten analyserades enligt protokollet som beskrivits ovan. Glykogenhalten per OD 730 nm var 13 ± 1,8 ug / ml / OD 730 nm ( N = 12). Den glykogeninnehåll i förhållande till proteinhalten var 0,24 ± 0,03 pg / ug (N = 12), och glykogeninnehåll i förhållande till klorofyll a halten var 5,7 ± 0,6 | ig / | ig (N = 12). På grund av den lilla mängd tillgängligt material utelämnades mätningen av cellens torrvikt. Med tanke på att proteininnehållet i cyanobakterier odlade under jämförbara betingelser är ca 50% av cellens torrvikt 25 </ Sup> uppskattas glykogenhalten vara 12% av cellens torrvikt, vilket överensstämmer med tidigare studier 26 .
Detektionsgränserna för GOD-POD-analysen visade en linjär korrelation mellan glukoskoncentrationen och absorbansen vid 510 nm i glukoskoncentrationsområdet mellan 10 och 100 | ig / ml, vilket motsvarade absorbansvärdena på 0,08 och 0,7 vid 510 nm. Den minsta gränsen är sannolikt beroende på den instrumentella detektionsgränsen. När glukoskoncentrationer högre än 150 μg / ml användes bildades mörkgröna fällningar, vilket medförde en stor variation i absorbansavläsningen. När det gäller mängden cellmaterial som användes uppnådde vi rutinmässigt reproducerbart glykogeninnehåll när OD 730nm- värdet av cellresuspension före celllysen var mellan 2 och 10. Cellresuspensioner med ett OD 730nm- värde av 1 eller lägre gav upphov till signaler nära Minsta detekteringslimiT, vilket leder till mycket varierande resultat. Cellresuspension med ett OD 730nm- värde högre än 20 var inte lämpligt eftersom celllysen var ofullständig och antingen förlängd lys eller utspädningar krävdes.
Figur 1 visar representativa resultat av glykogeninnehållet i Synechocystis sp. PCC 6803 vildtyp och två mutantstammar ( ΔpmgA och ΔpmgRl ). Cellerna odlade vid exponentiell tillväxtfas användes. Glykogeninnehållet normaliserades först med det totala proteininnehållet och uttrycktes därefter i förhållande till värdet för vildtypen. Resultaten visar att mutantstammarna har glykogeninnehåll som är minst dubbelt högre än vildtypstammen.
Därefter analyserades glykogeninnehållet i stammar av Synechococcus sp. PCC 7002 konstruerad för att producera mannitol 5 . Den första stammen (Glg +) innehåller vild typ glgA1 och glgA2 gener som kodar för två funktionella glykogen syntaser, medan den andra stammen (Glg -) saknar funktionella kopior av dessa gener 5. Glykogen- och mannitolinnehållet mättes därefter i båda stammarna ( Figur 2 ). Resultaten visar att Glg - saknade en detekterbar nivå av glykogen, medan den producerade mer mannitol än Glg + -stammen. Detta föreslår att kolhydratet syntetiserat genom fotosyntes omdirigeras till mannitol i mutantstammen som saknar förmågan att syntetisera glykogen. OD 730 nm- värdena från kulturerna var ungefär 10, vilket gav tillräckliga cellmaterial för analys av celltorkvikt. Glykogeninnehållet normaliserades med användning av cellens torrvikt.
8 / 56068fig1.jpg "/>
Figur 1: Glykogeninnehållet mätt i olika linjer av Synechocystis sp . PCC 6803. Relativa glykogeninnehåll i WT och i två mutanter (ΔpmgA 9 och ΔpmgR1 8) visas. Glykogenhalten normaliserades av det totala proteininnehållet. Medel av tre biologiska replikat visas med felstänger som representerar standardavvikelser. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Glykogen- och mannitolproduktion i genetiskt manipulerade Synechococcus sp. PCC 7002 5 . glg <Sup> +, stammen syntetiserar mannitol och glykogen. Glg - , stammen syntetiserande mannitol men ingen glykogen. De angivna värdena är medelvärdet av tre biologiska replikat, med felstänger som representerar standardavvikelserna. CDW: celltorkvikt, ND: ej detekterad. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritiska steg inom protokollet är glykogenutfällning och resuspendering. Efter centrifugering efter etanolutfällning bildar glykogen en genomskinlig pellet som löst fastnar vid väggarna i mikrocentrifugrören. När supernatanten avlägsnas måste därför särskild uppmärksamhet ges för att inte avlägsna pelleten. Glykogenpelleten är klibbig och solubilisering kan vara svårt om den torkar ut. Observera att fullständig solubilisering av glykogenpelleten är viktig eftersom ofullständig solubilisering leder till ineffektiv enzymatisk digestion och därför kommer att ge upphov till stora variationer mellan tekniska replikat. Tillämpningen av sonikering före solubilisering genom virvelbildning kan underlätta processen.
När det gäller valet av normaliseringsmetod är cellens torrvikt en allmänt använd referens. Det är mer krävande och kräver mer cellbiomassa än bestämningar av protein och klorofyllA. Det totala proteininnehållet tillhandahåller en alternativ referens till cellbiomassan och kan bestämmas i liten skala, såsom beskrivs i föreliggande protokoll. Den totala proteinhalten per torrcellsbiomassa är typiskt inom området mellan 40% och 50%, fastän det exakta värdet beror på tillväxtbetingelserna 25 , 28 . Klorofyll ett innehåll kan bestämmas lätt och kan användas som en proxy till cell mängd som föreligger i provet. Det är emellertid välkänt att mängden klorofyll a per cell varierar signifikant beroende på tillväxtbetingelserna, speciellt som svar på förändrade näringskoncentrationer och ljusintensiteter 29 .
En av de väsentliga fördelarna med den presenterade tekniken med avseende på andra metoder är att den är mycket selektiv. Den heta syran och fenolprotokollet och monosackaridkompositionsanalysen följerSur hydrolys är relativt enkla metoder och har använts i tidigare studier 9 , 10 , 12 , 13 . Emellertid kan dessa metoder överskatta glykogeninnehållet eftersom icke-glykogenglukos och ytterligare sockerarter kan bidra till mätningen, beroende på kolhydratdetekteringstekniken 12 . Den beskrivna tekniken detekterar selektivt glukos i glykogen. Det kan också diskriminera glukos från cellulosa, eftersom a-amylas och a-amyloglukosidas inte hydrolyserar de p-bundna glukosylbindningarna närvarande i cellulosa. I tidigare studier utfördes enzymatisk hydrolys av glykogen enbart av a-amyloglukosidas 7 , 27 . Inklusion av det endoverkande a-amylaset tillsammans med det exo-verkande a-amyloglukosidaset, som presenteras i detta protokoll, kan säkerställa tHan effektiv hydrolys av glykogen. En liknande selektiv hydrolys appliceras rutinmässigt på behandlingar av växtbiomassa, varvid kombinationen av a-amylas-a-amyloglukosidas används för att hydrolysera stärkelse utan att påverka andra glukosinnehållande polysackarider, såsom cellulosa 21 .
Huvudbegränsningen av tekniken är att proceduren är låg genomströmning eftersom enskilda prov behandlas separat med hjälp av mikrocentrifugrör. Glykogenutfällningssteget är den primära faktorn som förhindrar högre genomströmning. Genomförande som ett högt genomströmningsförfarande skulle kräva användning av djupbrunnsplattor och möjligheten att centrifugera dessa med hög hastighet (20 000 x g ). Medan centrifuger som kan centrifugera plattor med 96 brunnar med nödvändig hastighet finns tillgängliga, kan de flesta djupbrunnsplattor inte tåla kraft större än 6 000 x g . Därför krävs det noggranna materialvalet för att anpassa protokollet för higH-genomströmningsanalys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja.
Acknowledgments
Författarna erkänner Nordic Energy Research (AquaFEED, projekt nr 24), Innovationfonden Danmark (Pant Power, projekt nr 12-131844) och Villum Fonden (projekt nr 13363)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| QSonica Sonicators Q700 | Qsonica, LLC | NA | QSonica |
| SpectraMax 190 Microplate Reader | Molecular Devices | NA | Eliza plate reader |
| Bullet Blender Storm | Next Advance | BBY24M-CE | Beads beater |
| Ultrospec 3100 pro UV/Visible Spectrophotometer | Amersham Biosciences | NA | Spectrophotometer |
| Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | Buffer |
| HCl | Merck | 1-00317 | pH adjutment |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | 32319 | Buffer |
| Amyloglycosidase (Rhizopus sp.) | Megazyme | E-AMGPU | Enzyme for glycogen depolymerization |
| α-Amylase, thermostable (Bacillus licheniformis) | Sigma-Aldrich | A3176 | Enzyme for glycogen depolymerization |
| D-Glucose | Merch | 8337 | Standard for the glucose assay |
| Pierce BCA Protein assay kit | Thermo Fisher scientific | 23225 | For determination of protein concentrations |
| Aluminum drying trays, disposable | VWR | 611-1362 | For determination of cell dry weights |
| D-Glucose assay kit (GODPOD format) | Megazyme | K-GLUC | For determination of glucose concentrations |
| Zirconium oxide breads, 0.15 mm | Next Advance | ZrOB015 | Beads for cell lysis in a Bullet Blendar Storm |
| RINO tubes | Next Advance | NA | Tubes for cell lysis in a Bullet Blendar Storm |
References
- Chen, X., et al. The Entner-Doudoroff pathway is an overlooked glycolytic route in cyanobacteria and plants. Proc Natl Acad Sci USA. 113 (19), 5441-5446 (2016).
- Yang, C., Hua, Q., Shimizu, K. Metabolic flux analysis in Synechocystis using isotope distribution from C-13-labeled glucose. Metab Eng. 4 (3), 202-216 (2002).
- Pelroy, R. A., Levine, G. A., Bassham, J. A. Kinetics of light-dark CO2 fixation and glucose assimilation by Aphanocapsa 6714. J Bacteriol. 128, 633-643 (1976).
- You, L., Berla, B., He, L., Pakrasi, H. B., Tang, Y. J. 13C-MFA delineates the photomixotrophic metabolism of Synechocystis. sp. PCC 6803 under light- and carbon-sufficient conditions. Biotechnol J. 9, 684-692 (2014).
- Jacobsen, J. H., Frigaard, N. U. Engineering of photosynthetic mannitol biosynthesis from CO2 in a cyanobacterium. Metab Eng. 21, 60-70 (2014).
- Möllers, K. B., Cannella, D., Jørgensen, H., Frigaard, N. -U. Cyanobacterial biomass as carbohydrate and nutrient feedstock for bioethanol production by yeast fermentation. Biotechnol Biofuels. 7, 64 (2014).
- Angermayr, S. A., et al. Culturing Synechocystis. sp. strain PCC 6803 with N2 and CO 2 in a diel regime reveals multiphase glycogen dynamics with low maintenance costs. Appl Environ Microbiol. 82, 4180-4189 (2016).
- de Porcellinis, A. J., et al. The Non-coding RNA Ncr0700/PmgR1 is required for photomixotrophic growth and the regulation of glycogen accumulation in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Plant Cell Physiol. 57 (10), 2091-2103 (2016).
- Sakuragi, Y. alpha-Tocopherol plays a role in photosynthesis and macronutrient homeostasis of the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 that is independent of its antioxidant function. Plant Physiol. 141, 508-521 (2006).
- Osanai, T., et al. Positive regulation of sugar catabolic pathways in the cyanobacterium Synechocystis. sp. PCC 6803 by the group 2 sigma factor sigE. J Biol Chem. 280, 30653-30659 (2005).
- Yamauchi, Y., Kaniya, Y., Kaneko, Y., Hihara, Y. Physiological roles of the cyAbrB transcriptional regulator pair Sll0822 and Sll0359 in Synechocystis sp. strain PCC 6803. J Bacteriol. 193, 3702-3709 (2011).
- Dubois, M., Gilles, K., Hamilton, J., Rebers, P., Smith, F. Colorimetric method for determination of sugars and related substances. Anal Chem. 28, 350-356 (1956).
- Osanai, T., et al. Genetic engineering of group 2 {sigma} factor SigE widely activates expressions of sugar catabolic genes in Synechocystis species PCC 6803. J Biol Chem. 286, 30962-30971 (2011).
- Miao, X., Wu, Q., Wu, G., Zhao, N. Sucrose accumulation in salt-stressed cells of agp gene deletion-mutant in cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. FEMS Microbiol Letters. 218, 71-77 (2003).
- Hagemann, M., Erdmann, N. Activation and pathway of glucosylglycerol synthesis in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Microbiology. 140, 1427-1431 (1994).
- Nobles, D. R., Romanovicz, D. K., Brown, R. M. Cellulose in cyanobacteria. Origin of vascular plant cellulose synthase. Plant Physiol. 127, 529-542 (2001).
- Zhao, C., et al. High-yield production of extracellular type-I cellulose by the cyanobacterium Synechococcus sp. PCC 7002. Cell Discovery. 1, 15004 (2015).
- Kawano, Y., et al. Cellulose accumulation and a cellulose synthase gene are responsible for cell aggregation in the cyanobacterium Thermosynechococcus vulcanus RKN. Plant Cell Physiol. 52, 957-966 (2011).
- Angermayr, S. A., Gorchs Rovira, A., Hellingwerf, K. J. Metabolic engineering of cyanobacteria for the synthesis of commodity products. Trends Biotechnol. 33, 352-361 (2015).
- Zhang, B., Dhital, S., Gidley, M. J. Synergistic and antagonistic effects of α-amylase and amyloglucosidase on starch digestion. Biomacromolecules. 14, 1945-1954 (2013).
- Harholt, J., et al. ARABINAN DEFICIENT 1 is a putative arabinosyltransferase involved in biosynthesis of pectic arabinan in Arabidopsis. Plant Physiol. 140, 49-58 (2006).
- Fernando, C. D., Soysa, P. Optimized enzymatic colorimetric assay for determination of hydrogen peroxide (H2O2) scavenging activity of plant extracts. MethodsX. 2, 283-291 (2015).
- Jacobsen, J. H., Rosgaard, L., Sakuragi, Y., Frigaard, N. U. One-step plasmid construction for generation of knock-out mutants in cyanobacteria: studies of glycogen metabolism in Synechococcus sp PCC 7002. Photosynth Res. 107 (2), 215-221 (2011).
- Lichtenthaler, H. K. Chlorophylls and carotenoids: Pigments of photosynthetic biomembranes. Methods Enzymol. 148, 350-382 (1987).
- López, C. V. G., del Carmen Cerón García, M., Fernández, F. G. A., Bustos, C. S., Chisti, Y., Sevilla, J. M. F. Protein measurements of microalgal and cyanobacterial biomass. Bioresource Technol. 101, 7587-7591 (2010).
- Hasunuma, T., et al. Dynamic metabolic profiling of cyanobacterial glycogen biosynthesis under conditions of nitrate depletion. J Exp Bot. 64, 2943-2954 (2013).
- Díaz-Troya, S., López-Maury, L., Sánchez-Riego, A. M., Roldán, M., Florencio, F. J. Redox regulation of glycogen biosynthesis in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803: Analysis of the AGP and glycogen synthases. Molecular Plant. 7, 87-100 (2014).
- Parrott, L. M., Slater, J. H. The DNA, RNA and protein composition of the cyanobacterium Anacystis nidulans grown in light- and carbon dioxide-limited chemostats. Arch Microbiol. 127, 53-58 (1980).
- Hihara, Y., Kamei, A., Kanehisa, M., Kaplan, A., Ikeuchi, M. DNA microarray analysis of cyanobacterial gene expression during acclimation to high light. Plant Cell. 13, 793-806 (2001).
