Summary
ここでは、シアノバクテリア細胞のグリコーゲン含有量を測定するための信頼性の高い簡単なアッセイを提示します。この手順は、沈殿、選択可能な解重合、およびグルコース残渣の検出を必要とする。この方法は、野生型および遺伝子操作された株の両方に適しており、シアノバクテリアの代謝工学を促進することができる。
Abstract
シアノバクテリアは、光合成の間に主要な細胞内炭素およびエネルギー貯蔵としてグリコーゲンを蓄積する。最近の研究の進展により、生合成と異化のディールサイクル、レドックス調節、非コードRNAの関与を含む、グリコーゲン代謝の複雑なメカニズムが明らかになった。同時に、産物収量を増強するために、遺伝子操作されたシアノバクテリア中のグリコーゲンから望ましい産物に炭素をリダイレクトする努力がなされている。さまざまな精度と技術的な複雑さを伴い、シアノバクテリアのグリコーゲン含量を決定するためにいくつかの方法が使用されています。ここでは、標準的なライフサイエンス研究室で行うことができるシアノバクテリアのグリコーゲン含量の信頼できる測定のための詳細なプロトコールを提供します。プロトコールは、細胞溶解物からのグリコーゲンの選択的沈殿およびグリコーゲンの酵素的解重合によってグルコース単量体を生成し、これはグルコースオキシidase-peroxidase（GOD-POD）酵素結合アッセイを用いて測定した。この方法は、 Synechocystis sp。 PCC 6803およびSynechococcus sp。代謝工学で広く使用されている2つのモデルのシアノバクテリア種、PCC 7002。さらに、該方法は、野生型と調節エレメントまたはグリコーゲン生合成遺伝子に欠損を有する変異体との間のグリコーゲン含量の差異を首尾よく示した。
Introduction
シアノバクテリアは、光合成により光に固定されたCO 2から炭素の主要な炭水化物貯蔵物としてグリコーゲンを蓄積する。グリコーゲンは、α-1,6-結合グルコシル結合によってつくられる分枝を有する線状α-1,4-結合グルカンからなるグリカンである。シアノバクテリアにおけるグリコーゲン生合成は、ホスホグルコムターゼおよびADP-グルコースピロホスホリラーゼの連続作用によるグルコース-6-リン酸のADP-グルコースへの変換から始まる。 ADP-グルコース中のグルコース部分は、1種以上のグリコーゲンシンターゼ（GlgA）によってグリコーゲンのα-1,4-グルカン主鎖の非還元末端に転移される。続いて、分枝酵素はα-1,6-結合グルコシル結合を導入し、これはさらに伸長してグリコーゲン粒子を生成する。暗所では、グリコーゲンは、グリコーゲンホスホリラーゼ、グリコーゲン脱分岐酵素、α-グルカノトランスフェラーゼ、およびマルトデキストリンホスホリラーゼによってリン酸化されたグルコースおよび遊離グルコースに分解される。これらのフィードintO酸化的ペントースリン酸経路、エムデン-マイヤーホフ-パルナス経路（解糖）、およびエントナー・ドゥドロフ経路1、2、3、4を含む異化経路、。
シアノバクテリアのグリコーゲン代謝は、シアノバクテリアが日光によって駆動される微生物細胞工場に発展して化学物質や燃料を生産する可能性があるため、近年注目を集めています。グリコーゲン代謝は、グリコーゲンがこれらの細菌における最大の柔軟な炭素プールであるため、生成物の収量を増加させるように改変することができる。一例はシアノバクテリウム・シネココッカス sp。マンニトールを生産するように遺伝子操作されたPCC7002;グリコーゲン合成の遺伝的破壊はマンニトール収率を3倍に増加させる5 。別の例は、グリコーゲン負荷野生動物からのバイオエタノールの生産であるSynechococcus sp。 PCC 7002 6 。野生型細胞のグリコーゲン含有量は、窒素飢餓6中の細胞の乾燥重量の60％までとすることができます。
グリコーゲンの代謝および調節に関する我々の理解も近年拡大している。グリコーゲンは、光の中に蓄積し、暗所で異化されることが知られているが、ディールサイクル中のグリコーゲン代謝の詳細な動態は、 Synechocystis sp。 PCC 6803 7 。さらに、グリコーゲンの蓄積に影響を及ぼすいくつかの遺伝子が同定されている。顕著な例は、推定ヒスチジンキナーゼPmgAおよび非コードRNA PmgR1が調節カスケードを形成し、グリコーゲンの蓄積を制御するという発見である。興味深いことに、 pmgAおよびpmgR1欠失突然変異体は、 シネコシスティス spの野生型株の2倍のグリコーゲンを蓄積する。 PCC 68038、9。他の調節エレメントは、代替シグマ因子Eおよび転写因子CyAbrB2 10、11を含め、グリコーゲンの蓄積に影響を与えることが知られています。
グリコーゲン調節および代謝に関心が高まるにつれて、グリコーゲン含量の決定を記述する詳細なプロトコルが正当化される。いくつかの方法が文献で使用されている。パルスアンペロメトリック検出器または酸とフェノールと処置後分析決意に結合された高圧陰イオン交換液体クロマトグラフィーを介して単糖類含有量の決意に続く酸加水分解が広くグリコーゲン含量9、10、12、13を近似する方法を使用しています。しかしながら、高圧アニオン交換液体クロマトグラフィーC機器は非常に高価であり、いくつかのシアノバクテリア種中に蓄積することが知られているようなスクロース14、グルコ15、及びセルロース16、17、18のような他のグルコース含有複合糖質、に由来するものからグリコーゲン由来のグルコースを区別しません。酸 - フェノール法は、標準的な実験装置を用いて行うことができる。しかし、毒性の高い試薬を使用し、異なる複合糖質由来のグルコースを区別しておらず、そのような糖脂質、リポ多糖、および外マトリックス12などの細胞材料を構成する他の単糖からグルコースを区別しません。特に、熱い酸 - フェノールアッセイは、グルコース含量の特定の決定12ではなく、総炭水化物含量の決定にしばしば用いられる。酵素的ハイα-アミログルコシダーゼによるグリコーゲンのグルコースへのグルコースの加水分解、その後の酵素結合アッセイによるグルコースの検出は、グリコーゲン由来のグルコースに対して非常に感受性が高く特異的な比色測定値を生成する。特異性は、エタノール5、8、19によって細胞溶解物からのグリコーゲンの優先析出をさらに向上させることができます。
ここでは、最も広く研究されている2つのシアノバクテリア種であるSynechocystis sp。のグリコーゲン含量の酵素ベースのアッセイの詳細なプロトコールについて説明します。 PCC 6803およびSynechococcus sp。 PCC7002を野生型株および変異株に導入した。効率的な加水分解を確実にするために、α-アミラーゼおよびα-アミログルコシダーゼのカクテルを使用する8 。エンド作用性α-アミラーゼは、種々のグルカン中のα-1,4-結合を加水分解してデキストリンとし、さらに加水分解しexo-actingα-アミログルコシダーゼ20によってグルコースを分解する。これらの酵素の相乗効果は周知であり、これらの酵素は、植物バイオマス21中のセルロースなどの他の糖質結合剤に影響を及ぼすことなく、α結合グルカン様グリコーゲンであるデンプンの選択的加水分解に日常的に使用されている。放出されたグルコースは、酸素の過酸化水素への還元およびグルコースのラクトンへの酸化を触媒するグルコースオキシダーゼおよび過酸化水素からピンク色のキノンイミン染料を生成するペルオキシダーゼからなる酵素結合アッセイに従って定量的に検出され、フェノール化合物、および4-アミノアンチピリン22 。
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Protocol
1.準備
- シアノバクテリア培養
- 成長するSynechocystis sp。 1％（v / v）CO 2を補充した一定量の空気を供給しながら、液体BG11培地8中、30℃でPCC 6803。 50μmol光子/ m 2 / sの光合成光子束密度で光で連続的に培養物を照明する。
- 成長するSynechococcus sp。 1％（v / v）CO 2を補充した空気を一定にして、液体A +培地23 （BG11培地も使用することができる）中のPCC7002。温度は37℃でなければなりません。 150μmol光子/ m 2 / sの光合成光子束密度で光を用いて連続的に培養物を照明する。
- 1cmの光路を有するキュベットを用いて730nmで培養物の光学密度（OD）を測定する。 OD値が0.8より大きい場合、適切な希釈を行い、OD測定値を得る。e細胞濃度。
注記：以下に示すプロトコールは、OD 730nm値2以上に対応する細胞密度を有する液体培養に適している。指数関数的増殖期の培養物（典型的にはOD 730nm値が1未満である）が望ましい場合、OD 730nm値が2以上になるように緩衝液または培地中で遠心分離および再懸濁により細胞密度を濃縮する。
- バッファーと試薬
- pH 8で50mM Tris-HCl緩衝液を調製する。
- 50mM酢酸ナトリウム緩衝液をpH5にする。
- 50mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH5）中の8U / mLアミログルコシダーゼのストック溶液を調製する。
- 50mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH5）中に2U / mLのα-アミラーゼのストック溶液を調製する。
- 蒸留水を使用して、0〜100μg/ mLの範囲の濃度でメイクグルコース標準溶液を調製する。
- D-グルコースアッセイキット（GODPODフォーマット）からGOD-POD試薬を調製し、fメーカーの指示に従ってください。
2.細胞乾燥重量の測定（オプション）
- 2 mLの培養液または細胞再懸濁液（ステップ1.1参照）を2.0 mLチューブに移し、6,000 xgおよび4 o Cで5分間遠心します。上清を捨てる。
- ペレットを1 mLの水に再懸濁し、6,000 xgで4℃で5分間遠心します。上清を捨て、細胞ペレットを0.5mLの水に再懸濁する。
- サスペンションを予め計量されたアルミニウムトレイに移す。一晩乾燥（約18時間）するために、トレーを105℃の乾燥オーブンに移す。
重要：トレイからの材料の移動を避けるために、鉗子でトレイを取り扱うことが重要です。同じ条件で空のあらかじめ計量されたアルミニウムトレイを乾燥させて、乾燥中のトレイからの重量損失を測定する。 - 乾燥後、トレーをオーブンから取り出し、周囲温度で平衡させるそれを0.0001gの精度で計量する前に5分間保持する。
注記：この値は、細胞乾燥重量ベースでグリコーゲン含有量を標準化するために使用することができます。
3.シアノバクテリア細胞の溶解
- 1mLの培養液または細胞再懸濁液（ステップ1.1を参照）を1.5mLチューブに移し、6,000×gおよび4℃で10分間遠心分離する。上清を捨てる。
- ペレットを1 mLの50 mM Tris-HCl（pH 8）に再懸濁し、6,000 xgで4℃で10分間遠心分離します。上清を捨て、細胞ペレットを1mLのTris-HCl緩衝液に再懸濁する。プロセスを繰り返します。
- ペレットを500μLの50mM Tris-HCl緩衝液（pH 8）に徹底的に再懸濁する。
重要：ペレットを効率よく細胞溶解するために再懸濁する。再懸濁液を氷に入れておきます。 - 再懸濁した細胞を4℃で30サイクルの超音波処理を行い、各サイクルは最大振幅の20kHzの周波数で30秒間行い、それに続く90秒が続く。
注：この方法は、 Synechococcus spを効率的に溶解することができます。 PCC7002。- あるいは、細胞再懸濁液をスクリューキャップチューブに移し、製造業者の指示に従って、酸化ジルコニウムビーズをチューブに添加する。組織ホモジナイザーにチューブをセットし、ビーティングの2サイクルを行うことにより4℃で細胞を溶解する。各サイクルは、周波数設定5で5分で構成される。
注：この方法は、 Synechocystis sp。を効率よく溶解することができる。 PCC 6803およびSynechococcus sp。 PCC7002。
- あるいは、細胞再懸濁液をスクリューキャップチューブに移し、製造業者の指示に従って、酸化ジルコニウムビーズをチューブに添加する。組織ホモジナイザーにチューブをセットし、ビーティングの2サイクルを行うことにより4℃で細胞を溶解する。各サイクルは、周波数設定5で5分で構成される。
- ライセートを含むチューブを6,000 xgおよび4℃で10分間遠心します。
注：ペレットは、主に大きな細胞破片で構成されています。十分な数の破損していないセルがある場合は、手順3.4を繰り返します。上清を氷上に保つ。 - 市販のBCA Proteinアッセイキットを使用してタンパク質濃度を測定する。
注：この値は、グリコーゲン含有量を標準化するために使用することができますタンパク質含有量ベースで測定した。
4.グリコーゲン沈殿
- 96％（v / v）エタノール900μLとステップ3.5の上清100μLを1.5mLスクリューキャップチューブに混合することにより、細胞溶解物からクロロフィルaを除去する。キャップを閉めた後、標準の実験室用加熱ブロックを使用してチューブを90℃で10分間加熱します。
- チューブを氷上で30分間インキュベートする。
- チューブを20,000×gおよび4℃で30分間遠心分離し、上清を慎重に除去する。ペレットはグリコーゲンを含む。ペレットを軽く乾燥させて過剰のエタノールを除去する。
重要：ペレットの過度の乾燥は避けなければならない。さもなければ、ステップ5.1で可溶化することが困難になる。 - オプション：ステップ4.3で得られた上清の664nmでの吸光度を測定し、クロロフィルa含量を決定する。 84.6 L / g / cm 24の吸収係数を使用してください。
注：値をnormalizに使用することができますグリコーゲン含有量。
5.酵素加水分解およびグリコーゲン測定
- ステップ4.3で得られたペレットを50mM酢酸ナトリウム（pH5）100μLに可溶化し、8U / mLのアミログルコシダーゼ50μLと2U / mLのα-アミラーゼ50μLを添加する。ボルテックスを用いてこれらの材料をよく混合する。
注：グリコーゲンペレットは粘性であるため、ピペッティングによる混合は推奨されません。 - 混合物を60℃で加熱ブロック上で2時間インキュベートし、グリコーゲンがグルコース分子に消化されるようにする。
- サンプルを10,000 xgで5分間遠心分離し、上清を新しい1.5 mLチューブに移す。
GOD-POD試薬を用いた総グルコース含量の測定
- ステップ5.3で得られた上清中のグルコース濃度をGOD-POD試薬を用いて測定する。ステップ5.3の上清100μLを96ウェルプレートのウェルに移す。ネガティブコントロールとして、100μLの50 mM酢酸ナトリウム、pH 5を使用する。検量線を作成するには、グルコース標準溶液も測定する。
- 各サンプルに150μLのGOD-POD試薬を加え、ピペッティングで迅速に混合します。
- プレートを静的に25℃で30分間インキュベートする。プレートリーダーを用いて吸光度値を510 nmで記録する。
- グルコース標準から得られた較正曲線を用いてグルコースの濃度を計算する。
注：細胞溶解液中のグリコーゲン濃度は、グルコースの濃度（μg/ mL）として表されます。
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Representative Results
10mLの野生型シネコシスティス種。 PCC 6803を、OD 730nm値が約0.8に達するまで、光合成独立栄養条件下で増殖させた。細胞を回収し、pH8の50mM Tris-HClに再懸濁した.OD 730nm値を2-3に調整した。グリコーゲン含量は、上記のプロトコルに従って分析した。 OD 730nmあたりのグリコーゲン含量は、13± 1.8μg / mL / OD 730nm （ N = 12）であった。タンパク質含量のグリコーゲン含量相対0.24±0.03μgの/μgの（N = 12）、およびクロロフィルのグリコーゲン含量相対含有量は5.7±0.6μgの/μgの（N = 12）でした。利用可能な材料の量が少ないため、細胞乾燥重量の測定は省略された。同等の条件下で培養シアノバクテリアにおけるタンパク質含量は細胞乾燥重量の25 <の約50％であることを考えるとグリコーゲン含有量は細胞乾燥重量の12％であると推定され、これは以前の研究26と一致している26 。
GOD-PODアッセイの検出限界は、510nmで0.08および0.7の吸光度値に対応する、10〜100μg/ mLのグルコース濃度範囲の510nmでのグルコース濃度と吸光度との間に線形相関を示した。最小限度は機器の検出限界に起因する可能性が高い。グルコース濃度が150μg/ mLを超えると、暗緑色の沈殿物が形成され、吸光度の変化が大きくなった。使用した細胞材料の量に関して、細胞溶解前の細胞再懸濁のOD 730nm値が2〜10の間に、再現可能なグリコーゲン含量を日常的に得た。OD 730nm値が1以下の細胞再懸濁は、最小検出限界tとなり、結果は非常に変動する。 OD 730nm値が20より高い細胞再懸濁は、細胞溶解が不完全であり、延長された溶解または希釈のいずれかが必要であったため、適切ではなかった。
図1は、 Synechocystis sp。におけるグリコーゲン含量の代表的な結果を示す。 PCC 6803野生型および2つの変異株（ ΔpmgAおよびΔpmgR1 ）。指数増殖期で増殖した細胞を使用した。グリコーゲン含有量は、最初に総タンパク質含量によって正規化され、続いて野生型の値に対して相対的に表された。結果は、突然変異株が、野生型株よりも少なくとも2倍高いグリコーゲン含量を有することを示す。
次に、 Synechococcus sp。の菌株においてグリコーゲン含量を分析した。マンニトール5を製造するように設計されたPCC 7002 。第一株（GLG +）は 、二つの機能、グリコーゲン合成酵素をコードする野生型glgA1とglgA2遺伝子を含む第2株（GLG - ）に対し、これらの遺伝子5の機能的コピーを欠きます。グリコーゲンおよびマンニトールの含量を両株で測定した（ 図2 ）。結果は、Glg -は検出可能なレベルのグリコーゲンを欠いていたが、Glg +株よりも多くのマンニトールを生成したことを示している。これは、光合成によって合成された炭水化物が、グリコーゲンを合成する能力を欠く突然変異株において、マンニトールに向け直されることを示唆している。培養物のOD 730nm値は約10であり、細胞乾燥重量分析に十分な細胞材料を提供した。グリコーゲン含量は、細胞乾燥重量を用いて正規化した。
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図1： シネコシスティス種の異なる系統で測定されたグリコーゲン含有量。 WTおよび2つの変異体（ΔpmgA9及びΔpmgR18）におけるPCC 6803相対グリコーゲンの内容が示されています。グリコーゲンレベルは、総タンパク質含有量によって正規化した。 3つの生物学的反復の手段が示され、誤差バーは標準偏差を表す。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図2： 遺伝子操作されたSynechococcus sp。におけるグリコーゲンおよびマンニトールの産生。 PCC 7002 5 。 Glgマンニトールおよびグリコーゲンを合成する株である。 Glg -は、マンニトールを合成するがグリコーゲンは合成しない株である。示された値は、3つの生物学的反復の平均であり、誤差バーは標準偏差を表す。 CDW：細胞乾燥重量、ND：検出されなかった。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
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Discussion
プロトコル内の重要なステップは、グリコーゲン沈殿および再懸濁である。エタノール沈殿後の遠心分離後、グリコーゲンは、微量遠心管の壁に緩く付着する半透明ペレットを形成する。したがって、上清を除去する際には、ペレットを除去しないように注意する必要があります。グリコーゲンペレットは粘着性があり、乾燥すると可溶化が困難になります。グリコーゲンペレットの完全な可溶化は重要である。なぜなら、不完全な可溶化は効率の悪い酵素消化を招き、したがって技術的複製間に大きな変動を生じさせるからである。ボルテックスによる可溶化前の超音波処理の適用は、プロセスを容易にすることができる。
正規化法の選択に関して、細胞乾燥重量は広く用いられている参考文献である。これは、タンパク質およびクロロフィルの測定よりも面倒であり、細胞バイオマスを多く必要とするa 。総タンパク質含量は、細胞バイオマスに対する別の言及を提供し、本プロトコールに記載されているように、小規模で決定することができる。正確な値は、成長条件25、28にもよるが、乾燥細胞バイオマスあたりの全タンパク質含量は、典型的には40％から50％の間の範囲です。クロロフィルa含量は容易に決定することができ、試料中に存在する細胞量の代用として用いることができる。しかしながら、細胞あたりのクロロフィルaの量は、特に栄養濃度および光強度の変化に応答して、増殖条件に依存して著しく変化することは周知である29 。
他の方法に関して提示された技術の重要な利点の1つは、それが高度に選択的であることである。熱い酸とフェノールのプロトコールとその後の単糖組成分析酸加水分解は比較的簡単な方法であり、以前の研究9、10、12、13に使用されてきました。しかし、炭水化物検出技術12に依存して、非グリコーゲングルコースおよび追加の糖が測定に寄与できるので、これらの方法はグリコーゲン含量を過大評価する可能性がある12 。記載された技術は、グリコーゲン中のグルコースを選択的に検出する。また、α-アミラーゼおよびα-アミログルコシダーゼはセルロースに存在するβ-結合グルコシル結合を加水分解しないので、セルロースからグルコースを識別することもできる。以前の研究では、グリコーゲンの酵素加水分解は、α-アミログルコシダーゼ7、27のみによって行われました。このプロトコールで提示されているように、エキソ作用性α-アミログルコシダーゼとともに内作用性α-アミラーゼを含有させることにより、グリコーゲンの効率的な加水分解。同様の選択的加水分解が、植物バイオマスの処理に日常的に適用され、α-アミラーゼα-アミログルコシダーゼの組合せは、セルロース21などの他のグルコース含有多糖類に影響を与えずに澱粉を加水分解するために使用される。
この技術の主な限界は、個々のサンプルがマイクロ遠心チューブを使用して別々に処理されるため、手順が低スループットであることです。グリコーゲン沈殿工程は、より高い処理量を妨げる主な要因である。ハイスループット手順としての実施には、ディープウェルプレートの使用およびこれらを高速（20,000× g ）で遠心分離する能力が必要となる。必要な速度で96ウェルプレートを遠心分離することができる遠心分離機は利用可能であるが、ほとんどのディープウェルプレートは6,000× gを超える力に耐えられない。したがって、材料の慎重な選択は、hスループット分析。
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Disclosures
著者は何も開示することはない。
Acknowledgments
著者らは、デンマークのInnovationfonden Denmark（Pant Power、プロジェクト番号12-131844）、Villum Fonden（プロジェクト番号13363）のNordic Energy Research（AquaFEED、プロジェクト番号24）
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| QSonica Sonicators Q700 | Qsonica, LLC | NA | QSonica |
| SpectraMax 190 Microplate Reader | Molecular Devices | NA | Eliza plate reader |
| Bullet Blender Storm | Next Advance | BBY24M-CE | Beads beater |
| Ultrospec 3100 pro UV/Visible Spectrophotometer | Amersham Biosciences | NA | Spectrophotometer |
| Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | Buffer |
| HCl | Merck | 1-00317 | pH adjutment |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | 32319 | Buffer |
| Amyloglycosidase (Rhizopus sp.) | Megazyme | E-AMGPU | Enzyme for glycogen depolymerization |
| α-Amylase, thermostable (Bacillus licheniformis) | Sigma-Aldrich | A3176 | Enzyme for glycogen depolymerization |
| D-Glucose | Merch | 8337 | Standard for the glucose assay |
| Pierce BCA Protein assay kit | Thermo Fisher scientific | 23225 | For determination of protein concentrations |
| Aluminum drying trays, disposable | VWR | 611-1362 | For determination of cell dry weights |
| D-Glucose assay kit (GODPOD format) | Megazyme | K-GLUC | For determination of glucose concentrations |
| Zirconium oxide breads, 0.15 mm | Next Advance | ZrOB015 | Beads for cell lysis in a Bullet Blendar Storm |
| RINO tubes | Next Advance | NA | Tubes for cell lysis in a Bullet Blendar Storm |
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