Summary
Ici, nous présentons un dosage fiable et facile pour mesurer la teneur en glycogène dans les cellules cyanobactériennes. La procédure implique des précipitations, une dépolymérisation sélectionnable et la détection de résidus de glucose. Cette méthode est appropriée pour les souches de type sauvage et génétiquement modifiées et peut faciliter l'ingénierie métabolique des cyanobactéries.
Abstract
Les cyanobactéries accumulent du glycogène comme stockage majeur de carbone et d'énergie intracellulaire pendant la photosynthèse. Les développements récents dans la recherche ont mis en évidence des mécanismes complexes du métabolisme du glycogène, y compris le cycle diels de la biosynthèse et du catabolisme, la régulation redox et l'implication de l'ARN non codant. Dans le même temps, des efforts sont faits pour rediriger le carbone du glycogène vers des produits désirables dans des cyanobactéries génétiquement modifiées pour améliorer les rendements des produits. Plusieurs méthodes sont utilisées pour déterminer le taux de glycogène dans les cyanobactéries, avec des précisions variables et des complexités techniques. Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour la détermination fiable de la teneur en glycogène dans les cyanobactéries qui peuvent être effectuées dans un laboratoire de sciences de la vie standard. Le protocole implique la précipitation sélective du glycogène à partir du lysat cellulaire et la dépolymérisation enzymatique du glycogène pour générer des monomères de glucose, qui sont détectés par un bœuf de glucoseIdase-peroxydase (GOD-POD) couplé à l'enzyme. La méthode a été appliquée à Synechocystis sp. PCC 6803 et Synechococcus sp. PCC 7002, deux types d'espèces de cyanobactéries largement utilisées dans l'ingénierie métabolique. En outre, la méthode a montré avec succès des différences dans les teneurs en glycogène entre le type sauvage et les mutants défectueux dans les éléments régulateurs ou les gènes de biosynthèse du glycogène.
Introduction
Les cyanobactéries accumulent du glycogène comme principal stock de glucides provenant du CO 2 fixé à la lumière par la photosynthèse. Le glycogène est un glycan consistant en un glucane linéaire α-1,4-lié avec des branches créées par des liaisons glucosyle liées à l'α-1,6. La biosynthèse du glycogène dans les cyanobactéries commence par la conversion du glucose-6-phosphate en ADP-glucose par l'action séquentielle de la phosphoglucomutase et de la pyrophosphorylase ADP-glucose. La fraction de glucose dans ADP-glucose est transférée à l'extrémité non réductrice du squelette α-1,4-glucane du glycogène par une ou plusieurs glycogènes synthases (GlgA). Par la suite, des enzymes de ramification introduisent la liaison glucosyle liée à l'α-1,6, qui est encore étendue pour générer la particule de glycogène. Dans le noir, le glycogène est décomposé par la glycogène phosphorylase, les enzymes débranchantes du glycogène, l'α-glucanotransférase et la malto-dextrine phosphorylase dans le glucose phosphorylé et le glucose libre. Ces flux intLes voies cataboliques, y compris la voie de phosphate de pentose oxydante, la voie d'Embden-Meyerhof-Parnas (glycolyse) et la voie de Entner-Doudoroff 1 , 2 , 3 , 4 .
Le métabolisme du glycogène dans les cyanobactéries a suscité un intérêt croissant au cours des dernières années en raison de la possibilité que les cyanobactéries se développent dans des usines de cellules microbiennes entraînées par la lumière du soleil pour produire des produits chimiques et des combustibles. Le métabolisme du glycogène pourrait être modifié pour augmenter le rendement des produits, car le glycogène est le plus grand pool de carbone flexible de ces bactéries. Un exemple est la cyanobactérie Synechococcus sp. PCC 7002, qui a été génétiquement conçu pour produire du mannitol; La rupture génétique de la synthèse du glycogène augmente le rendement en mannit 3 fois 5 . Un autre exemple est la production de bioéthanol à partir de cellules sauvages chargées de glycogèneYpe Synechococcus sp. PCC 7002 6 . La teneur en glycogène des cellules de type sauvage peut représenter jusqu'à 60% du poids sec de la cellule pendant la famine par l'azote 6 .
Notre compréhension du métabolisme et de la régulation du glycogène a également été élargie ces dernières années. Alors que le glycogène est connu pour s'accumuler dans la lumière et être catabolisé dans l'obscurité, la cinétique détaillée du métabolisme du glycogène pendant le cycle diel n'a été révélée que récemment dans Synechocystis sp. PCC 6803 7 . En outre, plusieurs gènes affectant l'accumulation de glycogène ont été identifiés. Un exemple notable est la découverte que la putative histidine kinase PmgA et l'ARN non codant PmgR1 forment une cascade régulatrice et contrôlent l'accumulation de glycogène. Fait intéressant, les mutants de suppression de pmgA et pmgR1 accumulent deux fois plus de glycogène que la souche de type sauvage de Synechocystis sp. PCC 68038 , 9 . D'autres éléments réglementaires sont également connus pour affecter l'accumulation de glycogène, y compris le facteur de sigma alternatif E et le facteur de transcription CyAbrB2 10 , 11 .
À mesure que l'intérêt pour la régulation du glycogène et le métabolisme augmente, un protocole détaillé décrivant la détermination de la teneur en glycogène est justifié. Plusieurs méthodes sont utilisées dans la littérature. L'hydrolyse acide suivie de la détermination de la teneur en monosaccharides par une chromatographie liquide à échange d'anions haute pression associée à un détecteur ampérométrique pulsé ou à une détermination spectrométrique après des traitements avec de l'acide et du phénol sont des méthodes largement utilisées pour rapprocher la teneur en glycogène 9 , 10 , 12 , 13 . Cependant, une chromatographie liquide à échange d'anions haute pressionL'instrument c est très coûteux et ne distingue pas le glucose dérivé du glycogène de celui dérivé d'autres glycoconjugués contenant du glucose, tels que le saccharose 14 , le glucosylglycérol 15 et la cellulose 16 , 17 , 18 , qui sont connus pour s'accumuler dans certaines espèces de cyanobactéries. La méthode acide-phénol peut être effectuée en utilisant des équipements de laboratoire standard. Cependant, il utilise des réactifs hautement toxiques et ne distingue pas le glucose dérivé de différents glycoconjugués, ni distingue le glucose des autres monosaccharides qui constituent des matériaux cellulaires tels que les glycolipides, les lipopolysaccharides et les matrices extracellulaires 12 . Notamment, le dosage acide acide-phénol est souvent utilisé pour la détermination de la teneur totale en glucides plutôt que pour la détermination spécifique de la teneur en glucose 12 . Enzymatic hyL'hydrolyse du glycogène en glucose par l'α-amyloglucosidase suivie de la détection du glucose par un dosage couplé à une enzyme génère une lecture colorimétrique hautement sensible et spécifique au glucose dérivé du glycogène. La spécificité peut être renforcée avec la précipitation préférentielle du glycogène à partir des lysats cellulaires par l'éthanol 5 , 8 , 19 .
Ici, nous décrivons un protocole détaillé pour un dosage enzymatique du contenu en glycogène dans deux des espèces de cyanobactéries les plus étudiées, Synechocystis sp. PCC 6803 et Synechococcus sp. PCC 7002, dans les souches de type sauvage et mutant. Afin d'assurer une hydrolyse efficace, un cocktail d'α-amylase et d'α-amyloglucosidase est utilisé 8 . L'α-amylase à effet endo hydrolyse les liaisons α-1,4 dans divers glucanes dans les dextrines, qui sont encore hydrolysées tO glucose par ex-action de l'α-amyloglucosidase 20 . Les effets synergiques de ces enzymes sont bien connus, et ces enzymes sont habituellement utilisées pour l'hydrolyse sélective de l'amidon, qui est un glucane glycogène tel que glycogène, sans affecter d'autres glycoconjugants, comme la cellulose, dans la biomasse végétale 21 . Le glucose libéré est détecté quantitativement suite à un essai couplé par une enzyme consistant en glucose oxydase - qui catalyse la réduction de l'oxygène au peroxyde d'hydrogène et l'oxydation du glucose à une lactone et à la peroxydase - qui produit un colorant de quinoneimine de couleur rose provenant du peroxyde d'hydrogène, Un composé phénolique et la 4-aminoantipyrine 22 .
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Protocol
1. Préparation
- Les cultures de cyanobactéries
- Grow Synechocystis sp. PCC 6803 à 30 ° C dans un milieu liquide BG11 8 , avec un apport constant d'air additionné de CO 2 à 1% (v / v). Illuminer les cultures en continu avec de la lumière à une densité de flux photonique photosynthétique de 50 μmol de photon / m 2 / s.
- Grow Synechococcus sp. PCC 7002 en liquide A + moyen 23 (milieu BG11 peut également être utilisé), avec un apport constant d'air additionné de CO 2 à 1% (v / v). La température devrait être de 37 ° C. Illuminer les cultures en continu avec de la lumière à une densité de flux photonique photosynthétique de 150 μmol de photon / m 2 / s.
- Mesurer la densité optique (OD) de la culture à 730 nm à l'aide d'une cuvette avec un chemin d'éclairage de 1 cm. Si la valeur de l'OD est supérieure à 0,8, faites des dilutions appropriées pour obtenir des mesures de DO qui sont proportionnelles à laConcentration de cellule e.
NOTE: Les protocoles présentés ci-dessous conviennent aux cultures liquides, avec une densité cellulaire correspondant à une valeur OD 730nm de 2 ou supérieure. Lorsque des cultures dans la phase de croissance exponentielle sont souhaitées, qui ont typiquement une valeur de DO 730nm inférieure à 1, concentrent la densité cellulaire par centrifugation et remise en suspension dans un tampon ou un milieu pour obtenir une valeur de DO 730nm de 2 ou plus.
- Buffers et réactifs
- Faire un tampon Tris-HCl 50 mM à pH 8.
- Faire un tampon 50 mM d'acétate de sodium à pH 5.
- Faire une solution mère de 8 U / ml d'amyloglucosidase dans du tampon 50 mM d'acétate de sodium, pH 5.
- Faire une solution mère de 2 U / ml d'a-amylase dans du tampon 50 mM d'acétate de sodium, pH 5.
- En utilisant de l'eau distillée, des solutions standards de formolucose à des concentrations comprises entre 0 et 100 μg / mL.
- Préparer le réactif GOD-POD du kit D-Glucose Assay (Format GODPOD), fEn suivant les instructions du fabricant.
2. Détermination du poids sec à la cellule (en option)
- Transférer 2 mL d'une culture ou une resuspension cellulaire (voir étape 1.1) dans un tube de 2,0 mL et centrifuger à 6000 xg et 4 ° C pendant 5 min. Jeter le surnageant.
- Remettre en suspension la pastille dans 1 mL d'eau et centrifuger à 6000 xg et 4 ° C pendant 5 min. Jeter le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans 0,5 ml d'eau.
- Transférer la suspension dans un plateau en aluminium pré-pesé. Transférez le plateau à un four à sécher à 105 ° C pour un séchage pendant une nuit (environ 18 h).
CRITIQUE: Il est important que le bac soit manipulé avec une pince pour éviter le transfert du matériau des doigts. Séchez un bac en aluminium pré-pesé vide dans les mêmes conditions pour déterminer toute perte de poids des plateaux pendant le séchage. - Après séchage, retirez le plateau du four et laissez-le équilibrer à la température ambiantePendant 5 min avant de le peser avec une précision de 0,0001 g.
REMARQUE: la valeur peut être utilisée pour normaliser la teneur en glycogène sur une base cellulaire-sèche.
3. Lysis of Cyanobacterial Cells
- Transférer 1 mL d'une culture ou une remise en suspension cellulaire (voir étape 1.1) dans un tube de 1,5 mL et centrifuger à 6 000 xg et 4 ° C pendant 10 min. Jeter le surnageant.
- Remettre en suspension la pastille dans 1 ml de Tris-HCl 50 mM, pH 8 et centrifuger à 6 000 xg et 4 ° C pendant 10 min. Jeter le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans 1 ml du tampon Tris-HCl. Répétez le processus.
- Remettre complètement le culot dans 500 μL de tampon Tris-HCl 50 mM, pH 8.
CRITIQUE: Resuspendre bien le culot pour une lyse cellulaire efficace. Garder la resuspension dans la glace. - Lyse les cellules remises en suspension à 4 ° C en effectuant 30 cycles d'ultrasons, chaque cycle étant constitué de 30 s à une fréquence de 20 kHz avec l'amplitude maximale,Suivi de 90 s sans.
REMARQUE: Cette méthode peut efficacement lyse Synechococcus sp. PCC 7002.- Sinon, transférez la suspension de la cellule à un tube à vis et ajoutez des billes d'oxyde de zirconium au tube, conformément aux instructions du fabricant. Réglez le tube dans un homogénéisateur de tissu et lysez les cellules à 4 ° C en effectuant 2 cycles de battement, chaque cycle étant constitué de 5 min au réglage de fréquence de 5.
REMARQUE: cette méthode peut efficacement lyse Synechocystis sp. PCC 6803 et Synechococcus sp. PCC 7002.
- Sinon, transférez la suspension de la cellule à un tube à vis et ajoutez des billes d'oxyde de zirconium au tube, conformément aux instructions du fabricant. Réglez le tube dans un homogénéisateur de tissu et lysez les cellules à 4 ° C en effectuant 2 cycles de battement, chaque cycle étant constitué de 5 min au réglage de fréquence de 5.
- Centrifuger le tube contenant le lysat pendant 10 min à 6000 xg et 4 ° C.
REMARQUE: La pastille doit être principalement constituée de débris de grandes cellules. S'il existe un nombre important de cellules ininterrompues, répétez l'étape 3.4. Gardez le surnageant sur la glace. - Déterminer la concentration de protéines en utilisant un kit commercial de dosage de protéines BCA.
NOTE: La valeur peut être utilisée pour normaliser le contenu en glycogèneSur une base de protéines.
4. Précipitations de glycogène
- Enlever la chlorophylle a du lysat cellulaire en mélangeant 900 uL d'éthanol à 96% (v / v) et 100 μL du surnageant à partir de l'étape 3.5 dans un tube à bouchon à vis de 1,5 ml. Après avoir fermé le capuchon, chauffez le tube à 90 ° C pendant 10 min en utilisant un bloc de chauffage de laboratoire standard.
- Incuber le tube sur de la glace pendant 30 min.
- Centrifuger le tube à 20 000 xg et 4 ° C pendant 30 min et enlever soigneusement le surnageant; La pastille contient du glycogène. Sécher légèrement la pastille à l'air pour éliminer l'excès d'éthanol.
CRITIQUE: Le séchage excessif de la pastille doit être évité, sinon il devient difficile de se solubiliser à l'étape 5.1. - OPTIONNEL: Mesurer l'absorbance du surnageant obtenu à l'étape 4.3 à 664 nm pour déterminer la teneur en chlorophylle a . Utilisez un coefficient d'absorption de 84,6 L / g / cm 24 .
REMARQUE: la valeur peut être utilisée pour normaliserE la teneur en glycogène.
5. Détermination enzymatique de l'hydrolyse et du glycogène
- Solubiliser le pastille obtenu à l'étape 4.3 dans 100 μl d'acétate de sodium 50 mM, pH 5, et ajouter 50 μL de 8 U / mL d'amyloglucosidase et 50 μL d'α-amylase 2 U / mL. Mélangez bien ces matériaux à l'aide d'un vortex.
REMARQUE: le mélange par pipettage n'est pas recommandé car la pastille de glycogène est visqueuse. - Incuber le mélange à 60 ° C sur un bloc de chauffage pendant 2 h pour permettre la digestion du glycogène en molécules de glucose.
- Centrifuger l'échantillon à 10 000 xg pendant 5 min et transférer le surnageant dans un nouveau tube de 1,5 ml.
6. Détermination du contenu total en glycémie à l'aide du réactif GOD-POD
- Mesurer la concentration de glucose dans le surnageant obtenu à l'étape 5.3 en utilisant le réactif GOD-POD. Transférer 100 μL du surnageant de l'étape 5.3 à un puits dans une plaque à 96 puits. Comme un contrôle négatif,Utiliser 100 μl d'acétate de sodium 50 mM, pH 5. Pour générer une courbe d'étalonnage, mesurer également les solutions standard de glucose.
- Ajouter 150 μL de réactif GOD-POD à chaque échantillon et mélanger rapidement par pipettage.
- Incuber la plaque de manière statique à 25 ° C pendant 30 min. Enregistrez la valeur d'absorbance à 510 nm à l'aide d'un lecteur de plaques.
- Calculer la concentration de glucose en utilisant une courbe d'étalonnage obtenue à partir des normes de glucose.
NOTE: La concentration de glycogène dans le lysat cellulaire est exprimée en concentration de glucose (μg / mL).
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Representative Results
10 ml de Synechocystis sp. Le PCC 6803 a été cultivé dans des conditions photoautotrophiques jusqu'à ce que la valeur de la DO 730nm atteigne environ 0,8. Les cellules ont été récoltées et remises en suspension dans du Tris-HCl 50 mM, pH 8. La valeur de la DO730nm a été ajustée à 2-3. La teneur en glycogène a été analysée selon le protocole décrit ci-dessus. La teneur en glycogène par OD 730nm était de 13 ± 1,8 μg / mL / OD 730nm ( N = 12). La teneur en glycogène par rapport à la teneur en protéines était de 0,24 ± 0,03 μg / μg ( N = 12), et la teneur en glycogène par rapport à la teneur en chlorophylle a était de 5,7 ± 0,6 μg / μg ( N = 12). En raison de la faible quantité de matériel disponible, la mesure du poids sec de la cellule a été omise. Étant donné que la teneur en protéines dans les cyanobactéries cultivées dans des conditions comparables est d'environ 50% du poids sec de la cellule 25 </ Sup>, la teneur en glycogène est estimée à 12% du poids sec de la cellule, ce qui correspond aux études antérieures 26 .
Les limites de détection du dosage de DOD-POD ont montré une corrélation linéaire entre la concentration de glucose et l'absorbance à 510 nm dans la plage de concentration de glucose entre 10 et 100 μg / mL, ce qui correspond à des valeurs d'absorbance de 0,08 et 0,7 à 510 nm. La limite minimale est probablement due à la limite de détection instrumentale. Lorsque des concentrations de glucose supérieures à 150 μg / mL ont été utilisées, des précipités de vert foncé se sont formés, provoquant une grande variation dans la lecture de l'absorbance. En ce qui concerne la quantité de matériaux cellulaires utilisés, nous avons habituellement obtenu des teneurs en glycogène reproductibles lorsque la valeur de DO730nm de la resuspension cellulaire avant la lyse cellulaire était comprise entre 2 et 10. Les résistances cellulaires avec une valeur de DO 730nm de 1 ou moins ont donné lieu à des signaux proches de la Limi de détection minimumT, conduisant à des résultats très variables. La resuspension cellulaire avec une valeur de DO 730nm supérieure à 20 n'était pas appropriée car la lyse cellulaire était incomplète et une lyse prolongée ou des dilutions étaient nécessaires.
La figure 1 montre des résultats représentatifs du contenu en glycogène dans Synechocystis sp. PCC 6803 type sauvage et deux souches mutantes ( ΔpmgA et ΔpmgR1 ). Les cellules cultivées à la phase de croissance exponentielle ont été utilisées. Les teneurs en glycogène ont d'abord été normalisées par la teneur totale en protéines et ont ensuite été exprimées par rapport à la valeur du type sauvage. Les résultats montrent que les souches mutantes ont des teneurs en glycogène au moins deux fois plus élevées que la souche du type sauvage.
Ensuite, la teneur en glycogène a été analysée dans des souches de Synechococcus sp. PCC 7002 conçu pour produire du mannitol 5 . La première souche (Glg + ) contient les gènes glgA1 et glgA2 de type sauvage codant pour deux glycogène synthases fonctionnelles, tandis que la deuxième souche (Glg - ) manque de copies fonctionnelles de ces gènes 5 . Le taux de glycogène et de mannitol a ensuite été mesuré dans les deux souches ( figure 2 ). Les résultats montrent que le Glg - manque d'un niveau détectable de glycogène, alors qu'il produit plus de mannitol que la souche Glg + . Cela suggère que l'hydrate de carbone synthétisé par la photosynthèse est redirigé vers le mannitol dans la souche mutante qui n'a pas la capacité de synthétiser le glycogène. Les valeurs OD 730nm des cultures étaient d'environ 10, fournissant des matériaux cellulaires suffisants pour l'analyse du poids sec de la cellule. Le taux de glycogène a été normalisé en utilisant le poids sec de la cellule.
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Figure 1: Les teneurs en glycogène mesurées dans différentes lignes de Synechocystis sp . PCC 6803. Des teneurs relatives en glycogène dans le WT et dans deux mutants ( ΔpmgA 9 et ΔpmgR1 8 ) sont présentées. Les taux de glycogène ont été normalisés par la teneur totale en protéines. On montre des moyens de trois répliques biologiques, avec des barres d'erreur représentant des écarts types. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2: Production de glycogène et de mannitol chez Synechococcus sp. Génétiquement manipulé. PCC 7002 5 . Glg <Sup> +, la souche synthétisant le mannitol et le glycogène. Glg - , la souche synthétisant le mannitol mais pas de glycogène. Les valeurs représentées sont la moyenne de trois répliques biologiques, avec des barres d'erreur représentant les écarts-types. CDW: poids sec à la cellule, ND: non détecté. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Les étapes critiques dans le protocole sont la précipitation et la resuspension du glycogène. Après centrifugation suite à la précipitation de l'éthanol, le glycogène forme une pastille translucide qui adhère légèrement aux parois des tubes de microcentrifugeuse. Par conséquent, lors de l'élimination du surnageant, une attention particulière doit être accordée afin de ne pas enlever la pastille. La pastille de glycogène est collante, et la solubilisation peut être difficile si elle sèche. Notez que la solubilisation complète de la pastille de glycogène est importante car une solubilisation incomplète entraînera une digestion enzymatique inefficace et entraînera donc de fortes variations entre les réplications techniques. L'application de sonication avant la solubilisation par vortex peut faciliter le processus.
En ce qui concerne le choix de la méthode de normalisation, le poids sec de la cellule est une référence largement utilisée. Il est plus laborieux et nécessite plus de biomasse cellulaire que les déterminations de protéines et de chlorophylleA. La teneur totale en protéines fournit une référence alternative à la biomasse cellulaire et peut être déterminée à petite échelle, comme décrit dans le présent protocole. La teneur totale en protéines par biomasse cellulaire sèche est généralement comprise entre 40% et 50%, bien que la valeur exacte dépend des conditions de croissance 25 , 28 . La chlorophylle a une teneur peut être facilement déterminée et peut être utilisé comme un indicateur de la quantité de cellules présentes dans l'échantillon. Cependant, il est bien connu que la quantité de chlorophylle a par cellule varie considérablement en fonction des conditions de croissance, en particulier en réponse à l'évolution des concentrations d'éléments nutritifs et des intensités lumineuses 29 .
Un des avantages significatifs de la technique présentée par rapport à d'autres méthodes est qu'il est hautement sélectif. Le protocole acide acide et phénol et l'analyse de la composition du monosaccharide suivantL'hydrolyse acide sont des méthodes relativement simples et ont été utilisées dans les études précédentes 9 , 10 , 12 , 13 . Cependant, ces méthodes peuvent surestimer la teneur en glycogène parce que le glucose non glycogène et les sucres supplémentaires peuvent contribuer à la mesure, selon la technique de détection des glucides 12 . La technique décrite détecte sélectivement le glucose dans le glycogène. Il peut également discriminer le glucose à partir de la cellulose car l'α-amylase et l'α-amyloglucosidase n'hydrolysent pas les liaisons glucosyle liées à la β présents dans la cellulose. Dans des études antérieures, l'hydrolyse enzymatique du glycogène a été effectuée uniquement par l'α-amyloglucosidase 7 , 27 . L'inclusion de l'α-amylase à effet endo avec l'α-amyloglucosidase à action exotique, telle que présentée dans ce protocole, peut garantir que tIl hydrolyse efficacement le glycogène. Une hydrolyse sélective similaire est appliquée de manière routinière aux traitements de la biomasse végétale, dans lequel la combinaison de l'α-amyloglucosidase α-amylase est utilisée pour hydrolyser l'amidon sans affecter d'autres polysaccharides contenant du glucose, tels que la cellulose 21 .
La principale limitation de la technique est que la procédure est faible, car les échantillons individuels sont traités séparément à l'aide de tubes à microcentrifugeuse. L'étape de précipitation du glycogène est le principal facteur empêchant un débit plus élevé. La mise en œuvre en tant que procédure à haut débit nécessiterait l'utilisation de plaques de puits profondes et la possibilité de les centrifuger à une vitesse élevée (20 000 x g ). Alors que des centrifugeuses qui peuvent centrifuger des plaques à 96 puits à la vitesse nécessaire sont disponibles, la plupart des plaques de puits profond ne peuvent tolérer une force supérieure à 6 000 x g . Par conséquent, le choix judicieux des matériaux est nécessaire pour adapter le protocole pourAnalyse de débit h.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Acknowledgments
Les auteurs reconnaissent Nordic Energy Research (AquaFEED, projet no 24), Innovationfonden Denmark (Pant Power, projet n ° 12-131844) et Villum Fonden (projet n ° 13363)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| QSonica Sonicators Q700 | Qsonica, LLC | NA | QSonica |
| SpectraMax 190 Microplate Reader | Molecular Devices | NA | Eliza plate reader |
| Bullet Blender Storm | Next Advance | BBY24M-CE | Beads beater |
| Ultrospec 3100 pro UV/Visible Spectrophotometer | Amersham Biosciences | NA | Spectrophotometer |
| Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | Buffer |
| HCl | Merck | 1-00317 | pH adjutment |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | 32319 | Buffer |
| Amyloglycosidase (Rhizopus sp.) | Megazyme | E-AMGPU | Enzyme for glycogen depolymerization |
| α-Amylase, thermostable (Bacillus licheniformis) | Sigma-Aldrich | A3176 | Enzyme for glycogen depolymerization |
| D-Glucose | Merch | 8337 | Standard for the glucose assay |
| Pierce BCA Protein assay kit | Thermo Fisher scientific | 23225 | For determination of protein concentrations |
| Aluminum drying trays, disposable | VWR | 611-1362 | For determination of cell dry weights |
| D-Glucose assay kit (GODPOD format) | Megazyme | K-GLUC | For determination of glucose concentrations |
| Zirconium oxide breads, 0.15 mm | Next Advance | ZrOB015 | Beads for cell lysis in a Bullet Blendar Storm |
| RINO tubes | Next Advance | NA | Tubes for cell lysis in a Bullet Blendar Storm |
References
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