Summary
Burada, siyanobakteriyel hücrelerdeki glikojen içeriğini ölçmek için güvenilir ve kolay bir test sunuyoruz. İşlem, çökeltme, seçilebilir depolimerizasyon ve glikoz artıklarının belirlenmesini gerektirir. Bu yöntem hem vahşi hem de genetik mühendisliği yapılmış suşlar için uygundur ve siyanobakterilerin metabolik mühendisliğini kolaylaştırabilir.
Abstract
Siyanobakteriler, fotosentez sırasında ana hücre içi karbon ve enerji depolaması olarak glikojen biriktirir. Araştırmalardaki son gelişmeler, biyosentezin ve katabolizma döngüsü, redoks düzenlemesi ve kodlamayan RNA'nın dahil edilmesi gibi kompleks mekanizmaları vurgulamıştır. Aynı zamanda, ürün verimi artırmak için, karbonu glikojenden genetik olarak tasarlanmış siyanobakterilerdeki istenen ürünlere yönlendirmek için çaba sarf edilmektedir. Değişken doğruluk ve teknik karmaşıklıkla, siyanobakterilerdeki glikojen içeriğini belirlemek için çeşitli yöntemler kullanılır. Burada, standart yaşam bilimi laboratuarında yapılabilen siyanobakterlerdeki glikojen içeriğini güvenilir şekilde belirlemek için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Protokol, hücre lisatından glikojenin seçici olarak çökeltilmesini ve bir glikoz öküzü tarafından saptanan glikoz monomerlerinin üretilmesi için glikojenin enzimatik depololimerizasyonunu gerektirirIdase-peroksidaz (GOD-POD) enzim bağlı testi. Yöntem, Synechocystis sp. PCC 6803 ve Synechococcus sp. PCC 7002, metabolik mühendislikte yaygın olarak kullanılan iki model siyanobakteriyel tür. Üstelik, yöntem, düzenleyici elemanlarda veya glikojen biyosentetik genlerde bozuk olan vahşi tip ve mutantlar arasındaki glikojen içeriğinde başarılı bir şekilde farklılık sergiledi.
Introduction
Siyanobakteriler, fotosentez yoluyla ışığa sabitlenmiş CO 2'den gelen karbonun başlıca karbonhidrat deposu olarak glikojen biriktirir. Glikojen, α-1,6-bağlantılı glukosil bağlantıları ile yaratılan dalları olan doğrusal α-1,4-bağlı glukandan oluşan bir glıkan. Siyanobakterlerdeki glikojen biyosentezi, fosfoglukomütaz ve ADP-glikoz pirofosforilazın ardışık eylemi yoluyla glikoz-6-fosfatın ADP-glükoza dönüştürülmesiyle başlar. ADP-glikozdaki glukoz kısmı, bir veya daha fazla glikojen sentezleyicisi (GlgA) ile glikojen α-1,4-glukan omurgasının indirgeyici olmayan ucuna aktarılır. Daha sonra, dallanmış bir enzim, glikojen parçacığını üretmek için daha da genişletilen α-1,6-bağlantılı glukosil bağlantısını getirir. Karanlıkta, glikojen, glikojen fosforilaz, glikojen debranjivasyon enzimleri, α-glukanotransferaz ve malto-dekstrin fosforilazın fosforile glikoza ve serbest glikoza indirgenmesi ile parçalanır. Bu besleme intOksidatif pentoz fosfat yolu, Embden-Meyerhof-Parnas yolu (glikoliz) ve Entner-Doudoroff yolu 1 , 2 , 3 , 4 de dahil olmak üzere katabolik yolaklar.
Siyanobakterlerdeki glikojen metabolizması, son yıllarda cyanobacteria'nın, kimyasallar ve yakıtlar üretmek için güneş ışığı altında çalışan mikrobiyal hücre fabrikalarına dönüşmesi potansiyelinden dolayı artan bir ilgi topladı. Glikojen metabolizması, ürünlerin verimini artıracak şekilde modifiye edilebilir, çünkü glikojen bu bakterilerdeki en büyük esnek karbon havuzudur. Bunun bir örneği siyanobakteriyum Synechococcus sp. Mannitol üretmek için genetik olarak tasarlanmış PCC 7002; glikojen sentezinin genetik bozulma manitol verimi, 3-kat 5 artar. Bir başka örnek, biyoetanolün glikojen yüklü vahşi türevlerindenYpe Synechococcus sp. PCC 7002 6 . Vahşi hücre glikojen içeriği azot açlığı sırasında hücrenin kuru ağırlığının% 60'ına kadar olabilir 6 .
Glikojen metabolizması ve düzenlenmesi konusundaki anlayışımız son yıllarda da genişlemiştir. Glikojenin ışığa birikmesi ve karanlıkta katabolize olması bilinmesine rağmen, diel döngüsü boyunca glikojen metabolizmasının ayrıntılı kinetiği, Synechocystis sp. PCC 6803 7 . Dahası, glikojen birikimini etkileyen birkaç gen tespit edilmiştir. Dikkate değer bir örnek, varsayılan histidin kinaz PmgA'nın ve kodlamayan RNA PmgRl'in bir düzenleyici kaskad oluşturması ve glikojenin birikimini kontrol ettiği bulgudur. İlginç olarak, pmgA ve pmgR1 silme mutantları, Synechocystis sp. ' Un vahşi türü suşu kadar iki kat daha fazla glikojen birikir. PCC 68038 , 9 . Diğer düzenleyici elementlerin alternatif sigma faktörü E ve transkripsiyon faktörü CyAbrB2 10 , 11 de dahil olmak üzere glikojenin birikimini etkilediği bilinmektedir.
Glikojen düzenlenmesi ve metabolizması ilgi arttıkça, glikojen içeriğinin tayinini açıklayan ayrıntılı bir protokol gereklidir. Literatürde çeşitli yöntemler kullanılmaktadır. Asit hidrolizi, ardından yüksek basınçlı anyon değişimli sıvı kromatografisi ile monosakkarit içeriğinin saptanması, ardından atımlı amperometrik bir detektör veya asit ve fenille yapılan muameleler sonrası spektrometrik tayin , 9 , 10 , 12 , 13 glikojen içeriğini yaklaştırmak için yaygın olarak kullanılan yöntemlerdir. Bununla birlikte, yüksek basınçlı bir anyon değişimi sıvı kromatografisiC enstrümanı çok pahalıdır ve bazı siyanobakteriyel türlerde biriken bilinen sukroz 14 , glikosilgliserol 15 ve selüloz 16 , 17 , 18 gibi diğer glikoz içeren glikon konjugatlardan türetilen glikojeden türetilmiş glikozu ayırt etmez. Asit-fenol yöntemi, standart laboratuar ekipmanı kullanılarak gerçekleştirilebilir. Bununla birlikte, oldukça toksik reaktifler kullanır ve farklı gliko-konjügatlardan türeyen glikozu ayırt etmediği gibi glikoziti, glikolipidleri, lipopolisakaridleri ve hücre dışı matrisleri 12 gibi hücresel malzemeleri oluşturan diğer monosakaritlerden ayırt etmez. Özellikle, sıcak asit-fenol testi, glikoz içeriğinin spesifik belirlenmesi için değil, toplam karbonhidrat içeriğinin saptanması için sıklıkla kullanılır 12 . Enzimatik hyA-amiloglukozidaz ile glikozun glikoza droizlenmesi ve ardından bir enzim-eşlemeli analiz yoluyla glikozun saptanması, glıkojenden türetilmiş glukoza karşı oldukça hassas ve spesifik bir kolorimetrik okuma üretir. Özgüllük, hücre lizatlarından glikojenin etanol 5 , 8 , 19 tarafından tercihli olarak çökeltilmesi ile daha da geliştirilebilir.
Burada, en yaygın olarak incelenen iki siyanobakteriyal türün, Synechocystis sp. ' Deki glikojen içeriğinin enzim bazlı tahlili için ayrıntılı bir protokol açıklanmaktadır. PCC 6803 ve Synechococcus sp. PCC 7002, yabani tip ve mutant suşlarda. Etkin hidrolizi sağlamak için, α-amilaz ve α-amiloglükosidaz'dan oluşan bir kokteyl kullanılır 8 . Endo-etkili α-amilaz, çeşitli glukanlardaki α-1,4-bağlarını dekstrinlere hidrolize eder; bunlar, daha da hidrolize edilirler.O glukozun ekzo-etki eden α-amiloglükosidaz 20 ile sentezlenmesi. Bu enzimlerin sinerjistik etkileri çok iyi bilinmektedir ve bu enzimler, bitki biyokütle 21'inde selüloz gibi diğer glikoconjugantları etkilemeden glikojen gibi α'ya bağlı glukan olan nişastanın seçici hidrolizinde rutin olarak kullanılır. Serbest bırakılan glikoz, oksijenin hidrojen peroksite indirgenmesini katalize eden glikoz oksidaz ve glükozun bir laktona yükseltgenmesini katalizleyen bir enzim eşlenimli tahlilden sonra niceliksel olarak tespit edilir - ve peroksidaz hidrojen peroksitten pembe renkli bir kinonimin boyası üretir, Bir fenolik bileşik ve 4-aminoantipirin 22'yi içerir .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Hazırlık
- Siyanobakteri kültürleri
- Synechocystis sp. PCC 6803,% 1 (v / v) CO 2 ile takviye edilmiş sabit bir hava kaynağı ile 30 ° C'de sıvı BG11 ortamı 8'de karıştırılır . Kültürleri 50 umol foton / m 2 / s'lik bir fotosentetik foton akı yoğunluğunda sürekli olarak ışıkla aydınlatın.
- Synechococcus sp. % 1 (v / v) CO 2 ile takviye edilmiş sabit bir hava kaynağı ile, sıvı A + ortam 23'te (BG11 ortam da kullanılabilir) PCC 7002'yi. Sıcaklık 37 ° C olmalıdır. Kültürleri 150 μmol foton / m 2 / s'lik bir fotosentetik foton akı yoğunluğunda ışıkla sürekli olarak aydınlatın.
- 1 cm'lik bir ışık yoluna sahip bir küvet kullanarak 730 nm'de kültürün optik yoğunluğunu (OD) ölçün. OD değeri 0.8'in üstünde ise, uygun olan OD ölçümlerini elde etmek için uygun dilüsyonları yapın.Hücre konsantrasyonu.
NOT: Aşağıda sunulan protokoller, hücre yoğunluğu 2 veya daha yüksek bir OD 730nm değerine karşılık gelen sıvı kültürler için uygundur. Üslü büyüme fazındaki kültürler, tipik olarak 1'in altında bir OD 730 nm değerine sahip olan istendiğinde, santrifüjleme ve 2 ya da daha yüksek bir OD 730 nm değerini elde etmek için bir tampon ya da ortam içinde yeniden süspansiyon ile hücre yoğunluğunu konsantre hale getirin .
- Tamponlar ve reaktifler
- PH 8'de 50 mM Tris-HCl tamponu yapın.
- PH 5'de 50 mM sodyum asetat tamponu yapın.
- 50 mM sodyum asetat tamponu, pH 5 içinde 8 U / mL amiloglükosidaz stok solüsyonu yapın.
- 50 mM sodyum asetat tamponu, pH 5 içinde 2 U / mL α-amilaz stok solüsyonu yapın.
- Damıtılmış su kullanarak, 0 ila 100 ug / mL arasında değişen konsantrasyonlarda makyaj standart solüsyonları.
- GOD-POD reaktifini D-Glükoz Tahlil Setinden (GODPOD Formatı) hazırlayın, fÜreticinin talimatını kaldırmak.
2. Hücre Kuru Ağırlığının Belirlenmesi (Opsiyonel)
- 2 mL'lik bir kültür veya bir hücre yeniden süspansiyonu (adım 1.1'e bakın) 2.0 mL'lik bir tüpe aktarın ve 6,000 xg'de ve 4 ° C'de 5 dakika süreyle santrifüjleyin. Süpernatanı atın.
- Pelet 1 mL suda tekrar süspanse edin ve 6,000 xg'de ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı atın ve hücre topağını 0.5 mL suda tekrar süspanse edin.
- Süspansiyonu önceden tartılmış alüminyum tepsiye aktarın. Tepsiyi 105 ° C'de kurutma fırınına gece boyunca kurutma (yaklaşık 18 saat) için aktarın.
ÖNEMLİ: Malzemenin parmaklardan taşınmasını önlemek için tepsinin forsepsle işlenmesi önemlidir. Kurutma sırasında tepsilerden gelen herhangi bir kilo kaybını belirlemek için aynı koşullar altında önceden tartılmış alüminyum tepsi kurutun. - Kurumadan sonra tepsiyi fırından çıkarın ve ortam koşullarında dengeye gelmesine izin verin.0,0001 g hassasiyetle tartılmadan önce 5 dakika süreyle bekletilir.
NOT: Bu değer, hücre kuru ağırlığa dayalı olarak glikojen içeriğini normalleştirmek için kullanılabilir.
3. Siyanobakteriyel Hücrelerin Lizizasyonu
- 1 mL'lik bir kültür veya bir hücre yeniden süspansiyonu (adım 1.1'e bakın) 1.5 mL'lik bir tüpe aktarın ve 6,000 xg'de ve 4 ° C'de 10 dakika süreyle santrifüjleyin. Süpernatanı atın.
- Pelet 1 mL 50 mM Tris-HC1, pH 8 içinde süspansiyon haline getirin ve 10 dakika 6000 xg ve 4 ° C'de santrifüjleyin. Süpernatantı atın ve hücre peletini 1 mL Tris-HC1 tamponunda tekrar süspansiyon haline getirin. İşlemi tekrarlayın.
- Pelleti 500 mcL 50 mM Tris-HC1 tamponu (pH 8) içinde iyice süspanse edin.
ÖNEMLİ: Etkin bir hücre lizisi için peleti iyice süspanse edin. Yeniden süspansiyonu buzda tutun. - Yeniden süspanse edilen hücreleri 4 ° C'de, 30 siklüs ultrasonikasyon gerçekleştirerek, her siklüs, maksimum amplitüd ile, 20 kHz'lik bir frekansta 30 s'lik,90 s olmadan takip etti.
NOT: Bu yöntem, Synechococcus sp. PCC 7002.- Alternatif olarak, hücre resüspansiyonunu vidalı bir boruya aktarın ve üreticinin talimatlarını izleyerek boruya zirkonyum oksit boncukları ekleyin. Tüpü bir doku homojenleştiricisine yerleştirin ve hücreleri 4 ° C'de 5 frekans ayarında 5 dakikalık bir devirden oluşan 2 devirle yenerek çalkalayın.
NOT: Bu yöntem, Synechocystis sp. PCC 6803 ve Synechococcus sp. PCC 7002.
- Alternatif olarak, hücre resüspansiyonunu vidalı bir boruya aktarın ve üreticinin talimatlarını izleyerek boruya zirkonyum oksit boncukları ekleyin. Tüpü bir doku homojenleştiricisine yerleştirin ve hücreleri 4 ° C'de 5 frekans ayarında 5 dakikalık bir devirden oluşan 2 devirle yenerek çalkalayın.
- Lisatı içeren tüpü 6,000 xg ve 4 ° C'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin.
NOT: Pelet esas olarak büyük hücre artıkları içermelidir. Kesintisiz sayıda hücre varsa, adım 3.4'ü tekrarlayın. Süpernatanı buz üzerinde tutun. - Ticari bir BCA Protein test kiti kullanarak protein konsantrasyonunu belirleyin.
NOT: Değer, glikojen içeriğini normalleştirmek için kullanılabilirBir protein içeriği temelinde.
4. Glikojen Çökeltme
- 1.5 mL vidalı kapta adım 3.5'ten 900 μL% 96'lık (v / v) etanol ve 100 μL süpernatan karıştırılarak hücre lizatından klorofil a alınır. Kapağı kapattıktan sonra, tüpü standart bir laboratuar ısıtma bloğu kullanarak 10 dakika boyunca 90 ° C'de ısıtın.
- Tüp 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.
- Boruyu 20,000 xg'de ve 4 ° C'de 30 dakika santrifüj edin ve süpernatanı dikkatle çıkarın; Pelet glikojen içerir. Aşırı etanolü temizlemek için pelleti havada hafifçe kurutun.
ÖNEMLİ: Pelletin fazla kurutulması gerekir, aksi takdirde adım 5.1'te çözündürmek güçleşir. - İSTEĞE BAĞLI: klorofil a içeriğini belirlemek için 664 nm 'de aşama 4.3' de elde edilen yüzer absorbansı ölçülür. 84,6 L / g / cm 24 emme katsayısı kullanın.
NOT: Bu değer normalize etmek için kullanılabilirE glikojen içeriği.
5. Enzimatik Hidroliz ve Glikojen Tayini
- Adım 4.3'te elde edilen pelleti, 100 uL 50 mM sodyum asetat, pH 5 içinde çözünür hale getirin ve 50 uL 8 U / mL amiloglükosidaz ve 50 uL 2 U / mL α-amilaz ekleyin. Bir girdap kullanarak bu malzemeleri iyice karıştırın.
NOT: Pipetleme ile karıştırma tavsiye edilmez, çünkü glikojen pelleti viskozdur. - Karışımı 60 ° C'de bir ısıtma bloğu üzerinde 2 saat boyunca inkübe ederek glikojenin glikoz moleküllerine sindirilmesini sağlayın.
- Numuneyi 10,000 xg'de 5 dakika santrifüj edin ve süpernatanı yeni bir 1.5 mL tüp içine aktarın.
6. GOD-POD Reaktifini Kullanarak Toplam Glikoz İçeriğinin Saptanması
- GOD-POD reaktif maddesini kullanarak adım 5.3'te elde edilen süpernatanın glikoz konsantrasyonunu ölçün. Adım 5.3'ten 100 μL süpernatanı 96 oyuklu bir plakada bir oyuğa aktarın. Negatif bir kontrol olarak,100 μL 50 mM sodyum asetat, pH 5 kullanın. Bir kalibrasyon eğrisi oluşturmak için, glikoz standart solüsyonlarını da ölçün.
- Her bir numuneye 150 μL GOD-POD reaktif ekleyin ve pipetle hızlı bir şekilde karıştırın.
- Plakayı statik olarak 25 ° C'de 30 dakika inkübe edin. Bir plaka okuyucu kullanarak absorbans değerini 510 nm'de kaydedin.
- Glikoz standartlarından elde edilen bir kalibrasyon eğrisi kullanarak glukoz konsantrasyonunu hesaplayın.
NOT: Hücre lizatındaki glikojen konsantrasyonu glikoz konsantrasyonu (μg / mL) olarak ifade edilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
10 mL vahşi tipli Synechocystis sp. PCC 6803 , OD 730nm değeri yaklaşık 0.8'e ulaşana kadar foto- ototrofik koşullar altında yetiştirildi. Hücreler hasat edilmiş ve 50 mM Tris-HC1, pH 8 içinde yeniden süspanse edilmiştir. OD 730 nm değeri 2-3'e ayarlanmıştır. Glikojen içeriği, yukarıda tarif edilen protokolü izleyerek analiz edildi. OD 730nm başına glikojen içeriği 13 ± 1.8 μg / mL / OD 730nm ( N = 12) idi. Protein içeriğine glikojen içerik göre 0.24 ± 0.03 ug / ug (n = 12), ve klorofil glikojen içerik göre bir içerik 5.7 ± 0.6 ug / ug (n = 12) idi. Mümkün olan az miktarda malzemeden dolayı, hücre kuru ağırlığının ölçümü atlanmıştır. Benzer koşullar altında kültive siyanobakteriler protein içeriği, hücre kuru ağırlığının 25 <yaklaşık 50% olduğu göz önüne alındığında,/ Sup>, glikojen içeriğinin hücrenin kuru ağırlığının% 12'si olduğu tahmin edilmektedir ve bu daha önceki çalışmalarla uyumludur 26 .
GOD-POD testinin algılama limitleri, 10 ila 100 ug / mL arasındaki glikoz konsantrasyon aralığında, 510 nm'de 0.08 ve 0.7 emilim değerlerine karşılık gelen, 510 nm'de glukoz konsantrasyonu ve absorbans arasındaki doğrusal bir korelasyon gösterdi. Minimum sınır muhtemelen alet saptama limitinden kaynaklanmaktadır. 150 μg / ml'den yüksek glikoz konsantrasyonları kullanıldığında, koyu yeşil çökelti oluştu ve emilim okumasında büyük bir farklılığa neden oldu. Kullanılan hücre materyali miktarı ile ilgili olarak, hücre lizizinden önceki hücre yeniden süspansiyonunun OD 730nm değeri 2 ila 10 arasında olduğunda rutin olarak tekrarlanabilir glikojen içeriği elde ettik. OD 730nm değeri 1 veya daha düşük olan hücre yeniden süspansiyonları, Minimum bulgulama limiT, son derece değişken sonuçlara yol açar. OD 730nm değeri 20'den yüksek olan hücre yeniden süspansiyonu, hücre lizizi tam olmadığı için uygun değildi ve ya uzatılmış liziz ya da dilüsyonlar gerekliydi.
Şekil 1 , Synechocystis sp. ' Deki glikojen içeriğinin temsili sonuçlarını göstermektedir. PCC 6803 vahşi türü ve iki mutant suş ( ΔpmgA ve ΔpmgRl ). Üstel büyüme fazında yetişen hücreler kullanıldı. Glikojen içeriği ilk önce toplam protein içeriği ile normalleştirildi ve daha sonra vahşi tipli değere göre ifade edildi. Sonuçlar, mutant suşların, vahşi türe ait suştan en az iki misli yüksek olan glikojen içeriğine sahip olduğunu göstermektedir.
Daha sonra, glikojen içeriği Synechococcus sp. Suşlarında analiz edildi. Mannitol 5 üretmek üzere tasarlanmış PCC 7002 . Birinci suşu (Glg +), iki fonksiyonel glikojen sentazları kodlayan vahşi tipli glgA1 ve glgA2 genlerini içeren ikinci soy (Glg -) ise bu genlerin 5 fonksiyonel kopyasını yoksundur. Glikojen ve mannitol içerikleri daha sonra her iki suşta ölçülmüştür ( Şekil 2 ). O Glg + suşu daha mannitol üretimi ise, glikojen taranabilir düzeyde yoksun - sonuçlar Glg olduğunu göstermektedir. Bu, fotosentezle sentezlenen karbonhidratın, glikojen sentez yeteneğinden yoksun olan mutant suşta manitol'a yönlendirildiğini düşündürmektedir. Kültürlerin OD 730nm değerleri, hücre kuru ağırlık analizi için yeterli hücre materyali sağlayarak yaklaşık 10'dur. Glikojen içeriği hücre kuru ağırlığı kullanılarak normalize edildi.
8 / 56068fig1.jpg "/>
Şekil 1: Farklı Synechocystis sp . Hatlarında ölçülen glikojen içeriği . PCC, WT ve iki mutanttan (ΔpmgA 9 ve ΔpmgR1 8) içinde 6803. Bağıl glikojen içeriği gösterilmektedir. Glikojen seviyeleri, toplam protein içeriği ile normalize edildi. Üç biyolojik çoğaltmanın araçları gösterilir, hata çubukları standart sapmaları temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 2: Genetik olarak manipüle edilen Synechococcus sp. ' Deki glikojen ve manitol üretimi. PCC 7002 5 . Glg <Mannitol ve glikojen sentezleyen suş. Glg - , mannitol sentezleyen ancak glikojen içermeyen suş. Gösterilen değerler üç biyolojik çoğaltmanın ortalamasıdır ve hata çubukları standart sapmaları temsil eder. CDW: hücre kuru ağırlığı, ND: tespit edilmedi. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokolün kritik adımları glikojen çökmesi ve yeniden süspansiyon. Etanol çökeltisini takiben santrifüjden sonra, glikojen, gevşek şekilde mikrosantrifüj tüplerinin duvarlarına yapışan yarı saydam bir pelet oluşturur. Bu nedenle, yüzer maddenin çıkarılması sırasında, pelletin çıkarılmaması için özel dikkat gösterilmelidir. Glikojen pelleti yapışkandır ve kuruyorsa çözündürme zor olabilir. Glikojen pelletinin tamamen çözündürülmesinin önem taşıdığına dikkat edin, çünkü eksik çözünürlük verimsiz enzimatik sindirime yol açacak ve bu nedenle teknik kopyalar arasında büyük farklılıklara neden olacaktır. Vorteksleme ile çözündürmeden önce sonikasyon uygulanması süreci kolaylaştırabilir.
Normalleştirme yönteminin seçimi ile ilgili olarak, hücre kuru ağırlığı çokça kullanılan bir referanstır. Daha zahmetlidir ve protein ve klorofil tayinlerinden daha fazla hücre biyokütlesi gerektirirA. Toplam protein içeriği, hücre biyokütle için alternatif bir referans sağlar ve mevcut protokolde açıklandığı gibi küçük bir ölçekte tespit edilebilir. Kuru hücre biyokütlesi başına toplam protein miktarı tipik olarak% 40 ila% 50 aralığındadır, ancak kesin değer büyüme koşullarına 25 , 28 bağlıdır. Bir içerik kolayca belirlenebilir ve numunede mevcut olan hücre miktarı bir vekil olarak kullanılabilir klorofil. Bununla birlikte, hücre başına klorofil a miktarının, özellikle de değişen besin maddesi konsantrasyonlarına ve ışık yoğunluklarına cevap olarak, büyüme koşullarına bağlı olarak önemli derecede değiştiği iyi bilinmektedir 29 .
Sunulan tekniğin diğer yöntemlere göre önemli avantajlarından biri, son derece seçici olmasıdır. Sıcak asit ve fenol protokolü ve aşağıdaki monosakkarit bileşimi analiziAsit hidrolizi nispeten basit yöntemlerdir ve daha önceki çalışmalarında 9 , 10 , 12 , 13 kullanılmıştır . Bununla birlikte, bu yöntemler glikojen içeriğini olduğundan fazla tahmin edebilir, çünkü glikojen içermeyen glikoz ve ilave şekerler, karbonhidrat algılama tekniğine 12 bağlı olarak ölçümde katkıda bulunabilir. Tarif edilen teknik glikojende glikozu seçici olarak tespit eder. Ayrıca, glikozu selülozdan ayırt edebilir, çünkü α-amilaz ve α-amiloglükosidaz, selülozda bulunan β-bağlantılı glukosil bağlantılarını hidroliz etmez. Daha önceki çalışmalarda, glikojenin enzimatik hidrolizi yalnızca α-amiloglükozidaz 7 , 27 ile gerçekleştirildi . Endo-etkili α-amilazın ekso-aksiyonlu α-amiloglukozidaz ile birlikte bu protokolde gösterildiği gibi dahil edilmesi,Glikojenin verimli hidrolizi. Benzer bir selektif hidroliz, bitki biyokütlesinin muamelelerine rutin olarak uygulanmaktadır, burada a-amilaz α-amiloglükosidaz kombinasyonu, selüloz 21 gibi diğer glikoz içeren polisakkaritleri etkilemeden nişastayı hidrolize etmek için kullanılır.
Tekniğin temel sınırlaması, tek tek numuneler ayrı ayrı mikrosantrifüj tüpleri kullanılarak işlendiğinden prosedürün düşük verimlilikte olmasıdır. Glikojen çökeltme basamağı, daha yüksek verimliliği önleyen birincil faktördür. Yüksek verimli bir prosedür olarak uygulanması, derin kuyucuklu levhaların kullanılmasını ve bunları yüksek hızda (20.000 x g ) santrifüjleme kabiliyetine sahip olmasını gerektirecektir. Gerekli hızda 96 yuvalı plakaları santrifüjleyebilen santrifüjler mevcut olsa da, çoğu derin kuyucuklu plakalar 6000 x g'dan büyük kuvvetleri tolere edemezler. Dolayısıyla, malzemelerin dikkatle seçilmesi, protokolün yüksekH-throughput analizi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Yazarlar, Nordic Energy Research (AquaFEED, proje no. 24), Danimarka Yenilikçiliği (Pant Gücü, proje No: 12-131844) ve Villum Fonden (proje no: 13363)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| QSonica Sonicators Q700 | Qsonica, LLC | NA | QSonica |
| SpectraMax 190 Microplate Reader | Molecular Devices | NA | Eliza plate reader |
| Bullet Blender Storm | Next Advance | BBY24M-CE | Beads beater |
| Ultrospec 3100 pro UV/Visible Spectrophotometer | Amersham Biosciences | NA | Spectrophotometer |
| Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | Buffer |
| HCl | Merck | 1-00317 | pH adjutment |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | 32319 | Buffer |
| Amyloglycosidase (Rhizopus sp.) | Megazyme | E-AMGPU | Enzyme for glycogen depolymerization |
| α-Amylase, thermostable (Bacillus licheniformis) | Sigma-Aldrich | A3176 | Enzyme for glycogen depolymerization |
| D-Glucose | Merch | 8337 | Standard for the glucose assay |
| Pierce BCA Protein assay kit | Thermo Fisher scientific | 23225 | For determination of protein concentrations |
| Aluminum drying trays, disposable | VWR | 611-1362 | For determination of cell dry weights |
| D-Glucose assay kit (GODPOD format) | Megazyme | K-GLUC | For determination of glucose concentrations |
| Zirconium oxide breads, 0.15 mm | Next Advance | ZrOB015 | Beads for cell lysis in a Bullet Blendar Storm |
| RINO tubes | Next Advance | NA | Tubes for cell lysis in a Bullet Blendar Storm |
References
- Chen, X., et al. The Entner-Doudoroff pathway is an overlooked glycolytic route in cyanobacteria and plants. Proc Natl Acad Sci USA. 113 (19), 5441-5446 (2016).
- Yang, C., Hua, Q., Shimizu, K. Metabolic flux analysis in Synechocystis using isotope distribution from C-13-labeled glucose. Metab Eng. 4 (3), 202-216 (2002).
- Pelroy, R. A., Levine, G. A., Bassham, J. A. Kinetics of light-dark CO2 fixation and glucose assimilation by Aphanocapsa 6714. J Bacteriol. 128, 633-643 (1976).
- You, L., Berla, B., He, L., Pakrasi, H. B., Tang, Y. J. 13C-MFA delineates the photomixotrophic metabolism of Synechocystis. sp. PCC 6803 under light- and carbon-sufficient conditions. Biotechnol J. 9, 684-692 (2014).
- Jacobsen, J. H., Frigaard, N. U. Engineering of photosynthetic mannitol biosynthesis from CO2 in a cyanobacterium. Metab Eng. 21, 60-70 (2014).
- Möllers, K. B., Cannella, D., Jørgensen, H., Frigaard, N. -U. Cyanobacterial biomass as carbohydrate and nutrient feedstock for bioethanol production by yeast fermentation. Biotechnol Biofuels. 7, 64 (2014).
- Angermayr, S. A., et al. Culturing Synechocystis. sp. strain PCC 6803 with N2 and CO 2 in a diel regime reveals multiphase glycogen dynamics with low maintenance costs. Appl Environ Microbiol. 82, 4180-4189 (2016).
- de Porcellinis, A. J., et al. The Non-coding RNA Ncr0700/PmgR1 is required for photomixotrophic growth and the regulation of glycogen accumulation in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Plant Cell Physiol. 57 (10), 2091-2103 (2016).
- Sakuragi, Y. alpha-Tocopherol plays a role in photosynthesis and macronutrient homeostasis of the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 that is independent of its antioxidant function. Plant Physiol. 141, 508-521 (2006).
- Osanai, T., et al. Positive regulation of sugar catabolic pathways in the cyanobacterium Synechocystis. sp. PCC 6803 by the group 2 sigma factor sigE. J Biol Chem. 280, 30653-30659 (2005).
- Yamauchi, Y., Kaniya, Y., Kaneko, Y., Hihara, Y. Physiological roles of the cyAbrB transcriptional regulator pair Sll0822 and Sll0359 in Synechocystis sp. strain PCC 6803. J Bacteriol. 193, 3702-3709 (2011).
- Dubois, M., Gilles, K., Hamilton, J., Rebers, P., Smith, F. Colorimetric method for determination of sugars and related substances. Anal Chem. 28, 350-356 (1956).
- Osanai, T., et al. Genetic engineering of group 2 {sigma} factor SigE widely activates expressions of sugar catabolic genes in Synechocystis species PCC 6803. J Biol Chem. 286, 30962-30971 (2011).
- Miao, X., Wu, Q., Wu, G., Zhao, N. Sucrose accumulation in salt-stressed cells of agp gene deletion-mutant in cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. FEMS Microbiol Letters. 218, 71-77 (2003).
- Hagemann, M., Erdmann, N. Activation and pathway of glucosylglycerol synthesis in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Microbiology. 140, 1427-1431 (1994).
- Nobles, D. R., Romanovicz, D. K., Brown, R. M. Cellulose in cyanobacteria. Origin of vascular plant cellulose synthase. Plant Physiol. 127, 529-542 (2001).
- Zhao, C., et al. High-yield production of extracellular type-I cellulose by the cyanobacterium Synechococcus sp. PCC 7002. Cell Discovery. 1, 15004 (2015).
- Kawano, Y., et al. Cellulose accumulation and a cellulose synthase gene are responsible for cell aggregation in the cyanobacterium Thermosynechococcus vulcanus RKN. Plant Cell Physiol. 52, 957-966 (2011).
- Angermayr, S. A., Gorchs Rovira, A., Hellingwerf, K. J. Metabolic engineering of cyanobacteria for the synthesis of commodity products. Trends Biotechnol. 33, 352-361 (2015).
- Zhang, B., Dhital, S., Gidley, M. J. Synergistic and antagonistic effects of α-amylase and amyloglucosidase on starch digestion. Biomacromolecules. 14, 1945-1954 (2013).
- Harholt, J., et al. ARABINAN DEFICIENT 1 is a putative arabinosyltransferase involved in biosynthesis of pectic arabinan in Arabidopsis. Plant Physiol. 140, 49-58 (2006).
- Fernando, C. D., Soysa, P. Optimized enzymatic colorimetric assay for determination of hydrogen peroxide (H2O2) scavenging activity of plant extracts. MethodsX. 2, 283-291 (2015).
- Jacobsen, J. H., Rosgaard, L., Sakuragi, Y., Frigaard, N. U. One-step plasmid construction for generation of knock-out mutants in cyanobacteria: studies of glycogen metabolism in Synechococcus sp PCC 7002. Photosynth Res. 107 (2), 215-221 (2011).
- Lichtenthaler, H. K. Chlorophylls and carotenoids: Pigments of photosynthetic biomembranes. Methods Enzymol. 148, 350-382 (1987).
- López, C. V. G., del Carmen Cerón García, M., Fernández, F. G. A., Bustos, C. S., Chisti, Y., Sevilla, J. M. F. Protein measurements of microalgal and cyanobacterial biomass. Bioresource Technol. 101, 7587-7591 (2010).
- Hasunuma, T., et al. Dynamic metabolic profiling of cyanobacterial glycogen biosynthesis under conditions of nitrate depletion. J Exp Bot. 64, 2943-2954 (2013).
- Díaz-Troya, S., López-Maury, L., Sánchez-Riego, A. M., Roldán, M., Florencio, F. J. Redox regulation of glycogen biosynthesis in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803: Analysis of the AGP and glycogen synthases. Molecular Plant. 7, 87-100 (2014).
- Parrott, L. M., Slater, J. H. The DNA, RNA and protein composition of the cyanobacterium Anacystis nidulans grown in light- and carbon dioxide-limited chemostats. Arch Microbiol. 127, 53-58 (1980).
- Hihara, Y., Kamei, A., Kanehisa, M., Kaplan, A., Ikeuchi, M. DNA microarray analysis of cyanobacterial gene expression during acclimation to high light. Plant Cell. 13, 793-806 (2001).
