Summary
כאן, אנו מציגים assay אמין וקל למדידת תוכן הגליקוגן בתאי cyanobacterial. ההליך כרוך משקעים, דה פולימריזציה לבחירה, ואיתור של שאריות גלוקוז. שיטה זו מתאימה הן wildtype והן זנים מהונדסים גנטית והוא יכול להקל על ההנדסה המטבולית של cyanobacteria.
Abstract
Cyanobacteria לצבור גליקוגן כמו פחמן תאיים הגדולות ואנרגיה אחסון במהלך פוטוסינתזה. ההתפתחויות האחרונות במחקר הדגישו מנגנונים מורכבים של מטבוליזם גליקוגן, כולל מחזור diel של biosynthesis ו catabolism, רגולציה רגולציה, ואת מעורבותם של RNA לא קידוד. במקביל, נעשים מאמצים להפנות פחמן מגליקוגן למוצרים רצויים בקיאנובקטריות מהונדסות גנטית כדי לשפר את תפוקת המוצרים. כמה שיטות משמשות כדי לקבוע את תוכן הגליקוגן ב cyanobacteria, עם משתנות משתנה המורכבות הטכנית. כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט לקביעת אמין של תוכן הגליקוגן ב cyanobacteria כי ניתן לבצע במעבדה סטנדרטית מדעי החיים. הפרוטוקול כרוך משקעים סלקטיבי של גליקוגן מן lysate התא ואת deolymerization אנזימטי של גליקוגן לייצר מונומרים גלוקוז, אשר מזוהים על ידי גלוקוז שורIdase-peroxidase (GOD-POD) אנזים מצמידים אנזים. השיטה יושמה על Synechocystis sp. PCC 6803 ו- Synechococcus sp. PCC 7002, שני מינים cyanobacterial מודל כי נמצאים בשימוש נרחב בהנדסה מטבולית. יתר על כן, השיטה בהצלחה הראו הבדלים בתכולת הגליקוגן בין wildtype לבין מוטנטים פגומים ברכיבים רגולטוריים או גליקוגן biosynthetic גנים.
Introduction
Cyanobacteria לצבור גליקוגן כחנות פחמימות הגדולות של פחמן מ CO 2 קבוע באור באמצעות פוטוסינתזה. גליקוגן הוא גליקן המורכב של גלוקן ליניארי α-1,4 מקושר עם סניפים שנוצרו על ידי α-1,6 המקושרים גלוקוזיל קישורים. גליקוגן ביוסינתזה ב cyanobacteria מתחיל עם ההמרה של גלוקוז -6 פוספט לתוך ADP גלוקוז דרך פעולה רציפה של phosphoglucomutase ו- ADP גלוקוז pyrophosphorylase. מחצית הגלוקוז ב- ADP-glucose מועברת לקצה הלא-מפחית של עמוד השדרה α-1,4-glucan של הגליקוגן על-ידי סינתזה של גליקוגן אחת או יותר (GlgA). לאחר מכן, אנזימים מסתעפים להציג את הקישור α-1,6 מקושר גלוקוזיל, אשר המורחבת נוספת כדי ליצור את החלקיקים גליקוגן. בחושך, גליקוגן מחולק על ידי גליקוגן phosphorylase, אנזים גליקוגן זיוף, α-glucanotransferase, ו- malto-dextrin phosphorylase לתוך גלוקוז phosphorylated גלוקוז חינם. הזנות אלה intO מסלולים קטבוליים, כולל מסלול פוספט חמצון, מסלול Embeden-Meyerhof-Parnas (glycolysis), ואת מסלול Entner-Doudoroff 1 , 2 , 3 , 4 .
מטבוליזם גליקוגן ב cyanobacteria יש צבר עניין הולך וגובר בשנים האחרונות בגלל הפוטנציאל של cyanobacteria להתפתח מפעלים תא חיידקים מונע על ידי אור השמש לייצר כימיקלים ודלקים. מטבוליזם גליקוגן יכול להיות שונה כדי להגדיל את התשואה של המוצרים, כי הגליקוגן הוא מאגר פחמן גמיש הגדול ביותר בחיידקים אלה. דוגמה לכך היא cyanobacterium Synechococcus sp. PCC 7002, אשר כבר מהונדסים גנטית לייצר mannitol; הפרעה גנטית של סינתזת הגליקוגן מגדיל את התשואה מניטול 3 פי 5 . דוגמה נוספת היא ייצור של ביואתנול מ-גליקוגן נטען wildtYe Synechococcus sp. PCC 7002 6 . תוכן גליקוגן תא wildtype עשוי להיות עד 60% מהמשקל היבש של התא במהלך רעב חנקן 6.
ההבנה שלנו של מטבוליזם גליקוגן ורגולציה התרחבה גם בשנים האחרונות. בעוד גליקוגן ידוע לצבור באור להיות catabolized בחושך, קינטיקה מפורטת של מטבוליזם הגליקוגן במהלך מחזור דיל היה רק לאחרונה התגלה Synechocystis sp. PCC 6803 7 . יתר על כן, כמה גנים המשפיעים על הצטברות של גליקוגן זוהו. דוגמה בולטת היא התגלית כי pingA histidine histidine ואת הלא קידוד RNA PmgR1 טופס אשד פיקוח ולשלוט על הצטברות של גליקוגן. מעניין, את pmgA ו pmgR1 מחיקת מוטציות לצבור פעמיים כמו גליקוגן כמו זן wildtype של Synechocystis sp. PCC 68038 , 9 . אלמנטים רגולטוריים אחרים ידועים גם להשפיע על הצטברות של גליקוגן, כולל אלטרנטיבה גורם סיגמא E גורם תעתיק CyAbrB2 10 , 11 .
כמו עניין גליקוגן הרגולציה ומטבוליזם לגדול, פרוטוקול מפורט המתאר את קביעת התוכן הגליקוגן הוא מוצדק. מספר שיטות משמשות בספרות. חומצה hydrolysis ואחריו קביעת התוכן monosaccharide באמצעות ניתוח בלחץ גבוה אניון כרומטוגרפיה נוזלית יחד עם גלאי amperometric פעמו או קביעת ספקטרומטריים בעקבות טיפולים עם חומצה פנול נמצאים בשימוש נרחב שיטות כדי משוער תוכן הגליקוגן 9 , 10 , 12 , 13 . עם זאת, בלחץ גבוה אניון החלפת chromatographi נוזלימכשיר C הוא יקר מאוד ואינו להפלות גלוקוז נגזר גליקוגן מן הנגזר אחרים glycoconjugates המכילים גלוקוז, כגון סוכרוז 14 , glucosylglycerol 15 , תאית 16 , 17 , 18 , אשר ידועים לצבור כמה מינים cyanobacterial. השיטה חומצה פנול ניתן לבצע באמצעות ציוד מעבדה סטנדרטי. עם זאת, הוא משתמש ריאגנטים רעילים מאוד אינו מבחין גלוקוז נגזר glycoconjugates שונים, וגם לא להבחין גלוקוז מ monosaccharides אחרים המהווים חומרים סלולריים, כגון גליקוליפידים, lipopolysaccharides, מטריצות תאיים 12 . יש לציין כי חומצה חמה-פנול assay משמש לעתים קרובות לקביעת התוכן הכולל פחמימות ולא על הקביעה הספציפית של תוכן גלוקוז 12 . אנזימטיתDrolysis של גליקוגן לגלוקוז על ידי α-amyloglucosidase ואחריו זיהוי של גלוקוז באמצעות assay אנזים מצמידים מייצר readout colorimetric כי הוא רגיש במיוחד ספציפיים גלוקוז נגזר גליקוגן. הספציפיות יכולה להיות משופרת נוספת עם משקעים מועדפים של גליקוגן מ lysates התא על ידי אתנול 5 , 8 , 19 .
כאן, אנו מתארים פרוטוקול מפורט עבור assay מבוסס אנזים של תכולת הגליקוגן בשני מינים cyanobacterial הנחקרים ביותר, Synechocystis sp. PCC 6803 ו- Synechococcus sp. PCC 7002, ב wildtype ו זנים מוטציה. על מנת להבטיח הידרוליזה יעילה, קוקטייל של α-amylase ו α-amyloglucosidase משמש 8 . Endo משחק α-amylase hydrolyzes את α-1,4-linkages ב glucans שונים לתוך dextrins, אשר hydrolyzed נוספתO גלוקוז על ידי exo משחק α-amyloglucosidase 20 . ההשפעות הסינרגיסטיות של אנזימים אלה ידועות היטב, ואנזימים אלה משמשים באופן שגרתי להידרוליזה סלקטיבית של עמילן, שהוא גלוקן מקושר ל- α כמו גליקוגן, מבלי להשפיע על גליקוקונג'נטים אחרים, כגון תאית, ביומסה הצמחית 21 . גלוקוז משוחרר מזוהה כמותית לאחר assay אנזים מצמידים המורכב oxidase גלוקוז, אשר מזרז את הפחתת חמצן מי חמצן ואת חמצון של גלוקוז ל lactone ו peroxidase, אשר מייצרת צבע quinoneimine בצבע ורוד מי חמצן, תרכובת פנולית, ו- 4-aminoantipyrine 22 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנה
- תרבויות Cyanobacterial
- לגדול Synechocystis sp. PCC 6803 ב 30 מעלות צלזיוס BG11 בינוני 8 , עם אספקה קבועה של אוויר בתוספת 1% (V / V) CO 2 . להאיר את התרבויות ברציפות עם אור בכל צפיפות השטף הפוטוסינתזה פוטון של פוטון 50 μmol / m 2 / s.
- לגדול Synechococcus sp. PCC 7002 בנוזל A + בינוני 23 (בינוני BG11 יכול לשמש גם), עם אספקה קבועה של אוויר בתוספת 1% (V / V) CO 2 . הטמפרטורה צריכה להיות 37 ° C. להאיר את התרבויות ברציפות עם אור בכל צפיפות השטף הפוטוסינתזה פוטון של 150 μmol פוטון / m 2 / s.
- למדוד את הצפיפות האופטית (OD) של התרבות ב 730 ננומטר באמצעות קובט עם נתיב אור של 1 ס"מ. אם הערך OD הוא מעל 0.8, לעשות דילולים מתאימים כדי להשיג מדידות OD כי הם פרופורציונליים לריכוז התא.
הערה: הפרוטוקולים המוצגים להלן מתאימים לתרבויות נוזליות, עם צפיפות תאים המתאימה לערך של 730 ננו-מטר של 2 או יותר. כאשר תרבויות בשלב הצמיחה מעריכי הרצוי, אשר בדרך כלל יש ערך 730nm OD מתחת 1, לרכז את צפיפות התאים על ידי צנטריפוגה resuspension במאגר או בינוני להשיג ערך 730nm OD של 2 ומעלה.
- מאגרים וריאגנטים
- בצע 50 מ"מ טריס HCL חיץ ב pH 8.
- הפוך 50 מ"מ סודיום אצטט המאגר ב pH 5.
- הפוך פתרון מלאי של 8 U / mL amyloglucosidase ב 50 מ"מ מאגר אצטט אצטט, pH 5.
- הפוך פתרון המניות של 2 U / מ"ל α-amylase ב 50 מ"מ מאגר אצטט אצטט, pH 5.
- שימוש במים מזוקקים, פתרונות סטנדרטיים Makeglucose בריכוזים הנעים בין 0 ל 100 מיקרוגרם / מ"ל ,.
- הכן מגיב אלוהים- POD מן D- גלוקוז Assay Kit (פורמט GODPOD), fOllowing ההוראה של היצרן.
2. קביעת התא יבש משקל (אופציונלי)
- העברת 2 מ"ל של תרבות או resuspension התא (ראה שלב 1.1) לצינור 2.0 מ"ל ו צנטריפוגה ב XG 6,000 ו 4 ° C במשך 5 דקות. מחק את supernatant.
- Resuspend גלולה ב 1 מ"ל של מים צנטריפוגות ב XG 6000 ו 4 ° C במשך 5 דקות. מחק supernatant ו resuspend גלולה התא 0.5 מ"ל של מים.
- מעבירים את ההשעיה למגש אלומיניום שקול מראש. מעבירים את המגש לתנור ייבוש ב 105 ° C לייבוש לילה (כ 18 שעות).
קריטי: חשוב שהמגש יטופל במלקחיים כדי למנוע העברת חומר מהאצבעות. יבש מגש אלומיניום ריק מראש, שקול תחת אותם תנאים כדי לקבוע כל ירידה במשקל המגשים במהלך ייבוש. - לאחר הייבוש, הוציאו את המגש מהתנור ואפשרו לו לאזן את הקונדיטיעל 5 דקות לפני שקילתו עם דיוק של 0.0001 גרם.
הערה: ניתן להשתמש בערך כדי לנרמל את תוכן הגליקוגן על בסיס משקל תא יבש.
3. תמוגה של תאים Cyanobacterial
- העברת 1 מ"ל של תרבות או resuspension התא (ראה שלב 1.1) לצינור 1.5 מ"ל ו צנטריפוגות ב XG 6,000 ו 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. מחק את supernatant.
- Resuspend גלולה ב 1 מ"ל של 50 מ"מ Tris-HCl, pH 8, ו צנטריפוגות ב XG 6000 ו 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. מחק supernatant ו resuspend תא גלולה ב 1 מ"ל של חיץ Tris-HCl. חזור על התהליך.
- ביסודיות resuspend גלולה μL 500 של 50 מ"מ טריס HCL חיץ, pH 8.
קריטי: Resuspend גלולה היטב עבור תמוגה התא יעיל. שמור על resuspension בקרח. - Lyse התאים resuspended ב 4 מעלות צלזיוס על ידי ביצוע 30 מחזורים של ultrasonication, כל מחזור בהיקף של 30 שניות בתדר של 20 קילוהרץ עם משרעת מקסימלית,ואחריו 90 s ללא.
הערה: שיטה זו יכולה ביעילות lyse Synechococcus sp. PCC 7002.- לחלופין, להעביר resuspension התא כדי צינור בורג שווי ולהוסיף חרוזי תחמוצת זירקוניום לצינור, בעקבות הוראות היצרן. הגדר את הצינור homogenizer רקמות lyse התאים על 4 מעלות צלזיוס על ידי ביצוע 2 מחזורים של מכות, כל מחזור המורכב של 5 דקות בהגדרת תדר של 5.
הערה: שיטה זו יכולה ביעילות lyse Synechocystis sp. PCC 6803 ו- Synechococcus sp. PCC 7002.
- לחלופין, להעביר resuspension התא כדי צינור בורג שווי ולהוסיף חרוזי תחמוצת זירקוניום לצינור, בעקבות הוראות היצרן. הגדר את הצינור homogenizer רקמות lyse התאים על 4 מעלות צלזיוס על ידי ביצוע 2 מחזורים של מכות, כל מחזור המורכב של 5 דקות בהגדרת תדר של 5.
- צנטריפוגה הצינור המכיל lysate למשך 10 דקות ב XG 6,000 ו 4 ° C.
הערה: גלולה צריך בעיקר מורכב פסולת התא גדול. אם יש מספר משמעותי של תאים רצופים, חזור על שלב 3.4. שמור את supernatant על הקרח. - לקבוע את ריכוז החלבון באמצעות מסחרי BCA assay Protein Kit.
הערה: ניתן להשתמש בערך כדי לנרמל את תוכן הגליקוגןעל בסיס תוכן חלבון.
4. גליקוגן משקעים
- הסר chlorophyll א lysate התא על ידי ערבוב 900 μL של 96% (V / V) אתנול ו 100 μL של supernatant משלב 3.5 ב 1.5 מ"ל צינור בורג מכסה. לאחר סגירת מכסה, לחמם את הצינור על 90 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות באמצעות בלוק חימום במעבדה סטנדרטית.
- דגירה הצינור על קרח במשך 30 דקות.
- צנטריפוגה הצינור ב XG 20,000 ו 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות בזהירות להסיר את supernatant; גלולה מכיל גליקוגן. לייבש קלות את גלולה באוויר כדי להסיר אתנול עודף.
קריטי: ייבוש מוגזם של גלולה יש להימנע, אחרת זה הופך להיות קשה solubilize בשלב 5.1. - אופציונאלי: מדוד את הספיגה של supernatant שהושג בשלב 4.3 ב 664 ננומטר, כדי לקבוע את כלורופיל תוכן. השתמש במקדם ספיגה של 84.6 ליטר / גרם / ס"מ 24 .
הערה: הערך יכול לשמש לנורמליזציהתוכן הגליקוגן.
5. הידרוליזה אנזימטית וקביעת גליקוגן
- Solubilize גלולה שהתקבלו בשלב 4.3 μL 100 של חומצה אצטט 50 מ"מ, pH 5, ולהוסיף 50 μL של 8 U / mL amyloglucosidase ו 50 μL של 2 U / mL α-amylase. מערבבים חומרים אלה היטב באמצעות מערבולת.
הערה: ערבוב על ידי pipetting אינו מומלץ כי גלולה הגליקוגן הוא צמיג. - דגירה את התערובת על 60 מעלות צלזיוס על בלוק חימום עבור 2 שעות כדי לאפשר את העיכול של הגליקוגן לתוך מולקולות הגלוקוז.
- צנטריפוגה המדגם ב XG 10,000 במשך 5 דקות ולהעביר supernatant לצינור 1.5 מ"ל חדש.
6. קביעת תוכן גלוקוז הכולל באמצעות מגיב אלוהים- POD
- למדוד את הריכוז של גלוקוז supernatant שהושגו בשלב 5.3 באמצעות מגיב אלוהים- POD. העברת 100 μL של supernatant מ 5.3 שלב היטב בצלחת 96-היטב. כבקרה שלילית,השתמש 100 μL של חומצה אצטט 50 מ"מ, pH 5. ליצירת עקומת כיול, גם למדוד את הפתרונות הסטנדרטיים גלוקוז.
- הוסף 150 μL של אלוהים מגיב POD לכל מדגם במהירות לערבב על ידי pipetting.
- דגירה צלחת סטטי על 25 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. הקלט את הערך absorbance ב 510 ננומטר באמצעות קורא צלחת.
- חישוב הריכוז של גלוקוז באמצעות עקומת כיול המתקבל סטנדרטים הגלוקוז.
הערה: ריכוז הגליקוגן בתאי התא מתבטא בריכוז הגלוקוז (μg / mL).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
10 מ"ל של wildtype Synechocystis sp. PCC 6803 גדלו בתנאים photautotrophic עד הערך 730nm OD הגיעו כ 0.8. התאים נקצרו resuspended ב 50 מ"מ טריס HCl, pH 8. ערך 730nm OD הותאם 2-3. תכולת הגליקוגן נותחה בעקבות הפרוטוקול שתואר לעיל. תכולת הגליקוגן לכל 730 ננו-מטר היה 13 ± 1.8 מיקרוגרם / מ"ל / OD 730 ננומטר ( N = 12). קרוב המשפחה תוכן הגליקוגן לתוכן חלבון היה 0.24 ± 0.03 מיקרוגרם / מיקרוגרם (N = 12), ואת יחסי תוכן גליקוגן כלורופיל תוכן היה 5.7 ± 0.6 מיקרוגרם / מיקרוגרם (N = 12). בשל כמות קטנה של חומר זמין, המדידה של משקל התא היבש הושמטה. בהתחשב בכך התוכן חלבון cyanobacteria מעובדים בתנאים דומים הוא כ 50% של משקל התא יבש 25 </ Sup>, תכולת הגליקוגן מוערכת ב -12% ממשקל היובש התא, אשר עולה בקנה אחד עם מחקרים קודמים 26 .
מגבלות הגילוי של ה- GOD-POD הראו מתאם ליניארי בין ריכוז הגלוקוז לספיגה ב -510 ננומטר בטווח ריכוז הגלוקוז בין 10 ל -100 מיקרוגרם למ"ל, המקביל לערכי ספיגה של 0.08 ו -0.7 ב -510 ננו-מטר. הגבול המינימלי צפוי בשל מגבלת האיתור אינסטרומנטלי. כאשר ריכוז גלוקוז גבוה מ 150 מיקרוגרם / מ"ל שימשו, משקעים ירוקים כהים נוצרו, גרימת וריאציה גדולה readout absorbance. לגבי כמות החומרים התא בשימוש, אנחנו שגרתי שהושג תוכן הגליקוגן כאשר ערך 730nm OD של resuspension התא לפני תמוגה התא היה בין 2 ל 10. resuspensions התא עם ערך 730nm OD של 1 או מתחת הולידה אותות קרוב ל מינימום זיהוי לימיT, המוביל לתוצאות משתנות מאוד. התא resuspension עם ערך 730nm OD גבוה מ 20 לא היה מתאים, כי תמוגה התא היה שלם, וגם תרחיף המורחבת או דילולים נדרשו.
איור 1 מציג תוצאות נציג של תוכן הגליקוגן ב Synechocystis sp. PCC 6803 wildtype ושני זנים מוטנטים ( ΔpmgA ו ΔpmgR1 ). התאים שגדלו בשלב הצמיחה המעריכי היו בשימוש. תכולת הגליקוגן נוטרלה לראשונה על ידי תכולת החלבון הכוללת והובעה לאחר מכן ביחס לערך של wildtype. התוצאות מראות כי זנים מוטציה יש תוכן גליקוגן כי הם לפחות פי שניים גבוה יותר זן wildtype.
לאחר מכן, תוכן הגליקוגן נותח בזנים של סינצ'וקוקוס sp. PCC 7002 מהונדסים לייצר mannitol 5 . המתח הראשון (GLG +) מכיל את wildtype glgA1 ו glgA2 הגנים מקודדים שני synthases גליקוגן תפקודי, בעוד הזן השני (GLG -) חסר עותקים תפקודיים של גנים אלה 5. תכולת הגליקוגן ומניטול נמדדו אז בשני זנים ( איור 2 ). התוצאות מראות כי Glg - חסר רמה לגילוי של גליקוגן, בעוד זה הפיק יותר mannitol מאשר זן GLG + . זה מצביע על כך הפחמימות מסונתז על ידי הפוטוסינתזה מנותב למניטול בזן מוטציה כי אין את היכולת לסנתז גליקוגן. ערכי 730nm OD של תרבויות היו כ 10, מתן חומרים תא מספיק עבור ניתוח תאים במשקל יבש. תוכן הגליקוגן מנורמל באמצעות משקל התא היבש.
8 / 56068fig1.jpg "/>
איור 1: תכולת הגליקוגן הנמדדת בקווים שונים של סינכוקיסטיס sp . PCC 6803. תכולת הגליקוגן היחסי ב- WT ובשני מוטציות ( ΔpmgA 9 ו- ΔpmgR1 8 ) מוצגים. רמות הגליקוגן מנורמל על ידי תכולת החלבון. אמצעי של שלושה משכפל ביולוגי מוצגים, עם סורגים שגיאה המייצג סטיות תקן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: ייצור גליקוגן ו mannitol ב מניפולציה גנטית Synechococcus sp. PCC 7002 5 . גלג <Sup> +, זן synthesizing mannitol וגליקוגן. Glg - , זן מסנתז manititol אבל לא גליקוגן. הערכים המתוארים הם הממוצע של שלושה משכפלים ביולוגיים, עם מוטות שגיאה המייצגים את סטיית התקן. CDW: תא יבש, ND: לא זוהה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
צעדים קריטיים בפרוטוקול הם משקעים גליקוגן resuspension. לאחר צנטריפוגה לאחר משקעים אתנול, גליקוגן יוצר גלולה שקוף כי באופן רופף דבקות קירות microcentrifuge צינורות. לכן, בעת הסרת supernatant, תשומת לב מיוחדת צריך להינתן כדי לא להסיר את גלולה. גליקוגן גלולה הוא דביק, solubilization יכול להיות קשה אם הוא מתייבש. שים לב כי solubilization מלא של גלולה גליקוגן חשוב משום solubilization חלקית יוביל לעיכול אנזימטי יעיל ולכן יהיה ליצור וריאציות גדולות בין משכפל טכני. היישום של sonication לפני solubilization ידי vortexing עשוי להקל על התהליך.
לגבי הבחירה של שיטת הנורמליזציה, משקל התא היבש הוא הפניה בשימוש נרחב. זה יותר מייגע ודורש יותר ביומסה התא מאשר הקביעות של חלבון ו chlorophyllא . התוכן הכולל חלבון מספק התייחסות חלופית ביומסה התא ניתן לקבוע בקנה מידה קטן, כמתואר בפרוטוקול הנוכחי. תכולת החלבון לכל ביומסה תא יבש היא בדרך כלל בטווח שבין 40% ל 50%, אם כי הערך המדויק תלוי בתנאי צמיחה 25 , 28 . הכלורופיל תוכן ניתן לקבוע בקלות ויכול לשמש כמדד לכמות התא הנוכחי במדגם. עם זאת, זה ידוע היטב כי הסכום של כלורופיל לכל תא משתנה בהתאם משמעותי על תנאי הגידול, במיוחד בתגובת שינוי ריכוזי מזין ועוצמות אור 29.
אחד היתרונות המשמעותיים של הטכניקה המוצגת ביחס לשיטות אחרות הוא שהיא סלקטיבית מאוד. חומצה חם פרוטוקול פנול ואת הרכב הרכב monosaccharide הבאיםחומצה הידרוליזה הן שיטות פשוטות יחסית ו שימשו מחקרים קודמים 9 , 10 , 12 , 13 . עם זאת, שיטות אלה יכולים להעריך יתר על המידה את תוכן הגליקוגן כי גלוקוז שאינו גליקוגן וסוכרים נוספים יכולים לתרום למדידה, בהתאם טכניקה זיהוי פחמימות 12 . הטכניקה המתוארת מבחינה סלקטיבית מזהה גלוקוז בגליקוגן. זה גם יכול להפלות גלוקוז מתאית, כי α-amylase ו α-amyloglucosidase לא hydrolyze β המקושרים גלוקוזיל קשרים הקיימים תאית. במחקרים קודמים, הידרוליזה האנזימטית של הגליקוגן בוצעה רק על ידי α-amyloglucosidase 7 , 27 . הכללת endo משחק α-amylase יחד עם exo משחק α-amyloglucosidase, כפי שמוצג בפרוטוקול זה, יכול להבטיח tהוא הידרוליזה יעילה של גליקוגן. הידרוליזה סלקטיבית דומה מיושם באופן שגרתי על טיפולים של ביומסה צמח, שבו השילוב של α-amylase α-amyloglucosidase משמש לעמילן hydrolyze מבלי להשפיע על סוכרים המכילים גלוקוז אחרים, כגון תאית 21 .
המגבלה העיקרית של הטכניקה היא כי ההליך הוא תפוקה נמוכה, כי דגימות בודדים מעובדים בנפרד באמצעות צינורות microcentrifuge. שלב הגליקוגן של המשקעים הוא הגורם העיקרי המונע תפוקה גבוהה יותר. יישום כמו תפוקה גבוהה ההליך יחייב את השימוש היטב צלחות היטב ואת היכולת centrifuge אלה במהירות גבוהה (20,000 x גרם ). בעוד צנטריפוגות שיכול צנטריפוגה 96 צלחות היטב במהירות הנדרשת זמינים, צלחות עמוק ביותר היטב לא יכול לסבול כוח גדול מ 6,000 x גרם . לפיכך, בחירה זהירה של חומרים נדרש להתאים את הפרוטוקול עבור higניתוח ניתוח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לגלות.
Acknowledgments
המחברים מכירים במחקר Nordic Energy (AquaFEED, פרויקט מס '24), Innovationfonden Denmark (Pant Power, פרויקט מס' 12-131844) וווילום פונדן (פרויקט מס '13363)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| QSonica Sonicators Q700 | Qsonica, LLC | NA | QSonica |
| SpectraMax 190 Microplate Reader | Molecular Devices | NA | Eliza plate reader |
| Bullet Blender Storm | Next Advance | BBY24M-CE | Beads beater |
| Ultrospec 3100 pro UV/Visible Spectrophotometer | Amersham Biosciences | NA | Spectrophotometer |
| Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | Buffer |
| HCl | Merck | 1-00317 | pH adjutment |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | 32319 | Buffer |
| Amyloglycosidase (Rhizopus sp.) | Megazyme | E-AMGPU | Enzyme for glycogen depolymerization |
| α-Amylase, thermostable (Bacillus licheniformis) | Sigma-Aldrich | A3176 | Enzyme for glycogen depolymerization |
| D-Glucose | Merch | 8337 | Standard for the glucose assay |
| Pierce BCA Protein assay kit | Thermo Fisher scientific | 23225 | For determination of protein concentrations |
| Aluminum drying trays, disposable | VWR | 611-1362 | For determination of cell dry weights |
| D-Glucose assay kit (GODPOD format) | Megazyme | K-GLUC | For determination of glucose concentrations |
| Zirconium oxide breads, 0.15 mm | Next Advance | ZrOB015 | Beads for cell lysis in a Bullet Blendar Storm |
| RINO tubes | Next Advance | NA | Tubes for cell lysis in a Bullet Blendar Storm |
References
- Chen, X., et al. The Entner-Doudoroff pathway is an overlooked glycolytic route in cyanobacteria and plants. Proc Natl Acad Sci USA. 113 (19), 5441-5446 (2016).
- Yang, C., Hua, Q., Shimizu, K. Metabolic flux analysis in Synechocystis using isotope distribution from C-13-labeled glucose. Metab Eng. 4 (3), 202-216 (2002).
- Pelroy, R. A., Levine, G. A., Bassham, J. A. Kinetics of light-dark CO2 fixation and glucose assimilation by Aphanocapsa 6714. J Bacteriol. 128, 633-643 (1976).
- You, L., Berla, B., He, L., Pakrasi, H. B., Tang, Y. J. 13C-MFA delineates the photomixotrophic metabolism of Synechocystis. sp. PCC 6803 under light- and carbon-sufficient conditions. Biotechnol J. 9, 684-692 (2014).
- Jacobsen, J. H., Frigaard, N. U. Engineering of photosynthetic mannitol biosynthesis from CO2 in a cyanobacterium. Metab Eng. 21, 60-70 (2014).
- Möllers, K. B., Cannella, D., Jørgensen, H., Frigaard, N. -U. Cyanobacterial biomass as carbohydrate and nutrient feedstock for bioethanol production by yeast fermentation. Biotechnol Biofuels. 7, 64 (2014).
- Angermayr, S. A., et al. Culturing Synechocystis. sp. strain PCC 6803 with N2 and CO 2 in a diel regime reveals multiphase glycogen dynamics with low maintenance costs. Appl Environ Microbiol. 82, 4180-4189 (2016).
- de Porcellinis, A. J., et al. The Non-coding RNA Ncr0700/PmgR1 is required for photomixotrophic growth and the regulation of glycogen accumulation in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Plant Cell Physiol. 57 (10), 2091-2103 (2016).
- Sakuragi, Y. alpha-Tocopherol plays a role in photosynthesis and macronutrient homeostasis of the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 that is independent of its antioxidant function. Plant Physiol. 141, 508-521 (2006).
- Osanai, T., et al. Positive regulation of sugar catabolic pathways in the cyanobacterium Synechocystis. sp. PCC 6803 by the group 2 sigma factor sigE. J Biol Chem. 280, 30653-30659 (2005).
- Yamauchi, Y., Kaniya, Y., Kaneko, Y., Hihara, Y. Physiological roles of the cyAbrB transcriptional regulator pair Sll0822 and Sll0359 in Synechocystis sp. strain PCC 6803. J Bacteriol. 193, 3702-3709 (2011).
- Dubois, M., Gilles, K., Hamilton, J., Rebers, P., Smith, F. Colorimetric method for determination of sugars and related substances. Anal Chem. 28, 350-356 (1956).
- Osanai, T., et al. Genetic engineering of group 2 {sigma} factor SigE widely activates expressions of sugar catabolic genes in Synechocystis species PCC 6803. J Biol Chem. 286, 30962-30971 (2011).
- Miao, X., Wu, Q., Wu, G., Zhao, N. Sucrose accumulation in salt-stressed cells of agp gene deletion-mutant in cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. FEMS Microbiol Letters. 218, 71-77 (2003).
- Hagemann, M., Erdmann, N. Activation and pathway of glucosylglycerol synthesis in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Microbiology. 140, 1427-1431 (1994).
- Nobles, D. R., Romanovicz, D. K., Brown, R. M. Cellulose in cyanobacteria. Origin of vascular plant cellulose synthase. Plant Physiol. 127, 529-542 (2001).
- Zhao, C., et al. High-yield production of extracellular type-I cellulose by the cyanobacterium Synechococcus sp. PCC 7002. Cell Discovery. 1, 15004 (2015).
- Kawano, Y., et al. Cellulose accumulation and a cellulose synthase gene are responsible for cell aggregation in the cyanobacterium Thermosynechococcus vulcanus RKN. Plant Cell Physiol. 52, 957-966 (2011).
- Angermayr, S. A., Gorchs Rovira, A., Hellingwerf, K. J. Metabolic engineering of cyanobacteria for the synthesis of commodity products. Trends Biotechnol. 33, 352-361 (2015).
- Zhang, B., Dhital, S., Gidley, M. J. Synergistic and antagonistic effects of α-amylase and amyloglucosidase on starch digestion. Biomacromolecules. 14, 1945-1954 (2013).
- Harholt, J., et al. ARABINAN DEFICIENT 1 is a putative arabinosyltransferase involved in biosynthesis of pectic arabinan in Arabidopsis. Plant Physiol. 140, 49-58 (2006).
- Fernando, C. D., Soysa, P. Optimized enzymatic colorimetric assay for determination of hydrogen peroxide (H2O2) scavenging activity of plant extracts. MethodsX. 2, 283-291 (2015).
- Jacobsen, J. H., Rosgaard, L., Sakuragi, Y., Frigaard, N. U. One-step plasmid construction for generation of knock-out mutants in cyanobacteria: studies of glycogen metabolism in Synechococcus sp PCC 7002. Photosynth Res. 107 (2), 215-221 (2011).
- Lichtenthaler, H. K. Chlorophylls and carotenoids: Pigments of photosynthetic biomembranes. Methods Enzymol. 148, 350-382 (1987).
- López, C. V. G., del Carmen Cerón García, M., Fernández, F. G. A., Bustos, C. S., Chisti, Y., Sevilla, J. M. F. Protein measurements of microalgal and cyanobacterial biomass. Bioresource Technol. 101, 7587-7591 (2010).
- Hasunuma, T., et al. Dynamic metabolic profiling of cyanobacterial glycogen biosynthesis under conditions of nitrate depletion. J Exp Bot. 64, 2943-2954 (2013).
- Díaz-Troya, S., López-Maury, L., Sánchez-Riego, A. M., Roldán, M., Florencio, F. J. Redox regulation of glycogen biosynthesis in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803: Analysis of the AGP and glycogen synthases. Molecular Plant. 7, 87-100 (2014).
- Parrott, L. M., Slater, J. H. The DNA, RNA and protein composition of the cyanobacterium Anacystis nidulans grown in light- and carbon dioxide-limited chemostats. Arch Microbiol. 127, 53-58 (1980).
- Hihara, Y., Kamei, A., Kanehisa, M., Kaplan, A., Ikeuchi, M. DNA microarray analysis of cyanobacterial gene expression during acclimation to high light. Plant Cell. 13, 793-806 (2001).
