Summary
Aquí, presentamos un ensayo fiable y fácil para medir el contenido de glucógeno en células de cianobacterias. El procedimiento implica precipitación, despolimerización seleccionable y la detección de residuos de glucosa. Este método es adecuado para cepas de tipo salvaje y genéticamente modificadas y puede facilitar la ingeniería metabólica de las cianobacterias.
Abstract
Las cianobacterias acumulan glucógeno como almacenamiento intracelular de carbono y energía durante la fotosíntesis. Los recientes avances en la investigación han puesto de relieve los complejos mecanismos del metabolismo del glucógeno, incluyendo el ciclo diel de biosíntesis y catabolismo, la regulación redox, y la participación de ARN no codificante. Al mismo tiempo, se están haciendo esfuerzos para redirigir el carbono del glicógeno a productos deseables en cianobacterias modificadas genéticamente para mejorar los rendimientos del producto. Se utilizan varios métodos para determinar los contenidos de glucógeno en las cianobacterias, con precisión variable y complejidades técnicas. Aquí, proporcionamos un protocolo detallado para la determinación fiable del contenido de glucógeno en cianobacterias que se puede realizar en un laboratorio estándar de ciencias de la vida. El protocolo implica la precipitación selectiva de glicógeno a partir del lisado celular y la despolimerización enzimática de glucógeno para generar monómeros de glucosa, que son detectados por un buey de glucosaIdase-peroxidasa (GOD-POD). El método se ha aplicado a Synechocystis sp. PCC 6803 y Synechococcus sp. PCC 7002, dos especies de cianobacterias modelo que se utilizan ampliamente en la ingeniería metabólica. Además, el método mostró con éxito diferencias en los contenidos de glucógeno entre el tipo salvaje y mutantes defectuosos en elementos reguladores o genes biosintéticos de glicógeno.
Introduction
Las cianobacterias se acumulan glucógeno como el principal almacén de carbohidratos de carbono de CO 2 fijado a la luz a través de la fotosíntesis. El glucógeno es un glicano que consiste en glucano enlazado con α-1,4 lineal con ramificaciones creadas por enlaces glucosilo unidos por α-1,6. La biosíntesis de glicógeno en cianobacterias comienza con la conversión de glucosa-6-fosfato en ADP-glucosa a través de la acción secuencial de fosfoglucomutasa y ADP-glucosa pirofosforilasa. El resto de glucosa en ADP-glucosa se transfiere al extremo no reductor del esqueleto de α-1,4-glucano de glucógeno por una o más glucógeno sintasas (GlgA). Posteriormente, las enzimas ramificadoras introducen el enlace glucosilo unido a 1,6, que se extiende adicionalmente para generar la partícula de glicógeno. En la oscuridad, el glucógeno se descompone por glucógeno fosforilasa, enzimas desramificantes de glucógeno, α-glucanotransferasa y malto-dextrina fosforilasa en glucosa fosforilada y glucosa libre. Estos int de alimentaciónO las vías catabólicas, incluida la vía oxidativa de pentosa fosfato, la vía de Embden-Meyerhof-Parnas (glicólisis) y la vía de Entner-Doudoroff 1 , 2 , 3 , 4 .
El metabolismo del glicógeno en las cianobacterias ha despertado un interés creciente en los últimos años debido a la posibilidad de que las cianobacterias se conviertan en fábricas de células microbianas impulsadas por la luz solar para producir productos químicos y combustibles. El metabolismo del glicógeno podría modificarse para aumentar el rendimiento de los productos, porque el glicógeno es el grupo de carbono flexible más grande de estas bacterias. Un ejemplo es la cianobacteria Synechococcus sp. PCC 7002, que ha sido genéticamente modificado para producir manitol; La interrupción genética de la síntesis de glucógeno aumenta el rendimiento de manitol 3 veces 5 . Otro ejemplo es la producción de bioetanol a partir de wildt cargado con glucógenoYpe Synechococcus sp. PCC 7002 6 . El contenido de glucógeno de células de tipo salvaje puede ser hasta 60% del peso seco de la célula durante la inanición de nitrógeno 6 .
Nuestra comprensión del metabolismo del glucógeno y la regulación también se ha expandido en los últimos años. Aunque se sabe que el glucógeno se acumula a la luz y se cataboliza en la oscuridad, la cinética detallada del metabolismo del glucógeno durante el ciclo de diel fue revelada recientemente en Synechocystis sp. PCC 6803 7 . Además, se han identificado varios genes que afectan a la acumulación de glucógeno. Un ejemplo notable es el descubrimiento de que la supuesta histidina quinasa PmgA y el ARN no codificante PmgR1 forman una cascada reguladora y controlan la acumulación de glucógeno. De manera interesante, los mutantes de deleción pmgA y pmgR1 acumulan el doble de glucógeno que la cepa de tipo salvaje de Synechocystis sp. PCC 68038 , 9 . Se sabe también que otros elementos reguladores afectan la acumulación de glucógeno, incluyendo el factor sigma E alternativo y el factor transcripcional CyAbrB2 10 , 11 .
Como el interés en la regulación del glucógeno y el metabolismo crecen, un protocolo detallado que describe la determinación del contenido de glucógeno está garantizado. En la literatura se utilizan varios métodos. La hidrólisis ácida seguida por la determinación del contenido de monosacárido mediante cromatografía líquida de intercambio aniónico de alta presión acoplada con un detector amperométrico pulsado o determinación espectrométrica después de tratamientos con ácido y fenol son métodos ampliamente utilizados para aproximar el contenido de glucógeno 9 , 10 , 12 , 13 . Sin embargo, un cromatógrafo líquido de intercambio aniónico de alta presiónC es muy cara y no discrimina la glucosa derivada del glucógeno de la derivada de otros glicoconjugados que contienen glucosa, tales como la sacarosa 14 , el glucosilglicerol 15 y la celulosa 16 , 17 , 18 , que se sabe que se acumulan en algunas especies de cianobacterias. El método ácido-fenol se puede realizar utilizando equipo de laboratorio estándar. Sin embargo, utiliza reactivos altamente tóxicos y no distingue glucosa derivada de diferentes glicoconjugados, ni distingue glucosa de otros monosacáridos que constituyen materiales celulares, como glicolípidos, lipopolisacáridos y matrices extracelulares 12 . En particular, el ensayo ácido-fenol caliente se utiliza a menudo para la determinación del contenido total de hidratos de carbono más que para la determinación específica del contenido de glucosa 12 . Enzymatic hyLa hidrólisis de glicógeno a glucosa por α-amiloglucosidasa seguida por la detección de glucosa a través de un ensayo acoplado a enzima genera una lectura colorimétrica que es altamente sensible y específica a glucosa derivada de glucógeno. La especificidad puede mejorarse adicionalmente con la precipitación preferencial de glucógeno a partir de lisados celulares por etanol 5 , 8 , 19 .
Aquí, describimos un protocolo detallado para un ensayo basado en enzimas del contenido de glucógeno en dos de las especies de cianobacterias más estudiadas, Synechocystis sp. PCC 6803 y Synechococcus sp. PCC 7002, en el tipo salvaje y cepas mutantes. Con el fin de garantizar la hidrólisis eficiente, un cóctel de α-amilasa y α-amiloglucosidasa se utiliza [ 8] . La alpha - amilasa que actúa endo hidroliza los enlaces alpha - 1,4 en diversos glucanos en dextrinas, que se hidrolizan adicionalmente tO de glucosa mediante la α-amiloglucosidasa exoactiva 20 . Los efectos sinérgicos de estas enzimas son bien conocidos, y estas enzimas se utilizan rutinariamente para la hidrólisis selectiva del almidón, que es un glucano α-ligado como el glucógeno, sin afectar a otros glicoconjugantes, como la celulosa, en la biomasa vegetal 21 . La glucosa liberada se detecta cuantitativamente después de un ensayo acoplado a enzima que consiste en glucosa oxidasa, que cataliza la reducción de oxígeno en peróxido de hidrógeno y la oxidación de glucosa en lactona y peroxidasa, lo que produce un colorante quinoneimina rosado a partir de peróxido de hidrógeno, Un compuesto fenólico y 4-aminoantipirina 22 .
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Protocol
1. Preparación
- Cultivos de cianobacterias
- Cultivar Synechocystis sp. PCC 6803 a 30 ° C en medio BG11 líquido 8 , con un suministro constante de aire suplementado con CO 2 al 1% (v / v). Iluminar los cultivos continuamente con luz a una densidad de flujo de fotones fotosintéticos de 50 μmol fotón / m 2 / s.
- Cultivar Synechococcus sp. PCC 7002 en medio A + líquido 23 (se puede utilizar también medio BG11), con un suministro constante de aire suplementado con CO 2 al 1% (v / v). La temperatura debe ser de 37 ° C. Iluminar los cultivos continuamente con luz a una densidad de flujo de fotones fotosintéticos de 150 μmol fotón / m 2 / s.
- Medir la densidad óptica (DO) del cultivo a 730 nm usando una cubeta con un trayecto de luz de 1 cm. Si el valor de OD es superior a 0,8, haga las diluciones apropiadas para obtener mediciones de DO que sean proporcionales aE concentración de células.
NOTA: Los protocolos presentados a continuación son adecuados para cultivos líquidos, con una densidad celular que corresponde a un valor de DO 730nm de 2 o superior. Cuando se desean cultivos en fase de crecimiento exponencial, que normalmente tienen un valor de 730 nm OD por debajo de 1, se concentra la densidad celular mediante centrifugación y resuspensión en un tampón o medio para alcanzar un valor de 730 nm OD de 2 o superior.
- Tampones y reactivos
- Hacer un tampón Tris-HCl 50 mM a pH 8.
- Hacer tampón de acetato de sodio 50 mM a pH 5.
- Hacer una solución madre de 8 U / mL de amiloglucosidasa en tampón de acetato de sodio 50 mM, pH 5.
- Hacer una solución madre de 2 U / mL de α-amilasa en tampón de acetato de sodio 50 mM, pH 5.
- Utilizando agua destilada, soluciones patrón de manglucosa en concentraciones que oscilan entre 0 y 100 μg / mL.
- Prepare el reactivo GOD-POD del kit de ensayo de D-glucosa (formato GODPOD), fSiguiendo las instrucciones del fabricante.
2. Determinación del peso seco de la célula (opcional)
- Transferir 2 ml de un cultivo o una resuspensión celular (ver paso 1.1) a un tubo de 2,0 ml y centrifugar a 6000 xg ya 4 ° C durante 5 min. Deseche el sobrenadante.
- Resuspender el gránulo en 1 mL de agua y centrifugar a 6.000 xg y 4 ° C durante 5 min. Deseche el sobrenadante y resuspenda el sedimento celular en 0,5 ml de agua.
- Transfiera la suspensión a una bandeja de aluminio previamente pesada. Transferir la bandeja a un horno de secado a 105 ° C para el secado durante la noche (aproximadamente 18 h).
CRÍTICO: Es importante que la bandeja se manipule con fórceps para evitar la transferencia de material de los dedos. Se seca una bandeja de aluminio pre-pesada vacía bajo las mismas condiciones para determinar cualquier pérdida de peso de las bandejas durante el secado. - Después del secado, retirar la bandeja del horno y permitir que se equilibre a temperatura ambienteOns durante 5 min antes de pesarlo con una precisión de 0.0001 g.
NOTA: El valor puede usarse para normalizar el contenido de glucógeno en una base de peso seco de celda.
3. Lisis de Células Cianobacterianas
- Transferir 1 ml de un cultivo o una resuspensión celular (ver paso 1.1) a un tubo de 1,5 ml y centrifugar a 6000 xg ya 4 ° C durante 10 min. Deseche el sobrenadante.
- Resuspender el gránulo en 1 mL de Tris-HCl 50 mM, pH 8, y centrifugar a 6.000 xg y 4 ° C durante 10 min. Deseche el sobrenadante y resuspenda el sedimento celular en 1 mL del tampón Tris-HCl. Repita el proceso.
- Resuspender completamente el sedimento en 500 μl de tampón Tris-HCl 50 mM, pH 8.
CRÍTICO: Resuspender bien el sedimento para una lisis celular eficiente. Mantenga la resuspensión en hielo. - Lyse las células resuspendidas a 4 ° C mediante la realización de 30 ciclos de ultrasonicación, cada ciclo que consiste en 30 s a una frecuencia de 20 kHz con la amplitud máxima,Seguido por 90 s sin.
NOTA: Este método puede lisar eficientemente Synechococcus sp. PCC 7002.- Alternativamente, transfiera la resuspensión de la célula a un tubo de tapa roscada y añada perlas de óxido de circonio al tubo, siguiendo las instrucciones del fabricante. Colocar el tubo en un homogeneizador de tejidos y lisar las células a 4 ° C mediante la realización de 2 ciclos de batido, cada ciclo que consiste en 5 min en el ajuste de frecuencia de 5.
NOTA: Este método puede lisar eficientemente Synechocystis sp. PCC 6803 y Synechococcus sp. PCC 7002.
- Alternativamente, transfiera la resuspensión de la célula a un tubo de tapa roscada y añada perlas de óxido de circonio al tubo, siguiendo las instrucciones del fabricante. Colocar el tubo en un homogeneizador de tejidos y lisar las células a 4 ° C mediante la realización de 2 ciclos de batido, cada ciclo que consiste en 5 min en el ajuste de frecuencia de 5.
- Centrifugar el tubo que contiene el lisado durante 10 min a 6.000 xg y 4 ° C.
NOTA: El pellet debe consistir principalmente en desechos de celda grande. Si hay un número significativo de células intactas, repita el paso 3.4. Mantenga el sobrenadante sobre hielo. - Determine la concentración de proteína usando un kit comercial de ensayo de proteína BCA.
NOTA: El valor puede usarse para normalizar el contenido de glucógenoSobre una base de contenido proteico.
4. Precipitación de glicógeno
- Eliminar la clorofila a del lisado celular mezclando 900 μl de etanol al 96% (v / v) y 100 μl del sobrenadante de la etapa 3.5 en un tubo de tapa roscada de 1,5 ml. Después de cerrar la tapa, calentar el tubo a 90 ° C durante 10 min utilizando un bloque de calefacción de laboratorio estándar.
- Incubar el tubo en hielo durante 30 min.
- Centrifugar el tubo a 20.000 xg y 4 ° C durante 30 min y retirar cuidadosamente el sobrenadante; El gránulo contiene glicógeno. Secar ligeramente el gránulo en el aire para eliminar el exceso de etanol.
CRÍTICO: Se debe evitar el secado excesivo del gránulo, de lo contrario resulta difícil solubilizar en el paso 5.1. - OPCIONAL: Mida la absorbancia del sobrenadante obtenido en el paso 4.3 a 664 nm para determinar el contenido de clorofila a . Utilizar un coeficiente de absorción de 84,6 L / g / cm 24 .
NOTA: El valor se puede utilizar para normalizarE el contenido de glucógeno.
5. Hidrólisis enzimática y determinación de glicógeno
- Solubilizar el sedimento obtenido en el paso 4.3 en 100 μl de acetato sódico 50 mM, pH 5, y añadir 50 μl de 8 U / ml de amiloglucosidasa y 50 μl de α-amilasa 2 U / mL. Mezclar bien estos materiales utilizando un vórtice.
NOTA: No se recomienda la mezcla por pipeteado porque el gránulo de glucógeno es viscoso. - Incubar la mezcla a 60 ° C en un bloque de calentamiento durante 2 h para permitir la digestión de glucógeno en moléculas de glucosa.
- Centrifugar la muestra a 10.000 xg durante 5 min y transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de 1,5 ml.
6. Determinación del contenido total de glucosa utilizando el reactivo GOD-POD
- Mida la concentración de glucosa en el sobrenadante obtenido en el paso 5.3 usando el reactivo GOD-POD. Transferir 100 μl del sobrenadante del paso 5.3 a un pocillo en una placa de 96 pocillos. Como control negativo,Use 100 μl de acetato de sodio 50 mM, pH 5. Para generar una curva de calibración, también mida las soluciones patrón de glucosa.
- Añadir 150 μl de reactivo GOD-POD a cada muestra y mezclar rápidamente por pipeteo.
- Incubar la placa estáticamente a 25 ° C durante 30 min. Registre el valor de absorbancia a 510 nm usando un lector de placas.
- Calcular la concentración de glucosa usando una curva de calibración obtenida de los estándares de glucosa.
NOTA: La concentración de glucógeno en el lisado celular se expresa como la concentración de glucosa (μg / ml).
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Representative Results
Se añadieron 10 ml de Synechocystis sp. Se cultivaron PCC 6803 en condiciones fotoautótrofas hasta que el valor de DO 730nm alcanzó aproximadamente 0,8. Las células se recogieron y se resuspendieron en Tris-HCl 50 mM, pH 8. El valor de DO 730nm se ajustó a 2-3. El contenido de glucógeno se analizó siguiendo el protocolo descrito anteriormente. El contenido de glucógeno por la OD 730nm fue de 13 ± 1,8 μg / mL / OD 730nm ( N = 12). El contenido de glucógeno en relación con el contenido de proteína fue 0,24 ± 0,03 μg / μg ( N = 12), y el contenido de glucógeno en relación con el contenido de clorofila a fue de 5,7 ± 0,6 μg / μg ( N = 12). Debido a la pequeña cantidad de material disponible, se omitió la medición del peso seco de las células. Dado que el contenido de proteínas en cianobacterias cultivadas en condiciones comparables es de aproximadamente el 50% del peso seco de células 25 </ Sup>, el contenido de glucógeno se estima en un 12% del peso seco de las células, lo que es coherente con estudios previos [ 26] .
Los límites de detección del ensayo GOD-POD mostraron una correlación lineal entre la concentración de glucosa y la absorbancia a 510 nm en el intervalo de concentración de glucosa entre 10 y 100 μg / mL, correspondientes a valores de absorbancia de 0,08 y 0,7 a 510 nm. El límite mínimo es probable debido al límite de detección instrumental. Cuando se utilizaron concentraciones de glucosa superiores a 150 μg / ml, se formaron precipitados verde oscuro, causando una gran variación en la lectura de absorbancia. Respecto a la cantidad de materiales celulares usados, rutinariamente obteníamos contenidos de glucógeno reproducibles cuando el valor de OD 730nm de resuspensión celular antes de la lisis celular estaba entre 2 y 10. Las resuspensiones celulares con un valor de OD 730nm de 1 o inferior daban lugar a señales cercanas a la Límite mínimo de detecciónT, dando lugar a resultados muy variables. La resuspensión celular con un valor de OD 730 nm superior a 20 no era adecuada debido a que la lisis celular era incompleta, y se requerían lisis prolongada o diluciones.
La Figura 1 muestra resultados representativos de los contenidos de glucógeno en Synechocystis sp. PCC 6803 de tipo salvaje y dos cepas mutantes ( ΔpmgA y ΔpmgR1 ). Se usaron las células crecidas en la fase de crecimiento exponencial. Los contenidos de glucógeno se normalizaron por primera vez por el contenido total de proteínas y se expresaron posteriormente en relación con el valor para el tipo salvaje. Los resultados muestran que las cepas mutantes tienen contenidos de glucógeno que son al menos dos veces más altos que la cepa de tipo salvaje.
A continuación, se analizó el contenido de glucógeno en cepas de Synechococcus sp. PCC 7002 diseñado para producir manitol 5 . La primera cepa (Glg + ) contiene los genes glgA1 y glgA2 de tipo salvaje que codifican dos glicógeno sintasas funcionales, mientras que la segunda cepa (Glg - ) carece de copias funcionales de estos genes [ 5] . El contenido de glucógeno y manitol se midió entonces en ambas cepas ( Figura 2 ). Los resultados muestran que el Glg - carecía de un nivel detectable de glucógeno, mientras que produjo más manitol que la cepa Glg + . Esto sugiere que el carbohidrato sintetizado por fotosíntesis es redirigido al manitol en la cepa mutante que carece de la capacidad de sintetizar glucógeno. Los valores de OD 730nm de los cultivos eran aproximadamente 10, proporcionando suficientes materiales celulares para el análisis de peso en seco celular. Los contenidos de glucógeno se normalizaron usando el peso seco de las células.
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Figura 1: Los contenidos de glucógeno medidos en diferentes líneas de Synechocystis sp . PCC 6803. Se muestran los contenidos relativos de glicógeno en el WT y en dos mutantes ( ΔpmgA 9 y ΔpmgR1 8 ). Los niveles de glucógeno se normalizaron por el contenido total de proteínas. Se muestran medios de tres repeticiones biológicas, con barras de error que representan desviaciones estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Producción de glicógeno y manitol en Synechococcus sp. Manipulado genéticamente. PCC 7002 5 . Glg <Sup> +, la cepa sintetizando manitol y glucógeno. Glg - , la cepa sintetizando manitol pero sin glucógeno. Los valores representados son el promedio de tres repeticiones biológicas, con barras de error que representan las desviaciones estándar. CDW: peso seco de las células, ND: no detectado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Los pasos críticos dentro del protocolo son la precipitación del glucógeno y la resuspensión. Después de la centrifugación después de la precipitación con etanol, el glucógeno forma una pastilla translúcida que se adhiere flojamente a las paredes de los tubos de microcentrífuga. Por lo tanto, cuando se retira el sobrenadante, se debe prestar especial atención para no quitar el gránulo. El gránulo de glucógeno es pegajoso, y la solubilización puede ser difícil si se seca. Obsérvese que la solubilización completa del gránulo de glicógeno es importante porque la solubilización incompleta conducirá a una digestión enzimática ineficiente y por lo tanto dará lugar a grandes variaciones entre las repeticiones técnicas. La aplicación de la sonicación antes de la solubilización por vórtex puede facilitar el proceso.
En cuanto a la elección del método de normalización, el peso seco de las células es una referencia ampliamente utilizada. Es más laborioso y requiere más biomasa celular que las determinaciones de proteínas y clorofilaA. El contenido de proteína total proporciona una referencia alternativa a la biomasa celular y puede determinarse a pequeña escala, como se describe en el presente protocolo. El contenido de proteína total por biomasa de células secas está típicamente en el intervalo entre 40% y 50%, aunque el valor exacto depende de las condiciones de crecimiento 25 , 28 . El contenido de clorofila a se puede determinar fácilmente y se puede usar como un sustituto de la cantidad de células presentes en la muestra. Sin embargo, es bien sabido que la cantidad de clorofila a por célula varía significativamente dependiendo de las condiciones de crecimiento, particularmente en respuesta a las concentraciones de nutrientes cambiantes y las intensidades de luz 29 .
Una de las ventajas significativas de la técnica presentada con respecto a otros métodos es que es altamente selectiva. El protocolo de ácido caliente y fenol y el análisis de la composición de monosacáridosLa hidrólisis ácida son métodos relativamente simples y se han utilizado en estudios previos 9 , 10 , 12 , 13 . Sin embargo, estos métodos pueden sobrestimar el contenido de glucógeno porque glucosa no glicogénica y azúcares adicionales pueden contribuir a la medición, dependiendo de la técnica de detección de carbohidratos 12 . La técnica descrita detecta selectivamente la glucosa en glucógeno. También puede discriminar la glucosa de la celulosa, porque la α-amilasa y la α-amiloglucosidasa no hidrolizan los enlaces glucosilo unidos a β presentes en la celulosa. En estudios anteriores, la hidrólisis enzimática del glucógeno se realizó únicamente por α-amiloglucosidasa 7 , 27 . La inclusión de la α-amilasa que actúa endo junto con la α-amiloglucosidasa exoactiva, tal como se presenta en este protocolo, puede asegurarHidrólisis eficiente del glucógeno. Una hidrólisis selectiva similar se aplica rutinariamente a tratamientos de biomasa de plantas, en donde la combinación de α-amilasa α-amiloglucosidasa se usa para hidrolizar almidón sin afectar a otros polisacáridos que contienen glucosa, tales como celulosa 21 .
La principal limitación de la técnica es que el procedimiento es de bajo rendimiento debido a que las muestras individuales se procesan separadamente usando tubos de microcentrífuga. La etapa de precipitación de glucógeno es el factor primario que impide un mayor rendimiento. La implementación como un procedimiento de alto rendimiento requeriría el uso de placas de pozo profundo y la capacidad de centrifugar estas a alta velocidad (20.000 x g ). Aunque las centrifugadoras que pueden centrifugar placas de 96 pocillos a la velocidad necesaria están disponibles, la mayoría de las placas de pozo profundo no pueden tolerar una fuerza mayor de 6,000 x g . Por lo tanto, la cuidadosa selección de materiales es necesaria para adaptar el protocoloH-análisis de rendimiento.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores reconocen a Nordic Energy Research (AquaFEED, proyecto nº 24), Innovationfonden Denmark (Pant Power, proyecto nº 12-131844) y Villum Fonden (proyecto nº 13363)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| QSonica Sonicators Q700 | Qsonica, LLC | NA | QSonica |
| SpectraMax 190 Microplate Reader | Molecular Devices | NA | Eliza plate reader |
| Bullet Blender Storm | Next Advance | BBY24M-CE | Beads beater |
| Ultrospec 3100 pro UV/Visible Spectrophotometer | Amersham Biosciences | NA | Spectrophotometer |
| Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | Buffer |
| HCl | Merck | 1-00317 | pH adjutment |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | 32319 | Buffer |
| Amyloglycosidase (Rhizopus sp.) | Megazyme | E-AMGPU | Enzyme for glycogen depolymerization |
| α-Amylase, thermostable (Bacillus licheniformis) | Sigma-Aldrich | A3176 | Enzyme for glycogen depolymerization |
| D-Glucose | Merch | 8337 | Standard for the glucose assay |
| Pierce BCA Protein assay kit | Thermo Fisher scientific | 23225 | For determination of protein concentrations |
| Aluminum drying trays, disposable | VWR | 611-1362 | For determination of cell dry weights |
| D-Glucose assay kit (GODPOD format) | Megazyme | K-GLUC | For determination of glucose concentrations |
| Zirconium oxide breads, 0.15 mm | Next Advance | ZrOB015 | Beads for cell lysis in a Bullet Blendar Storm |
| RINO tubes | Next Advance | NA | Tubes for cell lysis in a Bullet Blendar Storm |
References
- Chen, X., et al. The Entner-Doudoroff pathway is an overlooked glycolytic route in cyanobacteria and plants. Proc Natl Acad Sci USA. 113 (19), 5441-5446 (2016).
- Yang, C., Hua, Q., Shimizu, K. Metabolic flux analysis in Synechocystis using isotope distribution from C-13-labeled glucose. Metab Eng. 4 (3), 202-216 (2002).
- Pelroy, R. A., Levine, G. A., Bassham, J. A. Kinetics of light-dark CO2 fixation and glucose assimilation by Aphanocapsa 6714. J Bacteriol. 128, 633-643 (1976).
- You, L., Berla, B., He, L., Pakrasi, H. B., Tang, Y. J. 13C-MFA delineates the photomixotrophic metabolism of Synechocystis. sp. PCC 6803 under light- and carbon-sufficient conditions. Biotechnol J. 9, 684-692 (2014).
- Jacobsen, J. H., Frigaard, N. U. Engineering of photosynthetic mannitol biosynthesis from CO2 in a cyanobacterium. Metab Eng. 21, 60-70 (2014).
- Möllers, K. B., Cannella, D., Jørgensen, H., Frigaard, N. -U. Cyanobacterial biomass as carbohydrate and nutrient feedstock for bioethanol production by yeast fermentation. Biotechnol Biofuels. 7, 64 (2014).
- Angermayr, S. A., et al. Culturing Synechocystis. sp. strain PCC 6803 with N2 and CO 2 in a diel regime reveals multiphase glycogen dynamics with low maintenance costs. Appl Environ Microbiol. 82, 4180-4189 (2016).
- de Porcellinis, A. J., et al. The Non-coding RNA Ncr0700/PmgR1 is required for photomixotrophic growth and the regulation of glycogen accumulation in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Plant Cell Physiol. 57 (10), 2091-2103 (2016).
- Sakuragi, Y. alpha-Tocopherol plays a role in photosynthesis and macronutrient homeostasis of the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 that is independent of its antioxidant function. Plant Physiol. 141, 508-521 (2006).
- Osanai, T., et al. Positive regulation of sugar catabolic pathways in the cyanobacterium Synechocystis. sp. PCC 6803 by the group 2 sigma factor sigE. J Biol Chem. 280, 30653-30659 (2005).
- Yamauchi, Y., Kaniya, Y., Kaneko, Y., Hihara, Y. Physiological roles of the cyAbrB transcriptional regulator pair Sll0822 and Sll0359 in Synechocystis sp. strain PCC 6803. J Bacteriol. 193, 3702-3709 (2011).
- Dubois, M., Gilles, K., Hamilton, J., Rebers, P., Smith, F. Colorimetric method for determination of sugars and related substances. Anal Chem. 28, 350-356 (1956).
- Osanai, T., et al. Genetic engineering of group 2 {sigma} factor SigE widely activates expressions of sugar catabolic genes in Synechocystis species PCC 6803. J Biol Chem. 286, 30962-30971 (2011).
- Miao, X., Wu, Q., Wu, G., Zhao, N. Sucrose accumulation in salt-stressed cells of agp gene deletion-mutant in cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. FEMS Microbiol Letters. 218, 71-77 (2003).
- Hagemann, M., Erdmann, N. Activation and pathway of glucosylglycerol synthesis in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Microbiology. 140, 1427-1431 (1994).
- Nobles, D. R., Romanovicz, D. K., Brown, R. M. Cellulose in cyanobacteria. Origin of vascular plant cellulose synthase. Plant Physiol. 127, 529-542 (2001).
- Zhao, C., et al. High-yield production of extracellular type-I cellulose by the cyanobacterium Synechococcus sp. PCC 7002. Cell Discovery. 1, 15004 (2015).
- Kawano, Y., et al. Cellulose accumulation and a cellulose synthase gene are responsible for cell aggregation in the cyanobacterium Thermosynechococcus vulcanus RKN. Plant Cell Physiol. 52, 957-966 (2011).
- Angermayr, S. A., Gorchs Rovira, A., Hellingwerf, K. J. Metabolic engineering of cyanobacteria for the synthesis of commodity products. Trends Biotechnol. 33, 352-361 (2015).
- Zhang, B., Dhital, S., Gidley, M. J. Synergistic and antagonistic effects of α-amylase and amyloglucosidase on starch digestion. Biomacromolecules. 14, 1945-1954 (2013).
- Harholt, J., et al. ARABINAN DEFICIENT 1 is a putative arabinosyltransferase involved in biosynthesis of pectic arabinan in Arabidopsis. Plant Physiol. 140, 49-58 (2006).
- Fernando, C. D., Soysa, P. Optimized enzymatic colorimetric assay for determination of hydrogen peroxide (H2O2) scavenging activity of plant extracts. MethodsX. 2, 283-291 (2015).
- Jacobsen, J. H., Rosgaard, L., Sakuragi, Y., Frigaard, N. U. One-step plasmid construction for generation of knock-out mutants in cyanobacteria: studies of glycogen metabolism in Synechococcus sp PCC 7002. Photosynth Res. 107 (2), 215-221 (2011).
- Lichtenthaler, H. K. Chlorophylls and carotenoids: Pigments of photosynthetic biomembranes. Methods Enzymol. 148, 350-382 (1987).
- López, C. V. G., del Carmen Cerón García, M., Fernández, F. G. A., Bustos, C. S., Chisti, Y., Sevilla, J. M. F. Protein measurements of microalgal and cyanobacterial biomass. Bioresource Technol. 101, 7587-7591 (2010).
- Hasunuma, T., et al. Dynamic metabolic profiling of cyanobacterial glycogen biosynthesis under conditions of nitrate depletion. J Exp Bot. 64, 2943-2954 (2013).
- Díaz-Troya, S., López-Maury, L., Sánchez-Riego, A. M., Roldán, M., Florencio, F. J. Redox regulation of glycogen biosynthesis in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803: Analysis of the AGP and glycogen synthases. Molecular Plant. 7, 87-100 (2014).
- Parrott, L. M., Slater, J. H. The DNA, RNA and protein composition of the cyanobacterium Anacystis nidulans grown in light- and carbon dioxide-limited chemostats. Arch Microbiol. 127, 53-58 (1980).
- Hihara, Y., Kamei, A., Kanehisa, M., Kaplan, A., Ikeuchi, M. DNA microarray analysis of cyanobacterial gene expression during acclimation to high light. Plant Cell. 13, 793-806 (2001).
