Summary
Her presenterer vi en pålitelig og enkel analyse for å måle glykogeninnholdet i cyanobakterielle celler. Prosedyren innebærer utfelling, selekterbar depolymerisering og påvisning av glukoserester. Denne metoden er egnet for både wildtype og genetisk utviklede stammer og kan lette metabolismen av cyanobakterier.
Abstract
Cyanobakterier akkumulerer glykogen som en stor intracellulær karbon- og energilagring under fotosyntese. Nylige utviklinger i forskning har fremhevet komplekse mekanismer for glykogenmetabolisme, inkludert dielsyklusen av biosyntese og katabolisme, redoksregulering og involvering av ikke-kodende RNA. Samtidig blir det gjort anstrengelser for å omdirigere karbon fra glykogen til ønskelige produkter i genetisk utviklede cyanobakterier for å forbedre produktutbyttet. Flere metoder brukes til å bestemme glykogeninnholdet i cyanobakterier, med variabel nøyaktighet og tekniske kompleksiteter. Her gir vi en detaljert protokoll for pålitelig bestemmelse av glykogeninnholdet i cyanobakterier som kan utføres i et standard livsvitenskapslaboratorium. Protokollen innebærer selektiv utfelling av glykogen fra cellelysatet og den enzymatiske depolymerisering av glykogen for å danne glukose-monomerer, som detekteres av en glukose-oksIdase-peroxidase (GOD-POD) enzymkoblet assay. Metoden har blitt anvendt på Synechocystis sp. PCC 6803 og Synechococcus sp. PCC 7002, to modell cyanobakterielle arter som er mye brukt i metabolsk prosjektering. Videre viste fremgangsmåten med suksess forskjeller i glykogeninnholdet mellom villtype og mutanter som er defekte i regulatoriske elementer eller glykogenbiosyntetiske gener.
Introduction
Cyanobakterier akkumulerer glykogen som den viktigste karbohydratbutikken av karbon fra CO 2 fastgjort i lys gjennom fotosyntese. Glykogen er en glykan bestående av lineær a-1,4-koblet glukan med grener opprettet av a-1,6-koblede glukosylbindinger. Glykogenbiosyntese i cyanobakterier starter ved omdannelse av glukose-6-fosfat til ADP-glukose gjennom sekvensiell virkning av fosfoglukomutase og ADP-glukose-pyrofosforylase. Glukosedelen i ADP-glukose overføres til den ikke-reduserende enden av a-1,4-glukan-ryggradene av glykogen med en eller flere glykogensyntaser (GlgA). Deretter introduserer et forgreningsenzymer a-1,6-koblet glukosylbinding, som videre utvides til å generere glykogenpartikkelen. I mørket brytes glykogen ned av glykogenfosforylase, glykogenforgreningsenzymer, a-glukanotransferase og maltodekstrinfosforylase i fosforylert glukose og fri glukose. Disse feed intO katabolske veier, inkludert oksidativ pentosefosfatbane, Embden-Meyerhof-Parnas-vei (glykolyse) og Entner-Doudoroff-vei 1 , 2 , 3 , 4 .
Glykogen metabolisme i cyanobakterier har fått økende interesse de siste årene på grunn av potensialet for cyanobakterier å utvikle seg til mikrobielle cellefabrikker drevet av sollys for å produsere kjemikalier og drivstoff. Glykogen metabolisme kan modifiseres for å øke utbyttet av produktene, fordi glykogen er det største fleksible karbonpulveret i disse bakteriene. Et eksempel er cyanobacterium Synechococcus sp. PCC 7002, som har blitt genetisk konstruert for å produsere mannitol; Den genetiske forstyrrelsen av glykogensyntese øker mannitolutbyttet 3 ganger 5 . Et annet eksempel er produksjon av bioetanol fra glykogenbelastet wildtYpe Synechococcus sp. PCC 7002 6 . Vilttypecelleglykogeninnholdet kan være opp til 60% av tørrvekten av cellen under nitrogenhud 6 .
Vår forståelse av glykogen metabolisme og regulering har også utvidet de siste årene. Selv om glykogen er kjent for å akkumulere i lyset og bli katabolisert i mørket, ble det nylig avslørt i Synechocystis sp. Detaljert kinetikk av glykogenmetabolismen under dielsyklusen. PCC 6803 7 . Videre er flere gener som påvirker akkumuleringen av glykogen blitt identifisert. Et bemerkelsesverdig eksempel er funnet at den formodede histidinkinasen PmgA og det ikke-kodende RNA PmgR1 danner en regulatorisk kaskade og kontrollerer akkumuleringen av glykogen. Interessant, akkumulerer pmgA og pmgR1 deletjonsmutanter dobbelt så mye glykogen som wildtypestammen av Synechocystis sp. PCC 68038 , 9 . Andre regulatoriske elementer er også kjent for å påvirke akkumuleringen av glykogen, inkludert den alternative sigmafaktor E og transkripsjonsfaktoren CyAbrB2 10 , 11 .
Da interessen for glykogenregulering og metabolisme vokser, er en detaljert protokoll som beskriver bestemmelsen av glykogeninnholdet berettiget. Flere metoder brukes i litteraturen. Syr hydrolyse etterfulgt av bestemmelse av monosakkaridinnholdet gjennom høytrykks anionbytter-væskekromatografi koplet med en pulserende amperometrisk detektor eller spektrometrisk bestemmelse etter behandling med syre og fenol, er allment brukte metoder for tilnærming av glykogeninnholdet 9 , 10 , 12 , 13 . Imidlertid utveksler en høytrykksanion væskekromatografiC-instrumentet er svært kostbart og diskriminerer ikke glukose avledet fra glykogen fra det som er avledet fra andre glukoseholdige glykokonjugater, slik som sukrose 14 , glukosylglycerol 15 og cellulose 16 , 17 , 18 , som er kjent for å akkumulere i noen cyanobakterielle arter. Syren-fenolmetoden kan utføres ved bruk av standard laboratorieutstyr. Imidlertid bruker den høyt giftige reagenser og skiller ikke glukose fra forskjellige glykokonjugater, og det skiller heller ikke glukose fra andre monosakkarider som utgjør cellulære materialer, slik som glykolipider, lipopolysakkarider og ekstracellulære matriser 12 . Spesielt brukes det varme syre-fenol-analysen ofte for å bestemme total karbohydratinnhold i stedet for for spesifikk bestemmelse av glukoseinnhold 12 . Enzymatisk hyDrolys av glykogen til glukose ved a-amyloglukosidase etterfulgt av deteksjon av glukose gjennom et enzymkoblet assay genererer en kolorimetrisk avlesning som er svært følsom og spesifikk for glukose avledet fra glykogen. Specificiteten kan forbedres ytterligere med den foretrukne utfelling av glykogen fra cellelysater av etanol 5 , 8 , 19 .
Her beskriver vi en detaljert protokoll for en enzymbasert analyse av glykogeninnholdet i to av de mest studerte cyanobakteriene, Synechocystis sp. PCC 6803 og Synechococcus sp. PCC 7002, i wildtype og mutantstammer. For å sikre effektiv hydrolyse brukes en cocktail av a-amylase og a-amyloglukosidase 8 . Den endo-virkende a-amylase hydrolyserer a-1,4-bindingene i forskjellige glukaner i dextriner, som videre hydrolyseres tO glukose ved exo-virkende a-amyloglukosidase 20 . De synergistiske effektene av disse enzymene er velkjente, og disse enzymer benyttes rutinemessig til selektiv hydrolyse av stivelse, som er et a-koblet glukan som glykogen, uten å påvirke andre glykokonjuganter, slik som cellulose, i plantebiomassen 21 . Den frigjorte glukosen detekteres kvantitativt ved å følge et enzymkoblet assay bestående av glukoseoksidase som katalyserer reduksjonen av oksygen til hydrogenperoksid og oksydasjonen av glukose til en lakton- og peroksidase-som frembringer et rosa-farget kinoniminfarve fra hydrogenperoksid, En fenolforbindelse og 4-aminoantipyrin 22 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling
- Cyanobakteriske kulturer
- Vokse synechocystis sp. PCC 6803 ved 30 ° C i flytende BG11 medium 8 , med konstant tilførsel av luft tilsatt 1% (volum / volum) CO 2 . Belyse kulturene kontinuerlig med lys på en fotosyntetisk foton flukstetthet på 50 umol fotoner / m2 / s.
- Vokse synechococcus sp. PCC 7002 i flytende A + medium 23 (BG11 medium kan også brukes), med konstant tilførsel av luft suppleres med 1% (volum / volum) CO 2 . Temperaturen skal være 37 ° C. Lys kulturen kontinuerlig med lys ved en fotosyntetisk fotonfluxtetthet på 150 μmol foton / m 2 / s.
- Mål den optiske tettheten (OD) av kulturen ved 730 nm ved bruk av en kuvette med en lysbane på 1 cm. Hvis OD-verdien er over 0,8, foreta passende fortynninger for å oppnå OD-mål som er proporsjonale med tE-cellekonsentrasjon.
MERK: Protokollene som presenteres nedenfor er egnet for flytende kulturer, med en celletetthet som tilsvarer en OD 730nm- verdi på 2 eller høyere. Når kulturer i den eksponentielle vekstfase ønskes, som typisk har en OD 730nm- verdi under 1, konsentrere celletettheten ved sentrifugering og resuspendering i en buffer eller et medium for å oppnå en OD 730nm- verdi på 2 eller høyere.
- Buffere og reagenser
- Lag 50 mM Tris-HCl buffer ved pH 8.
- Lag 50 mM natriumacetatbuffer ved pH 5.
- Lag en stamløsning av 8 U / ml amyloglukosidase i 50 mM natriumacetatbuffer, pH 5.
- Lag en stamløsning av 2 U / ml a-amylase i 50 mM natriumacetatbuffer, pH 5.
- Ved bruk av destillert vann, makeglukose standardløsninger i konsentrasjoner i området mellom 0 og 100 μg / mL ,.
- Forbered GOD-POD reagens fra D-glukose analysesettet (GODPOD Format), fÅ gi produsentens instruksjon.
2. Bestemmelse av Cell Dry Weight (valgfritt)
- Overfør 2 ml av en kultur eller en resuspendering av cellen (se trinn 1.1) til et 2,0 ml rør og sentrifuge ved 6000 xg og 4 ° C i 5 min. Kast supernatanten.
- Resuspender pelleten i 1 ml vann og sentrifuger ved 6000 xg og 4 ° C i 5 minutter. Kast supernatanten og resuspender cellepellet i 0,5 ml vann.
- Overfør suspensjonen til en forhåndsbestemt aluminiumskuff. Overfør brettet til en tørkeovn ved 105 ° C for tørking over natten (ca. 18 timer).
KRITISK: Det er viktig at brettet håndteres med tanger for å unngå overføring av materiale fra fingrene. Tørk en tom, forhåndsbestemt aluminiumskuff under de samme forholdene for å bestemme noe vekttap fra skuffene under tørking. - Etter tørking, fjern skuffen fra ovnen og la den ligge i ekvilibrering ved omgivelsestemperaturOns i 5 min før veiing med en nøyaktighet på 0,0001 g.
MERK: Verdien kan brukes til å normalisere glykogeninnholdet på en celle-tørr basis.
3. Lysis av cyanobakterielle celler
- Overfør 1 ml av en kultur eller en resuspendering av cellen (se trinn 1.1) til et 1,5 ml rør og sentrifuge ved 6000 xg og 4 ° C i 10 minutter. Kast supernatanten.
- Resuspender pelleten i 1 ml 50 mM Tris-HCl, pH 8, og sentrifuge ved 6000 xg og 4 ° C i 10 minutter. Kast supernatanten og resuspender cellepellet i 1 ml Tris-HCI-bufferen. Gjenta prosessen.
- Resuspender pelleten grundig i 500 ul 50 mM Tris-HCI buffer, pH 8.
KRITISK: Resuspender pelletbrønnen for en effektiv cellelyse. Hold resuspenningen i is. - Lyse de resuspenderte celler ved 4 ° C ved å utføre 30 sykluser med ultralyd, hver syklus bestående av 30 s ved en frekvens på 20 kHz med maksimal amplitude,Etterfulgt av 90 s uten.
MERK: Denne metoden kan effektivt lyse Synechococcus sp. PCC 7002.- Alternativt, overfør celle resuspenningen til en skruehett rør og legg til zirkoniumoksid perler til røret, etter produsentens instruksjoner. Sett røret i en vevshomogenisator og lyser cellene ved 4 ° C ved å utføre 2 sykluser av beating, hver syklus bestående av 5 min ved frekvensinnstillingen på 5.
MERK: Denne metoden kan effektivt lyse Synechocystis sp. PCC 6803 og Synechococcus sp. PCC 7002.
- Alternativt, overfør celle resuspenningen til en skruehett rør og legg til zirkoniumoksid perler til røret, etter produsentens instruksjoner. Sett røret i en vevshomogenisator og lyser cellene ved 4 ° C ved å utføre 2 sykluser av beating, hver syklus bestående av 5 min ved frekvensinnstillingen på 5.
- Sentrifuger røret som inneholder lysatet i 10 minutter ved 6000 xg og 4 ° C.
MERK: Pelleten skal hovedsakelig bestå av store celleavfall. Hvis det er et betydelig antall ubrukte celler, gjenta trinn 3.4. Hold supernatanten på is. - Bestem proteinkonsentrasjonen ved hjelp av et kommersielt BCA Protein assay kit.
MERK: Verdien kan brukes til å normalisere glykogeninnholdetPå basis av proteininnhold.
4. Glykogenutfelling
- Fjern klorofyll a fra cellelysatet ved å blande 900 μl 96% (v / v) etanol og 100 μl av supernatanten fra trinn 3.5 i en 1,5 ml skruehettør. Etter lukking av lokket, rør røret ved 90 ° C i 10 minutter ved bruk av en standard laboratorieoppvarmingsblokk.
- Inkuber røret på is i 30 minutter.
- Sentrifuger røret ved 20.000 xg og 4 ° C i 30 minutter og fjern forsiktig supernatanten; Pelleten inneholder glykogen. Tørk pelleten lett i luft for å fjerne overflødig etanol.
KRITISK: Overdreven tørking av pelleten må unngås, ellers blir det vanskelig å solubilisere i trinn 5.1. - EKSTRA: Mål absorbansen av supernatanten oppnådd i trinn 4.3 ved 664 nm for å bestemme klorofyll a-innhold. Bruk en absorpsjonskoeffisient på 84,6 L / g / cm 24 .
MERK: Verdien kan brukes til normalizE glykogeninnholdet.
5. Enzymatisk hydrolyse og glykogenbestemmelse
- Solubiliser pelleten oppnådd i trinn 4.3 i 100 μl 50 mM natriumacetat, pH 5, og tilsett 50 μl 8 U / ml amyloglukosidase og 50 μl 2 U / ml a-amylase. Bland disse materialene godt med en virvel.
MERK: Blanding ved pipetting anbefales ikke fordi glykogenpellet er viskøs. - Inkuber blandingen ved 60 ° C på en oppvarmingsblokk i 2 timer for å aktivere fordøyelsen av glykogen i glukose molekyler.
- Sentrifuger prøven ved 10.000 xg i 5 minutter og overfør supernatanten til et nytt 1,5 ml rør.
6. Bestemmelse av total glukoseinnhold ved hjelp av GOD-POD-reagensen
- Mål konsentrasjonen av glukose i supernatanten oppnådd i trinn 5.3 ved bruk av GOD-POD-reagenset. Overfør 100 μL av supernatanten fra trinn 5.3 til en brønn i en 96-brønns plate. Som en negativ kontroll,Bruk 100 μl 50 mM natriumacetat, pH 5. For å generere en kalibreringskurve måles også glukose standardløsninger.
- Tilsett 150 μL GOD-POD reagens til hver prøve og bland raskt ved pipettering.
- Inkuber platen statisk ved 25 ° C i 30 minutter. Ta opp absorbansverdien ved 510 nm ved hjelp av en plate leser.
- Beregn konsentrasjonen av glukose ved hjelp av en kalibreringskurve oppnådd fra glukosestandarden.
MERK: Glykogenkonsentrasjonen i cellelysatet uttrykkes som konsentrasjonen av glukose (μg / ml).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
10 ml wildtype Synechocystis sp. PCC 6803 ble dyrket under fotoautotrofiske forhold inntil OD 730nm- verdien nådde omtrent 0,8. Cellene ble høstet og resuspendert i 50 mM Tris-HCl, pH 8. OD 730nm- verdien ble justert til 2-3. Glykogeninnholdet ble analysert ved å følge protokollen beskrevet ovenfor. Glykogeninnholdet per OD 730 nm var 13 ± 1,8 ug / ml / OD 730 nm ( N = 12). Den glykogeninnhold i forhold til proteininnholdet var 0,24 ± 0,03 pg / pg (N = 12), og den glykogeninnhold i forhold til klorofyll a-innholdet var 5,7 ± 0,6 pg / pg (N = 12). På grunn av den lille mengden tilgjengelig materiale ble måling av celle tørrvekt utelatt. Gitt at proteininnholdet i cyanobakterier dyrket under sammenlignbare betingelser er ca. 50% av celle tørrvekt 25 </ Sup>, er glykogeninnholdet beregnet til å være 12% av celle tørrvekten, som er i overensstemmelse med tidligere studier 26 .
Deteksjonsgrensene for GOD-POD-analysen viste en lineær korrelasjon mellom glukosekonsentrasjonen og absorbansen ved 510 nm i glukosekonsentrasjonsområdet mellom 10 og 100 μg / ml, tilsvarende absorbansverdier på 0,08 og 0,7 ved 510 nm. Minimumsgrensen er sannsynligvis på grunn av den instrumentelle gjenkjenningsgrensen. Når glukosekonsentrasjoner høyere enn 150 μg / ml ble brukt, dannet mørkegrønn utfelling, noe som forårsaket en stor variasjon i absorbansavlesningen. Med hensyn til mengden av anvendte cellematerialer oppnådde vi rutinemessig reproducerbar glykogeninnhold når OD 730nm- verdien av celle resuspendering før cellelysis var mellom 2 og 10. Cellresuspensjoner med en OD 730nm- verdi på 1 eller under ga opphav til signaler nær Minimum gjenkjenning limiT, som fører til svært variable resultater. Cellresuspensjon med en OD 730nm verdi høyere enn 20 var ikke egnet fordi cellelysen var ufullstendig, og enten utvidet lysis eller fortynninger var påkrevd.
Figur 1 viser representative resultater av glykogeninnholdet i Synechocystis sp. PCC 6803 wildtype og to mutantstammer ( ΔpmgA og ΔpmgR1 ). Cellene dyrket ved den eksponensielle vekstfasen ble anvendt. Glykogeninnholdet ble først normalisert med det totale proteininnhold og ble deretter uttrykt i forhold til verdien for vildtypen. Resultatene viser at mutantstammene har glykogeninnhold som er minst to ganger høyere enn wildtypestammen.
Deretter ble glykogeninnholdet analysert i stammer av Synechococcus sp. PCC 7002 konstruert for å produsere mannitol 5 . Den første stammen (Glg +) inneholder villtype glgA1 og glgA2 gener som koder for to funksjonelle glykogen-syntaser, mens den andre stammen (Glg -) mangler funksjonelle kopier av disse genene 5. Glykogen- og mannitolinnholdet ble så målt i begge stammer ( Figur 2 ). Resultatene viser at Glg - manglet et påvisbart nivå av glykogen, mens det produserte mer mannitol enn Glg + -stammen. Dette antyder at karbohydratet syntetisert ved fotosyntese omdirigeres til mannitol i mutantstammen som mangler evnen til å syntetisere glykogen. OD 730nm verdiene av kulturen var ca. 10, og ga tilstrekkelige cellematerialer for analyse av celle tørrvekt. Glykogeninnholdet ble normalisert ved bruk av celle tørrvekt.
8 / 56068fig1.jpg "/>
Figur 1: Glykogeninnholdet målt i forskjellige linjer av Synechocystis sp . PCC 6803. Relative glykogeninnhold i WT og i to mutanter (ΔpmgA 9 og ΔpmgR1 8) er vist. Glykogennivåene ble normalisert av det totale proteininnholdet. Midler av tre biologiske replikater er vist, med feilstenger som representerer standardavvik. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Glykogen og mannitolproduksjon i genetisk manipulert Synechococcus sp. PCC 7002 5 . Glg <Sup> +, stammen syntetiserer mannitol og glykogen. Glg - , stammen syntetiserer mannitol men ingen glykogen. Verdiene som er avbildet er gjennomsnittet av tre biologiske replikater, med feilstenger som representerer standardavvikene. CDW: celle tørrvekt, ND: ikke oppdaget. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritiske trinn i protokollen er glykogenutfelling og resuspensjon. Etter sentrifugering etter etanolutfelling danner glykogen en gjennomskinnelig pellet som løst adherer til veggene i mikrocentrifugerørene. Når du fjerner supernatanten, må du derfor gi spesiell oppmerksomhet for ikke å fjerne pelleten. Glykogenpelleten er klebrig, og solubilisering kan være vanskelig hvis den tørker ut. Merk at den fullstendige oppløsningen av glykogenpelletet er viktig fordi ufullstendig solubilisering vil føre til ineffektiv enzymatisk fordøyelse og derfor vil gi opphav til store variasjoner mellom tekniske replikater. Anvendelsen av sonikering før solubilisering ved vortexing kan lette prosessen.
Når det gjelder valg av normaliseringsmetode, er celle tørrvekten en mye brukt referanse. Det er mer arbeidskrevende og krever mer cellebiomasse enn bestemmelse av protein og klorofyllA. Det totale proteininnhold gir en alternativ referanse til cellebiomassen og kan bestemmes i liten skala, som beskrevet i foreliggende protokoll. Det totale proteininnholdet per tørrcellebiomasse ligger typisk i området mellom 40% og 50%, selv om den nøyaktige verdien avhenger av vekstbetingelsene 25 , 28 . Klorofyll et innhold kan bestemmes lett og kan brukes som en proxy til cellemengden tilstede i prøven. Imidlertid er det velkjent at mengden av klorofyll a per celle varierer vesentlig avhengig av vekstbetingelsene, særlig som respons på endrede næringsstoffkonsentrasjoner og lysintensiteter 29 .
En av de betydelige fordelene ved den presenterte teknikken med hensyn til andre metoder er at den er svært selektiv. Den sure syren og fenolprotokollen og monosakkaridkompositionsanalysen følgerSur hydrolyse er relativt enkle metoder og har blitt brukt i tidligere studier 9 , 10 , 12 , 13 . Imidlertid kan disse metodene overvurdere glykogeninnholdet fordi ikke-glykogen glukose og ekstra sukkerarter kan bidra til måling, avhengig av karbohydratdetekteringsteknikken 12 . Den beskrevne teknikk detekterer glukose i glykogen selektivt. Det kan også diskriminere glukose fra cellulose, fordi a-amylase og a-amyloglukosidase ikke hydrolyserer de β-bundet glukosylbindinger som er tilstede i cellulose. I tidligere studier ble enzymatisk hydrolyse av glykogen utført utelukkende av a-amyloglukosidase 7 , 27 . Inkludering av den endo-virkende a-amylase sammen med den ekso-virkende a-amyloglukosidase, som presentert i denne protokollen, kan sikre tHan effektiv hydrolyse av glykogen. En lignende selektiv hydrolyse blir rutinemessig anvendt på behandling av plantebiomasse, hvor kombinasjonen av a-amylase-a-amyloglukosidase brukes til hydrolysering av stivelse uten å påvirke andre glukoseholdige polysakkarider, slik som cellulose 21 .
Hovedbegrensningen av teknikken er at prosedyren er lav gjennomstrømning fordi individuelle prøver behandles separat ved bruk av mikrocentrifugerør. Glykogenutfellingstrinnet er den primære faktoren som forhindrer høyere gjennomstrømning. Implementering som en høy gjennomstrømningsprosedyre ville kreve bruk av dypbrønnplater og muligheten til å sentrifugere disse med høy hastighet (20 000 x g ). Mens sentrifuger som kan sentrifugere 96-brønnsplater med nødvendig hastighet er tilgjengelige, kan de fleste brønnplater ikke tåle kraft større enn 6000 x g . Derfor er det nøye valg av materialer som kreves for å tilpasse protokollen for higH-gjennomstrømningsanalyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne anerkjenner Nordic Energy Research (AquaFEED, prosjekt nr. 24), Innovasjonsfond Danmark (Pant Power, prosjekt nr. 12-131844) og Villum Fonden (prosjekt nr. 13363)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| QSonica Sonicators Q700 | Qsonica, LLC | NA | QSonica |
| SpectraMax 190 Microplate Reader | Molecular Devices | NA | Eliza plate reader |
| Bullet Blender Storm | Next Advance | BBY24M-CE | Beads beater |
| Ultrospec 3100 pro UV/Visible Spectrophotometer | Amersham Biosciences | NA | Spectrophotometer |
| Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | Buffer |
| HCl | Merck | 1-00317 | pH adjutment |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | 32319 | Buffer |
| Amyloglycosidase (Rhizopus sp.) | Megazyme | E-AMGPU | Enzyme for glycogen depolymerization |
| α-Amylase, thermostable (Bacillus licheniformis) | Sigma-Aldrich | A3176 | Enzyme for glycogen depolymerization |
| D-Glucose | Merch | 8337 | Standard for the glucose assay |
| Pierce BCA Protein assay kit | Thermo Fisher scientific | 23225 | For determination of protein concentrations |
| Aluminum drying trays, disposable | VWR | 611-1362 | For determination of cell dry weights |
| D-Glucose assay kit (GODPOD format) | Megazyme | K-GLUC | For determination of glucose concentrations |
| Zirconium oxide breads, 0.15 mm | Next Advance | ZrOB015 | Beads for cell lysis in a Bullet Blendar Storm |
| RINO tubes | Next Advance | NA | Tubes for cell lysis in a Bullet Blendar Storm |
References
- Chen, X., et al. The Entner-Doudoroff pathway is an overlooked glycolytic route in cyanobacteria and plants. Proc Natl Acad Sci USA. 113 (19), 5441-5446 (2016).
- Yang, C., Hua, Q., Shimizu, K. Metabolic flux analysis in Synechocystis using isotope distribution from C-13-labeled glucose. Metab Eng. 4 (3), 202-216 (2002).
- Pelroy, R. A., Levine, G. A., Bassham, J. A. Kinetics of light-dark CO2 fixation and glucose assimilation by Aphanocapsa 6714. J Bacteriol. 128, 633-643 (1976).
- You, L., Berla, B., He, L., Pakrasi, H. B., Tang, Y. J. 13C-MFA delineates the photomixotrophic metabolism of Synechocystis. sp. PCC 6803 under light- and carbon-sufficient conditions. Biotechnol J. 9, 684-692 (2014).
- Jacobsen, J. H., Frigaard, N. U. Engineering of photosynthetic mannitol biosynthesis from CO2 in a cyanobacterium. Metab Eng. 21, 60-70 (2014).
- Möllers, K. B., Cannella, D., Jørgensen, H., Frigaard, N. -U. Cyanobacterial biomass as carbohydrate and nutrient feedstock for bioethanol production by yeast fermentation. Biotechnol Biofuels. 7, 64 (2014).
- Angermayr, S. A., et al. Culturing Synechocystis. sp. strain PCC 6803 with N2 and CO 2 in a diel regime reveals multiphase glycogen dynamics with low maintenance costs. Appl Environ Microbiol. 82, 4180-4189 (2016).
- de Porcellinis, A. J., et al. The Non-coding RNA Ncr0700/PmgR1 is required for photomixotrophic growth and the regulation of glycogen accumulation in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Plant Cell Physiol. 57 (10), 2091-2103 (2016).
- Sakuragi, Y. alpha-Tocopherol plays a role in photosynthesis and macronutrient homeostasis of the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 that is independent of its antioxidant function. Plant Physiol. 141, 508-521 (2006).
- Osanai, T., et al. Positive regulation of sugar catabolic pathways in the cyanobacterium Synechocystis. sp. PCC 6803 by the group 2 sigma factor sigE. J Biol Chem. 280, 30653-30659 (2005).
- Yamauchi, Y., Kaniya, Y., Kaneko, Y., Hihara, Y. Physiological roles of the cyAbrB transcriptional regulator pair Sll0822 and Sll0359 in Synechocystis sp. strain PCC 6803. J Bacteriol. 193, 3702-3709 (2011).
- Dubois, M., Gilles, K., Hamilton, J., Rebers, P., Smith, F. Colorimetric method for determination of sugars and related substances. Anal Chem. 28, 350-356 (1956).
- Osanai, T., et al. Genetic engineering of group 2 {sigma} factor SigE widely activates expressions of sugar catabolic genes in Synechocystis species PCC 6803. J Biol Chem. 286, 30962-30971 (2011).
- Miao, X., Wu, Q., Wu, G., Zhao, N. Sucrose accumulation in salt-stressed cells of agp gene deletion-mutant in cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. FEMS Microbiol Letters. 218, 71-77 (2003).
- Hagemann, M., Erdmann, N. Activation and pathway of glucosylglycerol synthesis in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Microbiology. 140, 1427-1431 (1994).
- Nobles, D. R., Romanovicz, D. K., Brown, R. M. Cellulose in cyanobacteria. Origin of vascular plant cellulose synthase. Plant Physiol. 127, 529-542 (2001).
- Zhao, C., et al. High-yield production of extracellular type-I cellulose by the cyanobacterium Synechococcus sp. PCC 7002. Cell Discovery. 1, 15004 (2015).
- Kawano, Y., et al. Cellulose accumulation and a cellulose synthase gene are responsible for cell aggregation in the cyanobacterium Thermosynechococcus vulcanus RKN. Plant Cell Physiol. 52, 957-966 (2011).
- Angermayr, S. A., Gorchs Rovira, A., Hellingwerf, K. J. Metabolic engineering of cyanobacteria for the synthesis of commodity products. Trends Biotechnol. 33, 352-361 (2015).
- Zhang, B., Dhital, S., Gidley, M. J. Synergistic and antagonistic effects of α-amylase and amyloglucosidase on starch digestion. Biomacromolecules. 14, 1945-1954 (2013).
- Harholt, J., et al. ARABINAN DEFICIENT 1 is a putative arabinosyltransferase involved in biosynthesis of pectic arabinan in Arabidopsis. Plant Physiol. 140, 49-58 (2006).
- Fernando, C. D., Soysa, P. Optimized enzymatic colorimetric assay for determination of hydrogen peroxide (H2O2) scavenging activity of plant extracts. MethodsX. 2, 283-291 (2015).
- Jacobsen, J. H., Rosgaard, L., Sakuragi, Y., Frigaard, N. U. One-step plasmid construction for generation of knock-out mutants in cyanobacteria: studies of glycogen metabolism in Synechococcus sp PCC 7002. Photosynth Res. 107 (2), 215-221 (2011).
- Lichtenthaler, H. K. Chlorophylls and carotenoids: Pigments of photosynthetic biomembranes. Methods Enzymol. 148, 350-382 (1987).
- López, C. V. G., del Carmen Cerón García, M., Fernández, F. G. A., Bustos, C. S., Chisti, Y., Sevilla, J. M. F. Protein measurements of microalgal and cyanobacterial biomass. Bioresource Technol. 101, 7587-7591 (2010).
- Hasunuma, T., et al. Dynamic metabolic profiling of cyanobacterial glycogen biosynthesis under conditions of nitrate depletion. J Exp Bot. 64, 2943-2954 (2013).
- Díaz-Troya, S., López-Maury, L., Sánchez-Riego, A. M., Roldán, M., Florencio, F. J. Redox regulation of glycogen biosynthesis in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803: Analysis of the AGP and glycogen synthases. Molecular Plant. 7, 87-100 (2014).
- Parrott, L. M., Slater, J. H. The DNA, RNA and protein composition of the cyanobacterium Anacystis nidulans grown in light- and carbon dioxide-limited chemostats. Arch Microbiol. 127, 53-58 (1980).
- Hihara, Y., Kamei, A., Kanehisa, M., Kaplan, A., Ikeuchi, M. DNA microarray analysis of cyanobacterial gene expression during acclimation to high light. Plant Cell. 13, 793-806 (2001).
