عدم وجود أدوات لقياس خصائص المواد والمعلمات المتوترة في فيفو يمنع التحقق من صحة أدوارهم أثناء التطوير. استخدمنا مجهر القوة الذرية (AFM) وتتبع نانوحبيبات لقياس الخصائص الميكانيكية على الخلية الزرد سليمة صفار الجنين أثناء ابيبولي. هذه الأساليب موثوقة وقابلة للتطبيق على نطاق واسع تجنب التدخلات تطفﻻ.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
فؤاد وميكرورهيولوجي في الخلية صفار الجنين الزرد
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
توضيح العوامل التي توجه المنظمة الزمانية المتطورة الأنسجة أحد الأغراض الرئيسية في دراسة التنمية. المقترحات المختلفة المطالبة كانت مساهمات هامة في فهم الخواص الميكانيكية للخلايا والأنسجة في منظمتهم الزمانية المكانية في العمليات الإنمائية ومورفوجينيتيك المختلفة. ومع ذلك، نظراً لعدم وجود أدوات موثوق بها ويمكن الوصول إليها لقياس خصائص المواد والمعلمات المتوترة في فيفو، التحقق من صحة هذه الفرضيات كانت صعبة. نقدم هنا أساليب استخدام مجهر القوة الذرية (AFM)، والجسيمات التي تتبع بهدف قياس الخواص الميكانيكية للخلية الزرد سليمة صفار الجنين أثناء ابيبولي. ابيبولي هو عملية إنمائية مصانة أوائل الدراسة الذي يسر بشفافية للجنين. هذه الأساليب بسيطة لتنفيذ وموثوق بها، والمطبقة على نطاق واسع نظراً للتغلب عليها تدخلي التدخلات التي يمكن أن تؤثر على الأنسجة الميكانيكا. تم تطبيق استراتيجية بسيطة لتركيب العينات وتسجيل فؤاد وحقن نانوحبيبات وتتبع. هذا النهج يجعل هذه الأساليب قابلة للتكيف بسهولة إلى أوقات الإنمائية أو الكائنات الحية الأخرى.
المقدمة
المبادئ المادية الأساسية لمراقبة النشاط الحيوي للعمليات مورفوجينيتيك إلى حد كبير غير معرف. في حين يتم جمع دراسات النشاط الحيوي على المستوى الجزيئي والخلوي زخما كبيرا، استكشاف معلمات النشاط الحيوي على مستوى الأنسجة/الكائن في مهدها. هيدرودينامية الانحدار1 أو "مجهرية القوة الفيديو"2 تسمح للباحثين التمييز بين القوات الإيجابي والسلبي، بينما الليزر الجراحة3أو أقل تطفﻻ مجهر القوة الذرية (AFM) من الخلايا ينتابها4 أو في فيفو ميكرورهيولوجي 5 أو نانوحبيبات6 تسمح تحسبا للخواص الميكانيكية للأنسجة والردود.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
كل بروتوكول الخطوات الموضحة أدناه اتبع المبادئ التوجيهية رعاية الحيوان لمؤسساتنا.
1-الزرد الثقافة
- تولد والحفاظ على الزرد الكبار تحت الظروف القياسية.
ملاحظة: استخدمت أجنة نوع البرية AB وليرة تركية لهذه الدراسة. - جمع الأجنة وزراعتها في 28.5 درجة مئوية في E3 الجنين المتوسط24. المرحلة لهم وفقا مورفولوجية كما هو موضح سابقا19.
2. مجهر القوة الذرية
- يدوياً نظموا ديتشوريوناتي الأجنة الزرد (من مختلف الإعمار وفقا للمصالح الفردية). إزالة تشوريونس بالملقط حادة ورقيقة اثنين (انظر الجدول للمواد).
- قبضة المشيمة استخدام ا....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
قياسات التوتر القشرية
لكل نقطة القياس، تم اقتناء خمس القوة-التشرد (وي) منحنيات بفؤاد التعلية ناتئ في 1 هرتز مع سعة الذروة إلى الذروة من 5 ميكرومتر (السرعة = 10 ميكرون/s) حتى المسافة بادئة الحد أقصى من ~ 2 ميكرومتر. هذا الإجراء قد أخذ أقل من 20 دقيقة ولم يتأثر بالتدرج ابيبولي. تم اختبار كل حالة تجريبية في الأجنة 5 على الأقل.
منحنيات القوة-التشرد المسجلة في الخلية صفار الجنين، على العكس من ذلك تلك المقابلة [اغر.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
هنا نظهر أن خصائص المواد وبعض معلمات النشاط الحيوي للخلية صفار الزرد أثناء ابيبولي يمكن بسهولة تقدير قبل ميكرورهيولوجي فؤاد وجسيمات نانوية.
في حين قد استخدمت فؤاد لاسترداد السمات انسيابية للخلايا والأنسجة في الظروف الفسيولوجية4،5،،من2528، هنا علينا وضع بروتوكول لتطبيق فؤاد على تنمية سليمة الأجنة التي استخدمنا اختبار سطح الخلية صفار الجنين الزرد أثناء ابيبولي.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب يعلن لا تضارب المصالح المالية أو غيرها تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
ونحن نشكر عمايرة هيرنانديز-فيغا، وفيليب ألكسندر بويي للمشاركة في إعداد الأساس لهذه البروتوكولات. ونشكر أيضا "منصة التصوير الجزيئي" من إيبمب-ثنائي الفينيل متعدد الكلور، واستبان كزافييه وأعضاء المختبر للدعم المستمر. وأيد "البرنامج الموحد مجموعات" محافظة كاتالونيا والإدارة و "تدعيم المنح المقدمة" من وزارة الاقتصاد والقدرة على المنافسة في إسبانيا للتطريز و DN هذا العمل.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| المجهر البصري المقلوب | نيكون | TE2000 | تصور العينة ومجهر القوة الذرية الكابولي AFM |
| (AFM) | مصنوع حسب الطلب | - | يمكن استخدام أي AFM تجاري |
| مجهر متحد البؤر | المقلوب Zeiss | LSM780 | جمع بيانات علم الريولوجيا النانوية |
| Agarose D1 Low EEO | Conda | 8016.00 | صب الأجنة |
| فائق النقاء LMP Agarose (ذوبان منخفض) | Invitrogen | 16520-100 | تأمين الأجنة قوالب |
| الحقن المجهري والزرع لأسماك الزرد | العالمية أدوات الدقة | Z-MOLDS | صب الأجنة. يمكن أيضا استخدام الأبعاد الأصلية المصنوعة حسب الطلب من |
| Dumont 5 Fallps | FST | 11251-20 | 1.5 مم قطر |
| Si3< / sub>N4< / sub> ناتئ | Novascan | PT. GS | قياس الجنين بواسطة AFM. طرف كروي: 4.5 وميكرو ؛ م القطر و k = 0.01 N / m |
| الجسيمات النانوية الفلورية | Life | Technologies FluoSpheres F8811 ، | لتتبع النانو |
| مجتذب الماصات | الدقيقة Sutter Instruments | P-2000 | تصنيع الإبر الدقيقة المصممة |
| البورسليكات الشعري | Warner Instruments | G100TF-4 | تصنيع الإبر الدقيقة المصممة |
| Micromanipulator | Narishige | MN-153 | التلاعب بالماصة |
| الحاقن الدقيق | Eppendorf | FemtoJet Express | التحكم في وقت الحقن والضغط |
| المجهر المجسم | Leica | DFC365FX | تصور الأجنة أثناء الحقن |
| برنامج | تحليل MathWorks | Matlab | تحليل بيانات AFM وتتبع الجسيمات |
| Zebrafish | AB و TL النوع البري | - | السلالات المستخدمة لجمع الأجنة |
| زجاجية سفلية | حصيرة Tek | P35G-0.170-14-C | أجنة متصاعدة لجمع بيانات علم الريولوجيا النانوية |
| المرحلة ميكرومتر | FST | 29025-02 | حجم الحقن |
المراجع
- Hernandez-Vega, A., et al. Polarized cortical tension drives zebrafish epiboly movements. EMBO J. 36, 25-41 (2017).
- Brodland, G. W., et al. Video force microscopy reveals the mechanics of ventral furrow invagination in Drosophila. Proc....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
استكشف المزيد من المقالات
