Summary
عدم وجود أدوات لقياس خصائص المواد والمعلمات المتوترة في فيفو يمنع التحقق من صحة أدوارهم أثناء التطوير. استخدمنا مجهر القوة الذرية (AFM) وتتبع نانوحبيبات لقياس الخصائص الميكانيكية على الخلية الزرد سليمة صفار الجنين أثناء ابيبولي. هذه الأساليب موثوقة وقابلة للتطبيق على نطاق واسع تجنب التدخلات تطفﻻ.
Abstract
توضيح العوامل التي توجه المنظمة الزمانية المتطورة الأنسجة أحد الأغراض الرئيسية في دراسة التنمية. المقترحات المختلفة المطالبة كانت مساهمات هامة في فهم الخواص الميكانيكية للخلايا والأنسجة في منظمتهم الزمانية المكانية في العمليات الإنمائية ومورفوجينيتيك المختلفة. ومع ذلك، نظراً لعدم وجود أدوات موثوق بها ويمكن الوصول إليها لقياس خصائص المواد والمعلمات المتوترة في فيفو، التحقق من صحة هذه الفرضيات كانت صعبة. نقدم هنا أساليب استخدام مجهر القوة الذرية (AFM)، والجسيمات التي تتبع بهدف قياس الخواص الميكانيكية للخلية الزرد سليمة صفار الجنين أثناء ابيبولي. ابيبولي هو عملية إنمائية مصانة أوائل الدراسة الذي يسر بشفافية للجنين. هذه الأساليب بسيطة لتنفيذ وموثوق بها، والمطبقة على نطاق واسع نظراً للتغلب عليها تدخلي التدخلات التي يمكن أن تؤثر على الأنسجة الميكانيكا. تم تطبيق استراتيجية بسيطة لتركيب العينات وتسجيل فؤاد وحقن نانوحبيبات وتتبع. هذا النهج يجعل هذه الأساليب قابلة للتكيف بسهولة إلى أوقات الإنمائية أو الكائنات الحية الأخرى.
Introduction
المبادئ المادية الأساسية لمراقبة النشاط الحيوي للعمليات مورفوجينيتيك إلى حد كبير غير معرف. في حين يتم جمع دراسات النشاط الحيوي على المستوى الجزيئي والخلوي زخما كبيرا، استكشاف معلمات النشاط الحيوي على مستوى الأنسجة/الكائن في مهدها. هيدرودينامية الانحدار1 أو "مجهرية القوة الفيديو"2 تسمح للباحثين التمييز بين القوات الإيجابي والسلبي، بينما الليزر الجراحة3أو أقل تطفﻻ مجهر القوة الذرية (AFM) من الخلايا ينتابها4 أو في فيفو ميكرورهيولوجي 5 أو نانوحبيبات6 تسمح تحسبا للخواص الميكانيكية للأنسجة والردود.
فؤاد أسلوب طبوغرافية ثلاثية الأبعاد مع ارتفاع القرار الذري حل خشونة السطح والامتثال من الانحراف نصائح ناتئ عند الاتصال مع سطح بروبيد7. تم وضع منهجيات مختلفة تستخدم فؤاد للتحقيق في خصائص السطح، بما في ذلك قياس خصائص لزج مطاطي من مواد متنوعة وقوى الالتصاق والاحتكاك. في الآونة الأخيرة، برز فؤاد كأداة قوية لاسترداد معلومات عن الخواص الميكانيكية للعينات البيولوجية. على وجه الخصوص، فؤاد غير إينفاسيفيلي استخراج معامل القص معقدة من الخلايا المفردة بتطبيق المسافات البادئة متذبذبة مع تلميح صغيرة تعلق على ناتئ معروفة ثابتة الانحناء/8. وهذا يتيح لنا استنتاج القوى الناتجة عن ذلك. فؤاد ليست فريدة من نوعها حتى الآن، ومنهجيات مختلفة تسمح لاستخراج بيانات انسيابية والخصائص الميكانيكية من الخلايا الفردية (مثلاً، ميكروبيبيتي تطلع9، المغناطيسية التواء الخلوي (MTC)10، أو أونياكسيال الشد اختبار11).
حتى الآن، تطبيق هذه المنهجيات الجديدة للعمليات المعقدة morphogenetic ليست واضحة. التحديات الرئيسية التي تواجه عند تحديد الخواص الميكانيكية للأنسجة الجنينية هي الصغيرة (ميكرومتر إلى ملم)، ناعمة (في 102 -نطاق السلطة الفلسطينية4 10) وطبيعة المواد12فيسكو-مطاطا (تؤدي إلى الظواهر تعتمد على الوقت). ولذلك من المهم أن التكيف مع الأساليب المستخدمة لتحديد الخواص الميكانيكية (صلابة، واللزوجة، والالتصاق) إلى الحالة المحددة للأجنة والكائنات الحية النامية. قضيتين هامتين بحاجة إلى أن تؤخذ في الاعتبار عند تحليل النهج انسيابية لدراسة التنمية: تجنب التدخل تدخلا، وتوفير سهولة الوصول إليها. في هذا السيناريو، تظهر تطلع ميكروبيبيتي ولجنة النقل البحري، واختبار الشد القيود. ففي الحالة الأولى، قد يغير تشوه العالية التي يعاني خلية بالخصائص الفسيولوجية والميكانيكية9. وفي الحالة الثانية، يمكن أيضا إدخال الحاجة إلى الالتزام بشدة الأنسجة التجريبية إلى ركيزة لضمان أن يشدد على تطبيق تشوه cytoskeleton محلياً الآثار في حالة التنشيط للخلايا، ومن ثم، في تلك الميزات الميكانيكية10 . نهج آخر، أونياكسيال الشد مقيدة بهندسة تطوير الكائنات الحية وإمكانية الوصول إلى11.
فؤاد يبدو أن يكون أكثر ملاءمة لدراسة العمليات الإنمائية أنها تتيح دراسة عينات بيولوجية مباشرة في بيئتها الطبيعية دون أي تحضير العينة مرهقة. وعلاوة على ذلك، كما تفكك الأنسجة الجنينية من الصعب عموما، تخفيض حجم المجسات فؤاد يوفر درجة عالية من التنوع مع أي قيود في اختيار نوع المتوسطة (مائي أو غير مائي) أو درجة حرارة العينة الكيميائية تكوين العينة. فؤاد مرنة بما يكفي لتطبيقها على مجالات كبيرة والوقت جداول، وقد استخدمت لاسترداد خصائص المواد للأنسجة في مراحل تنموية متميزة أو الظروف الفسيولوجية. الأنسجة الأصلية كاملة مثل الشرايين13 أو العظام14 قد درست من وجهة نظر طوبوغرافية، وفي بعض الحالات، مثل الصلبة، الخواص الميكانيكية قد أيضا تم استرجاع15. كما تم استكشاف التضاريس في الأجنة الحية يسمح التصور من، على سبيل المثال، الخلية إعادة ترتيب خلال morphogenesis في النمو16. وقد وضعت نموذج آخر، شاملة إعداد بروتوكولات لتحديد معلمات الميكانيكية أثناء عمليات إنمائية مختلفة. خرائط نانويندينتيشن تم إنشاؤها في أقسام الأنسجة غير المثبتة الأصلي ل القناة الهضمية الجنينية الفرخ11؛ استرداد خصائص لاصقة والميكانيكية الأديم الظاهر، mesoderm، والأنسجة السلف خلايا فردية معزولة عن جاسترولاتينج الزرد الأجنة4؛ القيام بقياسات صلابة epiblast والانتصارات البدائية في اكسبلانتس من أجنة الطيور17؛ ونمط متميز من صلابة تدرجات معرفة مباشرة في الدماغ الجنينية للنمو5.
قد تأتي قفزة نوعية كبيرة لتطبيق فؤاد لاستكشاف التطور الجنيني من الاقتراب من العمليات البسيطة morphogenetic موجوداً. ابيبولي الزرد هو حدث أساسي ومصانة، التي تنسق أنسجة مختلفة في الفضاء كروية مقيدة لتوجيه التوسع بلاستوديرم في بضع ساعات. في بداية ابيبولي الزرد (مرحلة كروية)، تغطي طبقة سطحية من الخلايا، طبقة تغليف (EVL)، غطاء شبه كروية من blastomeres تتمحور حول القطب الحيواني الجنين يجلس على خلية المخلوي صفار ضخمة. ابيبولي يتكون من توسيع وارد نباتية القشرية EVL، الخلايا العميقة (DCs) في بلاستوديرم، والطبقة الخارجية للخلية صفار المخلوي (E-المساومة) حول الصفار. ابيبولي تنتهي مع الإغلاق في EVL ووحدات تحكم المجال Dc في القطب فيجيتال18،،من1920. كيف وأين يتم إنشاء القوات أثناء ابيبولي وكيف أنها تقترن على الصعيد العالمي ليس واضحا بعد1،21.
هنا نحن تصف بالتفصيل كيفية تطبيق فؤاد للاستدلال على خصائص الأنسجة الميكانيكية السلبي أثناء التقدم ابيبولي في الصفار الزرد الخلية في الجسم الحي. للقيام بذلك، استخدمنا الجزئي المجالات الخرز الصغير الصغيرة تعلق على كانتيليفيرس فؤاد كما يسبر. وهذا ما يسمح على استرجاع المعلومات المحلية دقيقة داخل سطح الخلية صفار غير موحدة ودراسة التدرجات المتوترة وديناميتها على مر الزمن. نهج فؤاد بديلة مثل أولئك الذين يستخدمون آسفين cantilevers22، سوف لا تجعل البيانات المحلية التي دقيقة بما يكفي. تقنية آسفين، الذي يتطلب مهارات معالجة حذرة للغاية الغراء آسفين أكبر من حجم العينة في نهاية ناتئ، ليست مناسبة تماما لسبر الجنين (~ 2-fold أكبر من طول ناتئ) الميكانيكا.
يسمح النمذجة وتميز خصائص الخلايا لزج مطاطي في الطرق الكمية والنوعية لتحسين فهم على علم الميكانيكا الأحيائية. من وجهة نظر النشاط الحيوي، من الضروري فهم ابيبولي، وليس مجرد الطلب المعرفة على قياسات التوتر القشرية، وديناميات، التي يمكن أن تستخلص من فؤاد؛ وبالتالي هناك حاجة للحصول على معلومات حول الخصائص الفيزيائية-الحيوية للأنسجة. لاستخراج هذه المعلومات، قد وضعت مجموعة متنوعة من تقنيات ريولوجيا خلية على مر السنين لوصف أنواع مختلفة من الخلايا تحت ظروف فسيولوجية مختلفة23. وهي تشمل فؤاد، ولجنة النقل البحري، وملاقط بصرية (OT). هذه الأساليب، ولكن ثبت غير كافية للتحاليل mesoscopic بمقياس للأجنة أو أجهزة. وكبديل لذلك، نحن تكيفت بنجاح ميكرورهيولوجي نانوحبيبات-تتبع6 في فيفو القياسات انسيابية. هذا الأسلوب يحلل عمليات النزوح براونية الجزيئات الفردية، وتستدل على الخصائص المحلية ذبابة.
ميكرورهيولوجي فؤاد ونانوحبيبات معا يسمح تعريف ديناميات المتوترة القشرية وخواصها الميكانيكية الداخلية صفار البيض أثناء ابيبولي. ويؤيد هذه المعلومات نموذج الذي يطور متباين من الإجهاد نتيجة للاختلافات في رد التشوه EVL وصفار هيولى طبقة (يحتلون) إلى انكماش قشرة ه-ننصح أكتوميوسين الخواص ضروري حركة صافي اتجاهي ل التقدم EVL وابيبولي1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
كل بروتوكول الخطوات الموضحة أدناه اتبع المبادئ التوجيهية رعاية الحيوان لمؤسساتنا.
1-الزرد الثقافة
- تولد والحفاظ على الزرد الكبار تحت الظروف القياسية.
ملاحظة: استخدمت أجنة نوع البرية AB وليرة تركية لهذه الدراسة. - جمع الأجنة وزراعتها في 28.5 درجة مئوية في E3 الجنين المتوسط24. المرحلة لهم وفقا مورفولوجية كما هو موضح سابقا19.
2. مجهر القوة الذرية
- يدوياً نظموا ديتشوريوناتي الأجنة الزرد (من مختلف الإعمار وفقا للمصالح الفردية). إزالة تشوريونس بالملقط حادة ورقيقة اثنين (انظر الجدول للمواد).
- قبضة المشيمة استخدام الملقط واحدة وجعل المسيل للدموع في أنه مع الملقط الأخرى. بعد ذلك، عقد المشيمة في منطقة مقابل أن المسيل للدموع، دفع الجنين بلطف من خلال فتح.
- أداء ديتشوريونيشن تحت ستيريوميكروسكوبي تشريح مع مجموعة قابل لتعديل للتكبير بين 8 X و 50 س.
- جبل الأجنة لفؤاد
- تعد حلاً من [اغروس] 2% في المتوسط الجنين وملء طبق بتري 35 ملم مع هذا. يصلب. جعل الثقوب الصغيرة 1.5 ملم للقطر (ضعف حجم الجنين) وحوالي 350 ميكرون العمق (نصف حجم الجنين) مع الملقط رقيقة في السرير [اغروس].
- وضع الأجنة في الوخزات في الطبقة [اغروس] وأؤكد أنهم في مكان بنشر حول إيجاد حل لانخفاض 0.5% تذوب [اغروس] في متوسطة الجنين. من أجل هذا الحل حول الأجنة فقط لتأمينها في الثقوب.
- قبل نقطة انصهار منخفضة [اغروس] يتصلب في درجة حرارة الغرفة، قم بتدوير الأجنة في مثل هذه طريقة أن تواجه منطقة الفائدة أن سبر طريق فؤاد صعودا (الشكل 1A).
- فحص الأجنة بفؤاد
- قم بتحديد موقع وصورة الأجنة في طبق بتري توظيف هدفا X 20 في "المقلوب مجهر القوة الذرية" (انظر الجدول للمواد25) في درجة حرارة الغرفة (23-24 درجة مئوية).
ملاحظة: الأجنة هي أبقى على قيد الحياة منغمسين في المتوسط الجنين وتعلق على السرير [اغروس]. - التحقيق على سطح الخلية صفار مسبوك أجنة تستخدم الخرز البوليسترين كروية من 4.5 ميكرومتر في القطر إرفاقه ناتئ مع ثابت ربيع اسمي من 0.01 م ن. تعيين السعة الذروة إلى الذروة للتذبذب ناتئ إلى 5 ميكرومتر وترددها 1 هرتز.
- جمع البيانات الخاصة بكل منطقة اختبار في مواقف مختلفة وفي عدة أجنة، كروتين، لحساب متوسط البيانات.
ملاحظة: نقطة انطلاق جيدة للتحقيق خمسة مواقع تقع في الوسط وفي زوايا ساحة ميكرومتر 10 µm x 10 بالسيطرة على الموقف ناتئ مع XY بيزو-المشغلات المجهر فؤاد. جمع البيانات والتصوير استغرق حوالي 20 دقيقة لكل جنين. تسجيل البيانات في مناطق مختلفة من سطح الخلية صفار الجنين، مثلاً، القطب فيجيتال أو مناطق مختلفة قريبة من الهامش الخلايا EVL (الشكل 1 باء و جيم 1)، يمكن أن يتم إلا عن طريق استخدام العينات المتميزة الموجهة بشكل مختلف.
- قم بتحديد موقع وصورة الأجنة في طبق بتري توظيف هدفا X 20 في "المقلوب مجهر القوة الذرية" (انظر الجدول للمواد25) في درجة حرارة الغرفة (23-24 درجة مئوية).
- حساب القوات
- قياس الإزاحة الرأسية ناتئ فؤاد (z) مع مجسات قياس الضغط بالإضافة إلى بيزو-المحركات، وعن انحراف (د) استخدام الضوئي رباعي بواسطة الأسلوب رافعة بصري مع برنامج مراقبة المجهر (انظر الجدول للمواد 25).
- استخدام انحدار منحنى زي د التي تم الحصول عليها من البيانات التي تم جمعها من منطقة باري ساترة زجاجية لمعايرة العلاقة بين الإشارة الضوئي وانحراف ناتئ (د).
ملاحظة: يساوي الإزاحة الرأسية يقاس انحراف ناتئ والمنحدر يمثل حساسية انحراف رافعة الضوئية26. - استنتاج ثابت ربيع ناتئ (k) من التقلبات الحرارية كما تم وصفه سابقا27.
- حساب المسافة البادئة للعينة (ح) حسب:
ح = (z-zج) -(د-دقبالة) (1)
ملاحظة: هنا ضج هو موضع نقطة اتصال ودقبالة هو إزاحة الضوئي. - حساب هذه القوة (F) على ناتئ ك:
F = k · د (2)
- حساب توتر القشرة من حيث نموذجا بالون السائل يتكون من طبقة مرنة من التوتر القشرية تيج مرفقا بها سائل لزج. في هذا النموذج، للمسافات البادئة الصغيرة (بالمقارنة مع حجم الجنين)، قوة يزيد تناسبياً4،28 ك:
F = 4π Tc[(صب / Re) + 1)] ح (3)
ملاحظة: هنا Rب شعاع حبة و آره هو نصف القطر للجنين. للجنين الزرد، كما شعاع الجنين (400 ميكرون) اثنان أوامر من حجم أكبر من حبة (2.25 ميكرومتر)، يمكن تقريب هذه المعادلة حسب:
F = 4π ر حج (4)- حساب التوتر القوة--المسافة البادئة (وح) أشر المنحنيات في كل منطقة الخلية صفار الجنين لخمسة مختلفة القياسات.
- حساب Tc لكل وح المنحنى بتركيب المربعات الصغرى غير الخطية. يجب أن متوسط التحليل الإحصائي، أن التوتر القشرية المحسوبة Tc من مختلف وح المنحنيات.
- قياس خصائص لزج مطاطي (ريولوجيا) القشرة عن طريق تطبيق السعة منخفضة (100 nm) ذبذبات الأطوار خلال فؤاد تتألف من موجات جيبية من ترددات مختلفة25.
- حساب معامل معقدة فعالة g*(ƒ) في مجال التردد من منحنيات المسافة البادئة القوة ك:
ز * (و) = [و(و)/ ح(و)]- ifb (5)
هنا هو وحدة خيالية و واو(f) ح(و) أطياف التردد (f) من القوة والمسافة البادئة. ب هو التصحيح للسحب اللزج على ناتئ المستخرجة من الذبذبات المطبقة على السطح. - منفصلة g*(ƒ) إلى أجزاء الحقيقية والتخيلية ك:
ز * (Ƒ) = ز' (و) + ig'' (f) (6)
م > ز ' (و) هو معامل مرونة ومقياسا للطاقة المرنة تخزين واستردادها في كل دورة من التذبذب. ز'' (f) هو معامل اللزوجة التي تستأثر الطاقة تبدد. - حساب المماس الخسارة، الذي يوفر مؤشر الصلبة الشبيهة (< 1) أو سائل مثل (> 1) سلوك المواد، ك:
ز'' (f)/ ز' (و) (7)
ملاحظة: مع هذا النوع من القياس، فإنه من الممكن استخراج المعلمات تبين كيف لزوجة ومرونة كيف المواد بروبيد. على الرغم من أن قليلاً ب يعتمد على مسافة نهاية ناتئ إلى السطح، ونظرا لقيم منخفضة جداً ز´´ أظهرتها الصفار الخلية (انظر الشكل 2D أدناه)، اختلافات صغيرة في ب أثرا ضئيلا قياسات29.
- حساب معامل معقدة فعالة g*(ƒ) في مجال التردد من منحنيات المسافة البادئة القوة ك:
3-الجسيمات تتبع ميكرورهيولوجي
-
أداء microinjection الجسيمات داخل خلية الصفار
- اختﻻق ميكرونيدليس مصممة باستخدام ساحبة ميكروبيبيتي الأفقي وزجاج البورسليكات الشعرية (انظر الجدول للمواد).
- إعداد ميكرونيدليس التي تحتوي قطر خارجي 1.00 مم وقطر داخلي ل 0.58 مم وطوله 10 سم باستخدام إعدادات ساحبة: الضغط: 500؛ الحرارة: 510؛ سحب: 65؛ السرعة: 25؛ الوقت: 50.
- إعداد صفيحة طبق بيتري حقن عن طريق إنشاء ممرات مستقيمة البادئة في 1% [اغروس] في سرير الجنين المتوسط تستخدم قوالب الصنع مخصصة (انظر الجدول للمواد).
- اقلب في القوالب ووضعها على رأس السائل [اغروس] هلام وإزالة قوالب مرة واحدة وقد وطدت الهلام. "الماصة؛" الأجنة في الأخاديد المقدمة من العفن في [اغروس] تحت ستيريوميكروسكوبي تشريح في 1.2 X التكبير.
ملاحظة: العرض وتصميم قوالب تمكين الأجنة لمحاذاة ذاتيا.
- اقلب في القوالب ووضعها على رأس السائل [اغروس] هلام وإزالة قوالب مرة واحدة وقد وطدت الهلام. "الماصة؛" الأجنة في الأخاديد المقدمة من العفن في [اغروس] تحت ستيريوميكروسكوبي تشريح في 1.2 X التكبير.
- قبل الحقن، إزالة تماما تقريبا على المديين المتوسط وتسهيل الحقن (التوتر السطحي يمنع الجنين/المشيمة من التمسك الإبرة عند إزالته بعد الحقن).
- ميكروينجيكت نيون جسيمات نانوية (دائرة نصف قطرها = 100 نانومتر، انظر الجدول للمواد) المخفف في الماء (1:1، 000) في الجزء النباتي من الخلية صفار الجنين (الشكل 3A).
- ضبط ميكروبيبيتي مع ميكرومانيبولاتورس الدقة وإدخال الخرز مع ميكروينجيكتور تلقائي مع ضوابط الوقت والضغط (انظر الجدول للمواد). تعيين الضغط بين 10 و 20 رطل/بوصة مربعة.
- قبل الحقن الحل حبة، معايرة وحدة التخزين لحقن (0.5 nL) بقياس حجم الحبرية ألقاه ميكروينجيكتور مع ميكرومتر مرحلة 1 × 0.01 مم (انظر الجدول للمواد).
- استخدام بير 1.6 X في ستيريوميكروسكوبي تشريح لتصور الأجنة أثناء الحقن، التي تتم في درجة حرارة الغرفة.
- اختﻻق ميكرونيدليس مصممة باستخدام ساحبة ميكروبيبيتي الأفقي وزجاج البورسليكات الشعرية (انظر الجدول للمواد).
-
تقييم سلوك لزج مطاطي صفار البيض عن طريق تسجيل التقلبات الحرارية
- ديتشوريوناتي الأجنة ميكروينجيكتيد كما في الخطوة 2، 1 وتضمينها في انخفاض 0.5% يذوب [اغروس] نقطة في الحل المتوسط الجنين عند 30 درجة مئوية. وبعد ذلك نقلها إلى أسفل الزجاج لوحات (انظر الجدول للمواد) وتوجيه ودفعهم نحو ساترة عندما لا يزال السائل [اغروس].
ملاحظة: عندما [اغروس] يتصلب في درجة حرارة الغرفة، على استعداد لتصوير الأجنة. - وضع الأجنة التي شنت في لوحات أسفل الزجاج في مرحلة المجهر المقلوب [كنفوكل] ح 2 بعد microinjection. التقاط الصور من جسيمات نانوية 26 s بمعدل أخذ عينات من 25 هرتز مع هدف X 63 في درجة حرارة الغرفة في مجهر [كنفوكل] مقلوب توظيف البرمجيات القياسية المجهر التجاري (حجم بكسل = 166 نانومتر، الصور التي تم التقاطها كل 40 مللي ثانية).
- حساب موقف سينترويدس للجسيمات وتحديد مساراتها على مر الزمن مع البرنامج المساعد تراكماتي للمصدر المفتوح والبرمجيات إيماجيج (الشكل 3B).
- حساب "متوسط مربع" ثنائي الأبعاد (MSD) لكل الجسيمات مع البرمجيات حسب الطلب6،30 كالتشرد:
< Δص2 (τ) > = < [x(t + τ)- x(t)]2 + [y(t + τ)- y(t)]2> (8)
ملاحظة: هنا تي هو الوقت المنقضي والفاصل الزمني. في سائل لزج نقية، يزيد MSD تناسبا عكسيا مع اللزوجة (ν) وفقا للعلاقة ستوكس-اينشتاين:
< Δص2 (τ) > = 4ك Tτب /6πνa، (9)
حيث T هي درجة الحرارة المطلقة.
- ديتشوريوناتي الأجنة ميكروينجيكتيد كما في الخطوة 2، 1 وتضمينها في انخفاض 0.5% يذوب [اغروس] نقطة في الحل المتوسط الجنين عند 30 درجة مئوية. وبعد ذلك نقلها إلى أسفل الزجاج لوحات (انظر الجدول للمواد) وتوجيه ودفعهم نحو ساترة عندما لا يزال السائل [اغروس].
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
قياسات التوتر القشرية
لكل نقطة القياس، تم اقتناء خمس القوة-التشرد (وي) منحنيات بفؤاد التعلية ناتئ في 1 هرتز مع سعة الذروة إلى الذروة من 5 ميكرومتر (السرعة = 10 ميكرون/s) حتى المسافة بادئة الحد أقصى من ~ 2 ميكرومتر. هذا الإجراء قد أخذ أقل من 20 دقيقة ولم يتأثر بالتدرج ابيبولي. تم اختبار كل حالة تجريبية في الأجنة 5 على الأقل.
منحنيات القوة-التشرد المسجلة في الخلية صفار الجنين، على العكس من ذلك تلك المقابلة [اغروس] الناعمة المحيطة بها، يحمل علاقة خطية النسبي (ص2 > 0.999) (الشكل 2 أ). ونحن أداء مجموعات إضافية من عنصر التحكم و زي المنحنيات في 3 ميكرومتر/s و 30 ميكرون/s، والتخلص من اعتماد محتمل من التوتر القشرية تيج على سرعة ناتئ. Tc زادت بنسبة 13% فقط (ف < 0.01، اختبار t) عندما انخفض من 10 إلى 3 ميكرومتر/s السرعة ولم تظهر أي تغيير ملحوظ عند زيادة من 10 إلى 30 ميكرون/s.
وكانت منحنيات القوة--المسافة البادئة (وح) المسجلة سرعة ناتئ من 10 ميكرون/s في الخلية صفار تقريبا الخطي ومزودة ب السائل-بالون نموذجي (الشكل 2)1. هذا التركيب يسمح بحساب القيم المطلقة للتوتر السطحي يعني (pN/ميكرومتر) في مراحل ابيبولي مختلفة وفي مواقع مختلفة بالنسبة إلى حافة الرائدة EVL (المحددة بموجب الضوء المنقولة) (الجدول 1).
ريولوجيا القشرة
الاختلافات بين المسافة البادئة وتراجع من منحنيات القوة-التشرد (وي) (الشكل 2) تشير إلى سلوك لزج مطاطي من قشرة خلية صفار الجنين. منخفضة السعة (100 nm) القياسات التذبذب الأطوار تقدم المعلومات لحساب معامل معقدة فعالة ز*(ƒ) على سطح الخلية صفار البيض ومكوناته مطاطا ولزج (انظر البروتوكول أعلاه).
ريولوجيا اللحاء في الخلية صفار الجنين الزرد تهيمن على سلوك الصلبة الشبيهة بمعامل اللزوجة 5 مرات أقل من معامل مرونة1. هذا السلوك ليس التردد تعتمد، أما للمرونة (ANOVA، p = 0.123)، أو لمعامل اللزوجة (ANOVA، ف = 0.719) (الشكل 2D).
ريولوجيا الصفار
تم حساب اللزوجة من صفار البيض قبل تركيب المعادلة (5) إلى MSD البيانات التي تم الحصول عليها من تعقب نانوحبيبات (انظر الشكل 4 أ-ب). MSD التقلبات الحرارية لجسيمات نانوية الفلورية المدمجة في الصفار المعارض من اعتماد النسبي على الفارق الزمني τ، يتسق مع السلوك من السائل نيوتن. وكان لزوجة القص فعالة من صفار البيض، الذي يرتبط ارتباطاً عكسيا بمعاملات نشر الجزء الأكبر من جسيمات نانوية، 129 mPa·s.
رقم 1: فؤاد الزرد صفار الخلايا المجراة في. (أ) رسم تخطيطي لوصف المجموعة يصل المستخدمة لسبر قشرة خلية صفار الزرد بفؤاد. وكانت الأجنة ديتشوريوناتيد من مختلف الإعمار في منتصف الطريق إدراجها في الثقوب التي تم إنشاؤها في كتل مخصصة [اغروس] واستدارة في اتجاه معين ومختومة عند الحواف مع [اغروس] نقطة انصهار منخفضة. وقد سبر الخلايا صفار مع الخرز البوليسترين كروية إرفاقه ناتئ (أحمر). (ب) سبر الجنين في ابيبولي 50% نصف جزءا لا يتجزأ من [اغروس] مع ناتئ (false الملون باللون الأحمر) في القطب فيجيتال. (ج) سبر جنين ما يعادل ذلك في ب، في الخلية صفار في منطقة قريبة من الهامش الخلايا EVL. تغيير حجم أشرطة = 100 ميكرومتر (ب وج). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2. الزرد الجنين صفار الخلية القشرية التوتر وريولوجيا. (أ) قوة [انحراف (د)]--الحصول على منحنيات التشرد (z) جنينا ممثل كطرف ناتئ للنهج واتصالات العينة [[اغروس] سطح (تحكم) باللون الأزرق] وسطح الخلية صفار البيض باللون الأحمر. (ب) قوة منحنيات المسافة البادئة (وح) (n = 3 أجنة، وقياسات 3 كل جنين على مسافة 10 ميكرون من بعضها البعض. ويمثل كل قياس متوسط 5 المنحنيات) تتناسب مع نموذج السائل-بالون (من المرجع1). ملاحظة الزيادة الخطي في انحراف عند الاتصال مع سطح الخلية صفار الجنين. يظهر خط أسود متقطع المناسب للنموذج (من خلالها التوتر القشرية يتم الاستدلال). (ج) تقريب (أحمر) وسحب (الأرجواني) القوة-التشرد المنحنيات جنينا ممثل. الأسهم الحمراء والأرجواني منحنى أشر إلى النظام الزمني لجمع البيانات. سهم مزدوج الرأس يسلط الضوء على الفرق بين اقتراب وتراجعه انحراف القيم الإشارة إلى الطابع لزج مطاطي للقشرة. (د) فيسكولاستيسيتي قشرة خلية صفار (n = 5 أجنة). معامل معقدة فعالة (ز *) المستخرجة من ذبذبات الأطوار فؤاد القياسات (من 1). رموز حمراء تمثل معامل المرونة (ز ')، ورموز زرقاء تعريف معامل اللزوجة (g″)، على التوالي. يعني ويتم عرض "الخطأ المعياري" (SE). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3. ميكرورهيولوجي تتبع الجسيمات. يتم حقن nanoparticles نيون (A) في الخلية صفار الزرد الأجنة في ابيبولي 50%. (ب) تم تعقبها عمليات التشريد لجسيمات نانوية فردية موزعة بشكل عشوائي داخل صفار البيض (إلى اليسار). الوقت مسار من مسارات نموذجية من جسيمات نانوية (سينترويدس) المضمنة في صفار البيض (أمثلة 2) المعرض مناحي العشوائية التي تتميز بها نشر لزج. شريط المقياس = 100 ميكرومتر (A)؛ 1 ميكرومتر (ب من اليسار)؛ 200 نانومتر (ب، حق). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4. ميكرورهيولوجي صفار الجنين الزرد. العظمية (A) من جسيمات نانوية فردية (n = 99) يحمل الاعتماد على خطي تقريبا مع الفارق الزمني. (ب) يعني ± العظمية الخطأ القياسي لجسيمات نانوية واللزوجة من صفار البيض. فرقة بلغ العظمية (يعني-الخط الأحمر ± SE) نانوحبيبات السكان معارض لزج يغلب الطابع. انحدار خطي العلاقة تعكس خصائص انتشارية جسيمات نانوية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| التوتر (pN/مم) المتوسط ± سراج الدين | % من ابيبولي | |||
| 40-50 | 60-70 | 80-90 | ||
| المسافة إلى الهامش EVL | 20 ميكرومتر (E-المساومة) | - | 60 ± 7 | - |
| 40 ميكرومتر (الرابطة) | 67 ± 11 | 72 ± 5 | 110 ± 7 | |
| القطب فيجيتال | - | 75 ± 3 | - | |
| n = 3 أجنة (5 المسافات البادئة في كل منهما) لكل شرط | ||||
الجدول 1: توزيع التوتر الزمانية في سطح الخلية صفار البيض أثناء ابيبولي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا نظهر أن خصائص المواد وبعض معلمات النشاط الحيوي للخلية صفار الزرد أثناء ابيبولي يمكن بسهولة تقدير قبل ميكرورهيولوجي فؤاد وجسيمات نانوية.
في حين قد استخدمت فؤاد لاسترداد السمات انسيابية للخلايا والأنسجة في الظروف الفسيولوجية4،5،،من2528، هنا علينا وضع بروتوكول لتطبيق فؤاد على تنمية سليمة الأجنة التي استخدمنا اختبار سطح الخلية صفار الجنين الزرد أثناء ابيبولي.
لدينا قياسات فؤاد، تم تأمين التوجه للأجنة بمقدار النصف بتضمينها في [اغروس] انصهار منخفضة. حتى الآن، لم يؤثر التضمين [اغروس] قياسات فؤاد. صلابة [اغروس] تم قياسه بواسطة السبر سطحه مع طرف كروي. وجدنا معامل التحويل الشباب (ﻫ) 0.2 4.2 السلطة الفلسطينية لهذا جل باحتواء منحنيات المسافة البادئة القوة مع هيرتز الاتصال بنموذج للمجال التحريك إلى مستوى أدنى مستو هيئة مرنة. ونظرا لأن ه 3ز'، كان [اغروس] 50-fold أكثر ليونة من قشرة خلية صفار البيض (الشكل 2D). ولذلك، نظراً لقلة سمك وصلابة منخفضة جداً القياسات فؤاد سجلت فوق الجنين يبدو موثوق بها للغاية.
من المهم ملاحظة أن استرداد القيم المطلقة للتوتر القشرية من البيانات فؤاد يتطلب الحذر الشديد في فيما يتعلق بتركيب نموذج الميكانيكية. في حالة الخلية صفار الزرد، بتشكيلة فريدة من نوعها مع طبقة هيولى الغنية microtubules خارجي تشمل كتلة صفار عالية لزوجة، يمكننا التحايل على هذه المشكلة تستخدم نموذجا بالون السائل يتكون من قشرة مرنة إحاطة سائل لزج. هذا النموذج قد استخدمت سابقا لتقدير التوتر القشرية leucocytes مع ميكروبيبيتي تطلع28، والسلف كروية خلايا من أجنة الزرد جاسترولاتينج بادئة مع نصائح فؤاد كروية4، وخلايا هيلا مع فؤاد استخدام مثبتة كانتيليفيرس22.
ونحن قدر التوتر القشرية الخلية صفار المسافات البادئة سطحه مع تلميح كروية صغيرة متاحة تجارياً. هذا التحقيق الصغيرة سمح لنا بمباشرة قياس الاختلافات الإقليمية في التوتر القشرية. كما هو موضح أعلاه، تم تفسير البيانات القوة--المسافة البادئة من حيث نموذج السائل-بالون الحد أدنى (مكافئ. 2). تسجيل منحنيات القوة على السطح من المواد الهلامية وزيادة الخلايا مع تلميح كروية مع البادئة كقانون سلطة مع إس 3/2. وفي المقابل، نجد علاقة قوة النسبية-المسافة بادئة مجهزة جيدا بمكافئ. 2 (الشكل 2). اعتماد تيج قليلاً على سرعة ناتئ وانخفاض ز''/ز' نسبة (الشكل 2D) يشير إلى أن ميكانيكا اللحاء ويهيمن على سلوك مطاطا.
تم سبر ميكانيكا صفار البيض بشكل مستقل مع ريولوجيا يمثل. زيادة خطية من MSD ولاحظ يعكس بوضوح سلوك لزج نقية. تجدر الإشارة إلى أن لزوجة حلول البوليمر يعتمد على حجم المجس31. ولذلك، قيمة اللزوجة صفار قمنا بقياس مع قيق 100 نانومتر في دائرة نصف قطرها يمكن أن تختلف إلى حد ما عن الجزيئية (مثلاً، فلوريس depolarization) أو قياسات العيانية. أخذت معا، هذه النتائج توفر دعما قويا لمدى ملاءمة النموذج السائل-بالون ومتانة قياسات اللزوجة القشرية التوتر وصفار البيض.
ونحن السبب في أن هذا النهج يمكن أن تمتد بسهولة إلى قياس ميكانيكا بلاستوديرم في الأجنة نفسها أو إلى النقاط الزمنية الإنمائية الأخرى في الزرد، وفي نهاية المطاف، إلى الكائنات الأخرى. هذا التقريب فقط يعتمد على هندسة إجراءات متصاعدة المناسبة (انظر المرجع32) تسهيل وصول فؤاد يسبر إلى الأماكن الصحيحة في الوقت المناسب. لا يزال، ينبغي مراعاة حركة مستمرة لمعظم الخلايا والأنسجة من خلال التنمية في أي تطبيق نماذج إنمائية أخرى. سوف تجعل الحركات خلية تطبيق هذه الأساليب تحديا أكبر بكثير.
وفي بعض الحالات، فؤاد في فيفو ستكون قابلة للتطبيق في حالة إمكانية الوصول إلى مشاكل لا يمكن التغلب عليها. في كل من البالغين والأجنة النامية، خلايا قابلة للوصول إلى حد كبير. وبالتالي، لاختبار الخصائص الفيزيائية-الحيوية في الموقع، هو حتمية استخدام أساليب لا تتطلب مباشرة الاتصال. نانوحبيبات تتبع ميكرورهيولوجي يفي بهذه المتطلبات6. يستند هذا الأسلوب تحليل عالية الدقة المكانية والزمانية لعمليات النزوح براونية الجزيئات الفردية. الخصائص المحلية ذبابة من سائل لزج مطاطي الذي يحيط بهذه الجسيمات النانوية هو انعكاس مباشر لمدى والاعتماد على الفارق الزمني من على مسدس. هذا النهج تم تطبيقه بالفعل إلى تطوير الكائنات الحية، وساعد على تحديد الحرف عالية اللزوجة السيتوبلازم الجنين ايليجانس جيم- 30. نحن كشفت أن صفار الزرد عرض خصائص أي ما يعادل مع الأجنة C. ايليجانس ، على الرغم من أن لها لزوجة اثنان أوامر من حجم أقل. قد أبلغ مؤخرا اعتماد الزمن خطي من MSD مع قيم مماثلة للزوجة صفار البيض بالصفار الزرد في المورفولوجية33.
على الرغم من أننا عدم استكشاف هذه الإمكانية أنفسنا، جسيمات نانوية غير المصقول والمغلفة حقن مؤخرا استخدمت كأهداف لملاقط بصرية في الزرد اليرقات34. ميكرومانيبوليشن عدم الغازية داخل كل كائن قد يعطي رؤى ليس فقط مباشرة إلى تفاعلات الخلية ولكن في الخواص الميكانيكية وأنشطة لا يمكن الوصول إليها باستخدام النهج القائمة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب يعلن لا تضارب المصالح المالية أو غيرها تضارب في المصالح.
Acknowledgments
ونحن نشكر عمايرة هيرنانديز-فيغا، وفيليب ألكسندر بويي للمشاركة في إعداد الأساس لهذه البروتوكولات. ونشكر أيضا "منصة التصوير الجزيئي" من إيبمب-ثنائي الفينيل متعدد الكلور، واستبان كزافييه وأعضاء المختبر للدعم المستمر. وأيد "البرنامج الموحد مجموعات" محافظة كاتالونيا والإدارة و "تدعيم المنح المقدمة" من وزارة الاقتصاد والقدرة على المنافسة في إسبانيا للتطريز و DN هذا العمل.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Inverted optical microscope | Nikon | TE2000 | Visualization of the sample and AFM cantilever |
| Atomic force microscope (AFM) | Custom made | - | Any commercialized AFM could be employed |
| Inverted Confocal microscope | Zeiss | LSM780 | Nanorheology data collection |
| Agarose D1 Low EEO | Conda | 8016.00 | Casting embryos |
| Ultrapure LMP Agarose (low melting) | Invitrogen | 16520-100 | Securing embryos |
| Zebrafish Microinjection and Transplantation Molds | World Precision Instruments | Z-MOLDS | Casting embryos. Custom made with the original dimensions can also be employed |
| Dumont 5 Forceps | FST | 11251-20 | 1.5 mm diameter |
| Si3N4 cantilever | Novascan | PT.GS | Measuring the embryo by AFM. Spherical tip: 4.5 µm diameter and k=0.01 N/m |
| Fluorescent nanoparticles | Life Technologies | FluoSpheres F8811, | For tracking nanorheology |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | P-2000 | Fabricating tailored microneedles |
| Borosilicate capillary glass | Warner Instruments | G100TF-4 | Fabricating tailored microneedles |
| Micromanipulator | Narishige | MN-153 | Manipulating the micropipette |
| Microinjector | Eppendorf | FemtoJet Express | Controlling injection time and pressure |
| Stereomicroscope | Leica | DFC365FX | Visualization of the embryos during injection |
| Analysis Software | MathWorks | Matlab | Analyzing AFM and particle tracking data |
| Zebrafish | AB and TL wild type | - | Strains employed for embryo collection |
| Glass Bottom Plates | Mat Tek | P35G-0.170-14-C | Mounting embryos for nanorheology data collection |
| Stage micrometer | FST | 29025-02 | Measuring injection volume |
References
- Hernandez-Vega, A., et al. Polarized cortical tension drives zebrafish epiboly movements. EMBO J. 36, 25-41 (2017).
- Brodland, G. W., et al. Video force microscopy reveals the mechanics of ventral furrow invagination in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 22111-22116 (2010).
- Grill, S. W. Growing up is stressful: biophysical laws of morphogenesis. Curr Opin Genet Dev. 21, 647-652 (2011).
- Krieg, M., et al. Tensile forces govern germ-layer organization in zebrafish. Nat Cell Biol. 10, 429-436 (2008).
- Koser, D. E., et al. Mechanosensing is critical for axon growth in the developing brain. Nat Neurosci. 19, 1592-1598 (2016).
- Wirtz, D. Particle-tracking microrheology of living cells: principles and applications. Annu Rev Biophys. 38, 301-326 (2009).
- de Pablo, P. J., Carrión-Vázquez, M. Imaging Biological Samples with Atomic Force Microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 2014, 167-177 (2014).
- Roca-Cusachs, P., et al. Rheology of passive and adhesion-activated neutrophils probed by atomic force microscopy. Biophys J. 91, 3508-3518 (2006).
- Evans, E., Yeung, A. Apparent viscosity and cortical tension of blood granulocytes determined by micropipet aspiration. Biophys J. 56, 151-160 (1989).
- Fabry, B., et al. Time scale and other invariants of integrative mechanical behavior in living cells. Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys. 68, 041914 (2003).
- Kashef, J., Franz, C. M. Quantitative methods for analyzing cell-cell adhesion in development. Dev Biol. 401, 165-174 (2015).
- Chevalier, N. R., et al. Measuring the micromechanical properties of embryonic tissues. Methods. 94, 120-128 (2016).
- Reichlin, T., et al. Investigating native coronary artery endothelium in situ and in cell culture by scanning force microscopy. J Struct Biol. 152, 52-63 (2005).
- Rho, J. Y., Tsui, T. Y., Pharr, G. M. Elastic properties of osteon and trabecular bone measured by nanoindentation. J Biomech. 31, 21 (1998).
- Grant, C. A., et al. Surface characterisation and biomechanical analysis of the sclera by atomic force microscopy. J Mech Behav Biomed Mat. 4, 535-540 (2011).
- Efremov, Y. M., et al. Atomic force microscopy of living and fixed Xenopus laevis embryos. Micron. 42, 840-852 (2011).
- Henkels, J., et al. Spatiotemporal Mechanical Variation Reveals Critical Role for Rho Kinase During Primitive Streak Morphogenesis. Ann Biomed Eng. 41, 421-432 (2013).
- Solnica-Krezel, L. Gastrulation in zebrafish -- all just about adhesion? Curr Opin Genet Dev. 16, 433-441 (2006).
- Kimmel, C. B., et al.
- Rohde, L. A., Heisenberg, C. P. Zebrafish gastrulation: cell movements, signals, and mechanisms. Int Rev Cytol. 261, 159-192 (2007).
- Campinho, P., et al. Tension-oriented cell divisions limit anisotropic tissue tension in epithelial spreading during zebrafish epiboly. Nat Cell Biol. 15, 1405-1414 (2013).
- Fischer-Friedrich, E., et al. Quantification of surface tension and internal pressure generated by single mitotic cells. Sci Rep. 4, 6213 (2014).
- Moeendarbary, E., Harris, A. R. Cell mechanics: principles, practices, and prospects. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 6, 371-388 (2014).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. Eugene, OR. (2000).
- Alcaraz, J., et al. Microrheology of human lung epithelial cells measured by atomic force microscopy. Biophys J. 84, 2071-2079 (2003).
- Jorba, I., et al. Probing Micromechanical Properties of the Extracellular Matrix of Soft Tissues by Atomic Force Microscopy. J Cell Physiol. 232, 19-26 (2017).
- Hutter, J. L., Bechhoefer, J. Calibration of atomic-force microscope tips. Review of Scientific Instruments. 64, 1868-1873 (1993).
- Lomakina, E. B., et al. Rheological analysis and measurement of neutrophil indentation. Biophys J. 87, 4246-4258 (2004).
- Alcaraz, J., et al. Correction of Microrheological Measurements of Soft Samples with Atomic Force Microscopy for the Hydrodynamic Drag on the Cantilever. Langmuir. 18, 716-721 (2002).
- Daniels, B. R., Masi, B. C., Wirtz, D. Probing single-cell micromechanics in vivo: the microrheology of C. elegans developing embryos. Biophys J. 90, 4712-4719 (2006).
- Kalwarczyk, T., et al. Comparative analysis of viscosity of complex liquids and cytoplasm of mammalian cells at the nanoscale. Nano Lett. 11, 2157-2163 (2011).
- Soroldoni, D., et al. Genetic oscillations. A Doppler effect in embryonic pattern formation. Science. 345, 222-225 (2014).
- He, B., et al. Apical constriction drives tissue-scale hydrodynamic flow to mediate cell elongation. Nature. 508, 392-396 (2014).
- Johansen, P. L., et al. Optical micromanipulation of nanoparticles and cells inside living zebrafish. Nat Commun. 7, 10974 (2016).
