Summary
물성 및 비보에 긴장 매개 변수 측정 도구의 부족 방지 개발 하는 동안 그들의 역할을 확인 합니다. 우리는 원자 힘 현미경 (AFM) 및 나노-추적 epiboly 동안 그대로 zebrafish 태아 노른자위 셀에 기계적 기능 척도를 고용. 이 메서드는 안정적이 고 광범위 하 게 적용 관입 개입을 피하.
Abstract
Spatio 시간적 조직 조직 진화의 직접적인 요인 elucidating 연구 개발의 주요 목적 중 하나입니다. 다양 한 제안 다른 발달 및 전체적 프로세스에서 spatiotemporal 조직의 조직과 세포의 기계적 특성의 이해에 중요 한 기여 되었다고 주장 한다. 그러나, 소재 속성 및 비보에긴장 매개 변수 측정을 안정적이 고 접근 가능한 도구의 부족으로이 가설을 검증 어려운 되었습니다. 여기 우리는 원자 힘 현미경 (AFM) 및 입자 epiboly 동안 그대로 zebrafish 태아 노른자위 셀의 기계적 특성을 측정 하는 것을 목적으로 추적 하는 방법 제시. Epiboly는 그의 연구는 태아의 투명도 의해 촉진 된 초기 보존된 개발 프로세스입니다. 이 메서드는 구현 하기 간단 하 고 신뢰할 수 있는, 널리 적용 이후 그들은 조직 역학에 영향을 미칠 수 있는 방해 개입을 극복. 간단한 전략 표본, AFM, 기록과 나노 주사의 장착 및 추적에 대 한 적용 했다. 이 접근에 게 이러한 방법을 쉽게 적응할 수 있는 다른 발달 시간 또는 유기 체.
Introduction
전체적 프로세스의 biomechanical 제어 기본 원리는 크게 정의 되지 않습니다. Biomechanical 연구 분자 및 세포 수준에서 상당한 기세, 수집 하는 동안 biomechanical 매개 변수는 조직/유기 체 수준에서의 탐사 초기 단계에 있다. 유체역학 회귀1 또는 비디오 강제로 현미경2 레이저 미세3, 또는 덜 침입적 인 원자 힘 현미경 (AFM) 천연된 셀4 의 능동 및 수동 세력을 구별 하는 연구를 허용 또는 vivo에서 5 또는 나노 microrheology6 조직의 기계적 특성 및 응답의 기대를 수 있습니다.
AFM는 표면 거칠기 및 시험된 표면7접촉 시 캔틸레버 팁의 편향에서 준수 해결 원자 고해상도 3 차원 지형 기술입니다. AFM을 사용 하는 다른 방법론 마찰, 접착 힘, 및 다양 한 재료의 점 탄성 특성 측정을 포함 하 여 표면 특성을 조사 하기 위해 개발 되었습니다. 최근, AFM은 생물 학적 샘플의 기계적 특성에 대 한 정보를 검색 하는 강력한 도구로 떠오르고 있다. 특히, AFM 비 접촉 추출할 수 복잡 한 전단 계수 단일 셀에서 알려진된 벤딩 일정8의 캔틸레버에 연결 된 마이크로 팁과 진동 들여쓰기를 적용 하 여. 우리 결과 세력을 유추할 수 있습니다. 그러나, AFM은 고유 하 고 다른 방법론 개별 셀에서 데이터를 유 변 학적 및 기계적 특성을 추출 허용 (예: Micropipette 포부9, 자석 cytometry (MTC)10, 왜곡 또는 단축 인장 테스트11).
그러나, 복잡 한 전체적 프로세스에 이러한 새로운 방법론의 응용 프로그램은 간단 합니다. 미 발달 직물의 기계적 특성을 결정할 때 직면 하는 주요 과제는 작은 m m (µ m), 소프트 (10에2 -104 Pa 범위) 및 소재12의 탄성 (시간에 따른 현상 주는 상승) 자연. 그것은 따라서 배아와 개발 생물의 특정 경우에 기계적 성질 (강성, 점도, 접착)의 결정에 대 한 고용 하는 방법에 적응 하는 것이 중요. 두 가지 중요 한 문제는 고려해 분석 유 변 학적 접근 연구 개발 필요가: 간섭 방해를 방지 하 고 쉽게 액세스를 제공. 이 시나리오에서는 micropipette 포부, MTC와 인장 테스트 한계 전시. 첫 번째 경우, 셀 앓고 높은 변형의 생리 적 및 기계적 특성9변경할 수 있습니다. 두 번째의 경우, 단단히 준수 적용 스트레스 로컬로 골격 변형 되도록 기판에 실험 조직 필요 수 또한 효과 세포의 활성화 상태에서 그리고, 따라서, 그들의 기계적 기능10 소개 . 마지막으로, 단축 인장 접근 유기 체 및 접근성11개발의 형상에 의해 제한 됩니다.
AFM는 어떤 성가신 샘플 준비 없이 그들의 자연 환경에서 직접 수 생물 샘플의 연구 개발 프로세스의 연구에 대 한 더 나은 적합 것으로 보인다. 또한, 미 발달 직물의 분리는 일반적으로 어려운, AFM 프로브의 감소 된 크기 중간 (수성 또는 비 수성), 샘플 온도, 또는 화학 제품의 종류의 선택에서 제한 된 다양성의 높은 학위를 제공 샘플의 구성입니다. AFM는 큰 도메인에 적용 하 여 비늘 시간 충분히 다양 하 고 발달 단계로 또는 생리 적 조건에 조직의 소재 속성을 검색 하 고용 되었습니다. 전체 기본 조직 지형 관점에서 그리고 sclera, 같은 일부 경우에 동맥13 또는 뼈14 연구와 같은 기계적 성질도 검색된15있다. 지 세는 Xenopus16morphogenesis 동안 예를 들어, 셀 재배치의 시각화를 허용 하는 라이브 배아에서 탐구 했다. 마지막으로, 포괄적인 샘플 준비 프로토콜 다른 발달 과정 동안 기계 매개 변수를 확인 하기 위해 개발 되었습니다. 나노 지도 병아리 배아 소화 관11;에 대 한 네이티브 떼어낸된 조직 섹션에 생성 된 접착성 및 기계적 속성 개별 ectoderm, mesoderm, 및 endoderm 조상 셀 gastrulating zebrafish 태아4;에서 격리에 대 한 검색 강성 측정 epiblast 및 조류 배아17; explants에 원시 조 흔에 대 한 수행 그리고 강성 그라디언트 Xenopus5의 배아 뇌에 직접 정의 된의 뚜렷한 패턴.
배아 발달을 탐험에 대 한 AFM을 적용 하기 위한 상당한 질적 도약 접근 하는 간단한 접근 전체적 프로세스에서 올 수 있습니다. 제 브라 epiboly는 다른 조직을 직접 몇 시간에는 blastoderm의 확장을 제한 된 구체의 공간에 조정 하는 필수 및 보존 이벤트입니다. 제 브라 epiboly (구형 단계)의 발병에 표면 층의 세포, 무기력 레이어 (EVL), blastomeres 대규모 노른자위 syncytial 셀에 배아의 동물 극에 중심의 반 둥근 모자를 다루고 있습니다. Epiboly는 EVL의 외피 식물 구 확장 blastoderm, 및 노른자위의 주위 syncytial 노른자위 셀 (E-YSL)의 외부 층의 깊은 세포 (DCs)으로 구성 됩니다. Epiboly는 EVL 및 식물성 극18,,1920에 Dc의 폐쇄와 함께 끝납니다. 어떻게 그리고 어디 힘 epiboly 동안 생성 되 고 아직1,21을 명확 되지 않습니다 어떻게 그들은 세계적으로 결합 하는.
여기 우리가 자세히 AFM zebrafish 노른자위에서 epiboly 진행 하는 동안 수동 기계 조직 속성 vivo에서세포 유추 적용 하는 방법을 설명 합니다. 이렇게 하려면, 우리는 AFM 캔틸레버로 프로브에 연결 하는 작은 스피어 고용. 균일 하지 않은 노 른 자 세포 표면 및 시간이 지남에 정지와 그라디언트 및 그들의 역학을 공부 정확한 지역 정보를 검색할 수 있습니다. 대체 AFM 등 쐐기 캔틸레버22를 사용 하 여 접근, 하지 렌더링 로컬 데이터를 충분히 정확한 것입니다. 캔틸레버 끝에 샘플 크기 보다 큰 쐐기 하기 매우 조심 조작 기술이 필요 합니다, 쐐기 기법은 배아를 검색 하는 데 적합 (~ 2-fold 캔틸레버의 길이 보다 큰) 역학.
모델링 및 질적, 양적 방법으로 셀의 점 탄성 특성 그들의 역학에 대 한 향상 된 이해에 대 한 수 있습니다. Biomechanical 관점에서 epiboly, 그리고 대뇌 피 질의 긴장 측정 및 역학, AFM;에 의해 추출 될 수 있다 수요 지식 뿐 아니라 이해 하는 것이 필수적입니다. 따라서 조직의 생물 속성에 대 한 내용은 필요가 있다. 이 정보를 추출 하 셀 유동성 기법의 다양 한 다른 생리 적인 조건23에서 다른 세포 유형 성격을 나타내기 위하여 수 년에 걸쳐 개발 되었다. 그들은 AFM, MTC, 및 광학 핀셋 (OT)이 포함 됩니다. 그러나 이러한 방법에는,, 입증 되었습니다 배아 또는 장기의 규모에서 생체 분석에 대 한 부적 절 한. 대신, 우리가 성공적으로 나노 추적 microrheology6 유 변 학적 측정 비보에 적응 했습니다. 이 기술은 개별 입자의 브라운 변위를 분석 하 고 로컬 micromechanical 속성을 유추.
함께 AFM와 나노 microrheology epiboly 동안 대뇌 피 질의 정지와 역학의 정 및 노른자위의 내부 기계적 특성을 수 있습니다. 이 정보는 완전히 있는 이방성 스트레스는 EVL의 변형 응답에 있는 다름 결과로 개발 하 고 전자-YSL 피 등방성 actomyosin 수축 노른자위 세포질 레이어 (YCL)은 필수적인 모델 지지 EVL와 epiboly 진행1의 방향 순 이동.
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Protocol
아래 설명 하는 모든 프로토콜 단계 우리 기관의 동물 관리 지침을 따르십시오.
1. 제 브라 문화
- 번 식 하 고 성인 zebrafish 표준 조건 하에서 유지 합니다.
참고: AB와 TL 야생 타입 배아가이 연구를 위해 사용 되었다. - 배아를 수집 하 고 E3 배아 중간2428.5 ° C에서 그들을 성장. 앞에서 설명한19로 형태에 따라 그들을 무대.
2. 원자 힘 현미경 검사 법
- 수동으로 dechorionate zebrafish 태아 (개별 관심에 따라 다른 연령대)의 무대. ( 재료의 표참조) 두 개의 얇고 날카로운 집게와 chorions를 제거 합니다.
- Chorion 한 집게를 사용 하 여 그립 고 눈물에 다른 집게와. 그런 다음, 눈물의 반대 지역에는 chorion를 들고, 개방을 통해 부드럽게 배아 밀어.
- 8 X 50 X 사이 확대의 조정 가능한 범위 해 stereomicroscope에서 dechorionation를 수행 합니다.
- AFM에 대 한 배아를 탑재
- 배아 중간에 2 %agarose 솔루션을 준비 하 고이 35 mm 페 트리 접시를 채우십시오. 공고히 하자. Agarose 침대에서 얇은 집게와 1.5 m m 직경 (태아 크기의 두 배)의 고 약 350 µ m 깊이 (반 태아 크기)의 작은 구멍을 확인 합니다.
- Agarose 계층에서 만든 넘나들며에 배아를 놓고 그들은 0.5% 낮은 솔루션 주위 확산에 의해 장소에서 녹는 agarose 배아 매체에 보장 합니다. 그냥 구멍에 그들을 확보 하 여 배아를 중심으로이 솔루션을 붓는 다.
- 전에 낮은 융 점 agarose는 실 온에서 고형화, AFM에 의해 찾는 것에 관심 영역 것입니다 얼굴을 위쪽으로 (그림 1A) 그런 방법으로 배아를 회전 합니다.
- AFM에 의해 태아 검사
- 거꾸로 원자 힘 현미경 20 X 목표를 채용 하는 페 트리 접시에 배아 이미지를 찾아서 ( 재료의 표25참조) 상 온 (23-24 ° C).
참고: 배아는 유지 배아 중간에 몰입 하 고 agarose 침대에 부착 된. - 0.01 N/m. 5 µ m 및 1 Hz의 주파수에 외팔보 진동의 피크-피크 진폭을 설정의 공칭 스프링 상수와 캔틸레버에 연결 된 지름에서 4.5 µ m의 구형 폴리스 티 렌 구슬 채용 casted 배아의 노 른 자 세포 표면 프로브.
- 데이터 평균에 대 한 루틴으로 다른 위치에 및 여러 배아에서 테스트할 각 지역에 대 한 데이터를 수집 합니다.
참고: 좋은 시작 포인트는 5 위치에에서 위치한 중간 10 µ m x 10 µ m 사각형의 모서리에 AFM 현미경의 캔틸레버 위치 XY 압 전 액추에이터를 제어 하 여 이다. 영상 및 데이터 수집 태아 당 약 20 분 했다. 배아 노른자위 세포 표면의 다른 지역에 데이터를 기록, 예를 들어, 식물성 극 또는 EVL 셀 여백 (그림 1B 및 1 C), 거의 다른 지구만 수행할 수 있습니다 고유한 표본 다르게 지향을 채용 하 여.
- 거꾸로 원자 힘 현미경 20 X 목표를 채용 하는 페 트리 접시에 배아 이미지를 찾아서 ( 재료의 표25참조) 상 온 (23-24 ° C).
- 힘을 계산
- 압 전 액츄에이터 및 사분면 포토 다이오드를 사용 하 여 그것의 편향 (d)에 광학 레버 메서드에서 현미경 제어 소프트웨어와 결합 하는 스트레인 게이지 센서와 AFM 캔틸레버 (z)의 수직 변위를 측정 ( 재료의 표 참조 25)입니다.
- 유리 coverslip 맨 영역에서 수집 된 데이터 로부터 얻은 d-z 곡선의 기울기를 사용 하 여 포토 다이오드 신호와 외팔보 편향 (d) 사이의 상관 관계를 보정 하.
참고: 측정 된 수직 변위 외팔보 편향 이며 경사는 광학 레버26의 편향 감도 나타냅니다입니다. - 외팔보 스프링 상수 (k) 열 요동에서 앞에서 설명한27추론.
- 샘플 (h)의 들여쓰기로 계산:
h = (z-zc) -(d 조-d에서) (1)
참고: 여기 zc 접점의 위치 이며 d에서 광다이오드의 오프셋입니다. - 로 캔틸레버에 힘 (F)을 계산:
F = k · d (2)
- 점성 액체를 포함 하는 대뇌 피 질의 긴장 Tc 의 탄성 층의 구성 된 액체 풍선 모델 피 긴장을 계산 합니다. 이 모델에서 (태아의 크기에)에 비해 작은 들여쓰기에 힘 증가 비례로4,28 :
F = 4π Tc[(Rb / Re) + 1)] h (3)
참고: 여기는 구슬의 반지름 Rb Re 이며 태아의 반지름. Zebrafish 태아, 태아 (400 µ m)의 반지름은 두 배나 구슬 (2.25 µ m)의 그것 보다 더 큰으로이 방정식을 접근 수 있습니다.
F = 4π Tc h (4)- 계산 하는 긴장 힘-들여쓰기 (F-h) 다섯 가지에 대 한 각 배아 노른자위 셀 영역에 곡선 측정 지점.
- 각 F-h 커브 피팅 비 선형 최소 제곱법에 의해 Tc 를 계산 합니다. 위한 통계 분석, 대뇌 피 질의 긴장 Tc 계산 다른 F-h 곡선에서에서 평균 한다.
- 낮은 진폭을 적용 하 여 피 질의 점 탄성 특성 (유동성)을 측정 (100 nm) AFM 동안 여 진동25다른 주파수 정현파 파도의 구성.
- 로 강제 들여쓰기 곡선에서 주파수 영역에서 효과적인 복잡 한 계수 g*(ƒ) 계산:
g * (f) = [F(f) / h(f)]- ifb (5)
여기 내가 허수 단위 이며 F(f)와 h(f)는 힘과 들여쓰기의 주파수 (f) 스펙트럼. b 는 표면에 적용 하는 진동에서 추출 하는 캔틸레버에 점성 드래그에 대 한 보정 이다. - 별도 g*(ƒ) 으로 실수와 허수 부분으로:
g * (Ƒ) = g' (f) + ig' (f) (6)
전각 > g'(f)는 탄성 계수와 탄성 에너지의 측정값 저장 및 진동의 주기 당 복구. g' (f) 방탕된 에너지 차지 점성 계수 이다. - 솔리드 형의 인덱스를 제공 하는 손실 탄젠트를 계산 (< 1) 또는 액체 같은 (> 1), 물자의 행동으로:
g' (f) / g' (f) (7)
참고:이 유형의 측정 수는 매개 변수를 추출 얼마나 점성을 나타내는 이며 어떻게 탄성 시험된 자료. B 는 약간 표면에 캔틸레버의 끝의 거리에 따라, 비록 주어진 g의 매우 낮은 값 ´´는 노 른 자에 의해 전시 ( 2D 그림 아래 참조) 셀, b 에서 작은 변화 영향을 무시할 수 있다 측정29
- 로 강제 들여쓰기 곡선에서 주파수 영역에서 효과적인 복잡 한 계수 g*(ƒ) 계산:
3. 입자 추적 Microrheology
-
노 른 자 셀에 입자 microinjection 수행
- 맞춤형된 백신 수평 micropipette 끌어당기는 사람 및 모 세관 글라스 ( 재료의 표참조)를 사용 하 여 조작.
- 1.00 m m, 0.58 m m 내경 및 끌어당기는 설정을 사용 하 여 10 cm의 길이의 외부 직경 바늘 준비: 압력: 500; 열: 510; 풀: 65; 속도: 25; 시간: 50.
- 사용자 정의 만든된 금형 ( 재료의 표참조)를 사용 하는 배아 중간 침대에 똑바로 들여쓰기 레인 1 %agarose 만들어서 주입 페 트리 접시 접시를 준비 합니다.
- 금형의 밑면이 고 그들 액체 agarose 젤 위에 놓고 젤 경화는 일단 금형을 제거 합니다. 1.2 X 확대 해 stereomicroscope 아래 agarose에서 금형에 의해 홈에 배아를 플라스틱.
참고: 너비와 금형의 디자인 자체 정렬 배아를 사용 합니다.
- 금형의 밑면이 고 그들 액체 agarose 젤 위에 놓고 젤 경화는 일단 금형을 제거 합니다. 1.2 X 확대 해 stereomicroscope 아래 agarose에서 금형에 의해 홈에 배아를 플라스틱.
- 주입 하기 전에 거의 완전히 주입 (주입 후 그것을 제거할 때 바늘에 집착 표면 장력 방지 태아/chorion)를 촉진 하기 위하여 매체를 제거 합니다.
- Microinject 형광 나노 입자 (radius는 = 100 nm, 재료의 표참조) 배아 노른자위 셀 (그림 3A)의 식물에 물 (1:1, 000)에 희석.
- 정밀 micromanipulators와 micropipette 조정 하 고 시간과 압력 컨트롤 ( 재료의 표참조)는 자동 microinjector 구슬 주입. 10과 20 psi 사이 압력을 설정 합니다.
- 비드 솔루션을 주입 하기 전에 주사를 볼륨 보정 (0.5 nL) 작은 물방울 크기를 측정 하 여 함께 제공 되는 microinjector에 의해 1 x 0.01 m m 단계 마이크로미터 ( 재료의 표참조).
- 주사, 상 온에서 수행 되는 동안 배아를 시각화 해 stereomicroscope에 1.6 X 확대를 사용 합니다.
- 맞춤형된 백신 수평 micropipette 끌어당기는 사람 및 모 세관 글라스 ( 재료의 표참조)를 사용 하 여 조작.
-
노른자위의 점 탄성 행동 열 요동을 기록 하 여 평가
- Dechorionate에서 microinjected 배아 2.1 단계 및 0.5% 낮은 포인트 agarose 배아 중간 솔루션 30 ° c.에 녹는에 그들을 포함 이후에, 유리 하단 번호판 ( 재료의 표참조) 그들을 전송 하 고 오리엔트는 agarose는 여전히 액체 때는 coverslip 쪽으로 그들을 밀어.
참고:는 agarose는 실 온에서 고형화 한다 때 배아 준비가 될 몇 군데입니다. - Microinjection 후 거꾸로 confocal 현미경 2 h의 무대에 유리 하단 플레이트에 마운트 하는 배아를 놓습니다. 26 나노 입자의 이미지를 캡처 실내 온도 표준 상업 현미경 소프트웨어를 채용 하는 거꾸로 confocal 현미경에 63 X 목표 25 Hz의 샘플링 레이트에서 s (픽셀 크기 = 166 nm, 이미지 캡처 모든 40 ms).
- 입자의 중심의 위치를 계산 하 고 오픈 소스 ImageJ 소프트웨어 (그림 3B)의 TrackMate 플러그인과 함께 시간이 지남에 그들의 궤도 정의 합니다.
- 맞춤 소프트웨어6,30 로 각 입자의 2 차원 제곱 변위 (MSD) 계산.
< Δr2 (τ) > = < [x(t + τ)- x(t)]2 + [y(t + τ)- y(t)]2> (8)
참고: 여기 t 는 경과 시간 및 지연 시간입니다. 순수 점성 액체에는 MSD 스톡-아인슈타인 관계에 따라 점도 (ν)와 반대로 증가:
< Δr2 (τ) > = 4kB Tτ/ 6πνa, (9)
여기서 T 는 절대 온도입니다.
- Dechorionate에서 microinjected 배아 2.1 단계 및 0.5% 낮은 포인트 agarose 배아 중간 솔루션 30 ° c.에 녹는에 그들을 포함 이후에, 유리 하단 번호판 ( 재료의 표참조) 그들을 전송 하 고 오리엔트는 agarose는 여전히 액체 때는 coverslip 쪽으로 그들을 밀어.
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Representative Results
대뇌 피 질의 긴장 측정
각 측정 지점에 대 한 5 (F-z) 힘-변위 곡선 5 µ m의 피크-피크 진폭 1 Hz에서 캔틸레버 램프에 의해 AFM에 의해 취득 되었다 (속도 = 10 µ m/s)까지 ~ 2 µ m의 최대 들여쓰기. 이 이렇게 20 분 미만 복용 했다 고 했다 epiboly 진행에 의해 영향을 받지 않습니다. 각 실험 조건 적어도 5 배아에서 시험 되었다.
배아 노른자위 셀에 기록 하는 힘-변위 곡선 반대로 그에 해당 하는 소프트 주변 agarose, 전시 비례 선형 관계 (R2 > 0.999) (그림 2A). 우리는 F z 3 µ m/s와 30 µ m/s 커브와 캔틸레버의 속도에 대뇌 피 질의 긴장 Tc 의 잠재적인 의존을 삭제 하는 컨트롤의 추가 세트를 수행. Tc 단지 13% 증가 (p < 0.01, t-검정) 때 속도 3 µ m/s 10에서 감소 되었다 고 10에서 30 µ m/s로 증가 하는 때 중대 한 어떤 변화도 보여주지 않았다.
강제 들여쓰기 (F-h) 곡선 노른자위 셀에 10 µ m/s의 캔틸레버 속도로 기록 거의 선형이 고 액체 풍선 모델 (그림 2B)1장착 했다. 이이 음 쇠와 EVL 첨단 (전송된 빛 아래에서 식별 됨)를 기준으로 다른 위치에 다른 epiboly 단계에서 평균 표면 장력 (pN / µ m)의 절대값의 계산을 허용 (표 1).
외피의 유동성
(F-z) 힘-변위 곡선 (그림 2C)의 철회 및 들여쓰기의 차이점 배아 노른자위 셀 피 점 탄성 행동을 나타냅니다. 낮은 진폭 (100 nm) 여 진동 측정 (참조 위의 프로토콜) 노 른 자 세포 표면 및 탄성 및 점성 부품의 효과적인 복잡 한 계수 g*(ƒ)를 계산 하기 위해 정보를 제공.
Zebrafish 태아 노른자위 셀에서 피 유동 학 5 번 탄성 계수1보다 낮은 점성 계수와 고체 처럼 행동에 의해 지배 된다. 이 문제는 탄성에 대 한 의존, 주파수 (ANOVA, p = 0.123), 또는 점성 계수에 대 한 (ANOVA, p = 0.719) (그림 2D).
노른자위의 유동성
노른자위의 점성 방정식 (5) 나노 추적 ( 그림 4A-B참조)에서 얻은 MSD 데이터를 피팅 하 여 계산 했다. 노 른 자에 포함 된 형광 나노 입자의 열 요동의 MSD 시간 지연 τ, 뉴턴 액체의 동작과 일치에 대 한 비례 의존도 전시 한다. 노 른 자, 반대로 관련 있는 나노 입자의 대량 확산 계수의 효과적인 전단 점도 129 Mpa 이었다.
그림 1: 제 브라 노 른 자 세포의 AFM vivo에서. (A) 집합을 설명 하는 다이어그램 AFM에 의해 제 브라 노 른 자 셀 피 질을 고용. 다양 한 연령대의 Dechorionated 배아 중간 사용자 지정된 agarose 블록에서 만든 특정 방향으로 회전 하 고 낮은 융 점 agarose로 가장자리에 봉인 된 구멍에 삽입 했다. 노 른 자 세포는 외팔보 (빨간색)에 연결 된 구형 폴리스 티 렌 구슬 조사 했다. (B) 50 %epiboly 절반 agarose에 포함 된에서 배아 외팔보 (false 빨간색에서 색)와 식물성 극에 조사. (C) B, 그 동일한 배아 EVL 셀 여백에 가까운 지역에서 노른자위 셀에 조사. 바 규모 = 100 µ m (B와 C). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2입니다. Zebrafish 태아 노른자위 셀 대뇌 피 질의 긴장 그리고 유동성입니다. (A) 힘 [편향 (d)]-캔틸레버 끝에 접근 하 고 샘플 [agarose 표면 (제어) 파란색에서] 및 빨간색에서 노 른 자 세포 표면 접촉으로 변위 (z) 곡선 대표 태아에 대 한 취득. (B) 강제 들여쓰기 (F-h) 곡선 (n = 3 배아, 배아 서로 10 µ m의 거리에서 당 3 측정. 각 측정 5 곡선의 의미를 나타냅니다) (참조1)에서 액체 풍선 모델 맞지. 배아 노른자위 세포 표면과 접촉 시 편향에 선형 증가 note 검은 점선 피팅 모델 (있는 대뇌 피 질의 긴장 유추)을 보여 줍니다. (C) 근사 (레드)와 대표 태아에 대 한 철회 (보라색) 힘-변위 곡선. 곡선된 빨간색과 보라색 화살표는 데이터 수집의 임시 정권 가리킵니다. 양방향 화살표는 접근 및 축소 외피의 점 탄성 특성을 가리키는 편향 값의 차이 강조 표시 합니다. 노 른 자 셀 피 점 탄성 (D) (n = 5 배아). 효과적인 복잡 한 계수 (g *) ( 1)에서 AFM 측정 여 진동에서 추출. 빨간 기호 대표 탄성 계수 (g'), 파란색 기호 정의 점성 계수 (g″), 각각. 의미와 표준 오차 (SE) 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3입니다. 입자 추적 microrheology입니다. (A) 형광 나노 입자는 50 %epiboly zebrafish 태아의 노 른 자 셀에 주입. (B) 치환 (왼쪽) 노 른 자 내에서 무작위로 배포 개별 나노 입자에 대 한 추적 했다. 나노 (중심)의 전형적인 궤도의 시간 과정 포함 노 른 자 (2 예) 내 전시 임의 산책 점성 확산의 특성. 눈금 막대 = 100 µ m (A); 1 µ m (B, 왼쪽); 200 nm (B, 오른쪽). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4입니다. Zebrafish 태아 노른자위의 Microrheology입니다. 개별 나노 입자의 (A) MSDs (n = 99) 시간 지연 약 선형 의존을 전시. (B) 나노 입자의 표준 오류 MSDs와 노른자위의 점도 ± 의미. 앙상블 평균 나노 인구 전시 주로 점성 특성의 MSDs (평균-레드 라인 ± SE). 관계의 선형 슬로프는 나노 입자의 퍼지는 속성을 반영합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 긴장 (pN/m m) 평균 ± SE | Epiboly의 % | |||
| 40-50 | 60-70 | 80-90 | ||
| EVL 여백 거리 | 20 μ m (E-YSL) | - | 60 ± 7 | - |
| 40 μ m (YCL) | 67 ± 11 | 72 ± 5 | 110 ± 7 | |
| 식물성 극 | - | 75 ± 3 | - | |
| n = 각 조건에 대해 3 배아 (5 들여쓰기 각) | ||||
Epiboly 중 노 른 자 세포 표면에서 표 1: Spatio 시간적 긴장 배급.
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Discussion
여기 우리가 소재 속성 및 epiboly 동안 zebrafish 노른자위 셀의 일부 biomechanical 매개 변수 수 AFM 및 나노 입자 microrheology에 의해 쉽게 예상할 수 보여줍니다.
AFM 세포와 조직 생리 조건4,5,,2528의 유 변 학적 기능 검색 고용 되었다, 그러나 여기 우리는 AFM 그대로 개발에 적용 하기 위한 프로토콜 개발 우리 epiboly 동안 zebrafish 태아의 노 른 자 세포 표면을 테스트 하려면 고용 배아
우리의 AFM 측정에 대 한 배아의 방향은 낮은 녹는 agarose에서 그들을 포함 하는 절반에 의해 확보 되었다. 그러나, agarose 포함 미치지 않았다 AFM 측정. agarose의 강성은 구형 팁의 표면 조사에 의해 측정 되었다. 우리는 영의 탄성 계수 (E) 4.2 0.2 발견 Pa는 헤르츠와 강제 들여쓰기 커브 피팅 하 여이 젤에 대 한 문의 탄성 체의 평평한 표면 들여쓰기 구형 모델. 주어진 그 E 3g'는 agarose는 50-fold 노 른 자 셀 피 (그림 2D) 보다 부드럽고. 따라서, 제한 된 두께 및 매우 낮은 강성을 고려 하면 태아 위에 기록 된 AFM 측정 매우 신뢰할 수 있는 것 처럼.
그것은 대뇌 피 질의 긴장에 대 한 절대 값을 검색 하는 AFM 데이터에서 요구 하는 극단주의에 기계적 모델 피팅 관련 참고 해야 합니다. Zebrafish 노른자위 셀 외부 microtubules 풍부한 세포질 층이 높은 점성 노른자위 질량을 포함 된 그것의 독특한 구성으로 경우 우리는 탄성 피 바깥쪽의 구성 된 액체 풍선 모델 채용이 문제 회피를 점성 액체입니다. 이 모델은 이전에 사용 된 micropipette 포부28와 백혈구, afm HeLa 세포와 구형 AFM 팁4, 들여쓰기 gastrulating zebrafish 태아에서 구형 조상 세포의 외피 긴장을 추정 하 쐐기를 사용 하 여 캔틸레버22.
우리가 상용 작은 구형 팁 표면 들여쓰기 하 여 노 른 자 세포의 외피 긴장 추정. 이 작은 프로브를 사용 하 여 직접 측정 하는 대뇌 피 질의 긴장에 있는 지역 다름 수 있었습니다. 위에서 설명한 대로 최소한의 액체-풍선 모델 (식 2) 강제 들여쓰기 데이터 해석 했다. 힘 곡선 젤의 표면에 기록 하 고 구형 팁 셀 3/2 지 수와 함께 전원 법으로 들여쓰기 증가. 대조적으로, 우리는 아주 잘 eq. 2 (그림 2B) 장착 비례 힘-들여쓰기 관계를 발견. 캔틸레버 속도 및 낮은 g Tc 의 작은 의존 ' /g' 비율 (그림 2D) 나타냅니다 피 역학 탄성 행동에 의해 지배 된다.
노 른 자 역학 microparticle 유동성으로 하지 조사 독립적으로 했다. MSD 관찰의 선형 증가 명확 하 게 순수 점성 동작을 반영 합니다. 그것은 폴리머 솔루션의 점성 조사31의 크기에 따라 달라 집니다 지적 한다. 따라서, 우리가 100의 프로브 측정 른 점도의 값 반경에 nm 분자에서 다소 다를 수도 (예를 들어, 도발은 형광) 또는 거시적인 측정. 함께 찍은, 이러한 결과 액체 풍선 모델의 타당성 및 대뇌 피 질의 긴장 및 노른자위 점도 측정의 견고성에 강력한 지원을 제공 합니다.
우리 이유는이 이렇게 쉽게 확장할 수 blastoderm 역학 동일한 배아에는 제 브라의 다른 발달 시간 위치에 있고, 결국, 다른 유기 체를 측정 하는. 이 근사만 엔지니어링 (참조32참조) 적절 한 설치 절차에 따라 적절 한 시기에 적절 한 장소에 프로브 AFM의 액세스를 용이 하 게. 아직도, 대부분의 세포와 조직 개발 과정의 연속 동작 계정에 모든 응용 프로그램을 다른 개발 모델에서 취해야 한다. 셀 움직임 훨씬 더 도전적인 이러한 방법의 응용 프로그램을 만들 것입니다.
경우에 따라 vivo에서 AFM 것 접근성 문제는 극복 될 수 없는 경우. 모두 개발 배아에 성인, 셀 크게 액세스할 수 없습니다. 따라서, 제자리에서생물 속성 테스트는 하지 방법을 채택에 필수적 필요로 직접 문의. Microrheology 추적 나노6이러한 요구 사항을 충족. 이 기술은 개별 입자의 브라운 변위의 높은 공간과 시간 해상도 분석을 기반으로 합니다. 이러한 나노 입자를 둘러싸는 점 탄성 유체의 로컬 micromechanical 속성 범위의 직접적인 반영 이며 그들의 MSDs의 지연 시간-의존. 이 방법은 유기 체 개발에 이미 적용 된 고 선 충 C. 배아 세포질30의 높은 점성 특성을 결정 하는 데 도움이 있다. 그 점도 두 배나 낮은 우리 제 브라 노 른 자 C. 선 충 배아와 해당 속성을 표시 합니다 발견. 그 제 브라 노 른 노 른 점도의 유사한 값으로 MSD의 선형 시간 의존 초파리33에서 최근에 보고 되었습니다.
비록 우리가 않았다 하지 탐험이 가능성 자신, 주입된 코팅과 코팅 된 나노 입자는 최근 고용 광학 족집게의 대상으로 zebrafish 애벌레34에서. 전체 유기 체 안에 비 micromanipulation 세포 상호 작용 하지만 기계적 성질 및 기존 방법을 사용 하 여 액세스할 수 없는 활동으로 그냥 직접 통찰력을 줄 수 있습니다.
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Disclosures
저자 아무 경쟁 금융 관심사 또는 다른 충돌을 선언합니다.
Acknowledgments
우리가 이러한 프로토콜에 대 한 기준 설정에 대 한 Amayra 에르난데스-베가 필립 알렉산더 Pouille 감사 합니다. 우리는 또한 IBMB-PCB, 자비에 르 스 및 지속적인 지원에 대 한 실험실의 구성원에서 분자 이미징 플랫폼을 감사합니다. 통합 그룹 프로그램 Generalitat 드 Catalunya와 DGI EMB 및 DN에 경제와 스페인의 Competitivity Consolider 보조금의 지원이 작품.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Inverted optical microscope | Nikon | TE2000 | Visualization of the sample and AFM cantilever |
| Atomic force microscope (AFM) | Custom made | - | Any commercialized AFM could be employed |
| Inverted Confocal microscope | Zeiss | LSM780 | Nanorheology data collection |
| Agarose D1 Low EEO | Conda | 8016.00 | Casting embryos |
| Ultrapure LMP Agarose (low melting) | Invitrogen | 16520-100 | Securing embryos |
| Zebrafish Microinjection and Transplantation Molds | World Precision Instruments | Z-MOLDS | Casting embryos. Custom made with the original dimensions can also be employed |
| Dumont 5 Forceps | FST | 11251-20 | 1.5 mm diameter |
| Si3N4 cantilever | Novascan | PT.GS | Measuring the embryo by AFM. Spherical tip: 4.5 µm diameter and k=0.01 N/m |
| Fluorescent nanoparticles | Life Technologies | FluoSpheres F8811, | For tracking nanorheology |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | P-2000 | Fabricating tailored microneedles |
| Borosilicate capillary glass | Warner Instruments | G100TF-4 | Fabricating tailored microneedles |
| Micromanipulator | Narishige | MN-153 | Manipulating the micropipette |
| Microinjector | Eppendorf | FemtoJet Express | Controlling injection time and pressure |
| Stereomicroscope | Leica | DFC365FX | Visualization of the embryos during injection |
| Analysis Software | MathWorks | Matlab | Analyzing AFM and particle tracking data |
| Zebrafish | AB and TL wild type | - | Strains employed for embryo collection |
| Glass Bottom Plates | Mat Tek | P35G-0.170-14-C | Mounting embryos for nanorheology data collection |
| Stage micrometer | FST | 29025-02 | Measuring injection volume |
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