Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

AFM и микрореологию в ячейке желток Zebrafish эмбриона

Published: November 29, 2017 doi: 10.3791/56224
Automatic Translation
1, 2, 1, 2, 2, 1
1Instituto de Biología Molecular de Barcelona, Consejo Superior de Investigaciones Científicas, 2Institute for Bioengineering of Catalonia, Universitat de Barcelona and CIBER Enfermedades Respiratorias

Summary

Отсутствие инструментов для измерения свойств материала и растягивающих параметров в vivo предотвращает проверку их роли в процессе разработки. Мы использовали атомно-силовой микроскопии (АСМ) и наночастиц отслеживание для количественного определения механических функций на cell желток нетронутыми zebrafish эмбриона во время epiboly. Эти методы являются надежными и широко применимые, избегая интрузивных мер.

Abstract

Изучение факторов, которые направляют пространственно временной организации развиваются тканях является одной из основных целей в изучении развития. Различные предложения утверждают, что были важный вклад в понимание механических свойств клеток и тканей в их пространственно-временных Организации в различных процессах развития и морфогенетических. Однако из-за отсутствия надежных и доступных инструментов для измерения свойств материала и растягивающих параметров в естественных условиях, проверка эти гипотезы был сложной. Здесь мы представляем методы, используя атомно-силовой микроскопии (АСМ) и частица отслеживания с целью количественного определения механических свойств ячейки желток нетронутыми zebrafish эмбриона во время epiboly. Epiboly является ранних сохранившихся процесс развития которого исследование способствует прозрачности эмбриона. Эти методы являются простым в реализации, надежный и широко применимым, поскольку они преодолеть интрузивных мер, которые могут повлиять на ткани механика. Простая стратегия применяется для монтажа образцов, AFM записи и наночастиц инъекции и отслеживания. Этот подход делает эти методы легко адаптируется для других развития раз или организмов.

Introduction

Физические принципы, лежащие в основе биомеханических контроля морфогенетических процессов являются во многом неопределенными. Хотя биомеханических исследований на молекулярном и клеточном уровне собирают значительный импульс, исследованию биомеханических параметров на уровне ткани/организм находится в зачаточном состоянии. Гидродинамические регрессии1 или видео силу микроскопии2 позволяют исследователям различать активные и пассивные силы, во время лазерной микрохирургии3или менее навязчивым атомно-силовой микроскопии (АСМ) диссоциированных клетки4 или в естественных условиях 5 или наночастиц микрореологию6 позволяют в преддверии механических свойств ткани и ответы.

AFM является трехмерных топографических техника с высоким разрешением атомной, шероховатости поверхности и соблюдение от отклонения кантилевера советы после контакта поверхности исследуемого7. Различные методики, используя AFM были разработаны для изучения свойств поверхности, включая измерения трения, силы сцепления и вязкоупругие свойства различных материалов. Недавно AFM стала мощным инструментом для получения информации о механических свойствах биологических образцов. В частности AFM неинвазивно можно извлечь модуль сдвига комплекс из единичных клеток путем применения колебательных отступы с микро Совет придает консольные известных изгиб постоянной8. Это позволяет нам выводить результирующие силы. Тем не менее, АСМ не является уникальным и разные методики позволяют извлечение данных реологических и механические свойства из отдельных клеток (например, микропипеткой стремление9магнитные скручивания цитометрии (MTC)10, или Одноосное растяжение Тестирование11).

Тем не менее применение этих новых методологий для сложных морфогенетических процессов не проста. Основные проблемы при определении механических свойств эмбриональных тканей являются малые (мкм до мм), мягкие (в 102 - 10-4 ПА диапазона) и вязко упругие (приводящее к возникновению явлений время зависимых) характер материала12. Поэтому важно адаптировать методы, используемые для определения механических свойств (жесткость, вязкость, адгезия) в конкретном случае эмбрионы и развивающихся организмов. Два важных вопросов необходимо учитывать при анализе реологических подходы к изучению развития: чтобы избежать навязчивой вмешательства и обеспечить доступность. В этом случае микропипеткой аспирации, MTC и испытания на растяжение выставлять ограничения. В первом случае высокой деформации, что страдает ячейки могут изменить его физиологические и механические свойства9. Во втором случае необходимо твердо придерживаться экспериментальной ткани к подложке для обеспечения, что подчеркивает применяется деформироваться цитоскелета локально предусмотреть также воздействие на состояние активации клеток и, следовательно, их механические характеристики10 . Последний, Одноосное растяжение подходов ограничиваются геометрии развивающихся организмов и доступность11.

AFM, кажется, быть лучше подходят для изучения процессов развития, как изучение биологических образцов позволяет непосредственно в их естественной среде без каких-либо обременительных пробоподготовки. Кроме того как диссоциации эмбриональных тканей как правило, трудно, уменьшение размера АСМ зондов обеспечивает высокую степень универсальности без ограничения в выборе типа среднего (водный или безводным), температура образца или химического состав выборки. AFM достаточно универсален, чтобы применяться в больших доменах и времени весы и был нанят для извлечения свойств материала тканей в различные этапы развития или физиологических условиях. Всей родной тканей такие как артерий13 или кости14 были изучены с точки зрения топографических и в некоторых случаях, как склеры, механические свойства были также проверено15. Топография была также изучена в живой эмбрионов, позволяя визуализации, например, клетки перегруппировки в ходе морфогенеза в Xenopus16. Последние, всеобъемлющие образца подготовка протоколов были разработаны для определения механических параметров в ходе различных процессов развития. Наноиндентирование карты были созданы на родной незаписанных тканей секции для Чик эмбриональных пищеварительного тракта11; клей и механических свойств, извлекаемых для отдельных ячеек прародитель эктодермы, мезодермы и энтодермы изолированы от gastrulating zebrafish эмбриона4; жесткость измерений для Эпибласт и примитивных полоска на эксплантов от птичьего эмбрионов17; и собственный шаблон жесткость градиенты непосредственно определен в эмбриональных мозга Xenopus5.

Значительный качественный скачок для применения AFM для изучения развития эмбриона может исходить от приближается к простой доступной морфогенетических процессов. Данио рерио epiboly является важным и сохраняется событие, в котором различные ткани координировать в ограниченном пространстве сферических прямого расширения бластодермы в течение нескольких часов. В начале данио рерио epiboly (сферические этап) поверхностный слой клеток, обволакивающий слой (EVL), охватывает полусферических Кап бластомеров сосредоточены на животное полюс сидя на массивных желток-синцитиальный клеток эмбриона. Epiboly состоит из кортикального слоя растительного Уорд расширения EVL, глубокие клетки (DCs) бластодерма, и наружный слой клеток-синцитиальный желток (E-YSL) вокруг желтка. Epiboly концы с закрытием EVL и DCs на19,18,растительных полюса20. Как и где силы создаются во время epiboly, и как они соединены в глобальном масштабе не ясно еще1,21.

Здесь мы подробно описать как применять AFM заключить, что свойства пассивной механических тканей во время epiboly прогрессии в желтке данио рерио ячейки в естественных условиях. Сделать это, мы используем небольшие микросферы, придает AFM кантилеверы как зонды. Это позволяет поиск точных местной информации в пределах желток неоднородной поверхности клетки и учиться напряжённая градиентов и их динамику с течением времени. Альтернативные AFM подходы например, с использованием клин кантилеверы22, будет не визуализации локальных данных, который является достаточно точным. Клин технику, которая требует очень тщательного манипуляции навыки клеить клин больше, чем размер выборки в конце кантилевера, не хорошо подходит для исследования эмбриона (~ 2 раза больше, чем длина консольные) механика.

Моделирование и характеризующие вязкоупругие свойства клеток в качественном и количественном отношениях позволяет для более глубокого понимания их биомеханики. С биомеханической точки зрения важно, чтобы понять epiboly, а не только спрос знание корковых напряжения измерения и динамики, которые могут быть извлечены AFM; Таким образом, существует потребность в информации о биофизических свойствах ткани. Для получения этой информации, различных методов реологические свойства ячейки были разработаны с годами для характеристики различных типов клеток при различных физиологических условиях23. Они включают в себя AFM, MTC и Оптический пинцет (OT). Эти методы, однако, как было доказано недостаточно для анализа мезоскопических в масштабе эмбрионов или органов. В качестве альтернативы мы успешно адаптировались6 наночастиц отслеживания микрореологию в vivo реологических измерений. Этот метод анализирует броуновского перемещений отдельных частиц и выводит местных микромеханические свойства.

Вместе AFM и наночастиц микрореологию позволяют определение динамики корковых растягивающих и внутренних механических свойств желток во время epiboly. Эта информация полностью поддерживает модель, в котором анизотропной стресс развивается вследствие различий в ответе деформации EVL и желток цитоплазматических слой (коммунистической) к сужению изотропной actomyosin E-YSL коры имеет важное значение для направленного движения чистой EVL и epiboly прогрессии1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Уход за животными все описанные ниже шаги протокол придерживаться наших институтов.

1. данио рерио культура

  1. Породы и поддерживать взрослых рыбок данио при стандартных условиях.
    Примечание: AB и TL дикого типа эмбрионы использовались для этого исследования.
  2. Собирать эмбрионов и выращивать их на 28,5 ° C в E3 зародыш среднего24. Этапе их по морфологии как описано19.

2. атомно-силовая микроскопия

  1. Вручную dechorionate устроили данио рерио эмбрионов (из разных возрастов согласно индивидуальных интересов). Удалите chorions с двумя тонкие и острые щипцы (см. Таблицу материалы).
    1. Сцепление хориона, используя один щипцами и сделать слеза в нем с другими щипцами. Затем держа хориона в регионе противоположно из слезы, нажмите эмбриона мягко через отверстие.
    2. Выполните dechorionation под рассечения стереомикроскопом с регулируемый диапазон увеличения между 50 X и 8 X.
  2. Гора эмбрионы для AFM
    1. Подготовить раствор 2% агарозы в среде эмбриона и заполнить чашку Петри 35-мм с этим. Пусть это закрепить. Сделайте небольшие отверстия 1,5 мм в диаметре (дважды размер эмбриона) и примерно 350 мкм глубина (зародыша вдвое) тонким пинцетом в постели агарозы.
    2. Эмбрионы в тычет в слоя агарозы и заверить, что они в месте, распространяя вокруг раствор 0,5% низкий плавления агарозы в зародыш среднего. Налейте это решение вокруг только эмбрионы для обеспечения их в отверстия.
    3. Прежде чем низкой температурой плавления агарозы затвердевает при комнатной температуре, поверните эмбрионов в таким образом, что интерес к быть исследован AFM столкнется регион вверх (Рисунок 1A).
  3. Изучить эмбрионов с AFM
    1. Найдите и изображения эмбрионов в чашке Петри занято 20 X цель в Перевернутый атомно-силового микроскопа (см. Таблицу материалы25) при комнатной температуре (23-24 ° C).
      Примечание: Эмбрионы хранятся живы погружен в зародыш среднего и прилагается к постели агарозы.
    2. Зонд желток клеточной поверхности литые эмбрионов, используя сферическая шарики полистироля 4,5 мкм в диаметре, придает консольные с константой номинального весной 0,01, заданные N/м. пик пик амплитуда консольные колебаний 5 мкм и его частотой 1 Гц.
    3. Сбор данных для каждого региона испытываться в разных позициях и несколько эмбрионов, как обычные, для усреднения данных.
      Примечание: Хорошей отправной точкой является зонд пять позиций, расположенных в середине и по углам квадрата 10 мкм x 10 мкм, контролируя консольные позицию с пьезо приводы XY AFM микроскопа. Изображений и сбора данных занимает около 20 мин за эмбриона. Запись данных в различных регионах поверхности клеток эмбриона желток, например, полюса растительный или различных регионов рядом EVL клетки поля (рис. 1B и 1 C), может быть сделано только путем использования различных образцов, ориентированной по-разному.
  4. Рассчитайте силы
    1. Измерить вертикальное смещение AFM консольные (z) с тензометрических датчиков сочетании пьезо приводы, и ее прогиб (d) с помощью фотодиода квадрант методом оптической рычаг с программным обеспечением управления микроскопа (см. Таблицу материалы 25).
    2. Наклон кривой d-z, полученные из данных, собранных из голой региона стекла coverslip используйте для калибровки корреляции между сигнал фотодиода и отклонения кантилевера (d).
      Примечание: Измеренная вертикальное смещение равно отклонения кантилевера и склон представляет собой отклонение чувствительности оптической рычаг26.
    3. Сделать вывод, что консольные весной константа (k) из тепловых колебаний как описано27.
    4. Как вычислить отступ образца (h):
      h = (z - zc) -(d - dот)          (1)
      Примечание: Здесь zc положение точки контакта и dпокинуть является смещение фотодиод.
    5. Вычислите силу (F) на консольные как:
      F = k · d (2)
  5. Вычислите напряженность коры с точки зрения жидкость шар модель, состоящая из эластичного слоя корковых напряжения Tc ограждающих вязкой жидкости. В этой модели для мелких углублений (по сравнению с размером эмбриона), силы увеличивается пропорционально28 4,как:
    F = 4π Tc[(Rb / Re) + 1)] h (3)
    Примечание: Здесь Rb представляет радиус шарик и Re представляет радиус эмбриона. Для zebrafish эмбриона как радиус эмбриона (400 мкм) на два порядка больше, чем из бисера (2,25 мкм), это уровнение можно аппроксимировать как:
    F = 4π Tc h (4)
    1. Вычислить напряженность силы отступ (F-h) кривых в каждом регионе клеток эмбриона желток для пяти различных точки измерения.
    2. Вычислите Tc для каждого F-h кривой, нелинейный монтаж наименьших квадратов. Для статистического анализа, корковые напряжение Tc вычисляется должны усредняться с различными F-h кривых.
  6. Измерить вязкоупругие свойства (реология) коры, применяя малой амплитуды (100 Нм) многочастотных колебаний во время AFM состоит из синусоидальных волн различных частот25.
    1. Вычисление эффективной комплексный модуль g*(ƒ) в частотной области от силы отступ кривых как:
      g * (f) = [F(f) / h(f)]- ifb (5)
      Здесь я это мнимая единица, и F(f) и (f) hспектров частот (f) силы и отступы. b это исправление для вязкой перетащить на консольные, извлеченные из колебаний, применяется на поверхности.
    2. Отдельные g*(ƒ) в действительную и мнимую части, как:
      g * (Ƒ) = g' (f) + ig'' (f)          (6)
      ет > g' (f) является упругости и мера упругая энергия хранится и восстановлены за цикл колебаний. g'' (f) является вязкой модуль, обеспечивающий dissipated энергии.
    3. Вычислить тангенс угла диэлектрических потерь, который обеспечивает индекс твердых-как (< 1) или жидкость как (> 1) поведение материала, как:
      g'' (f) / g' (f)          (7)
      Примечание: С этим типом измерения, его можно извлечь параметры индикации как вязкой и как эластичный исследуемого материала. Хотя b слегка зависит от расстояния к концу кантилевера на поверхности, учитывая очень низкие значения g´´ выставлены желток ячейки (см. ниже Рисунок 2D ), небольшие вариации в b имеют незначительное влияние в 29измерений.

3. частица отслеживания микрореологию

  1. Выполнять микроинъекции частиц в ячейку желток
    1. Изготовления на заказ микроиглы, используя горизонтальный микропипеткой съемник и капиллярной боросиликатное стекло (см. Таблицу материалы).
      1. Подготовить микроиглы, имеют наружный диаметр 1,00 мм, внутренний диаметр 0,58 мм и длиной 10 см, с помощью съемника параметров: давление: 500; Жара: 510; Тяга: 65; Скорость: 25; Время: 50.
    2. Подготовьте инъекции Петри пластины, создавая прямой отступ полос в агарозы 1% в зародыш среднего кровати, используя пользовательские сделал прессформы (см. Таблицу материалы).
      1. Переверните формы и разместить их на вершине жидкого агарозном геле и удалить формы после затвердевшим геля. Пипетка эмбрионы в пазах, сделанное плесень в агарозном под рассечения стереомикроскопом в 1.2 X увеличением.
        Примечание: В ширину и дизайн формы позволяют эмбрионов для самостоятельной выравнивания.
    3. Перед инъекцией почти полностью удалите средство для облегчения инъекции (поверхностное натяжение предотвращает Хорион эмбриона от прилипания к иглы при удалении после инъекции).
    4. Microinject флуоресцентные наночастиц (радиус = 100 Нм, смотрите Таблицу материалы) разводят в воде (1:1, 000) в части растительной клетки эмбриона желток (рис. 3A).
    5. Отрегулируйте микропипеткой с точностью микроманипуляторов и придать бисер с автоматической microinjector с давления и времени управления (см. Таблицу материалы). Значение давления между 10 и 20 psi.
    6. Перед инъекцией решение шарик, калибровки объем придать (0,5 nL) путем измерения размера капли выступил microinjector микрометром этап 1 x 0.01 мм (см. Таблицу материалов).
    7. Использовать масштаб 1.6 X в рассечения стереомикроскопом визуализировать эмбрионов во время инъекции, которые выполняются при комнатной температуре.
  2. Оценить поведение вязкоупругих желток путем записи термические флуктуации
    1. Dechorionate microinjected эмбрионов как в шаг 2.1 и вставлять их в 0,5% Температура плавления точки агарозы в решение средних эмбриона при 30 ° C. Впоследствии передавать их на стекло нижней плиты (см. Таблицу материалы) и ориентировать и подтолкнуть их к coverslip, когда агарозы еще жидкости.
      Примечание: Когда агарозы затвердевает при комнатной температуре, эмбрионы готовы к записи образа.
    2. Место эмбрионов, монтируется в нижней стекла на сцене конфокальный инвертированным микроскопом 2 ч после микроинъекции. Захват изображения наночастиц для 26 s на дискретизации 25 Гц с 63 X цель при комнатной температуре в Перевернутый конфокального микроскопа, используя стандартные коммерческие Микроскоп программного обеспечения (размер пикселя = 166 Нм, снимках каждые 40 мс).
    3. Вычислить положение частицы центроиды и определить их траекторий с течением времени с TrackMate плагин с открытым исходным кодом программное обеспечение ImageJ (рис. 3B).
    4. Расчета двумерных среднеквадратичной перемещения (MSD) каждой частицы с6,на заказ программного обеспечения30 , как:
      < Δr2 (τ) > = < [x(t + τ) - x(t)]2 + [y(t + τ) - y(t)]2>           (8)
      Примечание: Здесь t -затраченное время и время запаздывания. В чисто вязкие жидкости Урс увеличивается обратно с вязкость (ν) согласно Стокса-Эйнштейна отношения:
      < Δr2 (τ) > = 4kB Tτ/ 6πνa,          (9)
      где T — абсолютная температура.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Корковых напряжение измерения
Для каждой точки измерения, пять кривых сила смещение (F-z) были приобретены AFM, наращивает консольные 1 Гц с амплитудой пик пик 5 мкм (скорость = 10 мкм/s) до Максимальный отступ ~ 2 мкм. Эта процедура принимает менее чем 20 минут и не был затронут прогрессии epiboly. Каждое условие экспериментальной был испытан в по крайней мере 5 эмбрионов.

Кривых сила смещение, записанные на желток клеток эмбриона, напротив для тех, кто соответствует мягкой окружающих агарозы, демонстрируют пропорциональной линейной зависимости (R2 > 0.999) (рис. 2A). Мы провели дополнительные наборы управления F-z кривые на 3 мкм/s и 30 мкм/s и отбрасываются корковых напряжения Tc потенциальных зависимость скорости кантилевера. Tc увеличилось только на 13% (p < 0.01, t тест) при скорости было сокращено с 10 до 3 мкм/s и не показывают каких-либо существенных изменений при увеличить с 10 до 30 мкм/сек.

Кривые силы отступ (F-h), записанная на консольные скорость 10 мкм/s на cell желток были почти линейных и оборудованы с жидкостью шар модели (рис. 2B)1. Эта установка позволила расчет абсолютных значений среднего поверхностного натяжения (pN/мкм) на разных epiboly этапах и в различных положениях относительно EVL передней кромки (определены в переданном свете) (Таблица 1).

Реология коры
Различия между отступы и Ретракция кривых сила смещение (F-z) (рис. 2 c) указывают вязкоупругих поведение клеток коры головного мозга эмбриона желток. Низкая амплитуда (100 Нм) многочастотных колебаний измерения предоставляют информацию для расчета эффективной комплексный модуль g*(ƒ) поверхности клетки желток и ее упругой и вязкой компонентов (см. Протокол выше).

Реология коры в zebrafish эмбриона желток клеток преобладают твердые подобное поведение с вязкой модуль 5 раз ниже, чем упругости1. Это поведение не является частота зависимых, либо для упругой (ANOVA, p = 0,123), или для вязких модуль (ANOVA, p = 0.719) (Рисунок 2D).

Реология желток
Вязкость желток рассчитывалось путем установки уравнение (5) MSD данным, полученным из наночастиц отслеживания (см. Рисунок 4A-B). MSD тепловых колебаний флуоресцентные наночастиц, встроенных в желток экспонатов пропорциональная зависимость от времени τ, согласуется с поведением ньютоновской жидкости. Эффективного сдвига вязкость желток, который пропорционален Основная коэффициенты диффузии наночастиц, был 129 МПа·с.

Figure 1
Рисунок 1: AFM данио рерио желток клеток в vivo. (A) схемы, описывающий набор вверх занятых зонда данио рерио желток клеток коры на AFM. Dechorionated эмбрионы разных возрастов были на полпути вставлены в отверстия в заказной агарозы блоков, поворачивается в определенной ориентации и ампулах по краям с низкой температурой плавления агарозы. Желток клетки были зондируемой с сферически шарики полистироля, придает консольные (красный). (B) эмбриона на 50% epiboly, половина встроенные в агарозном исследован с консольные (ложь, красным цветом) на полюсе растительный. (C) эквивалент эмбриона, в B, проверяемые в ячейке желток в регионе, недалеко от поля ячеек EVL. Масштаб баров = 100 мкм (B и C). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2. Zebrafish эмбриона желток клеток коркового напряженности и реология. (A) силы [прогиб (d)]-кривые перемещения (z) получены для представителя эмбриона, как кончик консольные подходы и контакты образца [агарозы (управления) в голубой] и желток клеток поверхностью в красном. (B) силы отступ (F-h) кривых (n = 3 эмбрионов, 3 измерений за эмбриона на расстоянии 10 мкм друг от друга. Каждое измерение представляет среднее 5 кривых) подходят с жидкостью шар модели (от ссылка1). Обратите внимание, линейное увеличение прогиб при контакте с поверхностью клетки эмбриона желток. Пунктирная черная линия показывает установку на модель (из которого выводится корковых напряженности). (C) аппроксимации (красный) и опровержения (фиолетовый) сила смещение кривых для представителя эмбриона. Изогнутые красные и фиолетовые стрелки указывают на временной режим сбора данных. Двусторонняя стрелка подчеркивает разницу между приближается и втягивания отклонение значения, указывая на вязкоупругие характер коры. (D) вязкоупругости желток клеток коры (n = 5 эмбрионов). Эффективный комплекс модуль (g *) извлекаются из многочастотных колебаний AFM измерения (от 1). Красные символы представляют упругости (g'), и синие символы определяют вязкой модуль (g″), соответственно. Значит и отображается стандартная ошибка (SE). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3. Микрореологию отслеживания частиц. (A) флуоресцентных наночастиц вводят в клетки желток zebrafish эмбриона на 50% epiboly. (B) перемещений были отслежены на отдельные наночастицы, случайным образом распределены внутри желток (слева). Время курса типичной траекторий наночастиц (центроиды) встроенных в желток (2 примеры) иллюстрация случайных блужданий, которые характерны для вязких диффузии. Шкалы бар = 100 мкм (A); 1 мкм (B, слева); 200 Нм (B, право). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4. Микрореологию zebrafish эмбриона желток. (A) MSDs отдельных наночастиц (n = 99) экспонат приблизительно линейной зависимости с опозданием. (B) означает ± Стандартная ошибка MSDs наночастиц и вязкость желток. Ансамбль в среднем MSDs (среднее - красная линия ± SE) преимущественно вязкий характер экспонатов населения наночастиц. Линейный склоне отношения отражает диффузионные свойства наночастиц. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Напряжение (pN/мм) среднее ± SE % Epiboly
40-50 60-70 80-90
Расстояние до EVL маржа 20 мкм (E-YSL) - 60 ± 7 -
40 мкм (коммунистической) 67 ± 11 72 ± 5 110 ± 7
Растительный полюс - 75 ± 3 -
n = 3 эмбрионов (5 выемки на каждом) для каждого условия

Таблица 1: Распределение пространственно-временных напряжения на поверхности клеток желток во время Epiboly.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Здесь мы покажем, что свойства материала и некоторые биомеханические параметры данио рерио желток ячейки во время epiboly может быть легко оценены AFM и наночастиц микрореологию.

В то время как AFM был нанят для получения реологических характеристик клеток и тканей в физиологических условиях4,5,25,28, здесь мы разработали протокол для применения AFM нетронутыми развивающихся эмбрионов, которые мы использовали для тестирования поверхности клетки желток zebrafish эмбриона во время epiboly.

Для измерения нашей AFM ориентация эмбрионов было обеспечено наполовину их встраивания в низких плавления агарозы. Тем не менее встраивание агарозы не влияет на AFM измерений. Жесткость агарозы был измерен путем прощупывания его поверхности с наконечником, сферические. Мы нашли Юнга (E) 4.2 0,2 ПА для этого геля, приблизив кривых силы отступ с Герц контакт модель сферы отступов плоской поверхности упругое тело. Учитывая что E 3g', агарозы был 50-fold мягче, чем желток клеток коры (Рисунок 2D). Таким образом учитывая его ограниченные толщины и очень низкую жесткость, измерения AFM, записанная на вершине эмбриона, как представляется, чрезвычайно надежными.

Важно отметить, что извлечения данных AFM абсолютные значения для корковой напряженность требует внимательнейшего отношения на относительно установки механической модели. В случае данио рерио желток клетку, с ее уникальным составом с внешний слой цитоплазмы микротрубочек богатые охватывающих высоковязких желток массу, мы обойти эту проблему, используя жидкость шар модель, состоящая из упругой коры ограждающих Вязкая жидкость. Эта модель ранее использовались для оценки корковых напряжение лейкоцитов с микропипеткой стремление28, сферические прародитель клеток от gastrulating эмбрионы данио рерио, отступ с сферически AFM советы4и клетки HeLa с AFM с помощью вклинивается кантилеверы22.

Мы оценили корковых напряжение ячейки желток отступов его поверхности с коммерчески доступных небольших сферических наконечником. Этот небольшой зонд позволили нам непосредственно измерить региональные различия в кортикальной напряженности. Как описано выше, сил отступ данных были интерпретированы с точки зрения минимального жидкость шар модели (уравнение 2). Кривые силы, записанные на поверхности гели и клетки с наконечником, сферические увеличить с отступом как власть закона с показателем 3/2. Напротив мы нашли пропорциональную силу отступ отношения очень хорошо оснащены уравнение 2 (Рисунок 2Б). Маленький зависимость Tc на консольные скорость и низкое g'' /g' соотношение (Рисунок 2D) указывает, что коры механики доминируют упругой поведение.

Желток механики были независимо исследован с микрочастица реологии. Линейное увеличение MSD наблюдается явно отражает чистый вязкой поведение. Следует отметить, что вязкость растворов полимеров зависит от размера зонд31. Таким образом, значение вязкости желток мы измерили с зондом из 100 Нм в радиусе могут несколько отличаться от молекулярных (например, флуоресцировать деполяризации) или макроскопические измерений. Взятые вместе, эти результаты обеспечивают твердую поддержку адекватности жидкости шар модели и надежность корковых измерения вязкости напряженности и желток.

Мы потому, что этот подход можно легко расширить для измерения бластодермы механики в том же эмбрионов или другим центрам развития время в данио рерио и, в конечном счете, для других организмов. Это приближение только будет зависеть от инженерных соответствующие монтажные процедуры (см. ссылку32) облегчение доступа АСМ зонды в нужном месте в нужное время. Тем не менее в любом приложении для других моделей развития следует учитывать непрерывного движения большинства клеток и тканей во время разработки. Клетки движений сделает применение этих методов гораздо более сложной.

В некоторых случаях AFM в естественных условиях будет применяться, если проблемы доступности не могут быть преодолены. Как в развивающихся эмбрионов и взрослых клетки основном недоступными. Таким образом, чтобы проверить биофизические свойства на месте, необходимо использовать методы не требует прямой контакт. Наночастицы отслеживания микрореологию выполняет эти требования6. Эта техника основана на анализе с высоким пространственным и временным разрешением броуновского перемещений отдельных частиц. Свойства локального микромеханические вязкоупругой жидкости, которая окружает эти наночастицы является прямым отражением степени и временной лаг зависимость их MSDs. Этот подход уже применялся для развивающихся организмов и помог определить высоковязких характер в C. elegans эмбриона цитоплазме30. Мы обнаружили, что желток данио рерио отображает эквивалентных свойств с C. elegans эмбрионов, хотя его вязкость двух порядков ниже. Линейное время зависимость MSD с аналогичными значениями желток вязкости тем, данио рерио желток недавно сообщалось в дрозофилы33.

Хотя мы не сделали исследовать эту возможность себе, вводят с покрытием и без покрытия наночастиц недавно были заняты в качестве цели Оптический пинцет в zebrafish личинки34. Неинвазивная микроманипуляции внутри всего организма может дать не просто прямые идеи в ячейку взаимодействий, но в механических свойств и мероприятия не доступны с помощью существующих подходов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что без финансовых интересов или другие конфликты интересов.

Acknowledgments

Мы благодарим Amayra Эрнандес-Вега и Филипп-Александр Пуй за участие в создании основы для этих протоколов. Мы также благодарим молекулярной визуализации платформы от IBMB-PCB, Xavier Эстебан и члены лаборатории для непрерывной поддержки. Сводной группы программа Женералитата Каталонии и DGI и Consolider грантов от министерства экономики и конкурентоспособности Испании наб и DN поддерживает эту работу.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Inverted optical microscope Nikon TE2000 Visualization of the sample and AFM cantilever
Atomic force microscope (AFM) Custom made - Any commercialized AFM could be employed
Inverted Confocal microscope Zeiss LSM780 Nanorheology data collection
Agarose D1 Low EEO Conda 8016.00 Casting embryos
Ultrapure LMP Agarose (low melting) Invitrogen 16520-100 Securing embryos
Zebrafish Microinjection and Transplantation Molds World Precision Instruments Z-MOLDS Casting embryos. Custom made with the original dimensions can also be employed
Dumont 5 Forceps FST 11251-20 1.5 mm diameter
Si3N4 cantilever Novascan PT.GS Measuring the embryo by AFM. Spherical tip: 4.5 µm diameter and k=0.01 N/m
Fluorescent nanoparticles Life Technologies FluoSpheres F8811, For tracking nanorheology
Micropipette puller Sutter Instruments P-2000 Fabricating tailored microneedles
Borosilicate capillary glass Warner Instruments G100TF-4 Fabricating tailored microneedles
Micromanipulator Narishige MN-153 Manipulating the micropipette
Microinjector Eppendorf FemtoJet Express Controlling injection time and pressure
Stereomicroscope Leica DFC365FX Visualization of the embryos during injection
Analysis Software MathWorks Matlab Analyzing AFM and particle tracking data
Zebrafish AB and TL wild type - Strains employed for embryo collection
Glass Bottom Plates Mat Tek P35G-0.170-14-C Mounting embryos for nanorheology data collection
Stage micrometer FST 29025-02 Measuring injection volume

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hernandez-Vega, A., et al. Polarized cortical tension drives zebrafish epiboly movements. EMBO J. 36, 25-41 (2017).
  2. Brodland, G. W., et al. Video force microscopy reveals the mechanics of ventral furrow invagination in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 22111-22116 (2010).
  3. Grill, S. W. Growing up is stressful: biophysical laws of morphogenesis. Curr Opin Genet Dev. 21, 647-652 (2011).
  4. Krieg, M., et al. Tensile forces govern germ-layer organization in zebrafish. Nat Cell Biol. 10, 429-436 (2008).
  5. Koser, D. E., et al. Mechanosensing is critical for axon growth in the developing brain. Nat Neurosci. 19, 1592-1598 (2016).
  6. Wirtz, D. Particle-tracking microrheology of living cells: principles and applications. Annu Rev Biophys. 38, 301-326 (2009).
  7. de Pablo, P. J., Carrión-Vázquez, M. Imaging Biological Samples with Atomic Force Microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 2014, 167-177 (2014).
  8. Roca-Cusachs, P., et al. Rheology of passive and adhesion-activated neutrophils probed by atomic force microscopy. Biophys J. 91, 3508-3518 (2006).
  9. Evans, E., Yeung, A. Apparent viscosity and cortical tension of blood granulocytes determined by micropipet aspiration. Biophys J. 56, 151-160 (1989).
  10. Fabry, B., et al. Time scale and other invariants of integrative mechanical behavior in living cells. Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys. 68, 041914 (2003).
  11. Kashef, J., Franz, C. M. Quantitative methods for analyzing cell-cell adhesion in development. Dev Biol. 401, 165-174 (2015).
  12. Chevalier, N. R., et al. Measuring the micromechanical properties of embryonic tissues. Methods. 94, 120-128 (2016).
  13. Reichlin, T., et al. Investigating native coronary artery endothelium in situ and in cell culture by scanning force microscopy. J Struct Biol. 152, 52-63 (2005).
  14. Rho, J. Y., Tsui, T. Y., Pharr, G. M. Elastic properties of osteon and trabecular bone measured by nanoindentation. J Biomech. 31, 21 (1998).
  15. Grant, C. A., et al. Surface characterisation and biomechanical analysis of the sclera by atomic force microscopy. J Mech Behav Biomed Mat. 4, 535-540 (2011).
  16. Efremov, Y. M., et al. Atomic force microscopy of living and fixed Xenopus laevis embryos. Micron. 42, 840-852 (2011).
  17. Henkels, J., et al. Spatiotemporal Mechanical Variation Reveals Critical Role for Rho Kinase During Primitive Streak Morphogenesis. Ann Biomed Eng. 41, 421-432 (2013).
  18. Solnica-Krezel, L. Gastrulation in zebrafish -- all just about adhesion? Curr Opin Genet Dev. 16, 433-441 (2006).
  19. Kimmel, C. B., et al. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).
  20. Rohde, L. A., Heisenberg, C. P. Zebrafish gastrulation: cell movements, signals, and mechanisms. Int Rev Cytol. 261, 159-192 (2007).
  21. Campinho, P., et al. Tension-oriented cell divisions limit anisotropic tissue tension in epithelial spreading during zebrafish epiboly. Nat Cell Biol. 15, 1405-1414 (2013).
  22. Fischer-Friedrich, E., et al. Quantification of surface tension and internal pressure generated by single mitotic cells. Sci Rep. 4, 6213 (2014).
  23. Moeendarbary, E., Harris, A. R. Cell mechanics: principles, practices, and prospects. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 6, 371-388 (2014).
  24. Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. Eugene, OR. (2000).
  25. Alcaraz, J., et al. Microrheology of human lung epithelial cells measured by atomic force microscopy. Biophys J. 84, 2071-2079 (2003).
  26. Jorba, I., et al. Probing Micromechanical Properties of the Extracellular Matrix of Soft Tissues by Atomic Force Microscopy. J Cell Physiol. 232, 19-26 (2017).
  27. Hutter, J. L., Bechhoefer, J. Calibration of atomic-force microscope tips. Review of Scientific Instruments. 64, 1868-1873 (1993).
  28. Lomakina, E. B., et al. Rheological analysis and measurement of neutrophil indentation. Biophys J. 87, 4246-4258 (2004).
  29. Alcaraz, J., et al. Correction of Microrheological Measurements of Soft Samples with Atomic Force Microscopy for the Hydrodynamic Drag on the Cantilever. Langmuir. 18, 716-721 (2002).
  30. Daniels, B. R., Masi, B. C., Wirtz, D. Probing single-cell micromechanics in vivo: the microrheology of C. elegans developing embryos. Biophys J. 90, 4712-4719 (2006).
  31. Kalwarczyk, T., et al. Comparative analysis of viscosity of complex liquids and cytoplasm of mammalian cells at the nanoscale. Nano Lett. 11, 2157-2163 (2011).
  32. Soroldoni, D., et al. Genetic oscillations. A Doppler effect in embryonic pattern formation. Science. 345, 222-225 (2014).
  33. He, B., et al. Apical constriction drives tissue-scale hydrodynamic flow to mediate cell elongation. Nature. 508, 392-396 (2014).
  34. Johansen, P. L., et al. Optical micromanipulation of nanoparticles and cells inside living zebrafish. Nat Commun. 7, 10974 (2016).

Tags

Биология развития проблема 129 данио рерио желток атомной силовой микроскопии корковых напряженности микрореологию наночастиц отслеживания
AFM и микрореологию в ячейке желток Zebrafish эмбриона
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Marsal, M., Jorba, I., Rebollo, E.,… More

Marsal, M., Jorba, I., Rebollo, E., Luque, T., Navajas, D., Martín-Blanco, E. AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell. J. Vis. Exp. (129), e56224, doi:10.3791/56224 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter