Summary
Das Fehlen von Instrumenten zur Messung von Materialeigenschaften und Zug Parameter in Vivo verhindert Validierung ihrer Rolle während der Entwicklung. Wir beschäftigten Rasterkraftmikroskopie (AFM) und Nanopartikel-Tracking, mechanische Eigenschaften auf die intakte Zebrafish Embryos Eigelb Zelle während der Epiboly zu quantifizieren. Diese Methoden sind zuverlässig und vielseitig einsetzbar, aufdringliche Interventionen zu vermeiden.
Abstract
Aufklärung der Faktoren, die die räumlich-zeitliche Organisation der sich entwickelnden Gewebe direkt ist einer der Hauptgründe für die Verwendung in der Studie der Entwicklung. Verschiedene Thesen behaupten, wichtige Beiträge zum Verständnis der mechanischen Eigenschaften von Zellen und Geweben in ihrer raumzeitlichen Organisation in verschiedenen Entwicklungs- und morphogenetischen Prozessen gewesen zu sein. Jedoch wegen des Mangels an zuverlässige und zugängliche Tools zur Messung von Materialeigenschaften und Zug Parameter in Vivo, war Überprüfung dieser Hypothesen schwierig. Hier stellen wir Ihnen Methoden beschäftigt Rasterkraftmikroskopie (AFM) und Teilchen verfolgen mit dem Ziel, die mechanischen Eigenschaften der intakten Zebrafish Embryos Eigelb Zelle während der Epiboly zu quantifizieren. Epiboly ist eine frühe konservierten Entwicklungsprozess, dessen Studie durch die Transparenz des Embryos erleichtert wird. Diese Methoden sind einfach zu implementieren, zuverlässig und vielseitig einsetzbar, da sie aufdringliche Interventionen überwinden, die Gewebe Mechanik beeinflussen könnten. Eine einfache Strategie wurde für die Montage von Proben, AFM-Aufnahme und Nanopartikel-Injektionen und Nachverfolgung angewendet. Dieser Ansatz macht diese Methoden leicht anpassbar an andere Entwicklungsstörungen Zeiten oder Organismen.
Introduction
Die physikalischen Grundsätze der biomechanischen Kontrolle der morphogenetischen Prozesse sind weitgehend undefiniert. Während biomechanische Untersuchungen auf molekularer und zellulärer Ebene erhebliche an Schwung, ist die Erforschung der biomechanischen Parameter der Ebene der Gewebe/Organismus in seiner Kindheit. Hydrodynamische Regression1 oder Video-Kraft-Mikroskopie2 Forscher, aktive und passive Kräfte, während der Laser Mikrochirurgie3oder weniger aufdringlich Rasterkraftmikroskopie (AFM) dissoziierten Zellen4 unterscheiden können oder in vivo 5 oder Nanopartikel Microrheology6 erlauben die Vorfreude der mechanischen Eigenschaften und Reaktionen des Gewebes.
AFM ist eine dreidimensionale topographische Technik mit hoher atomarer Auflösung Oberflächenrauhigkeit und Compliance aus der Durchbiegung der Freischwinger Tipps beim Kontakt mit einem sondierten Oberfläche7zu lösen. Verschiedene Methoden mit AFM wurden entwickelt, um Oberflächeneigenschaften, einschließlich der Messung von Reibung, Adhäsionskräfte und viskoelastischen Eigenschaften verschiedener Materialien zu untersuchen. AFM hat vor kurzem ein mächtiges Werkzeug zum Abrufen von Informationen auf die mechanischen Eigenschaften von biologischen Proben entwickelt. AFM kann insbesondere nicht-invasiv der komplexe Schubmodul aus einzelnen Zellen extrahieren, durch die Anwendung von oszillierender Vertiefungen mit einem Mikro Spitze an einem Freischwinger von bekannten Biegung konstant8befestigt. Dadurch können wir die daraus resultierenden Kräfte abzuleiten. Doch AFM ist nicht eindeutig und verschiedene Methoden erlauben extrahieren Daten rheologischen und mechanischen Eigenschaften von einzelnen Zellen (z. B. Mikropipette streben9, magnetische Zytometrie (MTC)10verdrehen oder einachsigen Zug- 11Tests).
Die Anwendung dieser neuartigen Methoden komplexe morphogenetischen Prozesse ist jedoch nicht einfach. Die größten Herausforderungen bei der Bestimmung der mechanischen Eigenschaften des embryonalen Gewebe sind die kleinen (µm bis mm), weich (in den 102 - 104 -Pa-Bereich) und Visco-elastische (entstehen auf zeitabhängige Phänomene) Natur der materiellen12. Es ist daher wichtig, die Methoden zur Bestimmung der mechanischen Eigenschaften (Steifigkeit, Viskosität, Adhäsion) auf den konkreten Fall von Embryonen und entwickelnden Organismen anzupassen. Zwei wichtige Punkte müssen berücksichtigt werden bei der Analyse der rheologische Ansätze zur Entwicklung zu studieren: aufdringlich Störungen zu vermeiden und gute Erreichbarkeit. In diesem Szenario zeigen Mikropipette Aspiration, MTC und Zugprüfung Einschränkungen. Im ersten Fall könnte die hohe Verformung, die eine Zelle leidet seine physiologischen und mechanischen Eigenschaften9ändern. Im zweiten Fall könnte die Notwendigkeit, sich fest das experimentelle Gewebe auf ein Substrat um sicherzustellen, dass die Spannungen angewendet das Zellskelett lokal verformen auch Auswirkungen auf die Zellen der Aktivierungsstatus und daher in ihrer mechanischen Eigenschaften10 bringen. . Letzte, einachsigen Zug-Ansätze werden durch die Geometrie der Entwicklung von Organismen und Zugänglichkeit11begrenzt.
AFM scheint für das Studium der Entwicklungsprozesse besser geeignet sein, wie es die Untersuchung von biologischen Proben direkt in ihrer natürlichen Umgebung ohne umständliche Probenvorbereitung ermöglicht. Darüber hinaus wie Dissoziation des embryonalen Gewebe in der Regel schwierig ist, bietet die geringere Größe der AFM Sonden ein hohes Maß an Vielseitigkeit ohne Einschränkung bei der Wahl der Art des Mediums (wässrige oder nichtwässrigen), Probentemperatur oder chemische Zusammensetzung der Probe. AFM ist vielseitig genug, um auf große Domänen angewendet werden und Zeitskalen und zum Abrufen von Eigenschaften von Gewebe in unterschiedlichen Entwicklungsstadien oder physiologischen Bedingungen beschäftigt. Gesamten nativen Gewebe wie Arterien13 oder Knochen14 untersucht worden sind, aus Sicht der topographischen und in einigen Fällen, wie der Sklera, mechanische Eigenschaften wurden auch abgerufen am15. Topographie ist auch in live ermöglicht die Visualisierung von zum Beispiel Zelle Umlagerung während Morphogenese Xenopus16Embryonen untersucht worden. Letzten, umfassenden Stichprobe Vorbereitung Protokolle wurden entwickelt, um mechanische Parameter zu bestimmen, während verschiedene Entwicklungsprozesse. Nanoindentation Karten wurden auf native fixierten Gewebeschnitten für die Küken embryonalen Verdauungstrakt11generiert; Kleber und mechanische Eigenschaften für einzelne Ektoderm, Mesoderm und Entoderm Progenitor-Zellen isoliert von gastrulating Zebrafish Embryos4abgerufen; Steifigkeit Messungen für die Epiblast und primitive Streak auf Explantaten von Vogelgrippe Embryonen17; und ein eindeutiges Muster von Steifigkeit Gradienten direkt im embryonalen Gehirn von Xenopus5definiert.
Annäherung an einfach zugänglichen morphogenetischen Prozesse kann ein erheblicher Qualitätssprung für die Anwendung von AFM für die Erkundung der Embryonalentwicklung entstehen. Zebrafisch-Epiboly ist ein wesentlicher und konservierte Ereignis, in dem verschiedene Geweben auf engstem Raum kugelförmig um den Ausbau der Blastoderm in wenigen Stunden direkte koordinieren. Zu Beginn der Zebrafisch Epiboly (sphärische Bühne) deckt eine oberflächliche Schicht von Zellen, die umhüllende Schicht (EVL), eine halbkugelförmige Kappe von Blastomeren auf die Tier-Pole des Embryos sitzt auf einer massiven Eigelb syncytial Zelle zentriert. Epiboly besteht aus den kortikalen pflanzlichen Ward Ausbau der EVL die tiefen Zellen (DCs) das Blastoderm und die äußere Schicht der syncytial Eigelb Zelle (E-YSL) um den Dotter. Epiboly endet mit der Schließung der EVL und die DCs Vegetal Pfosten18,19,20. Wie und wo Kräfte während Epiboly generiert werden und wie sie weltweit gekoppelt sind, ist nicht noch klar,1,21.
Hier beschreiben wir im Detail wie AFM zu folgern, dass passive mechanische Gewebeeigenschaften während Epiboly Progression im Zebrafisch Eigelb in VivoZelle angewendet. Dazu haben wir kleine Mikrosphären mit AFM Kragarmen als Sonden verbunden beschäftigt. Dies ermöglicht den Abruf von präzise lokale Informationen innerhalb der Zelloberfläche ungleichmäßige Eigelb und Zug Steigungen und ihre Dynamik im Laufe der Zeit zu studieren. Alternative AFM nähert sich z. B. die Verwendung von Keil Kragarme22, wird nicht Lokaldaten Render, die präzise genug ist. Die Keil-Technik, die sehr sorgfältige Handhabung Fähigkeiten, um einen Keil größer als die Größe der Stichprobe am Ende des Nadelträgers kleben erfordert, eignet sich nicht zum sondieren Embryo (~ 2-fach größer als die Länge des Nadelträgers) Mechanik.
Modellierung und Charakterisierung der viskoelastischen Eigenschaften der Zellen in qualitativer und quantitativer Hinsicht ermöglicht ein besseres Verständnis für die Biomechanik. Aus biomechanischer Sicht ist es wichtig zu verstehen, Epiboly und nicht nur Nachfrage wissen über Messungen der kortikalen Spannung und Dynamik, die durch AFM extrahiert werden können; so gibt es Bedarf an Informationen über die biophysikalischen Eigenschaften des Gewebes. Um diese Informationen zu extrahieren, eine Vielzahl von Zelle Rheologie Techniken wurden entwickelt, in den Jahren um verschiedene Zelltypen unter verschiedenen physiologischen Bedingungen23charakterisieren. Dazu gehören AFM, MTC und optische Pinzette (OT). Diese Methoden sind jedoch unzureichend für mesoskopische Analysen auf der Ebene der Embryonen oder Organen nachgewiesen worden. Als Alternative haben wir erfolgreich Nanopartikel-Tracking Microrheology6 für in Vivo rheologischen Messungen angepasst. Diese Technik analysiert die Brownschen Verschiebungen einzelner Partikel und schließt lokale mikromechanische Eigenschaften.
Zusammen AFM und Nanopartikel Microrheology erlauben die Definition der kortikalen Zug Dynamik und internen mechanischen Eigenschaften von Eigelb während Epiboly. Diese Informationen unterstützt voll und ganz eine Modell in dem anisotropen Stress entwickelt sich als Folge der Unterschiede in der Verformung Antwort von der EVL und die Eigelb zytoplasmatischen Schicht (YCL) zu den isotropen Actomyosin Kontraktion des E-YSL Kortex ist wichtig für net Richtungsbewegung der EVL und Epiboly Progression1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle Protokoll-Schritte, die unten beschriebenen Anweisungen Tierbetreuung unserer Institutionen.
(1) Zebrafisch-Kultur
- Züchten Sie und pflegen Sie Erwachsene Zebrafisch unter Standardbedingungen.
Hinweis: AB und TL Wildtyp-Embryonen wurden für diese Studie verwendet. - Sammeln Sie Embryonen zu und wachsen sie in E3 Embryo mittlere24bei 28,5 ° C. Inszenieren sie nach Morphologie als zuvor beschriebenen19.
(2) Rasterkraftmikroskopie
- Manuell Dechorionate inszeniert Zebrafisch-Embryonen (aller Altersgruppen nach individuellen Interessen). Entfernen Sie Chorions mit zwei dünnen und scharfen Pinzetten (siehe Tabelle der Materialien).
- Das Chorion mit einer Pinzette greifen und es mit anderen Zangen eine Träne machen. Dann hält das Chorion in einer Region entgegengesetzt zu der des Risses, den Embryo vorsichtig durch die Öffnung schieben.
- Führen Sie die Dechorionation unter einen sezierenden Stereomikroskop mit einem einstellbaren Bereich der Vergrößerung von 8 X bis 50 X.
- Montieren Sie die Embryonen für AFM
- Bereiten Sie eine Lösung von 2 % Agarose im Embryo Medium und füllen Sie einer 35-mm-Petrischale damit. Lassen Sie es zu festigen. Machen Sie kleine Löcher von 1,5 mm Durchmesser (doppelt so groß wie Embryo) und ca. 350 µm Tiefe (Hälfte der Embryo Größe) mit dünnen Pinzette in die Agarose-Bett.
- Legen Sie die Embryonen in die Pokes gemacht in der Agarose-Schicht und versichern Sie, dass sie im Ort durch die Verbreitung rund um eine Lösung von 0,5 % niedrige Agarose im Embryo Medium schmelzen. Gießen Sie diese Lösung, um nur die Embryonen in den Löchern befestigen.
- Bevor die niedrigen Schmelzpunktes Agarose bei Raumtemperatur erstarrt, drehen Sie die Embryonen in einer Weise, dass die Region von Interesse von AFM sondiert werden nach oben (Abbildung 1A) konfrontiert sein wird.
- Untersuchen Sie die Embryonen von AFM
- Suchen Sie und Bild die Embryos in der Petrischale mit einem 20 X Objektiv in einem Inverted Atomic Force Microscope (siehe Tabelle der Materialien25) bei Zimmertemperatur (23-24 ° C).
Hinweis: Die Embryonen sind lebendig gehalten, inmitten der Embryo Medium und an die Agarose-Bett. - Sondieren Sie die Eigelb Zellenoberfläche gegossen Embryonen mit sphärischen Polystyrol-Kügelchen von 4,5 µm im Durchmesser befestigt, ein Freischwinger mit einem nominalen Federkonstante von 0,01 N/m. Peak to Peak Amplitude der Freischwinger Schwingung auf 5 µm und seine Frequenz von 1 Hz eingestellt.
- Sammeln Sie Daten für jede Region in verschiedenen Positionen und in mehrere Embryonen als eine Routine für die Mittelung der Daten getestet werden.
Hinweis: Ein guter Ausgangspunkt ist fünf Positionen befindet sich in der Mitte und an den Ecken eines Quadrats µm 10 µm X 10 Steuerung Freischwinger mit XY Piezo-Aktuatoren der AFM Mikroskop zu untersuchen. Bildgebung und Datenerhebung dauerte rund 20 Minuten pro Embryo. Datenaufzeichnung in verschiedenen Regionen der Embryo Eigelb Zellenoberfläche, z.B.die Vegetal Pfosten oder verschiedene Regionen in der Nähe der EVL Zellen Rand (Abbildung 1 b und 1 C), geht nur durch den Einsatz von unterschiedlicher Proben unterschiedlich orientierte.
- Suchen Sie und Bild die Embryos in der Petrischale mit einem 20 X Objektiv in einem Inverted Atomic Force Microscope (siehe Tabelle der Materialien25) bei Zimmertemperatur (23-24 ° C).
- Kräfte zu berechnen
- Messen Sie die vertikale Verschiebung der AFM Cantilever (Z) mit DMS-Sensoren mit Piezo-Aktuatoren und ihre Ablenkung (d) mit einem Quadranten Photodiode durch die optische Hebel-Methode mit dem Mikroskop-Steuerungs-Software gekoppelt (siehe Tabelle der Materialien ( 25).
- Verwenden Sie die Neigung einer gewonnenen Daten aus einer bloßen Region von einem Glas Deckgläschen d-Z-Kurve, um die Korrelation zwischen der Photodiode Signal und die Cantilever-Auslenkung (d) zu kalibrieren.
Hinweis: Die gemessene vertikale Verschiebung entspricht die Cantilever-Durchbiegung und die Steigung stellt die Ablenkung Empfindlichkeit der optischen Hebel26. - Folgern Sie, dass die Freischwinger Federkonstante (k) von den thermischen Fluktuationen27wie oben beschrieben.
- Berechnen Sie die Einrückung der Probe (h) als:
h = (Z - Z-c) -(d - daus) (1)
Hinweis: Hier Zc ist die Position der Kontaktstelle und daus ist der Offset der Fotodiode. - Berechnen Sie die Kraft (F) auf der Cantilever als:
F = k · d (2)
- Berechnen Sie die Spannung des Kortex in Bezug auf eine Flüssigkeit-Ballon-Modell, bestehend aus einer Elastikschicht kortikalen Spannung Tc umschließt eine zähe Flüssigkeit. In diesem Modell für kleine Vertiefungen (im Vergleich zur Größe des Embryos), steigt Kraft proportional4,28 als:
F = 4π Tc[(Rb / Re) + 1)] h (3)
Hinweis: Hier Rb ist der Radius des Wulstes und e R ist der Radius des Embryos. Für Zebrafish Embryos wie der Radius des Embryos (400 µm) zwei Größenordnungen größer ist als die des Wulstes (2,25 µm), ist kann diese Gleichung als angenähert werden:
F = 4π Tc h (4)- Berechnen Sie die Spannung Kraft-Einrückung (F-h) Kurven in jeder Embryo Eigelb Zelle Region für fünf verschiedene Punktmessungen.
- Tc für jede F-h -Kurve durch nichtlineare kleinste-Quadrate passend zu berechnen. Für statistische Analysen, die kortikale Spannung Tc berechnet aus den verschiedenen F-h Kurven gemittelt werden muss.
- Die viskoelastischen Eigenschaften (Rheologie) des Kortex mittels niedrigen Amplitude messen (100 nm) Multifrequenz Schwingungen bei AFM bestehend aus sinusförmigen Wellen mit unterschiedlichen Frequenzen25.
- Eine effektive komplexen Modulus g*(ƒ) im Frequenzbereich von Kraft Einzug Kurven als zu berechnen:
g * (f) = [F(f) / h(f)]- Ifb (5)
hier i ist die imaginäre Einheit und F(f) und h(f) sind die Frequenzspektren (f) der Kraft und der Einzug. b ist die Korrektur für das zähflüssige ziehen auf der Cantilever entzogen die Schwingungen auf die Oberfläche aufgetragen. - Separate g*(ƒ) in realen und imaginären Teile wie:
g * (Ƒ) = g' (f) + Ig'' (f) (6)
Em > g'(f) ist der Elastizitätsmodul und ist ein Maß für die elastischen Energie gespeichert und wiederhergestellt pro Zyklus der Schwingung. g'' (f) ist der viskosen Modulus, die Konten für die Verlustleistung. - Berechnen Sie die Tangente Verlust, sorgt für einen Index von fest-wie (< 1) oder Flüssigkeit-wie (> 1) Verhalten des Materials, wie:
g'' (f) / g"(f) (7)
Hinweis: Mit dieser Art der Messung ist es möglich, Parameter zu extrahieren angibt wie Viskose und wie elastisch der sondierten Material ist. Obwohl b leicht von der Entfernung des Endes des Nadelträgers an die Oberfläche hängt, angesichts der sehr niedrige Werte von g´´ ausgestellt durch das Eigelb (siehe unten Abbildung 2D ), kleine Abweichungen in b haben einen vernachlässigbaren Einfluss in die Messungen29.
- Eine effektive komplexen Modulus g*(ƒ) im Frequenzbereich von Kraft Einzug Kurven als zu berechnen:
(3) Particle Tracking Microrheology
-
Führen Sie Partikel Mikroinjektion in die Eigelb-Zelle
- Fertigen Sie maßgeschneiderte Mikronadeln mit einem horizontalen Mikropipette Puller und Kapillare Borosilikatglas (siehe Tabelle der Materialien).
- Bereiten Sie Mikronadeln, die einen Außendurchmesser von 1,00 mm, einen Innendurchmesser von 0,58 mm und einer Länge von 10 cm mit Puller-Einstellungen haben: Druck: 500; Hitze: 510; Ziehen: 65; Geschwindigkeit: 25; Zeit: 50.
- Vorbereiten einer Injektion Petrischale Platte durch die Schaffung von geraden Einzug Bahnen in einem 1 % Agarose im Embryo mittlere Bett mit benutzerdefinierten gemacht Formen (siehe Tabelle der Materialien).
- Drehen Sie die Formen um und legen Sie sie auf das flüssige Agarosegel und entfernen Sie den Schimmel zu, sobald das Gel verfestigt hat. Pipette die Embryonen in die Nuten von der Form in der Agarose unter einen sezierenden Stereomikroskop bei 1,2 X Vergrößerung gemacht.
Hinweis: Die Breite und das Design der Werkzeuge ermöglichen die Embryonen selbst ausrichten.
- Drehen Sie die Formen um und legen Sie sie auf das flüssige Agarosegel und entfernen Sie den Schimmel zu, sobald das Gel verfestigt hat. Pipette die Embryonen in die Nuten von der Form in der Agarose unter einen sezierenden Stereomikroskop bei 1,2 X Vergrößerung gemacht.
- Vor der Injektion fast vollständig entfernen Sie das Medium, um die Injektion zu erleichtern (die Oberflächenspannung verhindert, dass der Embryo/Chorion festhalten an der Nadel, wenn es nach der Injektion zu entfernen).
- Microinject fluoreszierende Nanopartikel (Radius einer = 100 nm, siehe Tabelle der Materialien) verdünnt in Wasser (1:1 000) im pflanzlichen Teil der Embryo Eigelb Zelle (Abb. 3A).
- Passen Sie die Mikropipette mit Präzision Mikromanipulatoren und injizieren Sie die Perlen mit einer automatischen Microinjector mit Zeit und Druck-Regler (siehe Tabelle der Materialien). Stellen Sie den Druck zwischen 10 und 20 Psi.
- Vor der Injektion der Wulst Lösung, kalibrieren Sie das Volumen zu injizieren (0,5 nL) durch Messung der Tröpfchengröße geliefert durch die Microinjector mit einem 1 x 0,01 mm Bühne Mikrometer (siehe die Tabelle der Materialien).
- Beschäftigen Sie eine Vergrößerung von 1,6 X in den sezierenden Stereomikroskop, die Embryonen während der Injektionen zu visualisieren, die bei Raumtemperatur durchgeführt werden.
- Fertigen Sie maßgeschneiderte Mikronadeln mit einem horizontalen Mikropipette Puller und Kapillare Borosilikatglas (siehe Tabelle der Materialien).
-
Das viskoelastische Verhalten das Eigelb durch thermische Fluktuationen Aufzeichnung zu bewerten
- Dechorionate die microinjected Embryonen wie in Schritt 2.1 und eingebettet in eine 0,5 % niedrige Schmelz-Punkt Agarose im Embryo mittlere Lösung bei 30 ° C. Anschließend übertragen Sie sie auf Glasplatten unten (siehe Tabelle der Materialien) und orientieren Sie und schieben Sie sie auf das Deckglas, wenn die Agarose noch flüssig ist.
Hinweis: Wenn die Agarose bei Raumtemperatur erstarrt, können die Embryonen abgebildet werden. - Legen Sie die Embryonen in die unteren Glasplatten auf der Bühne von einem konfokalen umgekehrtes Mikroskop 2 h nach Mikroinjektion montiert. Die Aufnahmen der Nanopartikel für 26 s bei einer Sampling-Rate von 25 Hz mit einer 63 X Objektiv bei Raumtemperatur in einer invertierten confocal Mikroskop beschäftigt die standard kommerzielle Mikroskop-Software (Pixelgröße = 166 nm, Bilder, die alle 40 ms).
- Berechnen Sie die Position der Partikel Zentroiden zu und definieren Sie ihre Flugbahnen im Laufe der Zeit mit dem TrackMate-Plugin von open Source Software ImageJ (Abb. 3 b).
- Berechnen Sie die zweidimensionale mittlere quadratische Verschiebung (MSD) jedes Partikels mit maßgeschneiderten Software6,30 als:
< ΔR2 (τ) > = < [X(t + τ) - X(t)]2 + [y(t + τ) - y(t)]2> (8)
Hinweis: Hier ist t die verstrichene Zeit und die zeitliche Verzögerung. In einer reinen viskose Flüssigkeit steigt die MSD umgekehrt mit Viskosität (ν) nach der Stokes-Einstein-Beziehung:
< ΔR2 (τ) > = 4kB Tτ/ 6πνa, (9)
wobei T die Absolute Temperatur ist.
- Dechorionate die microinjected Embryonen wie in Schritt 2.1 und eingebettet in eine 0,5 % niedrige Schmelz-Punkt Agarose im Embryo mittlere Lösung bei 30 ° C. Anschließend übertragen Sie sie auf Glasplatten unten (siehe Tabelle der Materialien) und orientieren Sie und schieben Sie sie auf das Deckglas, wenn die Agarose noch flüssig ist.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kortikale Spannung Messungen
Für jeden Messpunkt wurden fünf Kraft-Weg (F-Z)-Kurven von AFM erworben, durch Rampen der Cantilever bei 1 Hz mit einer Spitze-Spitze-Amplitude von 5 µm (Geschwindigkeit = 10 µm/s) bis zu einer maximalen Einbuchtung von ~ 2 µm. Dieses Verfahren dauerte weniger als 20 min und war nicht betroffen von Epiboly fortschreiten. Jede experimentelle Bedingung wurde in mindestens 5 Embryonen getestet.
Die Kraft-Weg-Kurven auf den Embryo Eigelb Zelle aufgenommen im Gegenteil, die entsprechenden weichen umliegenden Agarose, weisen eine proportionale lineare Beziehung (R2 > 0,999) (Abbildung 2A). Wir haben zusätzliche Sets von F-Z Kurven bei 3 µm/s und 30 µm/s und eine mögliche Abhängigkeit der kortikalen Spannung Tc die Geschwindigkeit des Nadelträgers verworfen. Tc nur um 13 % erhöht (p < 0,01, t-Test) als die Geschwindigkeit wurde von 10 auf 3 µm/s reduziert und zeigte keine nennenswerten Veränderungen wenn von 10 bis 30 µm/s erhöht.
Kraft-Einrückung (F-h) Kurven mit einer Cantilever-Geschwindigkeit von 10 µm/s auf die Eigelb-Zelle aufgenommen wurden fast linear und ausgestattet mit einer Flüssigkeit-Ballon-Modell (Abb. 2 b)1. Diese Armatur erlaubt die Berechnung der absoluten Werte der mittlere Oberflächenspannung (pN/µm) in verschiedenen Epiboly Phasen und an verschiedenen Positionen im Verhältnis zu der EVL-Vorderkante (identifiziert unter Durchlicht) (Tabelle 1).
Rheologie der Hirnrinde
Die Unterschiede zwischen der Einrückung und Retraktion des Kraft-Weg (F-Z)-Kurven (Abb. 2) zeigen eine viskoelastisches Verhalten des Embryos Eigelb Zelle Kortex. Niedrige Amplitude (100 nm) Multifrequenz Oszillation Messungen liefern Informationen zur Berechnung der effektiven komplexen Modulus g*(ƒ) von der Zelloberfläche Eigelb und Blutbestandteilen elastischen und viskosen (siehe Protokoll oben).
Die Kortex Rheologie in den Zebrafish Embryos Eigelb Zelle wird durch ein fest-wie Verhalten mit dem zähflüssigen Modulus 5 Mal kleiner als der Elastizitätsmodul1dominiert. Dieses Verhalten ist nicht frequenzabhängig, entweder für die elastischen (ANOVA, p = 0.123), oder für die Viskose Modul (ANOVA, p = 0.719) (Abb. 2D).
Rheologie der Dotter
Die Viskosität des Eigelb wurde durch den Einbau von Gleichung (5), die MSD Daten aus tracking-Nanopartikel (siehe Abbildung 4A-B) berechnet. Der MSD der thermischen Schwankungen der fluoreszierende Nanopartikel eingebettet in das Eigelb weist eine proportionale Abhängigkeit von zeitlichen Verzögerung τ, konsistent mit dem Verhalten einer Newtonschen Flüssigkeit. Die wirksame Scherkräfte Viskosität das Eigelb, die umgekehrt mit der Masse Diffusionskoeffizienten der Nanopartikel zusammenhängt, war 129 mPa·s.
Abbildung 1: AFM Zebrafisch Eigelb Zellen in-vivo. (A) Diagramm beschreibt die oben eingesetzt, um die Zebrafisch Eigelb Zelle Rinde von AFM zu erforschen. Dechorionated Embryonen verschiedener Altersstufen waren auf halbem Weg in Löcher in maßgeschneiderte Agarose Blöcke erstellt, in einer bestimmten Ausrichtung gedreht und dicht an den Rändern mit niedrigem Schmelzpunkt Agarose eingefügt. Die Eigelb-Zellen wurden mit sphärischen Polystyrol-Kügelchen befestigt ein Freischwinger (rot) geprüft. (B) Embryo bei 50 % Epiboly, die Hälfte in Agarose eingebettet sondiert mit einem Freischwinger (falsch rot gefärbt) am Vegetal Pol. (C) gleichwertiger Embryo, in B, sondiert bei der Eigelb-Zelle in einer Region, in der Nähe der EVL Zellen Rand. Skalieren von Balken = 100 µm (B und C). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Zebrafish Embryos Eigelb Zelle kortikalen Spannung und Rheologie. (A) Kraft [Durchbiegung (d)]-Weg (Z)-Kurven für eine repräsentative Embryo gewonnen, wie die Cantilever-Spitze nähert und die Probe [die Agarose Oberfläche (Steuerung) in blau] und die Eigelb Zellenoberfläche in rot Kontakte. (B) zwingen Einrückung (F-h) Kurven (n = 3 Embryonen, 3 Messungen pro Embryo in einem Abstand von 10 µm voneinander. Jede Messung stellt den Mittelwert aus 5 Kurven) mit einem flüssig-Ballon Modell (Referenz1) passen. Beachten Sie die lineare Erhöhung der Durchbiegung bei Kontakt mit der Embryo Eigelb Zellenoberfläche. Die gestrichelte Linie zeigt die Montage des Modells (aus denen die kortikale Spannung abgeleitet wird). (C) Annäherung (rot) und Retraktion (lila) Kraft-Weg-Kurven für eine repräsentative Embryo. Gekrümmten roten und violetten Pfeile zeigen auf die zeitliche Regelung der Datenerhebung. Der Doppelpfeil hebt die Unterschiede der Naht und Durchbiegung Werte auf der viskoelastische Charakter des Kortex zurückziehen. (D) Viskoelastizität des Eigelb Zelle Kortex (n = 5 Embryonen). Effektive komplexe e-Modul (g *) Auszug aus Multifrequenz Schwingungen AFM-Messungen (von 1). Rote Symbole stehen für den Elastizitätsmodul (g'), und blauen Symbole definieren die Viskose Elastizitätsmodul (G″), beziehungsweise. Bedeuten und Standardfehler (SE) werden angezeigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3. Particle Tracking Microrheology. (A) fluoreszierende Nanopartikel in die Eigelb-Zelle von Zebrafisch-Embryonen im 50 % Epiboly eingespritzt werden. (B) Verschiebungen wurden für einzelne Nanopartikel zufällig verteilt innerhalb der Dotter (links) verfolgt. Zeitlicher Verlauf der typischen Trajektorien von Nanopartikeln (Zentroide) eingebettet in das Eigelb (2 Beispiele) Ausstellung Random Spaziergänge, die charakteristisch für Viskose Verbreitung. Maßstabsleiste = 100 µm (A); 1 µm (B, links); 200 nm (B, rechts). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4. Microrheology von Zebrafish Embryos Eigelb. (A) MSDs von einzelnen Nanopartikeln (n = 99) zeigen eine etwa lineare Abhängigkeit mit zeitlicher Verzögerung. (B) meine ± Standardfehler MSDs von Nanopartikeln und Viskosität von Eigelb. Ensemble gemittelt MSDs (Mittelwert - rote Linie ± SE) der Nanopartikel Bevölkerung Exponate überwiegend viskosen Charakter. Die lineare Steigung der Beziehung reflektiert die diffusiven Eigenschaften der Nanopartikel. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| Spannung (pN/mm) durchschnittliche ± SE | % der Epiboly | |||
| 40-50 | 60-70 | 80-90 | ||
| Entfernung zum EVL-Marge | 20 μm (E-YSL) | - | 60 ± 7 | - |
| 40 μm (YCL) | 67 ± 11 | 72 ± 5 | 110 ± 7 | |
| Vegetal Pole | - | 75 ± 3 | - | |
| n = 3 Embryonen (5 Einbuchtungen auf jedem) für jede Bedingung | ||||
Tabelle 1: Räumlich-zeitliche Spannungsverteilung an der Zelloberfläche Eigelb bei Epiboly.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier zeigen wir, dass die Materialeigenschaften und einige biomechanischen Parameter der Zebrafisch Eigelb Zelle während der Epiboly von AFM und Nanopartikel Microrheology leicht geschätzt werden können.
Während AFM, zum Abrufen von rheologischer Eigenschaften von Zellen und Geweben in physiologischen Bedingungen4,5,25,28 beschäftigt war, haben hier wir ein Protokoll für die Anwendung von AFM auf intakte Entwicklung Embryonen, die wir eingesetzt, um die Eigelb Zellenoberfläche des Zebrafish Embryos während Epiboly zu testen.
Für unsere AFM-Messungen wurde die Ausrichtung der Embryonen durch Einbettung in niedrig schmelzende Agarose Hälfte gesichert. Agarose Einbettung hat AFM Messungen jedoch nicht beeinträchtigt. Die Steifigkeit der Agarose wurde durch Sondierung der Oberfläche mit einer kugelförmigen Spitze gemessen. Wir fanden ein Elastizitätsmodul (E) von 4,2 0,2 Pa für dieses Gel durch den Einbau der Kraft-Einrückung Kurven mit Hertz Kontakt Modell einer Kugel eine Ebene Fläche eines elastischen Körpers einrücken. Gegeben, dass E 3g", die Agarose war das 50-fache weicher als das Eigelb Zelle Rinde (Abb. 2D). Daher erscheinen in Anbetracht seiner begrenzten Dicke und sehr geringe Steifigkeit, die AFM-Messungen aufgezeichnet auf der Embryo äußerst zuverlässig sein.
Es ist wichtig zu beachten, dass die Absolutwerte für kortikale Spannung von AFM Daten abrufen verlangt äußerste Sorgfalt auf über mechanisches Modell passende. Im Falle der Zebrafisch Eigelb Zelle, mit seiner einzigartigen Zusammensetzung mit einer Mikrotubuli-reiche cytoplasmatische Außenschicht umfasst eine hochviskose Eigelb-Masse, umgehen wir dieses Problem mit einer Flüssigkeit-Ballon-Modell bestehend aus einer elastischen Rinde umschließt ein viskose Flüssigkeit. Dieses Modell wurde früher verwendet, um die kortikalen Spannung der Leukozyten mit Mikropipette streben28, sphärische Vorläuferzellen aus gastrulating Zebrafisch-Embryonen mit sphärischen AFM Tipps4und HeLa-Zellen mit AFM eingerückt zu schätzen mit eingekeilt, kragt22.
Die kortikale Spannung der Zelle Eigelb durch Einrücken der Oberfläche mit einer handelsüblichen kleinen kugelförmigen Spitze geschätzt. Diese kleine Sonde erlaubt uns regionale Unterschiede in der kortikalen Spannung direkt zu messen. Wie oben beschrieben, wurden im Hinblick auf eine minimale Flüssigkeit-Ballon-Modell (GL. 2) Kraft-Einrückung Daten interpretiert. Kraft-Kurven aufgezeichnet auf der Oberfläche des Gels und Zellen mit einer kugelförmigen Spitze mit Einrückung wie ein Potenzgesetz mit einem 3/2-Exponenten zu erhöhen. Im Gegensatz dazu fanden wir eine proportionale Kraft-Einrückung Beziehung sehr gut ausgestattet mit GL. 2 (Abbildung 2 b). Die wenig Abhängigkeit von Tc Freischwinger Geschwindigkeit und niedrige g'' /g' Verhältnis (Abb. 2D) weist darauf hin, dass Kortex Mechanik durch eine elastische Verhalten dominiert wird.
Eigelb-Mechanik wurden unabhängig voneinander mit Mikropartikel Rheologie sondiert. Die lineare Erhöhung der MSD beobachtet spiegelt sich deutlich ein reines viskoses Verhalten. Es sei darauf hingewiesen, dass die Viskosität von Polymerlösungen hängt von der Größe der Sonde31. Daher der Wert der Dotter Viskosität, die wir gemessen, mit einer Sonde von 100 nm Radius kann etwas von molekularen abweichen (z.B.fluoreszieren Depolarisation) oder makroskopischen Messungen. Zusammengenommen bieten diese Ergebnisse unterstützen die Angemessenheit des Modells Flüssigkeit-Ballon und die Robustheit der kortikalen Spannung und Eigelb Viskositätsmessungen.
Wir folgern, dass dieser Ansatz problemlos erweitert werden, könnte um Blastoderm Mechanik in der gleichen Embryonen oder zu anderen Entwicklungszeit Punkten in der Zebrabärbling und schließlich auch auf andere Organismen zu messen. Diese Annäherung hängt nur Technik entsprechende Montage-Verfahren (siehe Referenz32) Erleichterung des Zugangs der AFM-Sonden an die richtigen Stellen zur richtigen Zeit. Dennoch sollte die kontinuierliche Bewegung der meisten Zellen und Gewebe während der Entwicklung in einer beliebigen Anwendung zu anderen Entwicklungsstörungen Modellen berücksichtigt werden. Zellbewegungen werden der Anwendung dieser Methoden viel schwieriger zu machen.
In einigen Fällen wäre AFM in Vivo nicht anwendbar wenn Zugänglichkeit Probleme überwunden werden können. Sowohl bei der Entwicklung von Embryonen und Erwachsene sind Zellen weitgehend unzugänglich. Um die biophysikalischen Eigenschaften in Situzu testen, ist Imperativ, Methoden nicht anzuwenden erfordern somit direkten Kontakt. Nanopartikel, die Verfolgung Microrheology erfüllt diese Anforderungen-6. Diese Technik basiert auf der Analyse mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung der Brownschen Verschiebungen einzelner Partikel. Die lokalen mikromechanische Eigenschaften des viskoelastischen Fluids, die diese Nanopartikel umgibt ist ein direktes Spiegelbild über den Umfang und zeitlicher Verzögerung-Abhängigkeit von ihrem MSDs. Dieser Ansatz wurde bereits für die Entwicklung von Organismen angewandt und hat dazu beigetragen, um die hochviskosen Charakter von C. Elegans Embryos Zytoplasma30zu bestimmen. Wir aufgedeckt, dass ein Zebrafisch Eigelb gleichwertige Eigenschaften mit C. Elegans Embryos zeigt, obwohl seine Viskosität zwei Größenordnungen niedriger ist. Eine lineare Zeitabhängigkeit von MSD mit ähnlichen Werten der Dotter Viskosität zu derjenigen der Zebrafisch Eigelb wurde vor kurzem in Drosophila33berichtet.
Obwohl wir nicht diese Möglichkeit uns selbst erforschen, sind die injizierten unbeschichteten und beschichteten Nanopartikel vor kurzem als Ziele der optischen Pinzette im Zebrafisch-Larven-34eingesetzt worden. Nicht-invasive Mikromanipulation innerhalb eines gesamten Organismus kann nicht nur direkte Einblicke in Zell-Interaktionen sondern in mechanischen Eigenschaften und Aktivitäten nicht zugänglich mit bestehenden Ansätzen geben.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren erklären keine finanziellen Interessenkonflikte oder andere Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Wir danken Amayra Hernandez-Vega und Philippe Alexandre Pouille für die Teilnahme an die Grundlage für diese Protokolle einrichten. Wir danken auch der Molecular Imaging Plattform vom IBMB-PCB, Xavier Esteban und Mitglieder des Labors für kontinuierliche Unterstützung. Das konsolidierte Gruppen Programm der Generalitat de Catalunya und DGI und Consolider Zuschüsse aus dem Ministerium für Wirtschaft und die Wettbewerbsfähigkeit von Spanien, EMB und DN unterstützt diese Arbeit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Inverted optical microscope | Nikon | TE2000 | Visualization of the sample and AFM cantilever |
| Atomic force microscope (AFM) | Custom made | - | Any commercialized AFM could be employed |
| Inverted Confocal microscope | Zeiss | LSM780 | Nanorheology data collection |
| Agarose D1 Low EEO | Conda | 8016.00 | Casting embryos |
| Ultrapure LMP Agarose (low melting) | Invitrogen | 16520-100 | Securing embryos |
| Zebrafish Microinjection and Transplantation Molds | World Precision Instruments | Z-MOLDS | Casting embryos. Custom made with the original dimensions can also be employed |
| Dumont 5 Forceps | FST | 11251-20 | 1.5 mm diameter |
| Si3N4 cantilever | Novascan | PT.GS | Measuring the embryo by AFM. Spherical tip: 4.5 µm diameter and k=0.01 N/m |
| Fluorescent nanoparticles | Life Technologies | FluoSpheres F8811, | For tracking nanorheology |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | P-2000 | Fabricating tailored microneedles |
| Borosilicate capillary glass | Warner Instruments | G100TF-4 | Fabricating tailored microneedles |
| Micromanipulator | Narishige | MN-153 | Manipulating the micropipette |
| Microinjector | Eppendorf | FemtoJet Express | Controlling injection time and pressure |
| Stereomicroscope | Leica | DFC365FX | Visualization of the embryos during injection |
| Analysis Software | MathWorks | Matlab | Analyzing AFM and particle tracking data |
| Zebrafish | AB and TL wild type | - | Strains employed for embryo collection |
| Glass Bottom Plates | Mat Tek | P35G-0.170-14-C | Mounting embryos for nanorheology data collection |
| Stage micrometer | FST | 29025-02 | Measuring injection volume |
References
- Hernandez-Vega, A., et al. Polarized cortical tension drives zebrafish epiboly movements. EMBO J. 36, 25-41 (2017).
- Brodland, G. W., et al. Video force microscopy reveals the mechanics of ventral furrow invagination in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 22111-22116 (2010).
- Grill, S. W. Growing up is stressful: biophysical laws of morphogenesis. Curr Opin Genet Dev. 21, 647-652 (2011).
- Krieg, M., et al. Tensile forces govern germ-layer organization in zebrafish. Nat Cell Biol. 10, 429-436 (2008).
- Koser, D. E., et al. Mechanosensing is critical for axon growth in the developing brain. Nat Neurosci. 19, 1592-1598 (2016).
- Wirtz, D. Particle-tracking microrheology of living cells: principles and applications. Annu Rev Biophys. 38, 301-326 (2009).
- de Pablo, P. J., Carrión-Vázquez, M. Imaging Biological Samples with Atomic Force Microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 2014, 167-177 (2014).
- Roca-Cusachs, P., et al. Rheology of passive and adhesion-activated neutrophils probed by atomic force microscopy. Biophys J. 91, 3508-3518 (2006).
- Evans, E., Yeung, A. Apparent viscosity and cortical tension of blood granulocytes determined by micropipet aspiration. Biophys J. 56, 151-160 (1989).
- Fabry, B., et al. Time scale and other invariants of integrative mechanical behavior in living cells. Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys. 68, 041914 (2003).
- Kashef, J., Franz, C. M. Quantitative methods for analyzing cell-cell adhesion in development. Dev Biol. 401, 165-174 (2015).
- Chevalier, N. R., et al. Measuring the micromechanical properties of embryonic tissues. Methods. 94, 120-128 (2016).
- Reichlin, T., et al. Investigating native coronary artery endothelium in situ and in cell culture by scanning force microscopy. J Struct Biol. 152, 52-63 (2005).
- Rho, J. Y., Tsui, T. Y., Pharr, G. M. Elastic properties of osteon and trabecular bone measured by nanoindentation. J Biomech. 31, 21 (1998).
- Grant, C. A., et al. Surface characterisation and biomechanical analysis of the sclera by atomic force microscopy. J Mech Behav Biomed Mat. 4, 535-540 (2011).
- Efremov, Y. M., et al. Atomic force microscopy of living and fixed Xenopus laevis embryos. Micron. 42, 840-852 (2011).
- Henkels, J., et al. Spatiotemporal Mechanical Variation Reveals Critical Role for Rho Kinase During Primitive Streak Morphogenesis. Ann Biomed Eng. 41, 421-432 (2013).
- Solnica-Krezel, L. Gastrulation in zebrafish -- all just about adhesion? Curr Opin Genet Dev. 16, 433-441 (2006).
- Kimmel, C. B., et al.
- Rohde, L. A., Heisenberg, C. P. Zebrafish gastrulation: cell movements, signals, and mechanisms. Int Rev Cytol. 261, 159-192 (2007).
- Campinho, P., et al. Tension-oriented cell divisions limit anisotropic tissue tension in epithelial spreading during zebrafish epiboly. Nat Cell Biol. 15, 1405-1414 (2013).
- Fischer-Friedrich, E., et al. Quantification of surface tension and internal pressure generated by single mitotic cells. Sci Rep. 4, 6213 (2014).
- Moeendarbary, E., Harris, A. R. Cell mechanics: principles, practices, and prospects. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 6, 371-388 (2014).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. Eugene, OR. (2000).
- Alcaraz, J., et al. Microrheology of human lung epithelial cells measured by atomic force microscopy. Biophys J. 84, 2071-2079 (2003).
- Jorba, I., et al. Probing Micromechanical Properties of the Extracellular Matrix of Soft Tissues by Atomic Force Microscopy. J Cell Physiol. 232, 19-26 (2017).
- Hutter, J. L., Bechhoefer, J. Calibration of atomic-force microscope tips. Review of Scientific Instruments. 64, 1868-1873 (1993).
- Lomakina, E. B., et al. Rheological analysis and measurement of neutrophil indentation. Biophys J. 87, 4246-4258 (2004).
- Alcaraz, J., et al. Correction of Microrheological Measurements of Soft Samples with Atomic Force Microscopy for the Hydrodynamic Drag on the Cantilever. Langmuir. 18, 716-721 (2002).
- Daniels, B. R., Masi, B. C., Wirtz, D. Probing single-cell micromechanics in vivo: the microrheology of C. elegans developing embryos. Biophys J. 90, 4712-4719 (2006).
- Kalwarczyk, T., et al. Comparative analysis of viscosity of complex liquids and cytoplasm of mammalian cells at the nanoscale. Nano Lett. 11, 2157-2163 (2011).
- Soroldoni, D., et al. Genetic oscillations. A Doppler effect in embryonic pattern formation. Science. 345, 222-225 (2014).
- He, B., et al. Apical constriction drives tissue-scale hydrodynamic flow to mediate cell elongation. Nature. 508, 392-396 (2014).
- Johansen, P. L., et al. Optical micromanipulation of nanoparticles and cells inside living zebrafish. Nat Commun. 7, 10974 (2016).
