Summary
缺少用于测量材料属性和拉伸参数的工具在体内可防止在开发过程中验证它们的角色。我们使用原子力显微镜 (AFM) 和纳米粒子跟踪来量化外包期间完整的斑马鱼胚胎卵黄细胞的机械特性。这些方法是可靠的, 广泛适用于避免介入干预。
Abstract
阐明影响组织演变的时空组织的因素是发展研究的主要目的之一。各种命题在不同的发育和形成过程中对其时空组织中细胞和组织的力学性质的理解有重要的贡献。然而, 由于缺乏可靠和容易接近的工具来测量材料的性质和张力参数在体内, 验证这些假设是困难的。在这里, 我们提出的方法采用原子力显微镜 (AFM) 和粒子跟踪的目的是量化的力学性能的完整斑马鱼的胚胎卵黄细胞在外包。外包是一个早期保守的发展过程, 其研究是由胚胎的透明度促进。这些方法是简单的实施, 可靠, 广泛适用, 因为他们克服侵入性干预, 可能影响组织力学。一个简单的策略, 用于安装标本, AFM 记录, 和纳米粒子注射和跟踪。这种方法可以很容易地适应其他发育时期或生物体。
Introduction
生物力学控制形成过程的物理原理在很大程度上是没有定义的。虽然生物力学研究在分子和细胞水平正在积聚相当大的动量, 生物力学参数的探索在组织/有机体水平是在它的初期阶段。流体力学回归1或视频力显微镜2允许研究人员区分主动和被动的力量, 而激光显微手术3, 或较少侵入原子力显微镜 (AFM) 的离解细胞4或在体内5或纳米粒子 microrheology6允许对组织的机械性能和响应进行预测。
AFM 是一个三维的地形技术, 具有高的原子分辨率, 解决表面粗糙度和遵守从悬臂尖端的挠度后, 与探测表面7。采用 AFM 的不同方法来研究表面性质, 包括测量摩擦、附着力和不同材料的粘弹性特性。最近, AFM 已成为一个强大的工具, 以获取信息的机械性能的生物样品。特别是, AFM 可以性提取复杂的剪切模量从单一的细胞应用振荡凹痕与微尖端连接到一个已知的弯曲常数8。这让我们推断出产生的力。然而, AFM 不是唯一的, 不同的方法可以从单个细胞中提取流变数据和机械特性 (例如,微吸入9, 磁扭式细胞仪 (MTC)10, 或单轴拉伸测试11)。
然而, 这些新方法在复杂的形态发生过程中的应用并不简单。在确定胚胎组织的机械性能时所面临的主要挑战是小 (µm 至 mm), 软 (在 102 -104 Pa 范围) 和粘弹性 (引起时间依赖性现象) 的性质的材料12。因此, 重要的是要调整的方法, 以确定机械性能 (刚度, 粘度, 粘附) 的具体情况下, 胚胎和发展中的有机体。在分析研究发展的流变学方法时, 需要考虑两个重要的问题: 避免侵入性干扰, 并提供易于获取。在这种情况下, 微的愿望, MTC, 和拉伸试验展览的限制。在第一种情况下, 细胞遭受的高变形可能改变它的生理和机械特性9。在第二种情况下, 需要坚定地坚持实验组织的基板, 以确保施加的应力变形的骨架局部也可以引入影响细胞的活化状态, 因此, 在其机械特性10.最后, 单轴拉伸方法受发育生物体的几何和可达性11的限制。
AFM 似乎更适合于研究发展过程, 因为它允许研究生物样品直接在他们的自然环境, 没有任何繁琐的样品准备。此外, 由于胚胎组织的离解通常是困难的, 减少的原子力显微镜探头的尺寸提供了高度的通用性, 在选择介质 (水或非水滴), 样品温度或化学物质的类型上没有限制。样品的组成。AFM 具有足够的通用性, 可以应用于大的领域和时间尺度, 并被用来检索不同发育阶段或生理条件下组织的物质特性。整个原生组织, 如动脉13或骨骼的14已从地形角度进行了研究, 在某些情况下, 如巩膜, 机械性能也被检索15。在爪16的活体胚胎中也探索了地形, 允许可视化, 例如在形态发生过程中细胞重排。最后, 开发了全面的样品制备规程, 以确定不同发育过程中的力学参数。压的地图已经生成的小鸡胚胎消化道的本地无固定组织切片11;从 gastrulating 斑马鱼胚胎中分离出的单个外胚层、胚层和内胚层祖细胞的胶粘剂和力学性能4;禽胚外植体叶和原始条纹的刚度测量17;在爪5的胚脑中直接定义的一种明显的刚度梯度模式。
应用 AFM 探索胚胎发育的一个重要的质的飞跃可能来自于简单的容易接近的形态发生过程。斑马鱼外包是一个重要的和保守的事件, 其中不同的组织协调在一个限制的球形空间, 以指导扩大胚在几个小时。在斑马鱼外包 (球形阶段), 表面层的细胞, 包围层 (EVL), 涵盖了半帽的卵中心的动物极点坐在一个巨大的卵黄合胞细胞。外包包括 EVL 的皮质植物病房扩张, 胚的深细胞 (DCs), 和蛋黄周围的合胞卵黄细胞 (e-YSL) 的外层。外包结束与 EVL 和 DCs 在植物极点18,19,20。在外包期间如何以及在何处生成力以及它们是如何进行全局耦合的还不清楚1,21。
在这里, 我们详细地描述了如何应用 AFM 在斑马鱼卵黄细胞的外包进展中推断被动的机械组织特性在体内。为此, 我们采用了小微球连接到 AFM 悬臂作为探针。这允许在不均匀的卵黄细胞表面上检索精确的局部信息, 并研究拉伸梯度及其随时间变化的动态。替代 AFM 方法, 如那些使用楔形悬臂22, 将不会呈现足够精确的本地数据。楔形技术, 需要非常仔细的操作技巧, 以胶水楔形大于样本大小在悬臂底, 不太适合探测胚胎 (〜2倍大于悬臂的长度) 力学。
用定性和定量的方法对细胞的粘弹性特性进行建模和表征, 可以提高对其生物力学的认识。从生物力学的角度来看, 必须了解外包, 而不仅仅是要求知识的皮层张力测量和动力学, 可以提取的 AFM;因此需要关于组织的生物物理特性的信息。为了提取这些信息, 在不同的生理条件下, 为了刻画不同的细胞类型, 我们已经开发了各种细胞流变学技术23。它们包括 AFM、MTC 和光学镊子 (OT)。然而, 这些方法在胚胎或器官的尺度上被证明不足以进行介观分析。作为替代, 我们已经成功地适应了纳米粒子跟踪 microrheology6的体内流变测量。该技术分析了单个粒子的布朗位移, 推导了局部微机械特性。
原子力显微镜和纳米粒子 microrheology 允许定义的皮层张力动力学和内部力学性质的蛋黄在外包。这一信息完全赞同一个模型, 其中各向异性的应力发展的结果的差异, EVL 和卵黄细胞质层 (共青团) 的变形反应, 以各向同性动收缩的 e-YSL 皮层是必不可少的EVL 和外包进程的定向网移动1。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
下面所述的所有协议步骤都遵循我们机构的动物保育准则。
1. 斑马鱼文化
- 在标准条件下培育和维持成年斑马鱼。
注: 本研究采用 AB 型和铊类野生胚。 - 收集胚胎并在28.5 ° c 的 E3 胚培养基上生长它们24。根据先前描述的19的形态学对它们进行阶段。
2. 原子力显微镜
- 手动 dechorionate 分期斑马鱼胚胎 (不同年龄根据个人利益)。用两个薄而锋利的镊子将 chorions 取出 (请参见材料表)。
- 用一个钳子夹住绒毛膜, 用另一个钳子把它撕裂。然后, 把绒毛膜在一个与撕裂的区域相对的地方, 轻轻地通过开口推动胚胎。
- 执行 dechorionation 下的解剖显微镜与可调范围的放大倍数之间的8X 和50X。
- 为 AFM 安装胚胎
- 在胚胎培养基中制备2% 琼脂糖溶液, 并用此填充 35 mm 的培养皿。让它凝固。制造1.5 毫米直径的小孔 (两倍于胚大小) 和大约350µm 深度 (一半胚胎大小) 与薄钳在琼脂糖床上。
- 将胚胎放入琼脂糖层中, 并通过在胚胎培养基中0.5% 低熔点琼脂糖的溶液中传播, 确保它们到位。把这个溶液倒在胚胎上, 把它们固定在洞里。
- 在低熔点琼脂糖凝固在室温下, 旋转的胚胎, 在这种方式, 该地区的利益将被探测的 AFM 将面临向上 (图 1A)。
- 用 AFM 检查胚胎
- 在室温下 (23-24 ° c) 中, 在一个倒置的原子力显微镜中找到并利用20X 目标的培养皿中的胚胎定位和图像 (参见材料表25)。
注意: 胚胎被保存在胚胎培养基中并附着在琼脂糖床上。 - 用直径4.5 µm 的球形聚苯乙烯珠, 用公称弹簧常数为0.01 米/秒, 对铸造胚的卵黄细胞表面进行探针研究. 将悬臂振荡的峰振幅设置为5µm, 频率为1赫兹。
- 为每个区域收集数据, 以便在不同的位置和在几个胚胎中进行测试, 以作为例行数据, 以进行统计。
注: 一个好的出发点是探测五位置位于中间和角落的一个10µm x 10 µm 广场通过控制悬臂位置与 XY 压电驱动器的 AFM 显微镜。成像和数据收集约20分钟每胚。在胚胎卵黄细胞表面的不同区域记录数据,例如, 植物极或靠近 EVL 细胞边缘的不同区域 (图 1B和1C), 只能通过使用不同的不同标本来完成。
- 在室温下 (23-24 ° c) 中, 在一个倒置的原子力显微镜中找到并利用20X 目标的培养皿中的胚胎定位和图像 (参见材料表25)。
- 计算力
- 测量 AFM 悬臂梁 (z) 与压电驱动器耦合的应变式传感器的垂直位移及其偏转 (d) 用光学杠杆法与显微镜控制软件的象限光电二极管 (参见材料表25)。
- 使用从玻璃片的裸区域收集的数据得到的 d-z 曲线的斜率, 以校准光电二极管信号与悬臂偏转 (d) 之间的相关性。
注: 测量的垂直位移等于悬臂偏转, 斜率表示光学杠杆的偏转灵敏度26。 - 从先前描述的27的热波动推断出悬臂弹簧常数 (k)。
- 将示例 (h) 的缩进计算为:
h = (z-zc) (d-d关闭) (1)
注意: 这里的zc 是触点的位置, doff是光电二极管的偏移。 - 计算悬臂上的力 (F) 为:
F = k · d (2)
- 计算的张力, 从一个液体气球模型, 包括一个弹性层的皮质张力 Tc包围一个粘性液体。在这个模型中, 对于小凹痕 (与胚胎的大小相比), 力按比例增加4,28为:
F = π Tc[(rb / re) + 1)] h (3)
注意: 这里的Rb 是珠的半径, re 是胚胎的半径。对于斑马鱼胚胎, 作为胚胎的半径 (400 µm) 是两个数量级大于那珠 (2.25 µm), 这个等式可以近似地是:
F = π Tc h (4)- 计算每个胚胎卵黄细胞区的张力-压痕 (F-h) 曲线, 用于五不同点的测量。
- 通过非线性最小二乘法拟合, 计算每个Fh曲线的Tc 。对于统计分析, 所计算的皮质张力Tc 必须从不同的Fh曲线中进行平均。
- 采用低振幅 (100 nm) 多振荡的方法, 在不同频率的正弦波组成的原子力显微镜下测量皮层的粘弹性特性 (流变学)25。
- 在频率域中从力压痕曲线计算一个有效的复模量g * (ƒ) , 如下所示:
g *(f) = [f(f)/ h(f)]- ifb (5)
这里i是虚数单位, F(f) 和h(f) 是力和缩进的频率 (f) 频谱。b是对从表面上应用的振荡中提取的悬臂的粘性阻力的修正。 - 将g * (ƒ)分离为真实的和虚构的部分, 如:
g *(ƒ) = g"(f) + ig" (f) (6)
em > g "(f) 是弹性模量, 是每周期振荡所储存和恢复的弹性能量的量度。g"(f) 是描述耗散能量的粘性模量。 - 计算损耗正切值, 该切线提供了材料的固体样 (< 1) 或类似液体 (> 1) 行为的指数, 如:
g"(f)/ g" (f) (7)
注: 有了这种类型的测量, 可以提取参数, 表明如何粘性和如何弹性是被探测的材料。虽然b稍微依赖于悬臂的末端到曲面的距离, 但由于卵黄细胞所展示的g´´的值非常低 (见图 2D ), 所以在b中的细微变化对度量值29。
- 在频率域中从力压痕曲线计算一个有效的复模量g * (ƒ) , 如下所示:
3. 粒子跟踪 Microrheology
-
对卵黄细胞进行微粒显微注射
- 使用水平微拉拔器和硼硅酸盐毛细管玻璃制造定制的微 (请参见材料表)。
- 准备微, 外径为1.00 毫米, 内径为 0.58 mm, 长度为10厘米, 使用拉拔器设置: 压力: 500;热量: 510;拉力:65;速度:25;时间:50。
- 制作一个注射培养皿板通过创建一个1% 琼脂糖在胚胎中型床使用定制模具的直压痕车道 (请参阅材料表)。
- 把模具倒置, 并把它们放在液体琼脂糖凝胶, 并删除模具一旦凝胶已固化。在1.2X 放大倍数下, 将胚胎移入琼脂糖中的模子所制成的凹槽中的显微镜。
注: 模具的宽度和设计使胚胎调整。
- 把模具倒置, 并把它们放在液体琼脂糖凝胶, 并删除模具一旦凝胶已固化。在1.2X 放大倍数下, 将胚胎移入琼脂糖中的模子所制成的凹槽中的显微镜。
- 注射前, 几乎完全清除培养基以方便注射 (表面张力防止胚/绒毛膜在注射后将其粘附在针头上)。
- Microinject 荧光纳米粒子 (半径 a = 100 nm, 见材料表) 稀释在水 (1:1, 000) 在植物部分的胚胎卵黄细胞 (图 3A)。
- 调整微与精密动和注入的珠子自动微量的时间和压力控制 (请参见材料表)。设置10和 20 psi 之间的压力。
- 在注入磁珠溶液之前, 通过测量微量带 1x 0.01 mm 级微米的液滴尺寸来校准体积以注入 (0.5 nL) (参见材料表)。
- 在解剖显微镜中采用1.6X 的放大倍数, 在注射过程中对胚胎进行可视化, 在室温下进行。
- 使用水平微拉拔器和硼硅酸盐毛细管玻璃制造定制的微 (请参见材料表)。
-
通过记录热涨落来评估蛋黄的粘弹性行为
- Dechorionate 微量胚在步骤2.1 中, 并将其嵌入到30° c 的胚胎培养基溶液中的0.5% 低熔点琼脂糖中。然后, 将它们转移到玻璃底板 (请参阅材料表), 并将其定向至片, 当琼脂糖仍为液态时。
注意: 当琼脂糖在室温下凝固时, 胚胎就可以被成像。 - 将胚胎放置在玻璃底板上, 在共聚焦倒置显微镜的舞台上注射后2小时。利用标准商用显微镜软件 (像素大小 = 166 nm, 每40毫秒捕获的图像), 以25赫兹的采样率在室温下的63X 目标下捕获纳米粒子的图像。
- 计算粒子的质心的位置和定义他们的轨迹随着时间的 TrackMate 插件的开放源码 ImageJ 软件 (图 3B)。
- 用 custom-made 软件6,30计算每个粒子的 two-dimensional 均方位移 (下):
< Δr2 (τ) > = < [x(t + τ)- x(t)]2 + [y(t + τ)- y(t)2> (8)
注意: 这里的t是经过的时间和滞后时间。在纯粘性液体中, 根据斯托克斯-爱因斯坦关系, 该流变液与粘度 (ν) 反向增加:
< Δr2 (τ) > = 4kB Tτ/6πνa, (9)
其中, T是绝对温度。
- Dechorionate 微量胚在步骤2.1 中, 并将其嵌入到30° c 的胚胎培养基溶液中的0.5% 低熔点琼脂糖中。然后, 将它们转移到玻璃底板 (请参阅材料表), 并将其定向至片, 当琼脂糖仍为液态时。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
皮质张力测量
对于每个测量点, 五力-位移 (F-z) 曲线获得了 AFM 通过斜向1赫兹的峰振幅为5µm (速度 = 10 µm/秒) 高达最大缩进〜2µm。这个程序是采取少于20分钟, 并没有受到外包进展。每个实验条件都在至少5胚胎中进行测试。
在胚胎卵黄细胞上记录的力-位移曲线, 与软的周围琼脂糖相对应, 呈现成正比线性关系 (R2 > 0.999) (图 2A)。我们执行了额外的控制 F-z 曲线在3µm/秒和30µm/秒, 并放弃了潜在的依赖性皮质张力 Tc对速度的悬臂。tc仅增加了 13% (p < 0.01, t 检验), 当速度从10到3µm/秒, 并没有显示任何重大变化时, 从10增加到30µm/秒。
在卵黄细胞上以10µm/秒的悬臂速度记录的力压痕 (F h) 曲线几乎是线性的, 并装有一个液体气球模型 (图 2B)1。此拟合允许计算在不同外包阶段和不同位置的平均表面张力 (pN/µm) 的绝对值, 相对于 EVL 前缘 (在透射光下识别) (表 1)。
皮层的流变学
力-位移 (F-z) 曲线的缩进和缩回之间的差异 (图 2C) 表明了胚胎卵黄细胞皮质的粘弹性行为。低振幅 (100 nm) 多振荡测量提供的信息, 计算有效的复杂模数g*(ƒ)的蛋黄细胞表面及其弹性和粘性的组成部分 (见上面的协议)。
斑马鱼胚胎卵黄细胞的皮质流变性由一种固体样行为控制, 其粘性模量比弹性模量1低5倍。此行为不是频率依赖性的, 无论是为弹性 (方差分析, p = 0.123), 或为粘性模数 (方差分析, p = 0.719) (图 2D)。
蛋黄的流变学
用拟合方程 (5) 计算了从纳米粒子跟踪得到的粘度数据 (见图 4A-b)。嵌入在蛋黄中的荧光纳米粒子的热涨落, 与牛顿液体的行为一致, 与时间滞后τ成正比的依赖性。蛋黄的有效剪切粘度与纳米颗粒的本体扩散系数成反比, 为 129 mPa·s。
图 1: 斑马鱼卵黄细胞的 AFM在体内. (A)图描述用于用 AFM 探测斑马鱼卵黄细胞皮质的设置。不同年龄段的 Dechorionated 胚入到特制的琼脂糖块中 , 旋转成特定的方向 , 并在低熔点琼脂糖的边缘处密封。用悬臂 (红色) 上的球形聚苯乙烯珠来探测卵黄细胞。(B)胚胎在50% 外包半嵌在琼脂糖中, 在植物极上用悬臂 (红色的假色) 探测。(C)在B中的等效胚胎, 在靠近 EVL 细胞边缘的区域的卵黄细胞中进行探测。缩放条形图 = 100 µm (B 和 C)。请单击此处查看此图的较大版本.
图2。斑马鱼胚胎卵黄细胞皮质张力和流变学。 (a)在有代表性的胚胎上获得的强制 [偏转 (d)]-位移 (z) 曲线, 当悬臂尖端接近并接触样品 (蓝色的琼脂糖表面 (控制) 和红色的蛋黄细胞表面)。(B)力压痕 (F-h) 曲线 (n = 3 胚胎, 每胚3测量, 距离为10µm。每个测量都代表5曲线的平均值) 与一个液体气球模型 (从参考1) 匹配。注意在与胚胎卵黄细胞表面接触时, 偏转的线性增加。虚线黑线显示该模型的拟合 (由此推断出皮质张力)。代表胚的(C)近似 (红色) 和回缩 (紫色) 力-位移曲线。弯红色和紫色箭头指向数据收集的世俗政权。双头箭头突出了接近和缩回偏转值之间的差异指向的粘弹性特征的皮层。(D)卵黄细胞皮质的粘弹性 (n = 5 胚胎)。从多振荡中提取的有效复模量 (g *) AFM 测量 (从1)。红色符号代表弹性模量 (g '), 蓝色符号分别定义粘性模量 (g″)。显示平均值和标准错误 (SE)。请单击此处查看此图的较大版本.
图3。粒子跟踪 microrheology (A)荧光纳米粒子在斑马鱼胚胎的卵黄细胞中注入50% 外包。(B)对在卵黄 (左) 内随机分布的单个纳米颗粒进行了位移跟踪。在蛋黄中嵌入的纳米颗粒 (质心) 的典型轨迹的时间过程 (2 例) 展示了粘性扩散特性的随机游动。刻度栏 = 100 µm (A);1µm (B, 左);200 nm (B, 右)。请单击此处查看此图的较大版本.
图4。斑马鱼胚胎卵黄的 Microrheology。 (A)单个纳米颗粒 (n = 99) 的 MSDs 在时间滞后时呈现近似线性依赖性。(B)意味着纳米颗粒的标准误差和蛋黄的粘度。集合平均 MSDs (平均红色线± SE) 的纳米粒子的人口表现出主要是粘性的字符。该关系的线性斜率反映了纳米粒子的扩散特性。请单击此处查看此图的较大版本.
| 张力 (pN/mm) 平均± SE | 外包% | |||
| 40-50 | 60-70 | 80-90 | ||
| 距离 EVL 边距 | 20μ m (E-YSL) | - | 60±7 | - |
| 40μ m (共青团) | 67±11 | 72±5 | 110±7 | |
| 植物极 | - | 75±3 | - | |
| n = 3 个胚胎 (每个条件有5个凹痕) | ||||
表 1: 外包期间卵黄细胞表面的时空张力分布。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
本文通过 AFM 和纳米粒子 microrheology, 研究了斑马鱼卵黄细胞在外包中的物质特性和生物力学参数。
在生理条件下, afm 被用来检索细胞和组织的流变学特征4,5,25,28, 这里我们开发了一个应用 afm 的协议, 用于完整的开发我们使用的胚胎在外包期间测试斑马鱼胚胎的卵黄细胞表面。
对于我们的 AFM 测量, 胚胎的方向是固定的一半嵌入他们在低融化琼脂糖。然而, 琼脂糖的嵌入并没有影响 AFM 测量。用球形针尖探测其表面, 测定琼脂糖的硬度。我们发现了一个杨氏模量 (E) 的 4.2 0.2 Pa 为这个凝胶通过拟合的力-压痕曲线与赫兹接触模型的球体缩进一个扁平表面的弹性体。鉴于E 3g, 琼脂糖的50倍比蛋黄细胞皮质 (图 2D) 更软。因此, 考虑到其有限的厚度和非常低的刚度, AFM 测量记录在胚胎上似乎是非常可靠的。
重要的是要注意, 从 AFM 数据中获取皮质张力绝对值需要对机械模型拟合的极端关注。在斑马鱼卵黄细胞的情况下, 其独特的组成与外微管丰富的细胞质层, 包括高度粘性的蛋黄质量, 我们绕过这个问题采用一个液体气球模型, 包括一个弹性皮质包围粘性液体。该模型曾用于估计白的皮质张力与微吸入28, gastrulating 斑马鱼胚胎的球形祖细胞与球形 afm 提示4, 和 HeLa 细胞与 afm使用楔形悬臂22。
我们估计的皮层张力的蛋黄细胞通过缩进其表面与商业可用的小球形尖端。这个小探针使我们能够直接测量皮层张力的区域差异。如上所述, 按最小液-气球模型 (Eq 2) 解释了力压痕数据。在凝胶表面和球形尖端的细胞上记录的力曲线随着压痕的增加而增大, 作为幂定律具有3/2 指数。相比之下, 我们发现一个比例的力-压痕关系非常适合与 Eq. 2 (图 2B)。在悬臂速度和低g"/g比率 (图 2D) 上, Tc的依赖性很小, 这表明皮质力学是由弹性行为控制的。
用微粒流变学对卵黄力学进行了独立的探讨。观察到的线性增加明显地反映了纯粘性的行为。应该注意, 聚合物溶液的粘度取决于探针的大小31。因此, 我们用探针测量的 100 nm 半径的蛋黄粘度值可能与分子 (例如, 荧光去极化) 或宏观测量有一定的不同。两者结合在一起, 这些结果为液体气球模型的充分性以及皮质张力和蛋黄黏度测量的鲁棒性提供了强有力的支持。
我们的理由, 这种方法可以很容易地扩展到测量胚力学在同一胚胎或其他发展时间点在斑马鱼, 并最终, 其他有机体。这种近似将只依赖于工程上适当的安装过程 (参见参考32), 以便于在适当的时间将原子力显微镜探头访问到正确的位置。尽管如此, 在开发过程中, 大多数细胞和组织的持续运动都应考虑到其他发展模式的应用。细胞运动将使这些方法的应用更加具有挑战性。
在某些情况下, 如果无法解决辅助功能问题, AFM在体内将不适用。在发育中的胚胎和成人中, 细胞基本上是无法进入的。因此, 为了测试生物物理特性原位, 必须使用不需要直接接触的方法。纳米粒子跟踪 microrheology 满足这些要求6。该技术基于对单个粒子布朗位移的高空间和时间分辨率分析。围绕这些纳米粒子的粘弹性流体的局部微机械特性直接反映了其 MSDs 的程度和时间滞后依赖性。这种方法已经被应用于发展中的生物体, 并帮助确定了线虫胚胎细胞质的高度粘性的特性30。我们发现, 斑马鱼的蛋黄显示了与 C.线虫胚胎的等效性质, 虽然它的粘度是两个数量级的低。最近在果蝇33中报告了与蛋黄粘度相近值与斑马鱼蛋黄的线性时间相关性。
尽管我们自己并没有探索这种可能性, 但最近在斑马鱼幼虫34中使用了非涂层和涂层纳米粒子作为光镊靶点。在整个生物体内的非侵入性微可能不只是直接洞察细胞间的相互作用, 而是通过现有方法无法接触到机械特性和活动。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者声明没有相互竞争的金融利益或其他利益冲突。
Acknowledgments
我们感谢 Amayra 埃尔南德斯和菲利普-亚历山大 Pouille 参与建立这些协议的基础。我们还感谢 IBMB 的分子成像平台, 泽维尔伊斯特班和实验室成员的持续支持。加泰罗尼亚自治区加泰罗尼亚和 dg 的联合小组方案以及西班牙经济部和竞争力向教统局和 DN 提供的 Consolider 赠款支持了这项工作。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Inverted optical microscope | Nikon | TE2000 | Visualization of the sample and AFM cantilever |
| Atomic force microscope (AFM) | Custom made | - | Any commercialized AFM could be employed |
| Inverted Confocal microscope | Zeiss | LSM780 | Nanorheology data collection |
| Agarose D1 Low EEO | Conda | 8016.00 | Casting embryos |
| Ultrapure LMP Agarose (low melting) | Invitrogen | 16520-100 | Securing embryos |
| Zebrafish Microinjection and Transplantation Molds | World Precision Instruments | Z-MOLDS | Casting embryos. Custom made with the original dimensions can also be employed |
| Dumont 5 Forceps | FST | 11251-20 | 1.5 mm diameter |
| Si3N4 cantilever | Novascan | PT.GS | Measuring the embryo by AFM. Spherical tip: 4.5 µm diameter and k=0.01 N/m |
| Fluorescent nanoparticles | Life Technologies | FluoSpheres F8811, | For tracking nanorheology |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | P-2000 | Fabricating tailored microneedles |
| Borosilicate capillary glass | Warner Instruments | G100TF-4 | Fabricating tailored microneedles |
| Micromanipulator | Narishige | MN-153 | Manipulating the micropipette |
| Microinjector | Eppendorf | FemtoJet Express | Controlling injection time and pressure |
| Stereomicroscope | Leica | DFC365FX | Visualization of the embryos during injection |
| Analysis Software | MathWorks | Matlab | Analyzing AFM and particle tracking data |
| Zebrafish | AB and TL wild type | - | Strains employed for embryo collection |
| Glass Bottom Plates | Mat Tek | P35G-0.170-14-C | Mounting embryos for nanorheology data collection |
| Stage micrometer | FST | 29025-02 | Measuring injection volume |
References
- Hernandez-Vega, A., et al. Polarized cortical tension drives zebrafish epiboly movements. EMBO J. 36, 25-41 (2017).
- Brodland, G. W., et al. Video force microscopy reveals the mechanics of ventral furrow invagination in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 22111-22116 (2010).
- Grill, S. W. Growing up is stressful: biophysical laws of morphogenesis. Curr Opin Genet Dev. 21, 647-652 (2011).
- Krieg, M., et al. Tensile forces govern germ-layer organization in zebrafish. Nat Cell Biol. 10, 429-436 (2008).
- Koser, D. E., et al. Mechanosensing is critical for axon growth in the developing brain. Nat Neurosci. 19, 1592-1598 (2016).
- Wirtz, D. Particle-tracking microrheology of living cells: principles and applications. Annu Rev Biophys. 38, 301-326 (2009).
- de Pablo, P. J., Carrión-Vázquez, M. Imaging Biological Samples with Atomic Force Microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 2014, 167-177 (2014).
- Roca-Cusachs, P., et al. Rheology of passive and adhesion-activated neutrophils probed by atomic force microscopy. Biophys J. 91, 3508-3518 (2006).
- Evans, E., Yeung, A. Apparent viscosity and cortical tension of blood granulocytes determined by micropipet aspiration. Biophys J. 56, 151-160 (1989).
- Fabry, B., et al. Time scale and other invariants of integrative mechanical behavior in living cells. Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys. 68, 041914 (2003).
- Kashef, J., Franz, C. M. Quantitative methods for analyzing cell-cell adhesion in development. Dev Biol. 401, 165-174 (2015).
- Chevalier, N. R., et al. Measuring the micromechanical properties of embryonic tissues. Methods. 94, 120-128 (2016).
- Reichlin, T., et al. Investigating native coronary artery endothelium in situ and in cell culture by scanning force microscopy. J Struct Biol. 152, 52-63 (2005).
- Rho, J. Y., Tsui, T. Y., Pharr, G. M. Elastic properties of osteon and trabecular bone measured by nanoindentation. J Biomech. 31, 21 (1998).
- Grant, C. A., et al. Surface characterisation and biomechanical analysis of the sclera by atomic force microscopy. J Mech Behav Biomed Mat. 4, 535-540 (2011).
- Efremov, Y. M., et al. Atomic force microscopy of living and fixed Xenopus laevis embryos. Micron. 42, 840-852 (2011).
- Henkels, J., et al. Spatiotemporal Mechanical Variation Reveals Critical Role for Rho Kinase During Primitive Streak Morphogenesis. Ann Biomed Eng. 41, 421-432 (2013).
- Solnica-Krezel, L. Gastrulation in zebrafish -- all just about adhesion? Curr Opin Genet Dev. 16, 433-441 (2006).
- Kimmel, C. B., et al.
- Rohde, L. A., Heisenberg, C. P. Zebrafish gastrulation: cell movements, signals, and mechanisms. Int Rev Cytol. 261, 159-192 (2007).
- Campinho, P., et al. Tension-oriented cell divisions limit anisotropic tissue tension in epithelial spreading during zebrafish epiboly. Nat Cell Biol. 15, 1405-1414 (2013).
- Fischer-Friedrich, E., et al. Quantification of surface tension and internal pressure generated by single mitotic cells. Sci Rep. 4, 6213 (2014).
- Moeendarbary, E., Harris, A. R. Cell mechanics: principles, practices, and prospects. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 6, 371-388 (2014).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. Eugene, OR. (2000).
- Alcaraz, J., et al. Microrheology of human lung epithelial cells measured by atomic force microscopy. Biophys J. 84, 2071-2079 (2003).
- Jorba, I., et al. Probing Micromechanical Properties of the Extracellular Matrix of Soft Tissues by Atomic Force Microscopy. J Cell Physiol. 232, 19-26 (2017).
- Hutter, J. L., Bechhoefer, J. Calibration of atomic-force microscope tips. Review of Scientific Instruments. 64, 1868-1873 (1993).
- Lomakina, E. B., et al. Rheological analysis and measurement of neutrophil indentation. Biophys J. 87, 4246-4258 (2004).
- Alcaraz, J., et al. Correction of Microrheological Measurements of Soft Samples with Atomic Force Microscopy for the Hydrodynamic Drag on the Cantilever. Langmuir. 18, 716-721 (2002).
- Daniels, B. R., Masi, B. C., Wirtz, D. Probing single-cell micromechanics in vivo: the microrheology of C. elegans developing embryos. Biophys J. 90, 4712-4719 (2006).
- Kalwarczyk, T., et al. Comparative analysis of viscosity of complex liquids and cytoplasm of mammalian cells at the nanoscale. Nano Lett. 11, 2157-2163 (2011).
- Soroldoni, D., et al. Genetic oscillations. A Doppler effect in embryonic pattern formation. Science. 345, 222-225 (2014).
- He, B., et al. Apical constriction drives tissue-scale hydrodynamic flow to mediate cell elongation. Nature. 508, 392-396 (2014).
- Johansen, P. L., et al. Optical micromanipulation of nanoparticles and cells inside living zebrafish. Nat Commun. 7, 10974 (2016).
