Summary
העדר כלים למדידת תכונות החומר, הפרמטרים tensional ויוו מונע אימות התפקידים שלהם במהלך הפיתוח. אנחנו מועסקים מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) ומעקב nanoparticle לכמת תכונות מכניות על התא חלמון העובר תקין דג זברה במהלך epiboly. שיטות אלה הינם אמינים החלים נרחב הימנעות התערבויות פולשניות.
Abstract
אחת מהמטרות העיקריות במחקר של פיתוח שחקרתי את הגורמים ישיר הארגון-עתיים המתפתחים ברקמות. הטענות שונים טוענים היו תרומות חשובות להבנה של התכונות המכאניות של תאים ורקמות בארגון שלהם ייתכן בתהליכים התפתחותיים, morphogenetic שונים. עם זאת, בשל היעדר כלים נגיש ואמין למדידת תכונות החומר, הפרמטרים tensional ויוו, אימות היפותזות אלה היה קשה. כאן אנו מציגים שיטות העסקת מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM), חלקיקים מעקב במטרה לכמת תכונות מכאניות של התא חלמון דג זברה שלם העובר במהלך epiboly. Epiboly הוא תהליך התפתחותי מוקדם שנשמרת שמחקרו בהנחייתם של השקיפות של העובר. שיטות אלה הם פשוט ליישם, אמינים ובעלי החלים נרחב מאז הם מתגברים על התערבויות פולשניות העלולה להשפיע על רקמות מכניקה. אסטרטגיה פשוטה הוחל על הרכבה של דגימות, הקלטה AFM ו ננו-חלקיק זריקות ומעקב. גישה זו הופכת השיטות להתאמה בקלות פעמים התפתחותית או אורגניזמים אחרים.
Introduction
העקרונות הפיזיים הפקד ביו-מכני של תהליכים morphogenetic אינם מוגדרים במידה רבה. בעוד מחקרים ביו-מכני ברמה המולקולרית, התאית הן צוברת תאוצה ניכר, חקר biomechanical פרמטרים ברמת רקמות/אורגניזם הוא למאכלים. רגרסיה hydrodynamic1 או מיקרוסקופ כוח וידאו2 מאפשרים להבחין בין כוחות פעיל וסביל, תוך תיאום לייזר3או מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) פחות פולשנית של תאים הפומבית4 או אין ויוו microrheology 5 או ננו-חלקיק6 לאפשר הציפייה של תכונות מכניות ותגובות של רקמה.
AFM היא טכניקה סימון שבילים תלת מימדי עם רזולוציה גבוהה אטומי לפתרון חספוס פני השטח ותאימות מ סטיה של זיז טיפים לאחר יצירת קשר עם משטח הנייר7. מתודולוגיות שונות העסקת AFM פותחו כדי לחקור את מאפייני משטח, כולל מדידת חיכוך, כוחות אדהזיה ומאפיינים viscoelastic של חומרים מגוונים. לאחרונה, AFM התפתחה כלי רב עוצמה כדי לאחזר מידע על תכונות מכניות של דגימות ביולוגיות. בפרט, AFM יכול לא פולשני לחלץ מודולוס גזירה מורכב של תאים בודדים על-ידי החלת הכניסות מתנדנדות עם טיפ מיקרו קשורה על זיז ידוע קבוע כיפוף8. פעולה זו מאפשרת לנו להסיק הכוחות שנוצר. ובכל זאת, AFM אינה ייחודית, מתודולוגיות שונות לאפשר חילוץ נתונים rheological ואת תכונות מכניות תאים בודדים (למשל, Micropipette השאיפה9, מגנטי פיתול cytometry (MTC)10, או uniaxial מתיחה בדיקה11).
ובכל זאת, היישום של מתודולוגיות הרומן אלה תהליכים מורכבים morphogenetic אינה פשוטה. אתגרי העיקריים בקביעת התכונות המכאניות של רקמות עובריים הם הקטנים (מיקרומטר מ"מ), רכה (ב 102 - 104 הרשות הפלסטינית טווח) והטבע ויסקו-אלסטית (והוליד תלויי-זמן התופעות) גשמי12. לכן חשוב להתאים את השיטות לקביעת תכונות מכניות (נוקשות, צמיגות, אדהזיה) למקרה הספציפי של עוברי ואורגניזמים המתפתח. שני נושאים חשובים שצריך לקחת בחשבון בעת ניתוח הגישות rheological ללמוד פיתוח: כדי למנוע הפרעה פולשניות וכדי לספק נגישות קלה. בתרחיש זה, השאיפה micropipette MTC, בדיקות התערוכה מגבלות. במקרה הראשון, להרכב גבוהה תא סובלת עלולה לשנות מאפיינים פיזיולוגיים ומכניים שלה9. במקרה השני, הצורך לדבוק בחוזקה רקמות ניסיוני מצע כדי להבטיח כי הלחצים חלה לעוות את שלד התא באופן מקומי יכול גם להציג אפקטים על מצב הפעלה התאים ומכאן שלהם תכונות מכניות10 . גישות מתיחה האחרון, uniaxial מוגבלים על ידי הצורה הגיאומטרית של פיתוח אורגניזמים נגישות11.
AFM נראה להיות מתאים יותר עבור חקר תהליכים פיתוחיים שכן היא מאפשרת המחקר של דגימות ביולוגיות ישירות בתוך הסביבה הטבעית שלהם ללא כל הכנה מדגם מסורבלת. יתר על כן, כפי דיסוציאציה של רקמות עובריים הוא בדרך כלל קשה, בגודל מופחת של AFM הגששים מספק רמה גבוהה של רב-תכליתיות ללא מגבלה בבחירת סוג בינוני (מימית או הלא-מימית), לדוגמה טמפרטורה או כימית ההרכב של המדגם. מיקרוסקופ כוח אטומי מספיק גמישים כדי להחיל על תחומים גדול וזמן קשקשים, ננקטה כדי לאחזר תכונות החומר של רקמות שלבים התפתחותיים או בתנאים פיזיולוגיים. כל ילידי רקמות כגון העורקים13 או עצמות14 נחקרו מנקודת מבט הטופוגרפי, במקרים מסוימים, כמו בסקלרה, תכונות מכניות היו גם שאוחזרו15. הטופוגרפיה יש נחקרו גם בחיים עוברי המאפשר את החזיית, למשל, תא שחלוף במהלך מורפוגנזה צפרדע רפואית16. הדוגמה האחרונה, מקיף הכנת פרוטוקולים פותחו כדי לקבוע פרמטרים מכני במהלך תהליכים התפתחותיים שונים. מפות Nanoindentation נוצרו על רקמות מבולבל יליד מקטעים עבור מערכת העיכול עובריים צ'יק11; דבק ועל מכניים מאפיינים המאוחזרים עבור הפרט האאקטודרם, והמזודרם והאנדודרם ובתאים מבודדים מן העוברים gastrulating דג זברה4; נוקשות מדידות שבוצעו על epiblast ועל רצף פרימיטיביים על explants של העוברים העופות17; . ואת דפוס ברור של נוקשות מעברי צבע מוגדרים ישירות המוח העוברי של צפרדע רפואית5
קפיצה איכותית משמעותית להחלת AFM לחקר התפתחות שעשוי להגיע מתקרב פשוט תהליכים morphogenetic נגיש. Epiboly דג זברה היא אירוע שנשמרת וחיוני, שבו ברקמות שונות לתאם בחלל כדורית מוגבלת כדי לכוון את התרחבות blastoderm בעוד כמה שעות. מיד עם תחילת epiboly דג זברה (שלב כדורית), שכבה שטחית של תאים, השכבה עוטף (EVL), מכסה חצי כיפה של blastomeres שבמרכזה הקוטב חיה של העובר יושב על תא syncytial חלמון מסיבית. Epiboly מורכב הרחבת קורטיקלית וורד פוליאותן EVL, התאים עמוק (Dc) את blastoderm, ואת השכבה החיצונית של התא syncytial חלמון (E-ליפשיץ) סביב החלמון. Epiboly מסתיים עם סגירת EVL את ו- Dc-19,18,20vegetal הקוטב. כיצד והיכן כוחות נוצרות במהלך epiboly, איך הם מצמידים באופן גלובלי אינו עדיין ברור1,21.
כאן נתאר בפירוט כיצד להחיל AFM להסיק רקמות מכני פסיבי מאפיינים במהלך התקדמות epiboly החלמון דג זברה תא ויוו. כדי לעשות זאת, אנחנו מועסקים microspheres קטן המוצמד cantilevers AFM כפי רגשים. דבר זה מאפשר דליית מידע מקומי מדויקת בתוך השטח תא החלמון לא אחידה, ללמוד מעברי צבע tensional ואת הדינמיקה שלהם לאורך זמן. AFM חלופי גישות כגון אלה באמצעות טריז cantilevers22, יהיה לא רינדור מקומית נתונים מדויק מספיק. הטכניקה טריז, הדורש מיומנויות מניפולציה מאוד זהירים כדי להדביק טריז גדול יותר מאשר גודל המדגם בסוף שלוחה, אינה מתאימה עבור בודק את העובר (~ קיפול כפול גדול יותר מהאורך הזיז) מכניקה.
מידול ואפיון המאפיינים viscoelastic של תאים בדרכים כמותיים מאפשר הבנה משופרת הביומכניקה שלהם. מנקודת מבט ביו-מכני, זה חיוני כדי להבין epiboly, לא רק דרישה ידע על מדידות מתח קורטיקלית, דינמיקה, אשר ניתן לחילוץ על AFM; לכן יש צורך מידע על מאפיינים ביופיזיקלי של הרקמה. כדי לחלץ את המידע הזה, במגוון טכניקות rheology תא פותחו עם השנים על מנת לאפיין את סוגי תאים שונים תחת מצבים פיזיולוגיים שונים23. הם כוללים AFM MTC, פינצטה אופטית (OT). שיטות אלו, עם זאת, הוכחו לא מתאימות עבור ניתוחים mesoscopic את המשקל של העוברים או איברים. כחלופה, אנו הסתגלו בהצלחה ננו-חלקיק-מעקב microrheology6 ויוו rheological מעבדתיים. טכניקה זו מנתח את displacements בראונית של חלקיקים בודדים או יסיק מאפיינים מקומיים micromechanical.
Microrheology AFM ו ננו-חלקיק יחד מאפשרים את ההגדרה של דינמיקה tensional קורטיקלית פנימי תכונות מכניות של החלמון במהלך epiboly. מידע זה באופן מלא מאשרת מודל שבו הלחץ אניסוטרופי מפתחת בשל הבדלי התגובה דפורמציה של EVL, החלמון Cytoplasmic שכבה (YCL) כדי התכווצות איזוטרופיות actomyosin של קליפת E-ליפשיץ, זה חיוני התנועה נטו כיוונית EVL ו epiboly התקדמות1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל השלבים פרוטוקול המתואר להלן בצע את ההנחיות טיפול בבעלי חיים המוסדות שלנו.
1. דג זברה תרבות
- להתרבות ולשמור על דג זברה בוגרת בתנאים רגילים.
הערה: עוברי פראי סוג AB ו TL שימשו למחקר זה. - לאסוף את העוברים, לגדל אותם ב 28.5 ° C ב- E3 העובר בינונית24. שלב אותם על פי המורפולוגיה כפי שתואר לעיל19.
2. מיקרוסקופ כוח אטומי
- באופן ידני dechorionate ביים דג זברה עוברי (בגילאים שונים על פי האינטרסים האישיים). הסר chorions עם מלקחיים דק וחד שני (ראה טבלה של חומרים).
- לאחוז את chorion באמצעות מלקחיים אחד ולעשות דמעה בו עם המלקחיים אחרים. לאחר מכן, מחזיק את chorion באזור הפוכה מזו של הקרע, לדחוף את העובר בעדינות דרך הפתח.
- לבצע את dechorionation תחת stereomicroscope ויבתר עם טווח מתכוונן של הגדלה בין 8 X 50 X.
- הר העוברים על מיקרוסקופ כוח אטומי
- להכין פתרון של 2% agarose במדיום העובר ולמלא צלחת פטרי 35 מ מ עם זה. . תן אותו לחזק. לעשות חורים קטנים של 1.5 מ מ קוטר (פעמיים את גודל העובר) ועומק כ 350 מיקרומטר (העובר בגודל חצי) עם מלקחיים דק במיטה agarose.
- מניחים את העוברים פוקס עשה בשכבה agarose ולהבטיח שהם במקום על ידי הפצת סביב פתרון של 0.5% נמוך נמסות agarose העובר בינוני. יוצקים את הפתרון הזה מסביב רק את העוברים כדי להבטיח להם החורים.
- לפני agarose נקודת התכה נמוכה מתמצק בטמפרטורת החדר, לסובב את העוברים בצורה כזאת, כי האזור עניין פתור על ידי AFM יעמדו בפני כלפי מעלה (איור 1 א').
- לבחון את העוברים על ידי מיקרוסקופ כוח אטומי
- אתר את התמונה העוברים בצלוחית הפטרי העסקת מטרה X 20 במיקרוסקופ כוח אטומי הפוך (ראה טבלה של חומרים25) בטמפרטורת החדר (23-24 מעלות צלזיוס).
הערה: העוברים נשמרים בחיים שקוע העובר בינוני ומחוברת אל המיטה agarose. - בדיקה על פני התא חלמון עוברי casted העסקת כדורית פוליסטירן חרוזים של מיקרומטר 4.5 קוטר קשורה על זיז עם קבוע קפיץ הנומינלי של 0.01 N/מ' להגדיר את משרעת השיא אל שיא של זיז תנודה 5 מיקרומטר, תדירותו עד 1 הרץ.
- לאסוף נתונים עבור כל אזור ייבדק עמדות שונות, מספר העוברים, שגרתי, עבור הנתונים בממוצע.
הערה: נקודת התחלה טובה היא בדיקה חמש העמדות ממוקם באמצע, בפינות של ריבוע מיקרומטר 10 מיקרומטר x 10 על ידי שליטה המיקום זיז עם אלמנט פייזו-מפעילים XY של מיקרוסקופ AFM. הדמיה ואיסוף נתונים לקח בסביבות 20 דקות לכל העובר. מקליט נתוני באזורים שונים של פני השטח של התא חלמון העובר, למשל, vegetal מוט או אזורים שונים קרוב השוליים תאים EVL (איור 1B ו- 1 C), יכול להיעשות רק על ידי העסקת דגימות ברורים מונחה באופן שונה.
- אתר את התמונה העוברים בצלוחית הפטרי העסקת מטרה X 20 במיקרוסקופ כוח אטומי הפוך (ראה טבלה של חומרים25) בטמפרטורת החדר (23-24 מעלות צלזיוס).
- חישוב כוחות
- למדוד בהזחה האנכית הזיז AFM (z) עם חיישנים מד המתח בשילוב אלמנט פייזו-מפעילים ולאחר שלה סטיה (d) בעזרת פוטודיודה רביע בשיטת ידית אופטי עם תוכנת שליטה מיקרוסקופ (ראה טבלה של חומרים 25).
- להשתמש את השיפוע של עקומת d-z המתקבל הנתונים שנאספו מאזור החשופות של coverslip זכוכית כדי לכייל את המתאם בין האות פוטודיודה והטיה זיז (d).
הערה: בהזחה האנכית נמדד שווה של סטיה זיז, השיפוע מייצג את הרגישות הסטה של ידית אופטי26. - גוזר שקבוע הקפיץ זיז (k) מ תנודות תרמית כאמור תיאר27.
- לחשב את הכניסה של המדגם (h) כמו:
h = (z - zc) -(d - d) (1)
הערה: כאן zc הוא המיקום של נקודת המגע, d. הוא ההיסט של פוטודיודה. - לחשב את הכוח (F) על הזיז כמו:
F = k · ד (2)
- לחשב את המתח של קליפת במונחים של מודל נוזלי-בלון המורכב שכבה אלסטית של מתח קורטיקלית Tc תוחמת נוזל צמיגה. במודל זה, עבור כניסות קטנות (בהשוואה לגודל של העובר), כוח מגבירה באופן פרופורציונלי4,28 כמו:
F = 4π Tc[(Rb / Re) +1)] h (3)
הערה: כאן Rb הוא הרדיוס של החרוז והוא Re הרדיוס של העובר. עבור העובר דג זברה, כפי הרדיוס של העובר (400 מיקרומטר) הוא בשני סדרי גודל גדול מזה של החרוז (2.25 מיקרומטר), המשוואה הזו ניתן לקרב את ערכיהן כמו:
F = 4π Tc h (4)- לחשב את המתח הכוח-הכניסה (F-h) עקומות בכל אזור תא חלמון עובר חמש שונים הצבע מדידות.
- חשב את Tc עבור כל F-h עקומת ידי ליניארי-שיטת הריבועים הפחותים הולם. עבור ניתוח סטטיסטי, המתח קורטיקלית Tc שחושב עליך יהיה ממוצעים של שונות F-h עקומות.
- למדוד את המאפיינים viscoelastic (rheology) של קליפת המוח על-ידי החלת משרעת נמוכה (100 ננומטר) תנודות multifrequency במהלך AFM המורכב sinusoidal גלים של תדרים שונים25.
- לחשב יעיל מודולוס מורכבים g*(ƒ) בתחום התדר מן העקומות כניסה כוח כמו:
g * (f) = [F(f) / h(f)]- ifb (5)
כאן אני היא היחידה דמיונית, F(f) ו- h(f) ספקטרום תדירות (f) של כוח וכניסות. b הוא התיקון לגרור את צמיגה על הזיז מופק תנודות מוחל על פני השטח. - נפרדים g*(ƒ) חלקים כמקדמים אמיתי כמו:
g * (פונקציות צפיפות) = g' (f) + איג' (f) (6)
em > g'(f) הנפח, מידת האנרגיה אלסטי האחסון, התאושש בכל מחזור של תנודה. ג'' (f) הוא המודולוס צמיגה that חשבונות עבור האנרגיה dissipated. - לחשב את הטנגנס הפסד, אשר מספק אינדקס מוצק-בדומה (< 1) או נוזלים דמוי (> 1) התנהגות של החומר, כמו:
ג'' (f) / g' (f) (7)
הערה: עם סוג זה של מדידה, זה אפשרי לחלץ פרמטרים המציין כמה צמיגה, כמה אלסטי הוא החומר הנייר. למרות b מעט תלוי המרחק של סוף שלוחה אל פני השטח, בהתחשב הערכים נמוך מאוד של g´´ הוצגו על ידי החלמון התא (ראה איור דו-ממדי להלן), וריאציות קטנות ב' יש השפעה מזערית מדידות29.
- לחשב יעיל מודולוס מורכבים g*(ƒ) בתחום התדר מן העקומות כניסה כוח כמו:
3. חלקיקים מעקב Microrheology
-
לבצע חלקיקים microinjection לתוך התא חלמון
- לפברק המותאמים microneedles באמצעות micropipette אופקי פולר נימי זכוכית בורוסיליקט (ראה טבלה של חומרים).
- להכין microneedles בעלות של הקוטר החיצוני של 1.00 מ מ, של הקוטר הפנימי של 0.58 מ מ באורך של 10 ס מ באמצעות הגדרות פולר: לחץ: 500; חום: 510; משיכה: 65; מהירות: 25; זמן: 50.
- להכין צלחת פטרי הזרקת על-ידי יצירת נתיבי כניסה ישר ב- agarose 1% במיטה בינוני העובר העסקת מותאם אישית בתבניות מוכנות (ראה טבלה של חומרים).
- הפוך את התבניות שבהן למקם אותם על גבי הג'ל agarose נוזלי, להסיר את התבניות לאחר הג'ל התחזק. Pipette העוברים לתוך החריצים שנעשו על ידי כייר ב agarose תחת stereomicroscope ויבתר בהגדלה X 1.2.
הערה: הרוחב ואת העיצוב של התבניות מאפשרות את העוברים ליישור עצמית.
- הפוך את התבניות שבהן למקם אותם על גבי הג'ל agarose נוזלי, להסיר את התבניות לאחר הג'ל התחזק. Pipette העוברים לתוך החריצים שנעשו על ידי כייר ב agarose תחת stereomicroscope ויבתר בהגדלה X 1.2.
- לפני זריקה, הסר כמעט לחלוטין את המדיום כדי להקל על הזרקה (המתח משטח מונע את העובר/chorion של דבק המחט בעת הסרתו לאחר ההזרקה).
- Microinject חלקיקים פלורסנט (רדיוס = 100 ננומטר, ראה טבלה של חומרים) מדולל במים (1:1, 000) בחלק פוליאותן של התא חלמון העובר (איור 3 א).
- להתאים את micropipette עם micromanipulators דיוק, להחדיר את החרוזים microinjector אוטומטית עם פקדי זמן ולחץ (ראה טבלה של חומרים). הגדר את הלחץ בין 10 ל- 20 psi.
- לפני הזרקת הפתרון חרוז, לכייל את עוצמת הקול כדי להזריק (0.5 nL) על ידי מדידת גודל droplet מועברים על ידי microinjector עם מיקרומטר שלב 1 x 0.01 מ מ (ראה את הטבלה של חומרים).
- מעסיקים ההגדלה של 1.6 X ב- stereomicroscope ויבתר להמחיש את העוברים במהלך הזריקות, אשר מבוצעות בטמפרטורת החדר.
- לפברק המותאמים microneedles באמצעות micropipette אופקי פולר נימי זכוכית בורוסיליקט (ראה טבלה של חומרים).
-
להעריך את ההתנהגות viscoelastic של החלמון על ידי הקלטה תרמיות תנודות
- Dechorionate העוברים microinjected כמו צעד 2.1 ולהטביע אותם ב- 0.5% נמוך התכה נקודת agarose בתמיסה בינוני העובר ב 30 º C. לאחר מכן, להעביר אותם לוחות זכוכית (ראה טבלה של חומרים) אוריינט, לדחוף אותם לכיוון coverslip כאשר agarose הוא עדיין נוזלי.
הערה: כאשר agarose מתמצק בטמפרטורת החדר, העוברים מוכנה לדימות. - מקם את העוברים רכוב על לוחית הרשיון התחתון זכוכית על השלב של מיקרוסקופ קונפוקלי הפוך 2 h לאחר microinjection. לכידת תמונות של חלקיקים עבור 26 s בקצב דגימה של 25 הרץ עם יעד X 63 בטמפרטורת החדר במיקרוסקופ קונפוקלי הפוכה העסקת את התוכנה מיקרוסקופ מסחרי רגיל (גודל הפיקסל = 166 nm, תמונות שנלכדו כל ms 40).
- לחשב את המיקום של centroids של החלקיקים ולהגדיר מסלולים שלהם לאורך זמן עם התוסף TrackMate של קוד פתוח ImageJ תוכנה (איור 3B).
- לחשב את מימדי ממוצע הריבועים הזחה (MSD) של כל חלקיק עם תוכנות מחשב6,,30 , כמו:
< Δr2 (τ) > = < [x(t + τ) - x(t)]2 + [y(t + τ) - y(t)]2> (8)
הערה: t הנה הזמן שחלף זמן השהיה. בנוזל צמיגה טהור, MSD עולה הפוך עם צמיגות (ν) על פי מערכת היחסים סטוקס-איינשטיין:
< Δr2 (τ) > = 4kB Tτ/ 6πνa, (9)
כאשר T היא הטמפרטורה המוחלט.
- Dechorionate העוברים microinjected כמו צעד 2.1 ולהטביע אותם ב- 0.5% נמוך התכה נקודת agarose בתמיסה בינוני העובר ב 30 º C. לאחר מכן, להעביר אותם לוחות זכוכית (ראה טבלה של חומרים) אוריינט, לדחוף אותם לכיוון coverslip כאשר agarose הוא עדיין נוזלי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מדידות מתח בקליפת המוח
עבור כל נקודה מדידה, חמש עקומות כוח-הזחה (F-z) נרכשו על ידי AFM באמצעות הגדלת שלוחה 1 הרץ עם משרעת השיא אל שיא של 5 מיקרומטר (מהירות = 10 מיקרומטר/s) עד הכניסה המרבי של ~ 2 מיקרומטר. הליך זה לוקח פחות מ 20 דקות, לא הושפע epiboly התקדמות. כל תנאי הניסוי נבדקה ב עוברי לפחות 5.
העקומות כוח-הזחה הוקלט על התא חלמון העובר, להיפך לאלה התואם agarose שמסביב רך, תערוכת הקשר הליניארי פרופורציונלי (R2 > 0.999) (איור 2 א). אנו לבצע סדרות נוספות של שליטה F-z ' עקומות ' ב 3 מיקרומטר/s ו 30 מיקרומטר/s ו שנמחקו התלות פוטנציאלי של מתח קורטיקלית Tc המהירות הזיז. Tc עלה רק ב- 13% (p < 0.01, מבחן t) כאשר המהירות פחת מ- 10 מיקרומטר/s 3, לא הראה כל שינוי משמעותי כאשר עלה מ 10 ל 30 מיקרומטר/s.
עקומות כוח-כניסה (F-h) הוקלט במהירות זיז של 10 מיקרומטר/s על התא חלמון היו כמעט ליניארי וכוללים נוזלי-בלון מודל (איור 2B)1. זה יאה מותר חישוב הערכים המוחלטים של מתח רשע (pN/מיקרומטר) בשלבים שונים epiboly, לעבר עמדות שונות ביחס EVL בחוד (המזוהה תחת אור המשודרת) (טבלה 1).
ראולוגיה של קליפת המוח
ההבדלים בין הכניסה לבין הכחשה של כוח-הזחה (F-z) עקומות (איור 2C) מצביעים על תופעה viscoelastic של קליפת תא חלמון העובר. משרעת נמוכה (100 ננומטר) multifrequency תנודה מדידות לספק את המידע לחישוב יעיל מודולוס מתחם g*(פונקציות צפיפות) של פני השטח של התא חלמון ומרכיביה אלסטיות וחוזק צמיגה (ראה פרוטוקול לעיל).
Rheology קליפת בתא חלמון עובר דג זברה נשלטת על ידי התנהגות מוצק דמוי עם המודולוס צמיגה נמוך יותר מאשר הנפח15 פעמים. התנהגות זו אינה תדירות תלויה, גם על הגומי (ANOVA, p = 0.123), או עבור המודולוס צמיגה (ANOVA, p = 0.719) (איור דו-ממדי).
ראולוגיה של חלמון
צמיגות החלמון היה מחושב על ידי התאמת משוואה (5) הנתונים MSD המתקבל nanoparticle מעקב (ראה איור 4A-B). MSD של תנודות תרמי של חלקיקים פלורסנט נעוץ החלמון תערוכות של יחסי התלות τ זמן השהיה, תואם אופן הפעולה של נוזל הניוטונית. הטיה יעיל צמיגות החלמון, אשר הפוך קשורה המקדמים דיפוזיה בכמות גדולה של חלקיקים, היה 129 mPa·s.
איור 1: AFM של דג זברה חלמון תאים ויוו. (א) דיאגרמה המתארת את ערכת למעלה מועסק כדי לחקור את קליפת דג זברה תא חלמון על ידי AFM. Dechorionated עוברי בגילאים שונים היו באמצע הדרך מוכנס לתוך חורים שנוצרו בבלוקים agarose מותאם אישית, מסובב לתוך כיוון מסוים ואטום בקצוות עם נקודת התכה נמוכה agarose. התאים חלמון היו שנבדק עם חרוזים כדורית פוליסטירן קשורה על זיז (אדום). (B) העובר ב- 50% epiboly שחצי נעוץ agarose שנבדק עם זיז (false מודגשים באדום) בקוטב vegetal. (ג) העובר המקביל לזה ב- B, ובחן מהתא חלמון באזור קרוב השוליים תאים EVL. גודל ברים = 100 מיקרומטר (B ו- C). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
באיור 2. דג זברה העובר חלמון סלולרי קורטיקלית והמתח rheology. (א) כוח [סטיה (d)]-עקומות הזחה (z) השיג עבור העובר נציג כמו הטיפ זיז מתקרב ואנשי קשר המדגם [agarose השטח (בקרה) בכחול] ואת השטח תא חלמון באדום. (B) להכריח כניסה (F-h) עקומות (n = 3 עוברי, 3 מדידות לכל העובר ממרחק של 10 מיקרומטר אחד מהשני. כל אחת מהמידות מייצג הממוצע של 5 עיקולים) מתאים מודל נוזלי-בלון (מתוך התייחסות1). שימו לב לעלייה ליניארית סטיה בעת מגע עם פני השטח של התא חלמון העובר. קו מקווקו שחור מראה ההתאמה על הדגם (שממנו המתח בקליפת המוח היא להסיק). (ג) קירוב (אדום) ועיקולים הכחשה (סגול) כוח-הזחה עבור העובר נציג. חצים אדום וסגול מעוקל הצבע המשטר הטמפורלי של איסוף נתונים. החץ הדו-כיווני מדגיש את ההבדל בין המתקרב היציבה ערכי סטיה הצבעה על אופייה viscoelastic של קליפת המוח. (ד) Viscoelasticity של קליפת תא חלמון (n = 5 העוברים). מודולוס מורכבים יעיל (g *) מופק multifrequency תנודות AFM מדידות (מ 1). סימנים אדומים מייצגים את הנפח (g'), סימנים כחולים מגדירים המודולוס צמיגה (g″), בהתאמה. זאת אומרת שגיאה סטנדרטית (SE) מוצגים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3. חלקיק מעקב microrheology. (א) חלקיקים פלורסנט מוזרקים לתוך התא חלמון עוברי דג זברה ב- 50% epiboly. (B) Displacements באונ חלקיקים בודדים מופץ באופן אקראי בתוך החלמון (משמאל). מהלך הזמן מסלולים טיפוסי של חלקיקים (centroids) מוטבע בתוך החלמון (2 דוגמאות) בנספח לבטיו האופייניים דיפוזיה צמיגה. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר (א); 1 מיקרומטר (B, משמאל); 200 ננומטר (B, נכון). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
באיור 4. Microrheology של חלמון עובר דג זברה. (א) MSDs של חלקיקים בודדים (n = 99) התערוכה של תלות ליניארית עם זמן השהיה. (B) זאת אומרת ± MSDs לשגיאה הסטנדרטית של חלקיקים, צמיגות החלמון. אנסמבל בממוצע MSDs (ממוצע - הקו האדום ± SE) אופי צמיגה בעיקר האוכלוסייה המוצגים nanoparticle. המדרון ליניארי של קשר הגומלין משקף את המאפיינים דיפוזיה של חלקיקים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| מתח (pN/מ מ) הממוצע ± SE | % Epiboly | |||
| 40-50 | 60-70 | 80-90 | ||
| מרחק אל השוליים EVL | 20 μm (E-ליפשיץ) | - | 60 ± 7 | - |
| 40 μm (YCL) | 67 ± 11 | 72 ± 5 | 110 ± 7 | |
| Vegetal הקוטב | - | 75 ± 3 | - | |
| n = 3 עוברי (5 כניסות בכל) עבור כל תנאי | ||||
טבלה 1: מתח-עתיים הפצה על פני התא חלמון במהלך Epiboly.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הנה אנחנו מראים כי את תכונות החומר מספר פרמטרים ביו-מכני של התא חלמון דג זברה במהלך epiboly יכול להיות בקלות מוערך על ידי AFM ו חלקיקים microrheology.
בעוד AFM ננקטה כדי לאחזר rheological תכונות של תאים ורקמות בתנאים פיזיולוגיים4,5,25,28, כאן אנחנו פיתחנו פרוטוקול ליישום AFM פיתוח ללא פגע עוברי שהפעיל לנו לבחון את השטח תא החלמון של העובר דג זברה במהלך epiboly.
למדידות AFM שלנו, הכיוון של העוברים היה מאובטח על ידי חצי הטמעתם ב agarose ההיתוך נמוכה. ובכל זאת, agarose הטבעה לא השפיע על מדידות AFM. הנוקשות של agarose נמדד ע י חקירת פני השטח שלו עם טיפ כדורית. . מצאנו האלסטיות (E) של 4.2 0.2 הרשות הפלסטינית על התכשיר על-ידי הזזת העקומות כוח-כניסה עם הרץ קשר עם דגם של כדור הסטה פנימה של משטח שטוח של גוף אלסטי. נתון כי E 3g', agarose היה 50-fold רך יותר קליפת תא חלמון (איור דו-ממדי). לכן, בהתחשב מוגבלת עובי וקשיחות נמוך מאוד, המדידות AFM הוקלט על גבי העובר נראה אמין ביותר.
חשוב לציין כי מאחזר את הערכים המוחלטים עבור מתח קורטיקלית מנתונים AFM דורש טיפול קיצוני לגבי התאמת מודל מכני. במקרה של התא חלמון דג זברה, להרכב ייחודי שלה עם עשיר microtubules cytoplasmic שכבה חיצונית המקיף מסה חלמון בעלי צמיגות גבוהה, נוכל לעקוף בעיה זו העסקת מודל נוזלי-בלון המורכב תוחמת קליפת אלסטי נוזלים צמיגה. מודל זה שימש בעבר כדי להעריך את המתח קורטיקלית של leucocytes עם השאיפה micropipette28, ובתאים כדורית מעוברים דג זברה gastrulating מדורגים עם AFM כדורית עצות4, הלה תאים עם מיקרוסקופ כוח אטומי באמצעות תקוע cantilevers22.
אנחנו מעריכים את המתח קורטיקלית של התא חלמון על-ידי הסטה פנימה של פני השטח שלו עם זמינים מסחרית תשר כדורית. המכשיר הקטן הזה אפשר לנו למדוד ישירות הבדלים אזוריים המתח קורטיקלית. כמתואר לעיל, כוח-כניסה נתונים היו מפורש במונחים של מודל נוזלי-בלון מינימלי (הציוד 2). כוח עקומות הקליט על פני השטח של ג'לים ולהגדיל תאים עם טיפ כדורית עם כניסה כחוק כוח עם אקספוננט 3/2. לעומת זאת, מצאנו יחסים יחסי כוח-כניסה מצוידים היטב עם הציוד 2 (איור 2B). התלות הקטן של Tc מהירות זיז, נמוך g' /g' יחס (איור דו-ממדי) מציין כי קליפת מכניקה חולש על התנהגות אלסטי.
חלמון מכניקה היו שנבדק באופן עצמאי עם microparticle rheology. גידול לינארי של MSD נצפו בבירור משקף התנהגות צמיגה טהור. יצוין, כי צמיגות של תמיסות פולימר תלויה בגודל של בדיקה31. לכן, הערך של צמיגות החלמון מדדנו עם מכשיר בדיקה של 100 ננומטר ברדיוס יכול במידה מסוימת נבדלים מולקולרית (למשללזרוח דפולריזציה) או מדידות מאקרוסקופית. יחדיו, תוצאות אלה מספקים תמיכה חזקה על הלימות של המודל נוזלי-בלון, החוסן של המדידות צמיגות קורטיקלית, מתח, חלמון.
אנחנו הסיבה כי גישה זו יכול בקלות להאריך למדוד מכניקה blastoderm, העוברים אותו או אחרים נקודות זמן התפתחותית דג זברה ובמידה בסופו של דבר, אורגניזמים אחרים. קירוב זה רק תלוי הנדסת תהליכי הרכבה המתאים (ראה התייחסות32) הקלת הגישה של AFM רגשים למקומות הנכונים בזמן הנכון. . עדיין, התנועה רציף של תאים ורקמות רוב במהלך הפיתוח צריכה להילקח בחשבון בכל יישום מודלים התפתחותיים אחרים. תנועות התא יגרום היישום של שיטות אלה הרבה יותר מאתגר.
במקרים מסוימים, AFM ויוו יהיה לא מתאים אם לא ניתן להתגבר על בעיות נגישות. גם בפיתוח עוברי וגם מבוגרים, התאים אינם נגישים במידה רבה. וכך, כדי לבדוק מאפיינים biophysical בחיי עיר, הוא ציווי להעסיק. את שיטות לא מצריכים ישיר קשר. ננו-חלקיק מעקב microrheology ממלא את הדרישות האלה6. טכניקה זו מבוססת על הניתוח עם רזולוציה גבוהה יכולות של displacements בראונית של חלקיקים בודדים. המאפיינים micromechanical המקומי של נוזל viscoelastic המקיף חלקיקים אלה הוא השתקפות ישירה של מידת העיכוב-התלות של MSDs שלהם. גישה זו כבר הוחל בפיתוח אורגניזמים ועזר כדי לקבוע את האופי בעלי צמיגות גבוהה של הציטופלסמה העובר30 C. elegans . גילינו כי חלמון דג זברה מציגה מאפיינים המקבילה עם עוברי C. elegans , למרות שלו צמיגות היא בשני סדרי גודל נמוך יותר. לאחרונה דווח על התלות לינאריים של MSD עם ערכים דומים של צמיגות החלמון לאלה של חלמון דג זברה ב דרוזופילה33.
אמנם אנחנו לא לחקור את האפשרות הזו בעצמנו, מוזרק חלקיקים ללא ציפוי ומצופות יש לאחרונה נוקטים כמטרות של מלקחיים אופטיים ב הזחלים דג זברה34. לא פולשנית המיקרומניפולציה בתוך אורגניזם שלם עשוי לתת תובנות לא רק ישיר לתוך התא אינטראקציות אבל אל תכונות מכניות ופעילויות שאינו נגיש באמצעות גישות קיימות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים אין מתחרים אינטרסים כלכליים או אחרים ניגודי עניינים.
Acknowledgments
אנו מודים Amayra הרננדז-וגה, פיליפ-אלכסנדר Pouille על השתתפות בהקמת על בסיס פרוטוקולים אלה. אנו מודים גם פלטפורמת הדמיה מולקולרית IBMB-PCB, אסטבן אקסבייר, חברי המעבדה תמיכה שוטפת. התוכנית קבוצות מאוחדות של Generalitat דה קטלוניה, DGI, מענקים Consolider משרד הכלכלה ואת Competitivity של ספרד ועד EMB DN תמיכה עבודה זו.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Inverted optical microscope | Nikon | TE2000 | Visualization of the sample and AFM cantilever |
| Atomic force microscope (AFM) | Custom made | - | Any commercialized AFM could be employed |
| Inverted Confocal microscope | Zeiss | LSM780 | Nanorheology data collection |
| Agarose D1 Low EEO | Conda | 8016.00 | Casting embryos |
| Ultrapure LMP Agarose (low melting) | Invitrogen | 16520-100 | Securing embryos |
| Zebrafish Microinjection and Transplantation Molds | World Precision Instruments | Z-MOLDS | Casting embryos. Custom made with the original dimensions can also be employed |
| Dumont 5 Forceps | FST | 11251-20 | 1.5 mm diameter |
| Si3N4 cantilever | Novascan | PT.GS | Measuring the embryo by AFM. Spherical tip: 4.5 µm diameter and k=0.01 N/m |
| Fluorescent nanoparticles | Life Technologies | FluoSpheres F8811, | For tracking nanorheology |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | P-2000 | Fabricating tailored microneedles |
| Borosilicate capillary glass | Warner Instruments | G100TF-4 | Fabricating tailored microneedles |
| Micromanipulator | Narishige | MN-153 | Manipulating the micropipette |
| Microinjector | Eppendorf | FemtoJet Express | Controlling injection time and pressure |
| Stereomicroscope | Leica | DFC365FX | Visualization of the embryos during injection |
| Analysis Software | MathWorks | Matlab | Analyzing AFM and particle tracking data |
| Zebrafish | AB and TL wild type | - | Strains employed for embryo collection |
| Glass Bottom Plates | Mat Tek | P35G-0.170-14-C | Mounting embryos for nanorheology data collection |
| Stage micrometer | FST | 29025-02 | Measuring injection volume |
References
- Hernandez-Vega, A., et al. Polarized cortical tension drives zebrafish epiboly movements. EMBO J. 36, 25-41 (2017).
- Brodland, G. W., et al. Video force microscopy reveals the mechanics of ventral furrow invagination in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 22111-22116 (2010).
- Grill, S. W. Growing up is stressful: biophysical laws of morphogenesis. Curr Opin Genet Dev. 21, 647-652 (2011).
- Krieg, M., et al. Tensile forces govern germ-layer organization in zebrafish. Nat Cell Biol. 10, 429-436 (2008).
- Koser, D. E., et al. Mechanosensing is critical for axon growth in the developing brain. Nat Neurosci. 19, 1592-1598 (2016).
- Wirtz, D. Particle-tracking microrheology of living cells: principles and applications. Annu Rev Biophys. 38, 301-326 (2009).
- de Pablo, P. J., Carrión-Vázquez, M. Imaging Biological Samples with Atomic Force Microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 2014, 167-177 (2014).
- Roca-Cusachs, P., et al. Rheology of passive and adhesion-activated neutrophils probed by atomic force microscopy. Biophys J. 91, 3508-3518 (2006).
- Evans, E., Yeung, A. Apparent viscosity and cortical tension of blood granulocytes determined by micropipet aspiration. Biophys J. 56, 151-160 (1989).
- Fabry, B., et al. Time scale and other invariants of integrative mechanical behavior in living cells. Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys. 68, 041914 (2003).
- Kashef, J., Franz, C. M. Quantitative methods for analyzing cell-cell adhesion in development. Dev Biol. 401, 165-174 (2015).
- Chevalier, N. R., et al. Measuring the micromechanical properties of embryonic tissues. Methods. 94, 120-128 (2016).
- Reichlin, T., et al. Investigating native coronary artery endothelium in situ and in cell culture by scanning force microscopy. J Struct Biol. 152, 52-63 (2005).
- Rho, J. Y., Tsui, T. Y., Pharr, G. M. Elastic properties of osteon and trabecular bone measured by nanoindentation. J Biomech. 31, 21 (1998).
- Grant, C. A., et al. Surface characterisation and biomechanical analysis of the sclera by atomic force microscopy. J Mech Behav Biomed Mat. 4, 535-540 (2011).
- Efremov, Y. M., et al. Atomic force microscopy of living and fixed Xenopus laevis embryos. Micron. 42, 840-852 (2011).
- Henkels, J., et al. Spatiotemporal Mechanical Variation Reveals Critical Role for Rho Kinase During Primitive Streak Morphogenesis. Ann Biomed Eng. 41, 421-432 (2013).
- Solnica-Krezel, L. Gastrulation in zebrafish -- all just about adhesion? Curr Opin Genet Dev. 16, 433-441 (2006).
- Kimmel, C. B., et al.
- Rohde, L. A., Heisenberg, C. P. Zebrafish gastrulation: cell movements, signals, and mechanisms. Int Rev Cytol. 261, 159-192 (2007).
- Campinho, P., et al. Tension-oriented cell divisions limit anisotropic tissue tension in epithelial spreading during zebrafish epiboly. Nat Cell Biol. 15, 1405-1414 (2013).
- Fischer-Friedrich, E., et al. Quantification of surface tension and internal pressure generated by single mitotic cells. Sci Rep. 4, 6213 (2014).
- Moeendarbary, E., Harris, A. R. Cell mechanics: principles, practices, and prospects. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 6, 371-388 (2014).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. Eugene, OR. (2000).
- Alcaraz, J., et al. Microrheology of human lung epithelial cells measured by atomic force microscopy. Biophys J. 84, 2071-2079 (2003).
- Jorba, I., et al. Probing Micromechanical Properties of the Extracellular Matrix of Soft Tissues by Atomic Force Microscopy. J Cell Physiol. 232, 19-26 (2017).
- Hutter, J. L., Bechhoefer, J. Calibration of atomic-force microscope tips. Review of Scientific Instruments. 64, 1868-1873 (1993).
- Lomakina, E. B., et al. Rheological analysis and measurement of neutrophil indentation. Biophys J. 87, 4246-4258 (2004).
- Alcaraz, J., et al. Correction of Microrheological Measurements of Soft Samples with Atomic Force Microscopy for the Hydrodynamic Drag on the Cantilever. Langmuir. 18, 716-721 (2002).
- Daniels, B. R., Masi, B. C., Wirtz, D. Probing single-cell micromechanics in vivo: the microrheology of C. elegans developing embryos. Biophys J. 90, 4712-4719 (2006).
- Kalwarczyk, T., et al. Comparative analysis of viscosity of complex liquids and cytoplasm of mammalian cells at the nanoscale. Nano Lett. 11, 2157-2163 (2011).
- Soroldoni, D., et al. Genetic oscillations. A Doppler effect in embryonic pattern formation. Science. 345, 222-225 (2014).
- He, B., et al. Apical constriction drives tissue-scale hydrodynamic flow to mediate cell elongation. Nature. 508, 392-396 (2014).
- Johansen, P. L., et al. Optical micromanipulation of nanoparticles and cells inside living zebrafish. Nat Commun. 7, 10974 (2016).
