Summary
Manglen værktøjer til at måle materialeegenskaber og tensional parametre i vivo forhindrer validering deres roller under udvikling. Vi ansat atomic force mikroskopi (AFM) og nanopartikel-tracking til at kvantificere mekaniske funktioner på intakt zebrafisk embryo æggeblomme celle under epiboly. Disse metoder er pålidelig og bredt anvendelig, undgå indgribende indgreb.
Abstract
Belyse de faktorer, der direkte spatio-temporale organisationen af skiftende væv er en af de primære formål i studiet af udvikling. Forskellige udsagn hævder at have været vigtige bidrag til forståelsen af de mekaniske egenskaber af celler og væv i deres spatiotemporelle organisation i forskellige udviklingsmæssige og morfogenetiske processer. På grund af manglende pålidelige og tilgængelige værktøjer til at måle materialeegenskaber og tensional parametre i vivo, har validering af disse hypoteser imidlertid været svært. Her præsenterer vi metoder beskæftiger atomic force mikroskopi (AFM) og partikel sporing med formålet at kvantificere de mekaniske egenskaber af intakt zebrafisk embryo æggeblomme celle under epiboly. Epiboly er en tidlig bevarede udviklingsproces hvis undersøgelse er lettet af gennemsigtighed af embryoet. Disse metoder er enkle at gennemføre, pålidelige og bredt gældende da de overvinde indgribende indgreb, der kan påvirke væv mekanik. En simpel strategi blev anvendt til montering af enheder, AFM optagelse og nanopartikel injektioner og sporing. Denne tilgang gør disse metoder let at tilpasse til andre udviklingsmæssige gange eller organismer.
Introduction
De fysiske principper den biomekaniske kontrol af morfogenetiske processer er i vid udstrækning udefineret. Mens biomekaniske studier på det molekylære og cellulære niveau er ved at samle betydelige momentum, er udforskning af biomekaniske parametre på væv/organisme niveau på begynderstadiet. Hydrodynamisk Regression1 eller Video kraft mikroskopi2 giver forskere til at skelne mellem aktiv og passiv kræfter, mens laser mikrokirurgi3, eller den mindre indgribende atomic force mikroskopi (AFM) af dissocierede celler4 eller i vivo 5 eller nanopartikel microrheology6 tillade foregribelse af et væv mekaniske egenskaber og svar.
AFM er en tre-dimensionel topografisk teknik med høj atomic opløsning løse overfladeruhed og overholdelse fra indbøjningen af cantilever tips ved kontakt med en probed overflade7. Forskellige metodikker beskæftiger AFM er blevet udviklet for at undersøge overflade egenskaber, herunder måling af friktion, vedhæftning styrker og viskoelastiske egenskaber af forskellige materialer. For nylig, AFM fremstod som et kraftfuldt værktøj til at hente oplysninger om de mekaniske egenskaber af biologiske prøver. AFM kan navnlig ikke-invasivt uddrag komplekse shear modulus fra enkelte celler ved at anvende oscillerende fordybninger med micro spids knyttet til en cantilever kendte bøjning konstant8. Dette lader os udlede resulterende kræfter. Endnu, AFM er ikke entydigt og forskellige metoder giver mulighed for udtrække rheologiske data og mekaniske egenskaber fra enkelte celler (fx mikropipette aspiration9, magnetiske vride flowcytometri (MTC)10, eller enakset trækstyrke test11).
Men anvendelsen af disse nye metoder til komplekse morfogenetiske processer er ikke ligetil. De vigtigste udfordringer ved fastsættelsen af de mekaniske egenskaber af embryonale væv er små (µm til mm), soft (i 102 - 104 Pa range) og viskoelastisk (giver anledning til tidsafhængig fænomener) arten af de materielle12. Det er derfor vigtigt at tilpasse metoderne til bestemmelse af mekaniske egenskaber (stivhed, viskositet, vedhæftning) til det specifikke tilfælde af embryoner og udvikle organismer. To vigtige spørgsmål skal tages i betragtning når du analyserer rheologiske tilgange til at studere udvikling: at undgå forstyrrende indgriben og give let tilgængelighed. I dette scenario udstille mikropipette aspiration, MTC og trækstyrke test begrænsninger. I det første tilfælde, den høje deformation, som en celle lider måske ændre dens fysiologiske og mekaniske egenskaber9. I det andet tilfælde, kunne behovet for at fast overholder den eksperimentelle væv til et substrat til at sikre, at de understreger anvendes deformere cytoskeleton lokalt også indføre effekter på cellerne aktiveringstilstanden og dermed, i deres mekaniske egenskaber10 . Sidste, enakset trækstyrke tilgange er begrænset af geometri for at udvikle organismer og tilgængelighed11.
AFM synes at være bedre egnet til undersøgelse af udviklingsprocesser, da det giver mulighed for undersøgelse af biologiske prøver direkte i deres naturlige miljø uden besværlig prøveforberedelse. Desuden, som dissociation af embryonale væv er generelt vanskeligt, reduceret størrelsen af AFM sonder giver en høj grad af alsidighed med ingen begrænsninger i valget af typen medie (enten vandig eller ikke-vandige), prøve temperatur eller kemiske sammensætningen af stikprøven. AFM er alsidig nok til at anvendes til store domæner og tid skalaer og har været ansat til at hente materiale egenskaber af væv i forskellige udviklingsstadier eller fysiologiske forhold. Hele indfødte væv såsom arterier13 eller knogler14 er blevet undersøgt fra en topografiske synspunkt og i nogle tilfælde, ligesom sclera, mekaniske egenskaber også har hentet15. Topografi er også blevet undersøgt i levende embryoner tillade visualisering af, for eksempel, celle omlejring under morfogenese i Xenopus16. Sidste, omfattende stikprøve forberedelse protokoller er blevet udviklet for at bestemme mekaniske parametre under forskellige udviklingsprocesser. Nanoindentation kort er blevet genereret på native ikke optagne væv sektioner for chick embryonale fordøjelseskanalen11; lim og mekaniske egenskaber hentes til individuelle ectoderm, mesoderm og endoderm stamceller isoleret fra gastrulating zebrafisk embryoner4; stivhed målinger udført for epiblast og primitivstriberne på explants fra aviær embryoner17; og en særskilt mønster af stivhed forløb direkte defineret i embryonale hjernen Xenopus5.
Et betydeligt kvalitetsløft for at anvende AFM for at udforske fosterudviklingen kan komme fra nærmer sig simpel tilgængelige morfogenetiske processer. Zebrafisk epiboly er et vigtigt og bevarede begivenhed, hvor forskellige væv koordinere i en begrænset sfæriske rum til direkte ekspansion af blastoderm i et par timer. Ved starten af zebrafisk epiboly (sfæriske etape) dækker en overfladiske lag af celler, det omsluttende lag (EVL), en halvkugleformet hætte af blastomeres centreret om dyret pole embryoets sidder på en massiv æggeblomme syncytial celle. Epiboly består af kortikale vegetabilsk ward udvidelse af EVL, de dybe celler (DCs) af blastoderm, og det ydre lag af cellen syncytial æggeblomme (E-YSL) omkring æggeblomme. Epiboly slutter med lukningen af EVL og DCs på vegetal pole18,19,20. Hvordan og hvor styrker genereres under epiboly og hvordan de er globalt kombineret er endnu ikke klart1,21.
Her beskriver vi i detaljer hvordan man kan anvende AFM for at udlede passiv mekaniske væv egenskaber under epiboly progression i zebrafisk æggeblomme celle i vivo. Det gør ansat vi lille mikrokugler knyttet til AFM udkragninger som sonder. Dette tillader hentning af præcise lokale oplysninger inden for uensartet æggeblomme celleoverfladen og til at studere tensional forløb og deres dynamik over tid. Alternative AFM tilgange såsom dem, der bruger kile udkragninger22, vil ikke render lokale data, der er præcise nok. Kile teknik, som kræver en meget omhyggelig manipulation færdigheder til at lime en kile større end stikprøvestørrelse for enden af cantilever, er ikke velegnet til sondering embryo (~ bukkes 2 gange større end længden af cantilever) mekanik.
Modellering og karakterisering viskoelastiske egenskaber af celler i kvalitative og kvantitative metoder giver mulighed for en bedre forståelse af deres biomekanik. Fra en biomekanisk synspunkt er det vigtigt at forstå epiboly, og ikke bare efterspørgsel viden om kortikale spænding målinger og dynamik, som kan udvindes af AFM; der er således behov for oplysninger om de biofysiske egenskaber af væv. For at udtrække denne information, en række celle reologi teknikker er blevet udviklet gennem årene for at karakterisere forskellige celletyper under forskellige fysiologiske tilstande23. De omfatter AFM, MTC og optiske pincet (OT). Disse metoder, men har vist sig utilstrækkelig mesoskopisk analyser på omfanget af embryoner eller organer. Som et alternativ, har vi med succes tilpasset nanopartikel-tracking microrheology6 i vivo rheologiske målinger. Denne teknik analyserer de Brownske fordrivelse af enkelte partikler og udleder lokale micromechanical egenskaber.
Sammen AFM og nanopartikel microrheology tillade definition af kortikale tensional dynamik og indre mekaniske egenskaber af blommesækken under epiboly. Denne information støtter fuldt ud en model hvor anisotrope stress udvikler som følge af forskelle i deformation svar af EVL og den æggeblomme cytoplasmatisk lag (YCL) til isotropic actomyosin sammentrækning af E-YSL cortex er afgørende for retningsbestemt netto flytning af EVL og epiboly progression1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle protokol trinene beskrevet nedenfor følger retningslinjerne dyrs pleje af vores institutioner.
1. zebrafisk kultur
- Arten og vedligeholde voksen zebrafisk under standardbetingelser.
Bemærk: AB og TL vildtype embryoner blev brugt til denne undersøgelse. - Indsamle embryoner og dyrke dem ved 28,5 ° C i E3 embryo medium24. Iscenesætte dem ifølge morfologi som tidligere beskrevet19.
2. atomic Force mikroskopi
- Manuelt dechorionate iscenesat zebrafisk embryoner (i forskellige aldre individuelle interesser). Fjern chorions med to tynde og skarpe pincet (Se Tabel af materialer).
- Greb chorion bruger en pincet og gøre en tåre i det med de andre pincet. Derefter holde chorion i en region modsat, at af tåre, skubbe embryo forsigtigt gennem åbningen.
- Udføre dechorionation under et dissekere stereomikroskop med en justerbar vifte af forstørrelse 8 X og 50 X.
- Mount embryoner til AFM
- Der fremstilles en opløsning af 2% Agarosen i embryo medium og udfylde en 35-mm petriskål med dette. Lad den størkne. Lave små huller i 1,5 mm i diameter (dobbelt embryo størrelse) og ca 350 µm dybde (embryo halvdelen) med tynde pincet i Agarosen seng.
- Placer embryoner i puffer i laget Agarosen og forsikre de på plads ved at sprede omkring en løsning på 0,5% lave smeltning Agarosen i embryo medium. Hæld denne løsning omkring bare embryoner til at sikre dem i hullerne.
- Før lavt smeltepunkt Agarosen størkner ved stuetemperatur, rotere embryoner på en sådan måde, at det pågældende område at være aftestede af AFM vil ansigt opad (figur 1A).
- Undersøge embryoner af AFM
- Find og image embryoner i petriskålen beskæftiger en 20 X mål i en inverteret Atomic Force mikroskop (Se Tabel af materialer25) ved stuetemperatur (23-24 ° C).
Bemærk: Embryonerne er holdt i live, nedsænket i embryo medium og knyttet til Agarosen seng. - Sonde æggeblomme cellens overflade af støbt embryoner beskæftiger sfæriske polystyren perler på 4,5 µm i diameter knyttet til en cantilever med en nominel foråret konstant 0,01 N/m. sæt peak til peak amplitude cantilever svingning til 5 µm og dens frekvens til 1 Hz.
- Indsamle data for hver region skal testes i forskellige positioner og i flere embryoner, som en rutine for data i gennemsnit.
Bemærk: Et godt udgangspunkt er at sonde fem positioner placeret i midten og i hjørnerne af en 10 µm x 10 µm pladsen ved at kontrollere cantilever stilling med XY piezo-aktuatorer AFM mikroskop. Billedbehandling og data indsamling tog ca 20 min pr embryo. Registrering af data i forskellige regioner af embryo æggeblomme cellens overflade, fx, den vegetal pole eller forskellige områder tæt på EVL celler margin (figur 1B og 1 C), kan kun gøres ved at ansætte særskilte prøver orienterede forskelligt.
- Find og image embryoner i petriskålen beskæftiger en 20 X mål i en inverteret Atomic Force mikroskop (Se Tabel af materialer25) ved stuetemperatur (23-24 ° C).
- Beregne styrker
- Måler den lodrette forskydning af AFM cantilever (z) med strain gauge sensorer koblet til piezo aktuatorer og dens deformation (d) ved hjælp af en kvadrant fotodiode af metoden optisk løftestang med mikroskop kontrol software (Se Tabel af materialer 25).
- Bruge hældningen af en d-z kurve fremstillet af data indsamlet fra en nøgne region i et glas coverslip for at kalibrere korrelation mellem fotodiode signal og cantilever afbøjning (d).
Bemærk: Den målte forskydningen er lig med cantilever afbøjning og hældningen repræsenterer afbøjning følsomheden af optiske løftestang26. - Aflede cantilever foråret konstant (k) fra de termisk udsving som tidligere beskrevet27.
- Beregne indrykningen af prøven (h) som:
h = (z - zc) -(d - doff) (1)
Bemærk: Her zc er placeringen af kontaktpunkt og doff er forskydningen af en fotodiode. - Beregne kraften (F) på cantilever som:
F = k · d (2)
- Beregne spændingen i cortex i form af en væske-ballon model bestående af en elastisk lag af kortikale spænding Tc omslutter en tyktflydende væske. I denne model, for små fordybninger (i forhold til størrelsen af embryonet), øger kraft proportionalt4,28 som:
F = 4π Tc[(Rb / Re) + 1)] h (3)
Bemærk: Her Rb er radius af perlen og Re er radius af embryoet. For zebrafisk embryon, som radius af embryo (400 µm) er to størrelsesordener større end perle (2.25 µm), kan denne ligning tilnærmes hinanden som:
F = 4π Tc h (4)- Beregne spændinger kraft-indrykning (F-h) kurver i hver embryo æggeblomme celle regionen for fem forskellige punkt målinger.
- Beregne Tc for hver F-h kurve af ikke-lineær mindste kvadraters montering. For statistisk analyse, kortikal spændingen Tc beregnet skal beregnes fra forskellige F-h kurver.
- Måle viskoelastiske egenskaber (reologi) af cortex ved at anvende lav amplitude (100 nm) Multifrekvens svingninger under AFM sammensat af sinusformede bølger af forskellige frekvenser25.
- Beregne en effektiv komplekse modulus g*(ƒ) i frekvens domæne fra force indrykning kurver som:
g * (f) = [F(f) / h(f)]- ifb (5)
Her er den imaginære enhed og F(f) og h(f) er frekvensen (f) spektre af kraft og indrykning. b er korrektion for den tyktflydende træk på cantilever udvundet af svingningerne anvendes på overfladen. - Separat g*(ƒ) i reelle og imaginære dele som:
g * (F) = g' (f) + ig'' (f) (6)
EM > g'(f) er den elasticitetsmodul og er et mål for den elastiske energi gemt og inddrives pr. cyklus af svingning. g'' (f) er den tyktflydende modulus, der tegner sig for den energi, der spredes. - Beregne tab tangent, som indeholder et indeks over solid-lignende (< 1) eller væske-lignende (> 1) adfærd af materialet, som:
g'' (f) / g' (f) (7)
Bemærk: Med denne form for måling, det er muligt at udtrække parametre angiver hvor tyktflydende og hvordan elastisk er det probed materiale. Selv om b afhænger lidt på afstand af slutningen af udlægget til overfladen, betragtning af de meget lave værdier af g´´ udstillet af blommesækken celle (Se figur 2D nedenfor), små variationer i b har en ubetydelig indvirkning målinger29.
- Beregne en effektiv komplekse modulus g*(ƒ) i frekvens domæne fra force indrykning kurver som:
3. partikel Tracking Microrheology
-
Udføre partikel mikroinjektion ind i cellen, æggeblomme
- Fremstille skræddersyede microneedles ved hjælp af en vandret mikropipette aftrækker og kapillær borsilikatglas (Se Tabel af materialer).
- Udarbejde microneedles, der har en ydre diameter på 1,00 mm, en indre diameter på 0.58 mm og en længde på 10 cm ved hjælp af aftrækker indstillinger: Tryk: 500; Varme: 510; Træk: 65; Hastighed: 25; Tid: 50.
- Forberede en injektion petriskål pladen ved at skabe lige indrykning baner i en 1% Agarosen i embryo medium bed beskæftiger custom made forme (Se Tabel af materialer).
- Vend formene hovedet og placere dem på toppen af den flydende agarosegel og fjerne formene når gelen er størknet. Der afpipetteres embryoner i rillerne lavet af mug i Agarosen under et dissekere stereomikroskop på 1,2 X forstørrelse.
Bemærk: Bredde og design af forme aktiverer embryoner selv justere.
- Vend formene hovedet og placere dem på toppen af den flydende agarosegel og fjerne formene når gelen er størknet. Der afpipetteres embryoner i rillerne lavet af mug i Agarosen under et dissekere stereomikroskop på 1,2 X forstørrelse.
- Før injektion, næsten helt at fjerne medium for at lette injektion (overfladespænding forhindrer embryo/chorion klistrer til nålen, når du fjerner det efter injektion).
- Microinject fluorescerende nanopartikler (radius en = 100 nm, se Tabel af materialer) fortyndet i vand (1:1, 000) i den vegetabilske del af cellen embryo æggeblomme (figur 3A).
- Justere mikropipette med præcision micromanipulators og injicere perler med en automatisk microinjector med tid og tryk kontrol (Se Tabel af materialer). Indstille pres mellem 10 og 20 psi.
- Før injektion perle løsning, kalibrere volumen at injicere (0,5 nL) ved at måle Dråbestørrelse leveret af microinjector med en 1 x 0,01 mm objektsmikrometeret (Se Tabel af materialer).
- Ansætte en forstørrelse af 1,6 X i dissekere stereomikroskopet at visualisere embryonerne under injektioner, som udføres ved stuetemperatur.
- Fremstille skræddersyede microneedles ved hjælp af en vandret mikropipette aftrækker og kapillær borsilikatglas (Se Tabel af materialer).
-
Vurdere den viskoelastiske opførsel af blommesækken ved at optage termisk udsving
- Dechorionate de microinjected embryoner som i trin 2.1 og integrere dem i en 0,5% lav smeltepunkt punkt Agarosen i embryo medium opløsning ved 30 ° C. Bagefter, overføre dem til glas bundplade (Se Tabel af materialer) og orientere og skubbe dem i retning af coverslip når Agarosen er stadig flydende.
Bemærk: Når Agarosen størkner ved stuetemperatur, embryonerne er klar til afbildning. - Sted embryonerne monteret i bunden glasplader på scenen af en Konfokal inverteret mikroskop 2 h efter mikroinjektion. Fange billeder af nanopartikler til 26 s på en samplingfrekvens på 25 Hz med et 63 X mål ved stuetemperatur i en inverteret Konfokal mikroskop beskæftiger standard kommercielle mikroskop software (pixelstørrelse = 166 nm, billeder taget hver 40 ms).
- Beregne position af partikler centroids og definere deres baner over tid med TrackMate plugin af open source ImageJ software (figur 3B).
- Beregn to-dimensionelle middelværdi deplacement (MSD) af hver partikel med skræddersyede software6,30 som:
< Δf2 (τ) > = < [x(t + τ) - x(t)]2 + [y(t + τ) - y(t)]2> (8)
Bemærk: Her t er den forløbne tid og forsinkelse. I en ren tyktflydende væske øger MSD omvendt med viskositet (ν) Ifølge Stokes-Einstein forholdet:
< Δf2 (τ) > = 4kB Tτ/ 6πνa, (9)
hvor T er den absolutte temperatur.
- Dechorionate de microinjected embryoner som i trin 2.1 og integrere dem i en 0,5% lav smeltepunkt punkt Agarosen i embryo medium opløsning ved 30 ° C. Bagefter, overføre dem til glas bundplade (Se Tabel af materialer) og orientere og skubbe dem i retning af coverslip når Agarosen er stadig flydende.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kortikale spænding målinger
For hvert målepunkt, fem kraft-forskydning (F-z) kurver blev erhvervet af AFM af ramping cantilever ved 1 Hz med et peak til peak amplitude af 5 µm (hastighed = 10 µm/s) op til en maksimal indrykningen af ~ 2 µm. Denne procedure tager mindre end 20 min og var ikke påvirket af epiboly progression. Hver eksperimentelle tilstand blev testet i mindst 5 embryoner.
Kraft-forskydning kurver optaget på cellen embryo æggeblomme tværtimod til dem, der svarer til den bløde omgivende agarosegelelektroforese, udviser en proportional lineær sammenhæng (R2 > 0.999) (figur 2A). Vi udført ekstra sæt F-z kurver på 3 µm/s og 30 µm/s og kasseret en potentiel afhængighed af kortikale spænding Tc på hastigheden af cantilever kontrol. Tc steg blot 13% (p < 0,01, t-test) når hastigheden blev reduceret fra 10 til 3 µm/s og ikke vise nogen signifikant ændring når steg fra 10 til 30 µm/s.
Kraft-indrykning (F-h) kurver optaget på en cantilever hastighed på 10 µm/s på cellen æggeblomme var næsten lineær og monteret med en væske-ballon model (figur 2B)1. Denne montering tilladt ved beregningen af de absolutte værdier af gennemsnitlige overfladespænding (pN/µm) i forskellige epiboly faser og ved forskellige positioner i forhold til EVL forkant (identificeret under gennemlysning) (tabel 1).
Reologi af cortex
Forskellene mellem indrykning og sammentrækning af kraft-forskydning (F-z) kurver (figur 2 c) angiver en viskoelastiske opførsel af embryo æggeblomme celle cortex. Lav amplitude (100 nm) Multifrekvens svingning målinger give oplysninger til at beregne den effektive komplekse modulus g*(ƒ) af æggeblomme cellens overflade og dens elastisk og tyktflydende komponenter (se protokollen ovenfor).
Cortex reologi i zebrafisk embryo æggeblomme celle er domineret af en solid-lignende opførsel med den tyktflydende modulus 5 gange lavere end elasticitetsmodul1. Denne opførsel er ikke frekvens afhængige, enten for elastiske (ANOVA, p = 0.123), eller til den tyktflydende modulus (ANOVA, p = 0.719) (figur 2D).
Reologi af æggeblomme
Viskositet af blommesækken blev beregnet ved at montere ligning (5) til MSD oplysninger indhentet fra nanopartikel tracking (jf. figur 4A-B). MSD af termisk udsving af fluorescerende nanopartikler indlejret i blommesækken udstiller en proportional afhængighed tidsforskydning τ, overensstemmelse med opførsel af en newtonsk væske. Effektiv shear viskositet af blomme, der er omvendt relateret til bulk diffusion koefficienter af nanopartikler, var 129 mPa·s.
Figur 1: AFM zebrafisk æggeblomme celler in vivo. (A) Diagram beskriver sæt op ansat til at probe zebrafisk æggeblomme celle cortex af AFM. Dechorionated embryoner i forskellige aldre var halvvejs indsat i huller skabt i tilpassede Agarosen blokke, drejes i en bestemt retning og forseglet på kanterne med lavt smeltepunkt agarosegelelektroforese. Æggeblomme celler var probed med sfæriske polystyren perler knyttet til en cantilever (rød). (B) embryon på 50% epiboly halvdelen indlejret i Agarosen aftestede med en cantilever (falsk farvet med rødt) på vegetal pole. (C) en tilsvarende embryonet til at i B, aftestede på cellen æggeblomme i en region tæt på EVL celler margen. Skalere barer = 100 µm (B og C). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Zebrafisk embryo æggeblomme celle kortikale spændinger og reologi. (A) kraft [afbøjning (d)]-deplacement (z) kurver fremstillet for en repræsentativ embryo som cantilever tip tilgange og kontakter stikprøven [Agarosen overflade (control) i blå] og æggeblomme cellens overflade i rød. (B) tvinge indrykning (F-h) kurver (n = 3 embryoner, 3 målinger pr. embryo i en afstand af 10 µm fra hinanden. Hver måling repræsenterer middelværdien af 5 kurver) passer med en væske-ballon model (fra reference1). Bemærk den lineær forøgelse fordrejning ved kontakt med embryo æggeblomme cellens overflade. Den stiplede sorte linie viser montering på modellen (hvorfra den kortikale spændinger er udledes). (C) indbyrdes tilnærmelse (rød) og retraktion (lilla) kraft-forskydning kurver for et repræsentativt embryo. Buede røde og lilla pilene peger på de tidsmæssige regime til indsamling af data. Den dobbeltpil understreger forskellen mellem den nærmer og tilbagetrækningskraften afbøjning værdier peger på viskoelastiske karakter af cortex. (D) Viscoelasticity af æggeblomme celle cortex (n = 5 embryoner). Effektiv komplekse modulus (g *) udvundet fra Multifrekvens svingninger AFM målinger (fra 1). Røde symboler repræsenterer den elasticitetsmodul (g'), og blå symboler definere den tyktflydende modulus (g″), henholdsvis. Betyde og standardfejl (SE) vises. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Partikel tracking microrheology. (A) fluorescerende nanopartikler er sprøjtet ind i cellen æggeblomme i zebrafisk embryoner på 50% epiboly. (B) fordrivelser blev sporet til enkelte nanopartikler tilfældigt fordelt inden for æggeblomme (til venstre). Tid forløbet af de typiske baner af nanopartikler (centroids) indlejret i æggeblomme (2 eksempler) udstille random vandreture, der er karakteristiske for tyktflydende diffusion. Skalalinjen = 100 µm (A); 1 µm (B, venstre); 200 nm (B, højre). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Microrheology af zebrafisk embryo æggeblomme. (A) MSDs af enkelte nanopartikler (n = 99) udviser en ca lineær afhængighed med tidsforskydning. (B) mener ± standardafvigelse MSDs af nanopartikler og viskositet af blommesækken. Ensemble gennemsnit muskel-og skeletbesvær (mean - rød linje ± SE) af nanopartikel befolkning udstiller overvejende tyktflydende karakter. Den lineære skråning af forholdet afspejler diffuserende egenskaberne af nanopartikler. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Spænding (pN/mm) gennemsnit ± SE | % af Epiboly | |||
| 40-50 | 60-70 | 80-90 | ||
| Afstanden til EVL margen | 20 μm (E-YSL) | - | 60 ± 7 | - |
| 40 μm (YCL) | 67 ± 11 | 72 IRHD ± 5 | 110 ± 7 | |
| Vegetal Pole | - | 75 ± 3 | - | |
| n = 3 embryoner (5 fordybninger på hver) for hver betingelse | ||||
Tabel 1: Spatio-temporale spænding distribution på celleoverfladen æggeblomme under Epiboly.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her viser vi, at de materialeegenskaber og nogle biomekaniske parametre af zebrafisk æggeblomme celle under epiboly kan skønnes let ved hjælp af AFM og nanopartikler microrheology.
Mens AFM har været ansat til at hente rheologiske egenskaber i celler og væv i fysiologiske forhold4,5,25,28, udviklede her vi en protokol til AFM for intakt udvikle embryoner, der vi ansat til at teste æggeblomme cellens overflade af zebrafisk embryo under epiboly.
For vores AFM målinger, blev orientering af embryoner sikret ved halv integrere dem i lav smeltepunkt agarosegelelektroforese. Endnu, Agarosen indlejring ikke påvirkede AFM målinger. Stivhed af Agarosen blev målt ved sondering dens overflade med en kugleformet spids. Vi fandt en ung modulus (E) af 4,2 0,2 Pa for denne gel ved at montere kraft-indrykning kurver med Hertz kontakt model af en kugle indrykke en flad overflade af et elastisk organ. Givet at E 3g', Agarosen var 50-fold blødere end æggeblomme celle cortex (figur 2D). Derfor, i betragtning af sine begrænsede tykkelse og meget lav stivhed, AFM målinger registreres på toppen af embryonet synes at være ekstremt pålidelig.
Det er vigtigt at bemærke, at hente absolutte værdier for kortikale spændinger fra AFM data kræver ekstrem omhu på med hensyn til mekanisk model montering. For zebrafisk æggeblomme celle, med sin unikke sammensætning med et ydre mikrotubuli-rige cytoplasmatisk lag omfatter en meget tyktflydende æggeblomme masse, vi omgå problemet beskæftiger en væske-ballon model bestående af en elastisk cortex omslutter en tyktflydende væske. Denne model har tidligere er blevet anvendt til at anslå den kortikale spænding af leukocytter med mikropipette aspiration28, sfæriske stamceller fra gastrulating zebrafisk embryoner indrykket med sfæriske AFM tips4og HeLa celler med AFM ved hjælp af kilet køreledningsophæng22.
Vi anslog den kortikale spænding i cellen æggeblomme af indrykning dens overflade med en kommercielt tilgængelig lille kugleformet spids. Denne lille sonde tillod os at direkte måle regionale forskelle i kortikale spænding. Som beskrevet ovenfor, blev kraft-indrykning data fortolket i form af en minimal væske-ballon model (Eq. 2). Kraft kurver optaget på overfladen af gels og celler med en kugleformet spids øge med indrykning som en magt lov med en 3/2 eksponent. Derimod fandt vi en proportional kraft-indrykning forhold meget godt udstyret med Eq. 2 (figur 2B). Lille afhængighed af Tc cantilever hastighed og lav g'' /g' ratio (figur 2D) angiver at cortex mekanik er domineret af en elastisk opførsel.
Æggeblomme mekanik var uafhængigt aftestede med microparticle reologi. En lineær forøgelse af MSD observeret afspejler klart en ren tyktflydende adfærd. Det skal bemærkes, at viskositet af polymer løsninger afhænger af størrelsen af sonden31. Derfor værdien af æggeblomme viskositet vi målt med en sonde af 100 nm i radius kunne noget afviger fra molekylære (fxfluorescerer depolarisering) eller makroskopisk målinger. Taget sammen, yde disse resultater stærk støtte til tilstrækkeligheden af den væske-ballon model og robusthed af de kortikale spændinger og æggeblomme viskositet målinger.
Vi derfor, at denne fremgangsmåde kan udvides nemt til at måle blastoderm mekanik i de samme embryoner eller andre udviklingsmæssige tid punkter i zebrafisk og i sidste ende, til andre organismer. Denne tilnærmelse vil kun afhænge af engineering passende montering procedurer (Se reference32) letter adgangen af AFM sonder til de rigtige steder på det rigtige tidspunkt. Stadig, kontinuerlig bevægelse af de fleste celler og væv under udvikling bør tages i betragtning i enhver anvendelse til andre udviklingsmæssige modeller. Celle bevægelser vil gøre anvendelsen af disse metoder meget mere udfordrende.
I nogle tilfælde, ville AFM i vivo være uanvendelige, hvis tilgængelighedsproblemer ikke kan løses. Både i udviklingslandene embryoner og voksne er celler stort set utilgængelige. Således, for at teste biofysiske egenskaber i stedet, er bydende nødvendigt at ansætte metoder ikke kræver direkte kontakt. Nanopartikel sporing microrheology opfylder disse krav6. Denne teknik er baseret på en analyse med høj rumlige og tidsmæssige opløsning af de Brownske forskydninger af enkelte partikler. Lokale micromechanical egenskaber af viskoelastisk væske, der omgiver disse nanopartikler er en direkte afspejling af omfanget og tidsforskydning-afhængighed af deres muskel-og skeletbesvær. Denne tilgang er allerede blevet anvendt til at udvikle organismer og har bidraget til at bestemme tegnet meget tyktflydende C. elegans embryo cytoplasma30. Vi afdækket, at en zebrafisk æggeblomme viser tilsvarende egenskaber med C. elegans embryoner, selv om dens viskositet er to størrelsesordener lavere. En lineær tid afhængighed af MSD med lignende værdier af æggeblomme viskositet til dem af zebrafisk blommesækken er for nylig blevet rapporteret i Drosophila33.
Selv om vi ikke selv udforske denne mulighed, er injiceres ubestrøget og belagt nanopartikler for nylig blevet ansat som mål Optisk pincet i zebrafisk larver34. Non-invasiv micromanipulation inde hele mikroorganismepræparatet kan giver ikke bare direkte indsigt i celle interaktioner men i mekaniske egenskaber og aktiviteter ikke er tilgængelige ved hjælp af eksisterende metoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ikke konkurrerende finansielle interesser eller andre interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi takker Amayra Hernández-Vega og Philippe-Alexandre Pouille for at deltage i oprettelsen af grundlaget for disse protokoller. Vi takker også den molekylære billeddannelse Platform fra IBMB-PCB, Xavier Esteban og medlemmer af laboratoriet for løbende support. Programmet konsoliderede grupper af Generalitat de Catalunya og DGI og Consolider tilskud fra ministeriet for økonomi og konkurrenceevne i Spanien til EMB og DN støttet dette arbejde.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Inverted optical microscope | Nikon | TE2000 | Visualization of the sample and AFM cantilever |
| Atomic force microscope (AFM) | Custom made | - | Any commercialized AFM could be employed |
| Inverted Confocal microscope | Zeiss | LSM780 | Nanorheology data collection |
| Agarose D1 Low EEO | Conda | 8016.00 | Casting embryos |
| Ultrapure LMP Agarose (low melting) | Invitrogen | 16520-100 | Securing embryos |
| Zebrafish Microinjection and Transplantation Molds | World Precision Instruments | Z-MOLDS | Casting embryos. Custom made with the original dimensions can also be employed |
| Dumont 5 Forceps | FST | 11251-20 | 1.5 mm diameter |
| Si3N4 cantilever | Novascan | PT.GS | Measuring the embryo by AFM. Spherical tip: 4.5 µm diameter and k=0.01 N/m |
| Fluorescent nanoparticles | Life Technologies | FluoSpheres F8811, | For tracking nanorheology |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | P-2000 | Fabricating tailored microneedles |
| Borosilicate capillary glass | Warner Instruments | G100TF-4 | Fabricating tailored microneedles |
| Micromanipulator | Narishige | MN-153 | Manipulating the micropipette |
| Microinjector | Eppendorf | FemtoJet Express | Controlling injection time and pressure |
| Stereomicroscope | Leica | DFC365FX | Visualization of the embryos during injection |
| Analysis Software | MathWorks | Matlab | Analyzing AFM and particle tracking data |
| Zebrafish | AB and TL wild type | - | Strains employed for embryo collection |
| Glass Bottom Plates | Mat Tek | P35G-0.170-14-C | Mounting embryos for nanorheology data collection |
| Stage micrometer | FST | 29025-02 | Measuring injection volume |
References
- Hernandez-Vega, A., et al. Polarized cortical tension drives zebrafish epiboly movements. EMBO J. 36, 25-41 (2017).
- Brodland, G. W., et al. Video force microscopy reveals the mechanics of ventral furrow invagination in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 22111-22116 (2010).
- Grill, S. W. Growing up is stressful: biophysical laws of morphogenesis. Curr Opin Genet Dev. 21, 647-652 (2011).
- Krieg, M., et al. Tensile forces govern germ-layer organization in zebrafish. Nat Cell Biol. 10, 429-436 (2008).
- Koser, D. E., et al. Mechanosensing is critical for axon growth in the developing brain. Nat Neurosci. 19, 1592-1598 (2016).
- Wirtz, D. Particle-tracking microrheology of living cells: principles and applications. Annu Rev Biophys. 38, 301-326 (2009).
- de Pablo, P. J., Carrión-Vázquez, M. Imaging Biological Samples with Atomic Force Microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 2014, 167-177 (2014).
- Roca-Cusachs, P., et al. Rheology of passive and adhesion-activated neutrophils probed by atomic force microscopy. Biophys J. 91, 3508-3518 (2006).
- Evans, E., Yeung, A. Apparent viscosity and cortical tension of blood granulocytes determined by micropipet aspiration. Biophys J. 56, 151-160 (1989).
- Fabry, B., et al. Time scale and other invariants of integrative mechanical behavior in living cells. Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys. 68, 041914 (2003).
- Kashef, J., Franz, C. M. Quantitative methods for analyzing cell-cell adhesion in development. Dev Biol. 401, 165-174 (2015).
- Chevalier, N. R., et al. Measuring the micromechanical properties of embryonic tissues. Methods. 94, 120-128 (2016).
- Reichlin, T., et al. Investigating native coronary artery endothelium in situ and in cell culture by scanning force microscopy. J Struct Biol. 152, 52-63 (2005).
- Rho, J. Y., Tsui, T. Y., Pharr, G. M. Elastic properties of osteon and trabecular bone measured by nanoindentation. J Biomech. 31, 21 (1998).
- Grant, C. A., et al. Surface characterisation and biomechanical analysis of the sclera by atomic force microscopy. J Mech Behav Biomed Mat. 4, 535-540 (2011).
- Efremov, Y. M., et al. Atomic force microscopy of living and fixed Xenopus laevis embryos. Micron. 42, 840-852 (2011).
- Henkels, J., et al. Spatiotemporal Mechanical Variation Reveals Critical Role for Rho Kinase During Primitive Streak Morphogenesis. Ann Biomed Eng. 41, 421-432 (2013).
- Solnica-Krezel, L. Gastrulation in zebrafish -- all just about adhesion? Curr Opin Genet Dev. 16, 433-441 (2006).
- Kimmel, C. B., et al.
- Rohde, L. A., Heisenberg, C. P. Zebrafish gastrulation: cell movements, signals, and mechanisms. Int Rev Cytol. 261, 159-192 (2007).
- Campinho, P., et al. Tension-oriented cell divisions limit anisotropic tissue tension in epithelial spreading during zebrafish epiboly. Nat Cell Biol. 15, 1405-1414 (2013).
- Fischer-Friedrich, E., et al. Quantification of surface tension and internal pressure generated by single mitotic cells. Sci Rep. 4, 6213 (2014).
- Moeendarbary, E., Harris, A. R. Cell mechanics: principles, practices, and prospects. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 6, 371-388 (2014).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. Eugene, OR. (2000).
- Alcaraz, J., et al. Microrheology of human lung epithelial cells measured by atomic force microscopy. Biophys J. 84, 2071-2079 (2003).
- Jorba, I., et al. Probing Micromechanical Properties of the Extracellular Matrix of Soft Tissues by Atomic Force Microscopy. J Cell Physiol. 232, 19-26 (2017).
- Hutter, J. L., Bechhoefer, J. Calibration of atomic-force microscope tips. Review of Scientific Instruments. 64, 1868-1873 (1993).
- Lomakina, E. B., et al. Rheological analysis and measurement of neutrophil indentation. Biophys J. 87, 4246-4258 (2004).
- Alcaraz, J., et al. Correction of Microrheological Measurements of Soft Samples with Atomic Force Microscopy for the Hydrodynamic Drag on the Cantilever. Langmuir. 18, 716-721 (2002).
- Daniels, B. R., Masi, B. C., Wirtz, D. Probing single-cell micromechanics in vivo: the microrheology of C. elegans developing embryos. Biophys J. 90, 4712-4719 (2006).
- Kalwarczyk, T., et al. Comparative analysis of viscosity of complex liquids and cytoplasm of mammalian cells at the nanoscale. Nano Lett. 11, 2157-2163 (2011).
- Soroldoni, D., et al. Genetic oscillations. A Doppler effect in embryonic pattern formation. Science. 345, 222-225 (2014).
- He, B., et al. Apical constriction drives tissue-scale hydrodynamic flow to mediate cell elongation. Nature. 508, 392-396 (2014).
- Johansen, P. L., et al. Optical micromanipulation of nanoparticles and cells inside living zebrafish. Nat Commun. 7, 10974 (2016).
