Summary
Het gebrek aan instrumenten voor het meten van de materiaaleigenschappen en spanning parameters in vivo kunnen valideren hun rol tijdens de ontwikkeling. Wij werkzaam atomaire kracht microscopie (AFM) en nanoparticle-tracking te kwantificeren van mechanische functies op de intact zebrafish embryo dooier cel tijdens epiboly. Deze methoden zijn betrouwbaar en breed toepasbaar vermijden opdringerig interventies.
Abstract
Het ophelderen van de factoren die de spatio-temporele organisatie direct van de zich ontwikkelende weefsels is één van de primaire doeleinden in de studie van ontwikkeling. Verschillende stellingen beweren te zijn belangrijke bijdragen aan het begrip van de mechanische eigenschappen van cellen en weefsels in hun Spatio organisatie in verschillende ontwikkelings- en morfogenetische processen. Echter, als gevolg van het ontbreken van betrouwbare en toegankelijke instrumenten voor het meten van de materiaaleigenschappen en spanning parameters in vivo, het valideren van deze hypothesen is moeilijk geweest. Hier presenteren we methoden gebruik van atomaire kracht microscopie (AFM) en de particle volgen met als doel het kwantificeren van de mechanische eigenschappen van de intact zebrafish embryo dooier cel tijdens epiboly. Epiboly is een vroege geconserveerde developmental proces wiens studie wordt vergemakkelijkt door de transparantie van het embryo. Deze methoden zijn breed toepasbaar, eenvoudig te implementeren en betrouwbaar aangezien zij overwinnen opdringerig interventies die invloed kunnen hebben op de mechanica van het weefsel. Een eenvoudige strategie werd toegepast voor de montage van specimens, AFM opnemen en nanoparticle injecties en volgen. Deze aanpak maakt deze methoden gemakkelijk aan te passen aan andere ontwikkelingsstoornissen keer of organismen.
Introduction
De fysische principes die ten grondslag liggen aan de biomechanische controle van morfogenetische processen zijn grotendeels ongedefinieerd. Terwijl biomechanische studies op de moleculaire en cellulaire niveau zijn het verzamelen van aanzienlijke dynamiek, is de verkenning van biomechanische parameters op het niveau van het weefsel/organisme in de kinderschoenen. Hydrodynamische regressie1 of Video kracht microscopie2 onderzoekers onderscheiden van actieve en passieve krachten, terwijl de laser microchirurgie3, of de minder opdringerig atomaire kracht microscopie (AFM) van gedissocieerde cellen4 of in vivo 5 of nanoparticle microrheology6 toestaan de anticipatie van een weefsel van mechanische eigenschappen en reacties.
AFM is een driedimensionale topografische techniek met hoge atomaire resolutie oppervlakteruwheid en naleving van de uitwijking van cantilever tips bij contact met een peilden oppervlakte7oplossen. Verschillende methodologieën AFM in dienst hebben ontwikkeld om te onderzoeken van de oppervlakte-eigenschappen, met inbegrip van het meten van de wrijving, hechting krachten en visco eigenschappen van verschillende materialen. Onlangs, AFM heeft ontpopt als een krachtig hulpmiddel voor het ophalen van informatie over de mechanische eigenschappen van biologische monsters. In het bijzonder kan AFM niet-gebeurt pak de complexe afschuifmodulus uit afzonderlijke cellen door oscillerende inkepingen met een micro tip gekoppeld aan een cantilever van bekende buigende constante8toe te passen. Dit laat ons afleiden van de resulterende krachten. Nog, AFM is niet uniek en verschillende methodes kunnen uitpakken Rheologische gegevens en mechanische eigenschappen van afzonderlijke cellen (bijvoorbeeld micropipet aspiratie9, magnetische cytometry (MTC)10draaien, of eenassige treksterkte testen van11).
De toepassing van deze nieuwe methodologieën op complexe morfogenetische processen is echter niet eenvoudig. De belangrijkste uitdagingen bij de bepaling van de mechanische eigenschappen van embryonale weefsels worden de kleine (µm tot mm), zacht (in de 102 - 104 Pa bereik) en visco-elastisch (die aanleiding geven tot tijdafhankelijke verschijnselen) aard van de materiële12. Daarom is het belangrijk aan te passen van de toegepaste methoden voor de bepaling van de mechanische eigenschappen (stijfheid, viscositeit, adhesie) op het specifieke geval van embryo's en ontwikkelende organismen. Twee belangrijke kwesties moeten worden rekening gehouden bij het analyseren van de reologische benaderingen te bestuderen ontwikkeling: opdringerig interferentie te voorkomen en te zorgen voor gemakkelijke toegankelijkheid. In dit scenario vertonen micropipet aspiratie, MTC en testen van de treksterkte beperkingen. In het eerste geval, kan de hoge vervorming dat een cel lijdt zijn fysiologische en mechanische eigenschappen9worden gewijzigd. In het tweede geval kon moet stevig vasthouden de experimentele weefsel op een substraat om ervoor te zorgen dat de stress toegepast het cytoskelet lokaal vervormen ook gevolgen voor de activeringsstatus van de cellen en, vandaar, in hun mechanische eigenschappen10 voeren . Laatste, eenassige treksterkte benaderingen zijn beperkt door de geometrie van de ontwikkeling van organismen en toegankelijkheid11.
AFM lijkt beter geschikt voor de studie van de ontwikkelings processen als het toelaat de studie van biologische monsters rechtstreeks in hun natuurlijke omgeving zonder enige omslachtig monstervoorbereiding. Bovendien, zoals dissociatie van embryonale weefsels over het algemeen moeilijk is, de beperkte grootte van AFM sondes biedt een hoge mate van veelzijdigheid zonder beperking in de keuze van het type medium (waterige of niet-waterige), temperatuur van het monster of chemische samenstelling van het monster. AFM is veelzijdig genoeg om te worden toegepast op grote domeinen en tijd schalen en om op te halen van de materiaaleigenschappen van weefsels in verschillende ontwikkelingsstadia of fysiologische omstandigheden heeft gewerkt. Geheel eigen weefsels zoals slagaders13 of botten14 zijn bestudeerd vanuit het oogpunt van topografische en in sommige gevallen, zoals de sclera, mechanische eigenschappen zijn ook ontvangen15. Topografie is ook onderzocht in levende embryo's waardoor de visualisatie van, bijvoorbeeld, cel omlegging tijdens morfogenese in Xenopus16. Laatste, uitgebreide steekproef voorbereiding protocollen hebben ontwikkeld om te bepalen van mechanische parameters tijdens verschillende ontwikkelings processen. Nanoindentation kaarten zijn gegenereerd op inheemse nietgefixeerde weefselsecties voor de chick embryonale spijsverteringskanaal11; zelfklevend en mechanische eigenschappen opgehaald voor individuele ectoderm, mesoderm en endoderm voorlopercellen geïsoleerd van gastrulating zebrafish embryo's4; stijfheid metingen voor de epiblast en de primitiefstreek op explantaten van aviaire embryo's17; en een verschillend patroon van stijfheid verlopen rechtstreeks gedefinieerd in het embryonale brein van Xenopus5.
Een belangrijke kwalitatieve sprong voorwaarts voor de toepassing van AFM voor het verkennen van de embryonale ontwikkeling kan afkomstig zijn van het naderen van eenvoudige toegankelijk morfogenetische processen. Zebravis epiboly is een essentieel en geconserveerde evenement, waarin verschillende weefsels en in een beperkte sferische ruimte coördineren om de uitbreiding van de blastoderm in een paar uur. Op het begin van de zebravis epiboly (sferische fase) dekt een oppervlakkige laag van cellen, de omhullende laag (EVL), een semi-sferische cap van blastomeren gecentreerd op de paal dier van het embryo zittend op een massale dooier syncytieel cel. Epiboly bestaat uit de uitbreiding van de corticale plantaardige ward van de EVL, de diepe cellen (DCs) van de blastoderm, en de externe laag van de syncytieel dooier cel (E-YSL) rond de eidooier. Epiboly eindigt met de sluiting van de EVL en de DCs op de vegetal pole18,19,20. Hoe en waar troepen worden gegenereerd tijdens epiboly en hoe zij wereldwijd zijn gekoppeld is nog niet duidelijk1,21.
Hier beschrijven we in detail hoe toe te passen van de AFM om te concluderen passieve mechanische weefsel eigenschappen tijdens epiboly progressie in de zebravis dooier cel in vivo. Om dit te doen, we klein microsferen gekoppeld aan AFM uitkragingen als sondes gebruikt. Hierdoor is het ophalen van de precieze lokale informatie binnen het celoppervlak van niet-uniforme dooier en te bestuderen of spanning verlopen en hun dynamiek na verloop van tijd. Alternatieve AFM benaderingen zoals die gebruik maken van de wig uitkragingen22, zal niet render lokale gegevens die nauwkeurig genoeg is. De techniek van de wig, waarvoor zeer voorzichtig manipulatie vaardigheden naar een wig groter is dan de grootte van de steekproef aan het einde van de uitkraging lijm, is niet goed geschikt voor indringende embryo (~ 2-fold groter is dan de lengte van de uitkraging) mechanica.
Modellering en karakterisering van de visco-eigenschappen van de cellen in kwalitatieve en kwantitatieve manieren zorgt voor een beter begrip van hun biomechanica. Vanuit een biomechanische oogpunt is het essentieel om te begrijpen epiboly, en niet alleen vraag naar kennis over corticale spanning metingen en de dynamiek, die kunnen worden geëxtraheerd door AFM; Er is dus behoefte aan informatie over de biofysische eigenschappen van het weefsel. Om deze informatie, een verscheidenheid van cel reologie technieken zijn ontwikkeld door de jaren heen om het karakteriseren van verschillende celtypes onder verschillende fysiologische omstandigheden23. Zij omvatten AFM, MTC en optisch pincet (OT). Deze methoden, echter hebben bewezen ontoereikend voor mesoscopische analyses op de schaal van embryo's of organen. Als alternatief hebben wij met succes nanoparticle-tracking microrheology6 voor in vivo Rheologische metingen aangepast. Deze techniek analyseert de Brownse verplaatsingen van individuele deeltjes en eigenschappen van de lokale micromechanische afleidt.
Samen AFM en nanoparticle microrheology toestaan dat de definitie van corticale spanning dynamiek en interne mechanische eigenschappen van de dooier tijdens epiboly. Deze informatie onderschrijft volledig een model waarin anisotrope stress ontwikkelt als gevolg van de verschillen in de reactie van de vervorming van de EVL en de dooier cytoplasmatische laag (YCL) naar de isotrope actomyosine samentrekking van de E-YSL cortex is essentieel voor de directionele netto verplaatsing van de EVL en epiboly progressie1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle protocol stappen hieronder beschreven richtsnoeren dierenverzorgers van onze instellingen.
1. de zebravis cultuur
- Fokken en onderhouden van volwassen zebrafish onder standaardomstandigheden.
Opmerking: AB en TL wild type embryo's werden gebruikt voor deze studie. - Verzamelen van de embryo's en groeien ze bij 28,5 ° C in E3 embryo middellange24. Etappe hen volgens morfologie als eerder beschreven19.
2. atomic Force microscopie
- Handmatig dechorionate geënsceneerd zebrafish embryo's (van verschillende leeftijden volgens individuele belangen). Verwijder chorions met twee dunne en scherpe pincet (Zie Tabel van materialen).
- Grip van de chorion met behulp van een pincet en maak een scheur in het met de andere verlostang. Vervolgens houden de chorion in een regio tegengesteld aan die van de scheur, duwen het embryo zachtjes door de opening.
- Het uitvoeren van de dechorionation onder een ontleden stereomicroscoop met een aanpasbare bereik van 50 X tot 8 X vergroting.
- De embryo's Mount voor AFM
- Bereiden van een oplossing van 2% agarose in embryo's medium en vul een 35-mm petrischaal met dit. Laat het stollen. Kleine gaatjes van 1,5 mm diameter (tweemaal de grootte van het embryo) en ongeveer 350 µm diepte (de embryo helft) met een dunne Tang in het agarose bed maken
- Plaats de embryo's in de pokes gemaakt in de agarose laag en verzekeren dat zij in plaats door het verspreiden van rond een oplossing van 0.5% lage smelten agarose in embryo medium. Giet deze oplossing rond alleen de embryo's teneinde hen in de gaten.
- Voordat de lage smeltpunt agarose bij kamertemperatuur stolt, draaien de embryo's op een zodanige wijze dat de regio van belang om te worden bestudeerd door de AFM zal worden geconfronteerd met omhoog (figuur 1A).
- Onderzoeken van de embryo's door AFM
- Zoek en de embryo's in de petrischaal met een 20 X doelstelling in een Inverted Atomic Force Microscope beeld (Zie Tabel van materialen25) bij kamertemperatuur (23-24 ° C).
Opmerking: De embryo's worden in leven gehouden ondergedompeld in embryo's medium en aangesloten aan het bed agarose. - Sonde het celoppervlak dooier van gegoten embryo's sferische polystyreen kralen van 4.5 µm in diameter gekoppeld aan een cantilever met een constante nominale lente van 0,01 N/m. de amplitude van de piek-tot-piek van cantilever-interstadiaal instelt met 5 µm en de frequentie ervan tot 1 Hz in dienst.
- Het verzamelen van gegevens voor elke regio te beproeven in verschillende posities en in meerdere embryo's, als een routine, voor het gemiddelde van de gegevens.
Opmerking: Een goed uitgangspunt is om te sonderen vijf posities gelegen in het midden en op de hoeken van een vierkant van 10 µm x 10 µm door het beheersen van de positie van de ' Freischwinger ' met de XY piëzo-actuatoren van de AFM Microscoop. Beeldvorming en gegevensverzameling nam ongeveer 20 min per embryo. Opslag van gegevens in verschillende regio's van het embryo dooier celoppervlak, kan bijvoorbeeld, de vegetal paal of verschillende regio's dicht bij de EVL cellen marge (figuur 1B en 1 C), alleen worden gedaan door gebruik te maken van verschillende exemplaren anders georiënteerd.
- Zoek en de embryo's in de petrischaal met een 20 X doelstelling in een Inverted Atomic Force Microscope beeld (Zie Tabel van materialen25) bij kamertemperatuur (23-24 ° C).
- Berekenen van krachten
- De verticale verplaatsing van de AFM cantilever (z) met spanningsmeter sensoren gekoppeld aan piëzo-actuatoren, en haar doorbuiging (d) met behulp van een fotodiode Kwadrant door de optische hefboom-methode met de software van de controle van de Microscoop te meten (Zie Tabel van materialen 25).
- Gebruik de helling van een d-z-curve verkregen gegevens verzameld uit een kale regio van een dekglaasje glas aan het kalibreren van de correlatie tussen het fotodiode-signaal en de cantilever uitwijking (d).
Opmerking: De gemeten verticale verplaatsing gelijk is aan de uitwijking cantilever en de helling vertegenwoordigt de gevoeligheid van de doorbuiging van de optische hendel26. - Afleiden dat Cantilever voorjaar constante (k) van de thermische schommelingen27zoals hiervoor is beschreven.
- Berekenen de inspringing van het monster (h) als:
h = (z - z-c) -(d - duit) (1)
Opmerking: Zc is de positie van het contactpunt hier en daf is de verschuiving van de fotodiode. - Bereken de kracht (F) op de uitkraging als:
F = k · d (2)
- Bereken de spanning van de cortex in termen van een vloeistof-ballon model dat bestaat uit een elastische laag van corticale spanning Tc bijvoeging van een viskeuze vloeistof. In dit model voor kleine inkepingen (ten opzichte van de grootte van het embryo), kracht neemt toe proportioneel4,,28 als:
F = 4π Tc[(Rb / Re) + 1)] h (3)
Opmerking: Hier Rb is de straal van de parel en Re is de straal van het embryo. Voor het embryo van de zebravis, als de straal van het embryo (400 µm) twee ordes van grootte groter dan dat van de Parel (2,25 µm), is kan deze vergelijking worden benaderd als:
F = 4π Tc h (4)- Bereken de spanning kracht-inspringing (F-h) krommen in elk embryo dooier cel regio voor vijf verschillende metingen wijzen.
- Berekent de Tc voor elk F-h curve door niet-lineaire kleinste kwadraten past. Voor statistische analyse, de corticale spanning Tc berekend moet worden gemiddeld uit de verschillende F-h curven.
- Meten van de visco-eigenschappen (reologie) van de cortex door lage amplitude toe te passen (100 nm) multifrequency oscillaties tijdens AFM samengesteld uit sinusvormige golven van verschillende frequenties25.
- Een effectieve complexe modulus g*(ƒ) in het frequentiedomein van de curven van de inspringing kracht als berekenen:
g * (f) = [F(f) / h(f)]- ifb (5)
hier is de imaginaire eenheid en F(f) en h(f) zijn de spectra van de frequentie (f) van kracht en inspringing. b is de correctie voor de viskeuze drag op de uitkraging geëxtraheerd uit de oscillaties toegepast op het oppervlak. - Aparte g*(ƒ) in reële en imaginaire delen als:
g * (Ƒ) = g' (f) + ig'' (f) (6)
em > g'(f) is de elasticiteitsmodulus is een maatregel van de elastische energie opgeslagen en hersteld per cyclus van trilling. g'' (f) is het viskeuze modulus die goed is voor de gedissipeerde energie. - Berekent de tangens van verlies, waarmee een index van de solid-achtige (< 1) of vloeistof-achtig (> 1) gedrag van het materiaal, zoals:
g'' (f) / g' (f) (7)
Opmerking: Met dit soort meting, is het mogelijk om uit te pakken van de parameters die aangeeft hoe viskeuze en hoe elastische is de peilden materiaal. Hoewel b is enigszins afhankelijk van de afstand van het einde van de ' Freischwinger ' aan de oppervlakte, gezien de zeer lage waarden van g´´ tentoongesteld van de dooier cel (Zie figuur 2D hieronder), kleine variaties in b hebben een te verwaarlozen effect in de metingen29.
- Een effectieve complexe modulus g*(ƒ) in het frequentiedomein van de curven van de inspringing kracht als berekenen:
3. de particle volgen Microrheology
-
Uitvoeren van deeltje microinjection in de dooier cel
- Fabriceren van op maat gemaakte microneedles met behulp van een horizontale micropipet trekker en capillaire borosilicaatglas (Zie Tabel van materialen).
- Microneedles hebben een buitendiameter van 1.00 mm, een inwendige diameter van 0.58 mm en een lengte van 10 cm met trekker instellingen bereiden: druk: 500; Serie: 510; Pull: 65; Snelheid: 25; Tijd: 50.
- Voorbereiden een injectie petrischaal plaat door te maken van rechte inspringing rijstroken in een 1% agarose in embryo middellange bed met aangepaste gemaakte mallen (Zie Tabel van materialen).
- De mallen ondersteboven en plaats ze op de top van de vloeibare agarose gel en de mallen te verwijderen zodra de gel heeft verhard. Pipetteer de embryo's in de groeven gemaakt door de schimmel in de agarose onder een ontleden stereomicroscoop bij 1.2 X vergroting.
Opmerking: De breedte en het ontwerp van de mallen inschakelen de embryo's zelf worden uitgelijnd.
- De mallen ondersteboven en plaats ze op de top van de vloeibare agarose gel en de mallen te verwijderen zodra de gel heeft verhard. Pipetteer de embryo's in de groeven gemaakt door de schimmel in de agarose onder een ontleden stereomicroscoop bij 1.2 X vergroting.
- Vóór injectie, bijna volledig verwijderen van het medium om de injectie (de oppervlaktespanning voorkomt dat de embryo's / chorion steken op de naald, bij het verwijderen van het na injectie).
- Microinject van fluorescerende nanodeeltjes (straal een = 100 nm, Zie Tabel van materialen) verdund in water (1:1, 000) in het plantaardige deel van het embryo dooier cel (figuur 3A).
- Aanpassen van de micropipet met precisie micromanipulators en injecteren de kralen met een automatische microinjector met tijd en druk besturingselementen (Zie Tabel van materialen). Instellen van de druk tussen 10 en 20 psi.
- Vóór het injecteren van de kraal-oplossing, het kalibreren van het volume te injecteren (0,5 nL) door het meten van de grootte van de druppel geleverd door de microinjector met een 1 x 0.01 mm fase micrometer (Zie de Tabel van de materialen).
- Dienst een vergroting van 1.6 X in het ontleden stereomicroscoop om te visualiseren van de embryo's tijdens de injecties, die worden uitgevoerd bij kamertemperatuur.
- Fabriceren van op maat gemaakte microneedles met behulp van een horizontale micropipet trekker en capillaire borosilicaatglas (Zie Tabel van materialen).
-
Beoordelen van het visco-gedrag van de dooier door het opnemen van thermische schommelingen
- Dechorionate de microinjected embryo's als in stap 2.1 en insluit in een 0,5% laag smelten punt agarose in embryo middellange oplossing bij 30 ° C. Daarna overbrengen naar glazen bodem platen (Zie Tabel van materialen) en oriënteren en duw ze naar het dekglaasje aan wanneer de agarose nog vloeibaar is.
Opmerking: Wanneer de agarose bij kamertemperatuur stolt, de embryo's zijn klaar om te worden beeld. - Plaats de embryo's gemonteerd in de bodem van de glasplaten op het podium van een confocal omgekeerde Microscoop 2 h na microinjection. Foto's vastleggen van de nanodeeltjes voor 26 s bij een sampling rate van 25 Hz met een 63 X doelstelling bij kamertemperatuur in een omgekeerde confocal microscoop met de standaard commerciële Microscoop software (pixelgrootte = 166 nm, beelden elke 40 ms).
- Berekenen van de positie van de deeltjes centroids en definiëren hun trajecten na verloop van tijd met de TrackMate plugin van de open source ImageJ software (figuur 3B).
- Bereken de tweedimensionale Mean Square verplaatsing (MSD) van elk deeltje met op maat gemaakte software6,30 als:
< Δr2 (τ) > = < [x(t + τ) - x(t)]2 + [y(t + τ) - y(t)]2> (8)
Nota: Hier t is de verstreken tijd en de tijdspanne. In een pure viskeuze vloeistof verhoogt de MSD omgekeerd met viscositeit (ν) volgens de Stokes-Einstein-relatie:
< Δr2 (τ) > = 4kB Tτ/ 6πνa, (9)
waar is T de absolute temperatuur.
- Dechorionate de microinjected embryo's als in stap 2.1 en insluit in een 0,5% laag smelten punt agarose in embryo middellange oplossing bij 30 ° C. Daarna overbrengen naar glazen bodem platen (Zie Tabel van materialen) en oriënteren en duw ze naar het dekglaasje aan wanneer de agarose nog vloeibaar is.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Corticale spanning metingen
Voor elk meetpunt, vijf kracht-verplaatsing (F-z) krommen werden verworven door de AFM door speedramp de uitkraging 1 Hz met een amplitude van de piek-tot-piek van 5 µm (snelheid = 10 µm/s) tot een maximale inspringing van ~ 2 µm. Deze procedure was het nemen van minder dan 20 min en werd niet beïnvloed door epiboly progressie. Elke experimentele voorwaarde werd getest in ten minste 5 embryo's.
De curven van de kracht-verplaatsing opgenomen op de embryo dooier cel, integendeel aan die overeenkomt met de zachte omliggende agarose, vertonen een proportionele lineaire relatie (R2 > 0.999) (figuur 2A). Wij uitgevoerd extra sets van besturingselement F-z curven op 3 µm/s en 30 µm/s en een potentiële afhankelijkheid van corticale spanning Tc van de snelheid van de uitkraging weggegooid. Tc slechts met 13% gestegen (p < 0,01, t-toets) wanneer de snelheid werd teruggebracht van 10 tot 3 µm/s en toonde geen significante wijzigingen als verhoogd van 10 tot 30 µm/s.
Kracht-inspringing (F-h) bochten opgenomen met een cantilever snelheid van 10 µm/s op de cel die dooier waren bijna lineaire en uitgerust met een vloeistof-ballon model (figuur 2B)1. Deze montage mag de berekening van de absolute waarden van gemiddelde oppervlaktespanning (pN/µm) in epiboly van de verschillende fasen en op verschillende posities ten opzichte van de voorrand van de EVL (aangeduid onder doorvallend licht) (tabel 1).
Reologie van de cortex
De verschillen tussen de inspringing en de intrekking van kracht-verplaatsing (F-z) krommen (figuur 2C) geven een visco-gedrag, van de embryo dooier cel cortex. Lage amplitude (100 nm) multifrequency oscillatie metingen bieden de informatie voor de berekening van de effectieve complexe modulus g*(ƒ) van het celoppervlak dooier en zijn elastisch en viskeuze componenten (zie protocol hierboven).
De cortex reologie in de zebravis embryo dooier cel wordt gedomineerd door een solid-achtig gedrag met de viskeuze modulus 5 keer lager dan de elasticiteitsmodulus1. Dit gedrag is niet frequentie afhankelijk, hetzij voor de elastische (ANOVA, p = 0.123), of voor de viskeuze modulus (ANOVA, p = 0.719) (figuur 2D).
Reologie van de dooier
De viscositeit van de dooier werd berekend door het aanbrengen van vergelijking (5) de MSD-gegevens verkregen nanoparticle bijhouden (Zie figuur 4A-B). Het MSD van thermische schommelingen van fluorescerende nanodeeltjes ingebed in de dooier vertoont een proportionele afhankelijkheid van vertraging τ, consistent met het gedrag van een Newtoniaanse vloeistof. De viscositeit van de effectieve schuintrekken van de dooier, die omgekeerd gerelateerd is aan de bulk diffusie coëfficiënten van de nanodeeltjes, was 129 mPa·s.
Figuur 1: AFM van zebravis dooier cellen in vivo. (A) Diagram beschrijven de set up werkzaam sonde de zebravis dooier cel cortex door AFM. Dechorionated embryo's van verschillende leeftijden waren halverwege gaten gemaakt in aangepaste agarose blokken, in een bepaalde richting gedraaid en verzegeld aan de randen met lage smeltpunt agarose ingevoegd. De dooier cellen werden gesondeerd met bolvormige polystyreen kralen gekoppeld aan een cantilever (rood). (B) Embryo op 50% epiboly die helft ingebed in agarose gesondeerd met een cantilever (onwaar gekleurd in rood) op de vegetal paal. (C) een gelijkwaardig embryo dat in B, peilden bij de dooier cel in een regio dicht bij de EVL cellen marge. Schaal bars = 100 µm (B en C). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2. Zebravis embryo dooier cel corticale spanning en reologie. (A) kracht [doorbuiging (d)]-curven van de verplaatsing (z) verkregen voor een representatieve embryo zoals de ' Freischwinger '-tip benaderingen en contacten van het monster [het agarose oppervlak (control) in blauw] en het celoppervlak dooier in het rood. (B) dwingen inspringen (F-h) curven (n = 3 embryo's, 3 metingen per embryo op een afstand van 10 µm van elkaar. Elke meting geeft het gemiddelde van 5 curven) passen met een vloeistof-ballon model (van referentie1). Opmerking de lineaire toename van de doorbuiging bij contact met het embryo dooier celoppervlak. De zwarte stippellijn geeft de montage aan het model (waaruit de corticale spanning is afgeleid). (C) onderlinge aanpassing (rood) en retractie (paars) kracht-verplaatsing curven voor een representatieve embryo. Gebogen rode en paarse pijlen wijzen naar de temporele regime van gegevensverzameling. De tweepuntige pijl wijst op het verschil tussen het naderen en intrekken van de doorbuiging waarden verwijzen naar het visco-karakter van de cortex. (D) Viscoelasticity van de dooier cel cortex (n = 5 embryo's). Effectieve complexe modulus (g *) geëxtraheerd uit multifrequency oscillaties AFM metingen (vanaf 1). Rode symbolen vertegenwoordigen de elasticiteitsmodulus (g'), en blauwe symbolen definiëren de viskeuze modulus (g″), respectievelijk. Betekenen en standaardfout (SE) worden weergegeven. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3. Particle volgen microrheology. (A) TL nanodeeltjes worden ingespoten in de cel in de dooier van zebravis embryo's bij 50% epiboly. (B) verplaatsingen werden bijgehouden voor afzonderlijke nanodeeltjes willekeurig verdeeld binnen de dooier (links). Tijdsverloop van de typische trajecten van nanodeeltjes (centroids) ingebed in de dooier (2 voorbeelden) tentoonstelling toevalsbewegingen die karakteristiek voor viskeuze diffusie zijn. Schaal bar = 100 µm (A); 1 µm (B, links); 200 nm (B, rechts). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4. Microrheology van de zebravis embryo dooier. (A) MSDs van individuele nanodeeltjes (n = 99) vertonen een ongeveer lineair afhankelijkheid met vertraging. (B) betekenen ± standaardafwijking MSDs van nanodeeltjes en viscositeit van de dooier. Ensemble gemiddeld MSDs (gemiddelde - rode lijn ± SE) van de nanoparticle bevolking exposities overwegend viskeuze karakter. De lineaire helling van de relatie weerspiegelt de diffusive eigenschappen van de nanodeeltjes. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Spanning (pN/mm) gemiddelde ± SE | % van Epiboly | |||
| 40-50 | 60-70 | 80-90 | ||
| Afstand tot de EVL marge | 20 μm (E-YSL) | - | 60 ± 7 | - |
| 40 μm (YCL) | 67 ± 11 | 72 ± 5 | 110 ± 7 | |
| Vegetal Pole | - | 75 ± 3 | - | |
| n = 3 embryo's (5 inspringingen op elk) voor elke voorwaarde | ||||
Tabel 1: Spatio-temporele spanning distributie op het celoppervlak dooier tijdens Epiboly.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier laten we zien dat de materiële eigenschappen en sommige biomechanische parameters van de zebravis dooier cel tijdens de epiboly worden gemakkelijk door AFM en nanodeeltjes microrheology geschat kunnen.
Terwijl AFM heeft gewerkt om op te halen van de reologische eigenschappen van cellen en weefsels in fysiologische omstandigheden4,5,25,28, ontwikkelde hier we een protocol voor de toepassing van de AFM aan de ontwikkeling van intact embryo's die we gebruikt om te testen het celoppervlak van de dooier van het embryo van de zebravis tijdens epiboly.
Voor onze metingen van de AFM, werd de oriëntatie van de embryo's beveiligd door de helft hen te embedding in lage smeltende agarose. Nog, agarose insluiten beïnvloedde niet AFM metingen. De stijfheid van het agarose werd gemeten door het sonderen van het oppervlak met een sferische tip. We vonden een Youngs modulus (E) van 4,2 0.2 Pa voor dit gel door het aanbrengen van de kracht-inspringing bochten met de Hertz Neem contact op met het model van een bol inspringen een plat oppervlak van een elastische lichaam. Gegeven dat E 3g', de agarose was 50-fold zachter dan de dooier cel cortex (figuur 2D). Daarom, gezien haar beperkte dikte en de zeer lage stijfheid, de metingen van de AFM opgenomen bovenop het embryo blijken te zijn uiterst betrouwbaar.
Het is belangrijk op te merken dat ophalen van absolute waarden voor corticale spanning uit AFM gegevens uiterste zorg op met betrekking tot de montage van de mechanische model eisen. In het geval van de zebravis dooier cel, met haar unieke samenstelling met een microtubuli-rijke cytoplasmatische buitenlaag omvat een zeer viskeuze dooier massa, omzeilen wij dit probleem met een vloeistof-ballon model dat bestaat uit een elastische cortex bijvoeging een viskeuze vloeistof. Dit model is eerder hanteert voor het schatten van de corticale spanning van leukocyten met micropipet aspiratie28, sferische voorlopercellen van gastrulating zebrafish embryo's ingesprongen met bolvormige AFM tips4en HeLa cellen bij AFM met behulp van ingeklemd kraagt22.
Wij de corticale spanning van de cel van de dooier door het oppervlak met een commercieel beschikbare kleine bolvormige tip inspringen geschat. Deze kleine sonde konden we direct regionale verschillen in de corticale spanning meten. Zoals hierboven beschreven, werden kracht-inspringing gegevens geïnterpreteerd in termen van een minimale vloeistof-ballon model (Eq. 2). Kracht curven opgenomen op het oppervlak van gels en cellen met een sferische tip toenemen met inspringing als een vermogen wet met een 3/2-exponent. Daarentegen vonden we een proportionele werking-inspringing relatie zeer goed uitgerust met Eq. 2 (figuur 2B). Beetje afhankelijk van Tc cantilever snelheid en de lage g'' /g' verhouding (figuur 2D) geeft aan dat de cortex mechanica wordt gedomineerd door een elastisch gedrag.
Dooier mechanica waren onafhankelijk gesondeerd met microparticle reologie. De lineaire toename van MSD waargenomen weerspiegelt duidelijk een zuivere viskeuze gedrag. Opgemerkt moet worden dat de viscositeit van Polymeeroplossingen hangt af van de grootte van de sonde31. Dus, de waarde van de dooier viscositeit we gemeten met een sonde van 100 nm in straal kan enigszins afwijken van moleculaire (bijvoorbeeldfluoresceren depolarisatie) of macroscopische metingen. Samen genomen, deze resultaten sterke steun geven aan de toereikendheid van de vloeistof-ballon model en de robuustheid van de corticale spanning en dooier viscositeit metingen.
Wij reden dat deze aanpak kan gemakkelijk worden uitgebreid voor het meten van de mechanica van de blastoderm in de dezelfde embryo's of andere ontwikkelingsstoornissen tijdstippen in de zebravis en, uiteindelijk, naar andere organismen. Deze benadering zal alleen afhangen van engineering passende montage procedures (zie referentie32) vergemakkelijking van de toegang van de AFM sondes op de juiste plaats op het juiste moment. Toch moet de continue beweging van de meeste cellen en weefsels tijdens de ontwikkeling rekening vanuit elke toepassing andere ontwikkelingsstoornissen modellen worden gehouden. Cel bewegingen zal de toepassing van deze methoden maken veel uitdagender.
In sommige gevallen zou AFM in vivo niet toepasbaar als toegankelijkheidsproblemen niet overwonnen kunnen worden. Zowel in de ontwikkeling van embryo's en volwassenen zijn cellen grotendeels ontoegankelijk. Om te testen biofysische eigenschappen in situ, is noodzakelijk om methoden niet in dienst waarvoor derhalve direct contact. Nanoparticle voor het bijhouden van microrheology voldoet aan deze eisen6. Deze techniek is gebaseerd op de analyse met hoge ruimtelijke en temporele resolutie van de Brownse verplaatsingen van individuele deeltjes. De eigenschappen van de lokale micromechanische van de visco-vloeistof die deze nanodeeltjes omringt is een directe afspiegeling van de omvang en vertraging-afhankelijkheid van hun spier-en skeletaandoeningen. Deze aanpak is al toegepast aan de ontwikkeling van organismen en heeft bijgedragen tot het bepalen van de zeer viskeuze karakter van de C. elegans embryo cytoplasma30. We ontdekt dat een zebravis dooier gelijkwaardige met C. elegans embryo's eigenschappen, hoewel de viscositeit twee ordes van grootte lager is. Een lineaire tijdafhankelijkheid van MSD met gelijkaardige waarden van dooier viscositeit tot die van de zebravis dooier heeft onlangs gemeld in Drosophila33.
Hoewel we deze mogelijkheid niet onszelf verkennen hebben, zijn ingespoten niet gestreken en gecoate nanodeeltjes onlangs tewerkgesteld als doelen van optisch pincet in zebrafish larven34. Niet-invasieve micromanipulation binnen een geheel-organisme kan niet alleen directe inzichten geven in cel interacties, maar in de mechanische eigenschappen en activiteiten niet toegankelijk met behulp van bestaande benaderingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen of andere belangenconflicten.
Acknowledgments
Wij danken Amayra Hernández-Vega en Philippe-Alexandre Pouille voor deelname aan het opzetten van de basis voor deze protocollen. Wij danken ook de Molecular Imaging Platform van de IBMB-PCB, Xavier Esteban en leden van het laboratorium voor continue ondersteuning. De geconsolideerde groepen programma van de Generalitat de Catalunya en de DGI en de subsidies van de Consolider van het ministerie van economie en de concurrentiekracht van Spanje voor EMB en DN ondersteund dit werk.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Inverted optical microscope | Nikon | TE2000 | Visualization of the sample and AFM cantilever |
| Atomic force microscope (AFM) | Custom made | - | Any commercialized AFM could be employed |
| Inverted Confocal microscope | Zeiss | LSM780 | Nanorheology data collection |
| Agarose D1 Low EEO | Conda | 8016.00 | Casting embryos |
| Ultrapure LMP Agarose (low melting) | Invitrogen | 16520-100 | Securing embryos |
| Zebrafish Microinjection and Transplantation Molds | World Precision Instruments | Z-MOLDS | Casting embryos. Custom made with the original dimensions can also be employed |
| Dumont 5 Forceps | FST | 11251-20 | 1.5 mm diameter |
| Si3N4 cantilever | Novascan | PT.GS | Measuring the embryo by AFM. Spherical tip: 4.5 µm diameter and k=0.01 N/m |
| Fluorescent nanoparticles | Life Technologies | FluoSpheres F8811, | For tracking nanorheology |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | P-2000 | Fabricating tailored microneedles |
| Borosilicate capillary glass | Warner Instruments | G100TF-4 | Fabricating tailored microneedles |
| Micromanipulator | Narishige | MN-153 | Manipulating the micropipette |
| Microinjector | Eppendorf | FemtoJet Express | Controlling injection time and pressure |
| Stereomicroscope | Leica | DFC365FX | Visualization of the embryos during injection |
| Analysis Software | MathWorks | Matlab | Analyzing AFM and particle tracking data |
| Zebrafish | AB and TL wild type | - | Strains employed for embryo collection |
| Glass Bottom Plates | Mat Tek | P35G-0.170-14-C | Mounting embryos for nanorheology data collection |
| Stage micrometer | FST | 29025-02 | Measuring injection volume |
References
- Hernandez-Vega, A., et al. Polarized cortical tension drives zebrafish epiboly movements. EMBO J. 36, 25-41 (2017).
- Brodland, G. W., et al. Video force microscopy reveals the mechanics of ventral furrow invagination in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 22111-22116 (2010).
- Grill, S. W. Growing up is stressful: biophysical laws of morphogenesis. Curr Opin Genet Dev. 21, 647-652 (2011).
- Krieg, M., et al. Tensile forces govern germ-layer organization in zebrafish. Nat Cell Biol. 10, 429-436 (2008).
- Koser, D. E., et al. Mechanosensing is critical for axon growth in the developing brain. Nat Neurosci. 19, 1592-1598 (2016).
- Wirtz, D. Particle-tracking microrheology of living cells: principles and applications. Annu Rev Biophys. 38, 301-326 (2009).
- de Pablo, P. J., Carrión-Vázquez, M. Imaging Biological Samples with Atomic Force Microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 2014, 167-177 (2014).
- Roca-Cusachs, P., et al. Rheology of passive and adhesion-activated neutrophils probed by atomic force microscopy. Biophys J. 91, 3508-3518 (2006).
- Evans, E., Yeung, A. Apparent viscosity and cortical tension of blood granulocytes determined by micropipet aspiration. Biophys J. 56, 151-160 (1989).
- Fabry, B., et al. Time scale and other invariants of integrative mechanical behavior in living cells. Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys. 68, 041914 (2003).
- Kashef, J., Franz, C. M. Quantitative methods for analyzing cell-cell adhesion in development. Dev Biol. 401, 165-174 (2015).
- Chevalier, N. R., et al. Measuring the micromechanical properties of embryonic tissues. Methods. 94, 120-128 (2016).
- Reichlin, T., et al. Investigating native coronary artery endothelium in situ and in cell culture by scanning force microscopy. J Struct Biol. 152, 52-63 (2005).
- Rho, J. Y., Tsui, T. Y., Pharr, G. M. Elastic properties of osteon and trabecular bone measured by nanoindentation. J Biomech. 31, 21 (1998).
- Grant, C. A., et al. Surface characterisation and biomechanical analysis of the sclera by atomic force microscopy. J Mech Behav Biomed Mat. 4, 535-540 (2011).
- Efremov, Y. M., et al. Atomic force microscopy of living and fixed Xenopus laevis embryos. Micron. 42, 840-852 (2011).
- Henkels, J., et al. Spatiotemporal Mechanical Variation Reveals Critical Role for Rho Kinase During Primitive Streak Morphogenesis. Ann Biomed Eng. 41, 421-432 (2013).
- Solnica-Krezel, L. Gastrulation in zebrafish -- all just about adhesion? Curr Opin Genet Dev. 16, 433-441 (2006).
- Kimmel, C. B., et al.
- Rohde, L. A., Heisenberg, C. P. Zebrafish gastrulation: cell movements, signals, and mechanisms. Int Rev Cytol. 261, 159-192 (2007).
- Campinho, P., et al. Tension-oriented cell divisions limit anisotropic tissue tension in epithelial spreading during zebrafish epiboly. Nat Cell Biol. 15, 1405-1414 (2013).
- Fischer-Friedrich, E., et al. Quantification of surface tension and internal pressure generated by single mitotic cells. Sci Rep. 4, 6213 (2014).
- Moeendarbary, E., Harris, A. R. Cell mechanics: principles, practices, and prospects. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 6, 371-388 (2014).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. Eugene, OR. (2000).
- Alcaraz, J., et al. Microrheology of human lung epithelial cells measured by atomic force microscopy. Biophys J. 84, 2071-2079 (2003).
- Jorba, I., et al. Probing Micromechanical Properties of the Extracellular Matrix of Soft Tissues by Atomic Force Microscopy. J Cell Physiol. 232, 19-26 (2017).
- Hutter, J. L., Bechhoefer, J. Calibration of atomic-force microscope tips. Review of Scientific Instruments. 64, 1868-1873 (1993).
- Lomakina, E. B., et al. Rheological analysis and measurement of neutrophil indentation. Biophys J. 87, 4246-4258 (2004).
- Alcaraz, J., et al. Correction of Microrheological Measurements of Soft Samples with Atomic Force Microscopy for the Hydrodynamic Drag on the Cantilever. Langmuir. 18, 716-721 (2002).
- Daniels, B. R., Masi, B. C., Wirtz, D. Probing single-cell micromechanics in vivo: the microrheology of C. elegans developing embryos. Biophys J. 90, 4712-4719 (2006).
- Kalwarczyk, T., et al. Comparative analysis of viscosity of complex liquids and cytoplasm of mammalian cells at the nanoscale. Nano Lett. 11, 2157-2163 (2011).
- Soroldoni, D., et al. Genetic oscillations. A Doppler effect in embryonic pattern formation. Science. 345, 222-225 (2014).
- He, B., et al. Apical constriction drives tissue-scale hydrodynamic flow to mediate cell elongation. Nature. 508, 392-396 (2014).
- Johansen, P. L., et al. Optical micromanipulation of nanoparticles and cells inside living zebrafish. Nat Commun. 7, 10974 (2016).
