Summary
A falta de ferramentas para medir propriedades materiais e parâmetros tensional na vivo impede Validando seus papéis durante o desenvolvimento. Utilizamos microscopia de força atômica (AFM) e acompanhamento de nanopartículas para quantificar as características mecânicas da célula de gema intacta zebrafish embrião durante epiboly. Esses métodos são confiáveis e amplamente aplicável, evitando intervenções intrusivas.
Abstract
Elucidar os fatores que direcionam a organização espaço-temporal de evolução tecidos é uma das principais finalidades no estudo do desenvolvimento. Várias proposições afirmam ter sido importantes contribuições para o entendimento das propriedades mecânicas de células e tecidos em sua organização spatiotemporal em diferentes processos de desenvolvimento e morfogenéticas. No entanto, devido à falta de ferramentas confiáveis e acessíveis para medir propriedades materiais e parâmetros tensional na vivo, validar estas hipóteses tem sido difícil. Aqui nós apresentamos métodos empregando microscopia de força atômica (AFM) e partículas de rastreamento com o objectivo de quantificar as propriedades mecânicas da célula de gema intacta zebrafish embrião durante epiboly. Epiboly é um processo de desenvolvimento precoce conservado cujo estudo é facilitado pela transparência do embrião. Esses métodos são simples de implementar, confiáveis e amplamente aplicável, desde que eles superam intrusivas intervenções que poderiam afetar a mecânica do tecido. Uma estratégia simples foi aplicada para a montagem de amostras, gravação de AFM e injeções de nanopartículas e rastreamento. Esta abordagem faz com que esses métodos facilmente adaptável para outros tempos do desenvolvimento ou organismos.
Introduction
Os princípios físicos subjacentes o controle biomecânico de processos morfogenéticas são largamente indefinidos. Enquanto estudos biomecânicos a nível molecular e celular estão se reunindo considerável impulso, a exploração dos parâmetros biomecânicos no nível do tecido/organismo está em sua infância. Hidrodinâmico regressão1 ou vídeo microscopia de força2 permite aos investigadores distinguir forças ativas e passivas, enquanto o de microcirurgia laser3, ou a menos intrusiva microscopia de força atômica (AFM) de células dissociadas4 ou na vivo 5 ou nanopartículas microrheology6 permitem a antecipação de um tecido propriedades mecânicas e respostas.
AFM é uma técnica topográfica tridimensional com resolução de rugosidade da superfície e conformidade da deflexão de dicas do cantilever em caso de contacto com uma superfície sondado7de alta resolução atômica. Diferentes metodologias empregando AFM foram desenvolvidas para investigar as propriedades da superfície, incluindo medição de atrito, forças de adesão e nas propriedades viscoelásticas de diversos materiais. Recentemente, a AFM tem emergido como uma ferramenta poderosa para recuperar informações sobre as propriedades mecânicas de amostras biológicas. Em particular, AFM não invasiva pode extrair o módulo de cisalhamento complexo de células únicas aplicando recuos oscilatórios com uma ponta de micro ligada a um cantilever de constante flexão conhecido8. Isto permite-nos inferir a resultante de forças. No entanto, AFM não é exclusiva e diferentes metodologias permitem extrair dados reológicos e propriedades mecânicas de células individuais (por exemplo, micropipeta aspiração9, magnético de torção cytometry (MTC)10, ou uniaxial elástica testando a11).
No entanto, a aplicação dessas novas metodologias para processos complexos morfogenéticas não é simples. Os principais desafios enfrentados na determinação das propriedades mecânicas dos tecidos embrionários são os pequenos (µm a mm), macio (no 102 - 10 intervalo de4 Pa) e natureza de visco-elástico (dando origem a fenómenos de tempo-dependente) do material12. Portanto, é importante adaptar os métodos utilizados para a determinação das propriedades mecânicas (rigidez, viscosidade, aderência) para o caso específico de embriões e organismos em desenvolvimento. Duas questões importantes devem ser tomadas em consideração quando analisando reológicas abordagens para estudar o desenvolvimento: para evitar interferência intrusiva e para fornecer fácil acessibilidade. Neste cenário, aspiração micropipeta, MTC e teste de tração apresentam limitações. No primeiro caso, a alta deformação que sofre de uma célula pode alterar suas propriedades fisiológicas e mecânicas9. No segundo caso, a necessidade de aderir firmemente o tecido experimental a um substrato para garantir que as tensões aplicadas deformam o citoesqueleto localmente também poderia apresentar efeitos no estado de ativação das células e, consequentemente, em suas características mecânicas10 . Abordagens de tração uniaxiais, últimas são limitadas pela geometria do desenvolvimento de organismos e acessibilidade11.
AFM parece ser mais adequado para o estudo de processos de desenvolvimento, pois permite o estudo de amostras biológicas diretamente em seu ambiente natural sem qualquer preparação da amostra pesada. Além disso, como a dissociação dos tecidos embrionários é geralmente difícil, o tamanho reduzido das sondas AFM fornece um alto grau de versatilidade com nenhuma limitação na escolha do tipo de meio (aquoso ou aquosos), temperatura da amostra ou produto químico composição da amostra. AFM é versátil o suficiente para ser aplicado a grandes domínios e escalas de tempo e tem sido empregada para recuperar propriedades materiais de tecidos em diferentes estádios de desenvolvimento ou em condições fisiológicas. Todo nativos tecidos tais como artérias13 ou ossos14 foram estudadas do ponto de vista topográfico e em alguns casos, como a esclera, propriedades mecânicas também foram recuperados15. Topografia também tem sido explorada em embriões ao vivo, permitindo a visualização de, por exemplo, o rearranjo de célula durante a morfogênese em Xenopus16. Protocolos de preparação abrangente, última amostra foram desenvolvidos para determinar parâmetros mecânicos durante os processos de desenvolvimento diferentes. Nanoindentação mapas foram gerados em secções de tecido unfixed nativo para o filhote embrionário do aparelho digestivo,11; propriedades adesivas e mecânicas obtida para células individuais ectoderme, mesoderme e endoderme progenitoras isoladas de gastrulating zebrafish4embriões; realizadas medidas de rigidez para o epiblasto e raia primitiva em explantes de embriões aviários17; e um padrão distinto de gradientes de rigidez definidos diretamente no cérebro embrionário do Xenopus5.
Um salto qualitativo significativo para a aplicação de AFM para explorar o desenvolvimento embrionário pode vir de aproximação simples processos morfogenéticas acessíveis. Zebrafish epiboly é um evento essencial e conservado, em que diferentes tecidos coordenam em um espaço restrito esférico para direcionar a expansão da Drosophila em poucas horas. No início da epiboly zebrafish (fase esférica), uma camada superficial de células, a camada envolvente (EVL), abrange um boné semi-esférico de blastómeros centrada no polo animal do embrião sentado em uma cela sincicial gema maciça. Epiboly consiste a expansão cortical ala vegetal do EVL, as células profundas (DCs) da Drosophila e a camada externa da célula em torno da gema gema sincicial (E-YSL). Epiboly termina com o encerramento do EVL e as DCs no polo vegetal18,19,20. Como e onde as forças são geradas durante a epiboly e como eles são acoplados globalmente ainda não está claro1,21.
Aqui descrevemos detalhadamente como aplicar AFM para inferir Propriedades tecido mecânico passivo durante progressão epiboly a gema de zebrafish celular na vivo. Para isso, usamos pequenas microesferas anexadas a AFM cantilevers como sondas. Isto permite a recuperação de informações locais precisas dentro da superfície de células não-uniforme de gema e estudar gradientes tensionais e sua dinâmica ao longo do tempo. AFM alternativo aproxima-se como aqueles que usam Cunha cantilevers22, will não processar dados local que é suficientemente precisos. A técnica de cunha, que requer habilidades de manipulação muito cuidado para colar um pedaço maior do que o tamanho da amostra no final do cantilever, não é adequada para sondar o embrião (~ 2 dobras maiores que o comprimento do cantilever) mecânica.
Modelagem e caracterizar as propriedades viscoelásticas de células de forma qualitativa e quantitativa permitem uma melhor compreensão da sua biomecânica. Do ponto de vista biomecânico, é essencial para compreender a epiboly e não apenas a demanda conhecimento em medições de tensão cortical e dinâmica, que pode ser extraída por AFM; assim, não há necessidade de informações sobre as propriedades biofísicas do tecido. Para extrair essas informações, uma variedade de técnicas de reologia celular foram desenvolvidos ao longo dos anos para caracterizar os diferentes tipos de células sob diferentes condições fisiológicas23. Eles incluem AFM, MTC e pinças ópticas (OT). Esses métodos, no entanto, têm provados inadequados para mesoscópica análises na escala de embriões ou órgãos. Como alternativa, adaptámos com êxito acompanhamento de nanopartículas microrheology6 para medições reológicas na vivo . Esta técnica analisa os deslocamentos browniano das partículas isoladas e infere Propriedades micromecânicas local.
Junto microrheology AFM e nanopartículas permite a definição de dinâmica tensional cortical e propriedades mecânicas internas da gema durante epiboly. Esta informação apoia plenamente um modelo no qual anisotrópica stress desenvolve-se em consequência as diferenças na resposta de deformação do EVL e a camada citoplasmática de gema (YCL) para a contração isotrópica actomyosin do córtex E YSL é essencial para o movimento líquido direcional da EVL e epiboly progressão1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todas as etapas do protocolo descritas abaixo sigam as orientações de cuidados com animais de nossas instituições.
1. Zebrafish cultura
- Criar e manter zebrafish adulto em condições normais.
Nota: AB e TL tipo selvagem embriões foram utilizados para este estudo. - Coletar embriões e cultivá-las a 28,5 ° C na E3 embrião médio24. Estágio-los de acordo com a morfologia como descrito anteriormente,19.
2. microscopia de força atômica
- Manualmente dechorionate encenado zebrafish embriões (de diferentes idades, de acordo com os interesses individuais). Remova chorions com dois pinça fina e afiada (ver Tabela de materiais).
- Segure o córion usando uma pinça e tornar uma lágrima com a outra pinça. Em seguida, segurando o córion numa região oposta do rasgo, empurre o embrião suavemente através da abertura.
- Execute o dechorionation sob um estereomicroscópio dissecação com uma escala ajustável de ampliação entre 8x e 50 X.
- Montar os embriões para AFM
- Preparar uma solução de agarose 2% no meio do embrião e encher um prato de Petri 35mm com isto. Deixe solidificar. Faça pequenos furos de 1,5 mm de diâmetro (duas vezes o tamanho do embrião) e profundidade de aproximadamente 350 µm (metade do embrião tamanho) com pinça fina na cama do agarose.
- Coloque os embriões no pokes feito na camada de agarose e garantir que eles estão no lugar, espalhando em torno de uma solução de 0,5% de baixa fusão agarose no meio do embrião. Despeje esta solução em torno de apenas os embriões para fixá-los nos buracos.
- Antes que a agarose de baixo ponto de fusão que se solidifica à temperatura ambiente, gire os embriões de tal forma que a região de interesse a ser sondada por AFM enfrentará para cima (figura 1A).
- Examinar os embriões por AFM
- Localize e os embriões no prato de petri empregando um objectivo X 20 em um microscópio de força atômica invertida da imagem (consulte a Tabela de materiais25) à temperatura ambiente (23-24 ° C).
Nota: Os embriões são mantidos vivos imerso no meio do embrião e anexada à sua cama de agarose. - Sonda de superfície celular de gema de embriões fundidas empregando esferas de poliestireno esféricas de 4,5 µm de diâmetro conectado a um cantilever com uma constante de mola nominal de 0,01 N/m. definir a amplitude pico-a-pico de oscilação do cantilever para 5 µm e sua frequência de 1 Hz.
- Colete dados para cada região a ser testado em posições diferentes e em vários embriões, como uma rotina, para uma média de dados.
Nota: Um bom ponto de partida é a sonda de 5 posições, localizadas no meio e nos cantos de um quadrado de µm 10 µm x 10 controlando a posição do cantilever com os XY piezo-atuadores do microscópio AFM. Coleção de imagens e dados levou cerca de 20 min por embrião. Gravação de dados em diferentes regiões da superfície da célula de gema do embrião, por exemplo, o polo vegetal ou diferentes regiões próximas a margem de células EVL (figura 1B e 1C), só pode ser feito empregando distintas espécimes orientadas de forma diferente.
- Localize e os embriões no prato de petri empregando um objectivo X 20 em um microscópio de força atômica invertida da imagem (consulte a Tabela de materiais25) à temperatura ambiente (23-24 ° C).
- Calcular as forças
- Medir o deslocamento vertical do cantilever AFM (z) com sensores de Extensômetro acoplados ao piezo-atuadores e sua deflexão (d) usando um fotodíodo quadrante pelo método óptico de alavanca com o software de controle de microscópio (ver Tabela de materiais 25).
- Use a inclinação de uma curva de d-z obtida a partir de dados coletados de uma região nua de uma lamela de vidro para calibrar a correlação entre o sinal do fotodiodo e a deflexão do cantilever (d).
Nota: O deslocamento vertical medido é igual a deflexão do cantilever e a inclinação representa a sensibilidade de deflexão da alavanca óptica26. - Inferi que a constante de mola do cantilever (k) das flutuações térmicas conforme descrito anteriormente27.
- Calcule o recuo da amostra (h) como:
h = (z - zc) -(d - dfora) (1)
Nota: Aqui zc é a posição do ponto de contacto e dfora é o deslocamento do fotodiodo. - Calcule a força (F) no cantilever como:
F = k · d (2)
- Calcule a tensão do córtex em termos de um modelo de balão de líquido consistindo de uma camada elástica de tensão cortical Tc encerram um líquido viscoso. Neste modelo, para recuos pequenos (em comparação com o tamanho do embrião), força aumenta proporcionalmente4,28 , como:
F = 4π Tc[(Rb / Re) + 1)] h (3)
Nota: Aqui nb R é o raio da esfera e ne R é o raio do embrião. Para o embrião do zebrafish, como o raio do embrião (400 µm) é duas ordens de magnitude maiores do que o grânulo (2.25 µm), esta equação pode ser aproximada como:
F = 4π Tc h (4)- Calcular o força de tensão-recuo (F-h) curvas em cada região de célula de gema do embrião por cinco diferentes apontam as medições.
- Calcule o Tc para cada F-h curva por não-linear menos-quadrados encaixe. Para análise estatística, a tensão cortical Tc calculado deve ser em média dos diferentes F-h curvas.
- Medir as propriedades viscoelásticas (reologia) do córtex através da aplicação de baixa amplitude (100 nm) oscilações de multifrequência durante AFM é composto por ondas senoidais de diferentes frequências de25.
- Calcule um módulo eficaz de complexo g*(ƒ) no domínio da frequência de curvas de recuo de força, como:
g * (f) = [F(f) / h(f)]- ifb (5)
aqui é a unidade imaginária e F(f) e h(f) são os espectros de frequência (f) da força e recuo. b é a correção para o arrasto viscoso em cantilever extraído as oscilações aplicadas na superfície. - Separado g*(ƒ) em partes reais e imaginárias, como:
g * (Ƒ) = g' (f) + ig' (f) (6)
em > g'(f) é o módulo de elasticidade e é uma medida da energia elástica armazenada e recuperada por ciclo de oscilação. g' (f) é o módulo viscoso que contabiliza a energia dissipada. - Calcular a tangente de perda, que fornece um índice de como o sólido (< 1) ou líquido-como (> 1) comportamento do material, como:
g' (f) / g' (f) (7)
Nota: Com este tipo de medida, é possível extrair parâmetros indicando como viscoso e elástico como é o material sondado. Embora b ligeiramente depende da distância da extremidade do cantilever à superfície, dado os valores muito baixos de g´´ exibido pela gema de célula (ver Figura 2D abaixo), pequenas variações no b têm um impacto insignificante as medições de29.
- Calcule um módulo eficaz de complexo g*(ƒ) no domínio da frequência de curvas de recuo de força, como:
3. partícula rastreamento Microrheology
-
Executar a microinjeção de partículas na célula de gema
- Fabrica sob medidas microagulhas usando um extrator de micropipeta horizontal e vidro de borosilicato capilar (ver Tabela de materiais).
- Preparar microagulhas que têm um diâmetro externo de 1,00 mm, diâmetro interno de 0,58 mm e um comprimento de 10 cm, usando as configurações do extrator: pressão: 500; Calor: 510; Tração: 65; Velocidade: 25; Tempo: 50.
- Prepare uma placa de Petri de injeção através da criação de faixas de recuo em linha reta em um agarose a 1% na cama médio de embrião empregando moldes feitos feitos sob encomenda (consulte a Tabela de materiais).
- Vire os moldes e colocá-los em cima do gel do agarose líquido e remover os moldes, uma vez que o gel tem solidificado. Pipete os embriões nas ranhuras feitas pelo molde no agarose sob um estereomicroscópio dissecação 1.2 ampliação de X.
Nota: A largura e o projeto dos moldes permitem que os embriões alinhar o Self.
- Vire os moldes e colocá-los em cima do gel do agarose líquido e remover os moldes, uma vez que o gel tem solidificado. Pipete os embriões nas ranhuras feitas pelo molde no agarose sob um estereomicroscópio dissecação 1.2 ampliação de X.
- Antes da injeção, remova quase completamente o meio para facilitar a injeção (a tensão de superfície impede que o embrião/córion degola para a agulha quando removê-lo após a injeção).
- Microinjeção de nanopartículas fluorescentes (raio um = 100 nm, consulte Tabela de materiais) diluído em água (1:1, 000) na parte vegetal da célula de gema embrião (Figura 3A).
- Ajustar a micropipeta com Micromanipuladores precisão e injetar os grânulos com um microinjector automático com controles de tempo e pressão (ver Tabela de materiais). Ajustar a pressão entre 10 e 20 libras por polegada quadrada.
- Antes de injectar a solução do grânulo, calibrar o volume para injetar (0,5 nL) medindo o tamanho das gotas, entregue pelo microinjector com um micrômetro de fase 1 x 0.01 mm (ver a Tabela de materiais).
- Emprega uma magnificação de 1.6 X no dissecação estereomicroscópio Visualizar os embriões durante as injeções, que são realizadas à temperatura ambiente.
- Fabrica sob medidas microagulhas usando um extrator de micropipeta horizontal e vidro de borosilicato capilar (ver Tabela de materiais).
-
Avaliar o comportamento viscoelástico da gema gravando flutuações térmicas
- Dechorionate os embriões microinjected como no passo 2.1 e incorporá-los em uma baixa de 0,5% de fusão ponto de agarose em solução médio de embrião a 30 ° C. Em seguida, transferi-los para placas de fundo de vidro (veja a Tabela de materiais) e orientar e empurrá-los para a lamela, quando a agarose é ainda líquido.
Nota: Quando a agarose solidifica à temperatura ambiente, os embriões estão prontos para ser fotografada. - Coloque os embriões montados nas placas de vidro de fundo no palco de um microscópio confocal invertido 2 h após microinjeção. Capturar imagens das nanopartículas para 26 s a uma taxa de amostragem de 25 Hz com um objetivo X 63 à temperatura ambiente em um microscópio confocal invertido empregando o software microscópio padrão comercial (tamanho de pixel = 166 nm, imagens capturadas a cada 40 ms).
- Calcular a posição dos centroides das partículas a e definir suas trajetórias ao longo do tempo com o plugin TrackMate do open source software ImageJ (Figura 3B).
- Calcule o deslocamento de Mean Square bidimensional (MSD) de cada partícula com software feito por6,30 , como:
< Δr2 (τ) > = < [x(t + τ) - x(t)]2 + [y(t + τ) - y(t)]2> (8)
Nota: Aqui t é o tempo decorrido e o intervalo de tempo. Em um líquido viscoso puro, a MSD aumenta inversamente com viscosidade (ν), de acordo com a relação de Stokes-Einstein:
< Δr2 (τ) > = 4kB Tτ/ 6πνa, (9)
onde T é a temperatura absoluta.
- Dechorionate os embriões microinjected como no passo 2.1 e incorporá-los em uma baixa de 0,5% de fusão ponto de agarose em solução médio de embrião a 30 ° C. Em seguida, transferi-los para placas de fundo de vidro (veja a Tabela de materiais) e orientar e empurrá-los para a lamela, quando a agarose é ainda líquido.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Medições de tensão cortical
Para cada ponto de medição, cinco curvas força-deslocamento (F-z) foram adquiridas pela AFM pela rampa cantilever com uma amplitude de pico-a-pico de 5 µm a 1 Hz (velocidade = 10 µm/s) até um recuo máximo de ~ 2 µm. Este procedimento estava a menos de 20 min e não foi afectado pela progressão epiboly. Cada condição experimental foi testada pelo menos 5 embriões.
As curvas de força-deslocamento gravadas no celular de gema embrião, ao contrário para os correspondentes para o macio agarose circundante, apresentam uma relação linear proporcional (R2 > 0.999) (Figura 2A). Realizamos conjuntos adicionais de controle F-z curvas em 3 µm/s e 30 µm/s e Descartado uma potencial dependência de tensão cortical Tc a velocidade do cantilever. Tc aumentou apenas 13% (p < 0,01, teste-t) quando a velocidade foi reduzida de 10 para 3 µm/s e não mostrou qualquer alteração significativa, quando aumentou de 10 a 30 µm/s.
Curvas de força-recuo (F-h) gravadas a uma velocidade de cantilever de 10 µm/s na célula gema foram quase linear e estão equipados com um modelo de líquido-balão (Figura 2B)1. Este encaixe permitiu o cálculo dos valores absolutos de tensão de superfície média (pN/µm) em epiboly diferentes fases e em diferentes posições em relação à borda do líder EVL (identificados sob luz transmitida) (tabela 1).
Reologia do córtex
As diferenças entre o recuo e a retração das curvas força-deslocamento (F-z) (Figura 2) indicam um comportamento viscoelástico do córtex de célula de embrião gema. Baixa amplitude (100 nm) medições de oscilação de multifrequência fornecem a informação para calcular o módulo complexo eficaz g*(ƒ) da superfície da pilha de gema e seus componentes elásticos e viscosos (Veja o protocolo acima).
A reologia do córtex na célula de gema zebrafish embrião é dominada por um comportamento de sólido com o módulo viscoso 5 vezes menores que o módulo elástico1. Esse comportamento não é frequência dependente, seja para o elástico (ANOVA, p = 0.123), ou para o módulo viscoso (ANOVA, p = 0.719) (Figura 2D).
Reologia da gema
A viscosidade da gema foi computadorizada por encaixe a equação (5) os dados MSD obtidos a partir de nanopartículas de rastreamento (ver Figura 4A-B). A MSD de flutuações térmicas de nanopartículas fluorescentes incorporadas a gema apresenta uma dependência proporcional no intervalo de tempo τ, consistente com o comportamento de um líquido Newtoniano. A viscosidade de cisalhamento eficaz da gema, que está inversamente relacionada com os coeficientes de difusão em massa das nanopartículas, foi 129 mPa · s.
Figura 1: AFM de células de gema zebrafish in vivo. (A) diagrama descreve o conjunto acima empregou para sondar o córtex de célula de gema zebrafish por AFM. Dechorionated embriões de diferentes idades foram meio inserido nos orifícios criados em blocos de agarose personalizado, girado em uma determinada orientação e selado nas bordas com agarose de baixo ponto de fusão. As células de gema foram analisadas com esferas de poliestireno esféricas anexadas a um cantilever (vermelho). (B) embrião em epiboly de 50%, que metade incorporado em agarose sondado com um cantilever (falso colorido em vermelho) no polo vegetal. (C) um embrião equivalente àquele em B, sondou a cela de gema em uma região perto da margem de células EVL. Barras de escala = 100 µm (B e C). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Zebrafish embrião gema célula cortical tensão e reologia. (A) força [deflexão (d)]-curvas de deslocamento (z) obtidos por um embrião representativo como a ponta do cantilever se aproxima e entra em contato com a amostra [a superfície de agarose (controle) em azul] e superfície celular de gema em vermelho. (B) força curvas de recuo (F-h) (n = 3 embriões, 3 medições por embrião a uma distância de 10 µm do outro. Cada medida representa a média de 5 curvas) se encaixam com um modelo da líquido-balão (de referência1). Observe o aumento linear da deflexão em contacto com a superfície da célula de embrião gema. A linha preta pontilhada mostra o encaixe para o modelo (do qual a tensão cortical é inferida). (C) aproximação (vermelho) e as curvas de força-deslocamento de retração (roxo) para um embrião representativa. Setas vermelhas e roxas curvas apontam para o regime temporal da recolha de dados. A seta de duas pontas, destaca a diferença entre a aproximar-se e retraindo valores de deflexão, apontando para o caráter de viscoelástico do córtex. (D) viscoelasticidade do córtex celular gema (n = 5 embriões). Módulo complexo eficaz (g *) extraído de oscilações de multifrequência medições AFM (de 1). Símbolos vermelhos representam o módulo de elasticidade (g'), e azuis símbolos definem o módulo viscoso (g″), respectivamente. Quer dizer e erro padrão (SE) são exibidos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Microrheology de rastreamento de partículas. (A) de nanopartículas fluorescentes são injetadas na célula gema de zebrafish embriões em epiboly de 50%. (B) deslocamentos foram seguidos por nanopartículas individuais distribuídas aleatoriamente dentro da gema (à esquerda). Curso de tempo das trajectórias típico de nanopartículas (centroides) incorporado dentro a gema (2 exemplos) passeios aleatórios de exposição que são característicos de difusão viscosa. Barra de escala = 100 µm (A); 1 µm (B, esquerda); 200 nm (B, direita). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Microrheology da gema embrião zebrafish. (A) MSDs de nanopartículas individuais (n = 99) apresentam uma dependência aproximadamente linear com intervalo de tempo. (B) média ± erro padrão MSDs de nanopartículas e viscosidade da gema. Ensemble em média MSDs (média - linha vermelha ± SE) do personagem de nanopartículas população exposições predominantemente viscoso. A inclinação linear da relação reflete as propriedades difusiva das nanopartículas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Tensão (pN/mm) média ± SE | % de Epiboly | |||
| 40-50 | 60-70 | 80-90 | ||
| Distância até a margem do EVL | 20 μm (E-YSL) | - | 60 ± 7 | - |
| 40 μm (YCL) | 67 ± 11 | 72 ± 5 | 110 ± 7 | |
| Polo vegetal | - | 75 ± 3 | - | |
| n = 3 embriões (5 indentações em cada um) para cada condição | ||||
Tabela 1: Distribuição de tensão espácio-temporais na superfície da célula de gema durante Epiboly.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Aqui nós mostramos que as propriedades do material e alguns parâmetros biomecânicos da célula de gema zebrafish durante epiboly podem ser facilmente estimados pela AFM e nanopartículas microrheology.
Enquanto a AFM tem sido empregada para recuperar características reológicas de células e tecidos em condições fisiológicas,4,5,25,28, aqui nós desenvolvemos um protocolo de aplicação AFM para desenvolver intacta embriões que usamos para testar a superfície de célula de gema do zebrafish embrião durante epiboly.
Para nossas medições de AFM, a orientação dos embriões foi assegurada pela metade, incorporando-os em agarose derretimento baixo. Ainda, incorporação de agarose não afetou as medições de AFM. A rigidez da agarose foi medida por sua superfície com uma ponta esférica de sondagem. Encontramos um módulo de Young (E) de 4,2 0,2 Pa para este gel por encaixe as curvas força-recuo com a Hertz entre em contato com o modelo de uma esfera de recuo de uma superfície plana de um corpo elástico. Dado que E 3g', a agarose foi 50-fold mais suave do que o córtex de célula de gema (Figura 2D). Portanto, considerando-se sua espessura limitada e muito baixa rigidez, as medições de AFM gravadas no topo do embrião parecem ser extremamente confiável.
É importante notar que recuperar valores absolutos para tensão cortical de dados AFM exige extremo cuidado em relação a montagem do modelo mecânico. No caso da célula de gema zebrafish, com sua composição única, com uma camada externa de ricos em microtúbulos citoplasmática englobando uma massa de gema altamente viscoso, podemos contornar esse problema, empregando um modelo de balão de líquido que consiste de um córtex elástico delimitador um líquido viscoso. Este modelo tem sido usado anteriormente para estimar a tensão cortical de leucócitos com micropipeta aspiração28, células progenitoras esférico de embriões de peixe-zebra gastrulating recuados com esférico AFM dicas4e células HeLa com AFM usando encravado vigas22.
Estimamos a tensão cortical da célula gema pelo recuo de sua superfície com uma ponta esférica pequena comercialmente disponível. Esta pequena sonda nos permitiu medir diretamente as diferenças regionais na tensão cortical. Conforme descrito acima, dados de força-recuo foram interpretados em termos de um modelo minimamente líquido-balão (EQ. 2). Curvas de força gravado na superfície do gel e células com uma ponta esférica aumentam com a marca como uma lei de potência com um expoente de 3/2. Por outro lado, encontramos uma relação de força-recuo proporcional muito bem equipada com 2 eq. (Figura 2B). A pequena dependência da Tc na velocidade do cantilever e a baixa g' /g' ratio (Figura 2D) indica que a mecânica do córtex é dominada por um comportamento elástico.
Mecânica de gema foram analisadas independentemente com micropartículas reologia. O aumento linear da MSD observado claramente reflete um comportamento viscoso puro. Note-se que a viscosidade de soluções de polímero depende do tamanho da sonda31. Portanto, o valor de viscosidade de gema medimos com uma sonda de 100 nm raio poderia um pouco diferem molecular (por exemplo, fluorescem despolarização) ou medições macroscópicas. Tomados em conjunto, estes resultados fornecem forte apoio para a adequação do modelo líquido-balão e a robustez das medições de viscosidade tensão e gema corticais.
Podemos argumentar que esta abordagem pode ser facilmente estendida para medir mecânica Drosophila nos embriões mesmos ou a outros pontos de tempo de desenvolvimento no zebrafish e, eventualmente, para outros organismos. Essa aproximação só dependerá de engenharia procedimentos de montagem apropriado (ver referência32) facilitando o acesso do AFM sondas para os lugares certos na hora certa. Ainda, o movimento contínuo da maioria das células e tecidos durante o desenvolvimento deve ser tidos em conta em qualquer aplicação para outros modelos de desenvolvimento. Movimentos de célula fará a aplicação destes métodos muito mais desafiador.
Em alguns casos, AFM na vivo seria inaplicável se problemas de acessibilidade não podem ser superados. Tanto no desenvolvimento de embriões e adultos, as células são largamente inacessíveis. Assim, para testar propriedades biofísicas em situ, é imperativo para empregar métodos não exigindo direto entre em contato. Nanopartículas de rastreamento microrheology cumpre estes requisitos6. Esta técnica baseia-se na análise com alta resolução espacial e temporal dos deslocamentos browniano das partículas individuais. As propriedades micromecânicas local do fluido viscoelástico que rodeia estas nanopartículas é um reflexo direto da extensão e intervalo de tempo-dependência de seus MSDs. Essa abordagem já foi aplicada para o desenvolvimento de organismos e tem ajudado a determinar o caráter altamente viscoso do c. elegans embrião citoplasma30. Descobrimos que uma gema zebrafish exibe propriedades equivalentes com embriões de c. elegans , embora sua viscosidade é duas ordens de magnitude mais baixas. Uma dependência de tempo linear da MSD com valores similares de viscosidade de gema para aqueles da gema zebrafish, recentemente, tem sido relatada em Drosophila33.
Embora não explorar essa possibilidade nos, injetadas revestidas e não revestidas nanopartículas recentemente têm sido empregadas como alvos de Pinça óptica no zebrafish larvas34. Não-invasivos micromanipulação dentro de um todo-organismo pode dar insights-não só diretos em interações célula mas em propriedades mecânicas e actividades não acessíveis usando abordagens existentes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores declaram não concorrentes interesses financeiros ou outros conflitos de interesse.
Acknowledgments
Agradecemos Amayra Hernández-Vega e Philippe-Alexandre Pouille para participar na criação de base para estes protocolos. Agradecemos também a plataforma de imagem Molecular do IBMB-PCB, Xavier Esteban e membros do laboratório de apoio contínuo. O programa de grupos consolidados da Generalitat de Catalunya e DGI e consolidar subsídios do Ministério da economia e competitividade da Espanha para EMB e DN apoiou este trabalho.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Inverted optical microscope | Nikon | TE2000 | Visualization of the sample and AFM cantilever |
| Atomic force microscope (AFM) | Custom made | - | Any commercialized AFM could be employed |
| Inverted Confocal microscope | Zeiss | LSM780 | Nanorheology data collection |
| Agarose D1 Low EEO | Conda | 8016.00 | Casting embryos |
| Ultrapure LMP Agarose (low melting) | Invitrogen | 16520-100 | Securing embryos |
| Zebrafish Microinjection and Transplantation Molds | World Precision Instruments | Z-MOLDS | Casting embryos. Custom made with the original dimensions can also be employed |
| Dumont 5 Forceps | FST | 11251-20 | 1.5 mm diameter |
| Si3N4 cantilever | Novascan | PT.GS | Measuring the embryo by AFM. Spherical tip: 4.5 µm diameter and k=0.01 N/m |
| Fluorescent nanoparticles | Life Technologies | FluoSpheres F8811, | For tracking nanorheology |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | P-2000 | Fabricating tailored microneedles |
| Borosilicate capillary glass | Warner Instruments | G100TF-4 | Fabricating tailored microneedles |
| Micromanipulator | Narishige | MN-153 | Manipulating the micropipette |
| Microinjector | Eppendorf | FemtoJet Express | Controlling injection time and pressure |
| Stereomicroscope | Leica | DFC365FX | Visualization of the embryos during injection |
| Analysis Software | MathWorks | Matlab | Analyzing AFM and particle tracking data |
| Zebrafish | AB and TL wild type | - | Strains employed for embryo collection |
| Glass Bottom Plates | Mat Tek | P35G-0.170-14-C | Mounting embryos for nanorheology data collection |
| Stage micrometer | FST | 29025-02 | Measuring injection volume |
References
- Hernandez-Vega, A., et al. Polarized cortical tension drives zebrafish epiboly movements. EMBO J. 36, 25-41 (2017).
- Brodland, G. W., et al. Video force microscopy reveals the mechanics of ventral furrow invagination in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 22111-22116 (2010).
- Grill, S. W. Growing up is stressful: biophysical laws of morphogenesis. Curr Opin Genet Dev. 21, 647-652 (2011).
- Krieg, M., et al. Tensile forces govern germ-layer organization in zebrafish. Nat Cell Biol. 10, 429-436 (2008).
- Koser, D. E., et al. Mechanosensing is critical for axon growth in the developing brain. Nat Neurosci. 19, 1592-1598 (2016).
- Wirtz, D. Particle-tracking microrheology of living cells: principles and applications. Annu Rev Biophys. 38, 301-326 (2009).
- de Pablo, P. J., Carrión-Vázquez, M. Imaging Biological Samples with Atomic Force Microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 2014, 167-177 (2014).
- Roca-Cusachs, P., et al. Rheology of passive and adhesion-activated neutrophils probed by atomic force microscopy. Biophys J. 91, 3508-3518 (2006).
- Evans, E., Yeung, A. Apparent viscosity and cortical tension of blood granulocytes determined by micropipet aspiration. Biophys J. 56, 151-160 (1989).
- Fabry, B., et al. Time scale and other invariants of integrative mechanical behavior in living cells. Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys. 68, 041914 (2003).
- Kashef, J., Franz, C. M. Quantitative methods for analyzing cell-cell adhesion in development. Dev Biol. 401, 165-174 (2015).
- Chevalier, N. R., et al. Measuring the micromechanical properties of embryonic tissues. Methods. 94, 120-128 (2016).
- Reichlin, T., et al. Investigating native coronary artery endothelium in situ and in cell culture by scanning force microscopy. J Struct Biol. 152, 52-63 (2005).
- Rho, J. Y., Tsui, T. Y., Pharr, G. M. Elastic properties of osteon and trabecular bone measured by nanoindentation. J Biomech. 31, 21 (1998).
- Grant, C. A., et al. Surface characterisation and biomechanical analysis of the sclera by atomic force microscopy. J Mech Behav Biomed Mat. 4, 535-540 (2011).
- Efremov, Y. M., et al. Atomic force microscopy of living and fixed Xenopus laevis embryos. Micron. 42, 840-852 (2011).
- Henkels, J., et al. Spatiotemporal Mechanical Variation Reveals Critical Role for Rho Kinase During Primitive Streak Morphogenesis. Ann Biomed Eng. 41, 421-432 (2013).
- Solnica-Krezel, L. Gastrulation in zebrafish -- all just about adhesion? Curr Opin Genet Dev. 16, 433-441 (2006).
- Kimmel, C. B., et al.
- Rohde, L. A., Heisenberg, C. P. Zebrafish gastrulation: cell movements, signals, and mechanisms. Int Rev Cytol. 261, 159-192 (2007).
- Campinho, P., et al. Tension-oriented cell divisions limit anisotropic tissue tension in epithelial spreading during zebrafish epiboly. Nat Cell Biol. 15, 1405-1414 (2013).
- Fischer-Friedrich, E., et al. Quantification of surface tension and internal pressure generated by single mitotic cells. Sci Rep. 4, 6213 (2014).
- Moeendarbary, E., Harris, A. R. Cell mechanics: principles, practices, and prospects. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 6, 371-388 (2014).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. Eugene, OR. (2000).
- Alcaraz, J., et al. Microrheology of human lung epithelial cells measured by atomic force microscopy. Biophys J. 84, 2071-2079 (2003).
- Jorba, I., et al. Probing Micromechanical Properties of the Extracellular Matrix of Soft Tissues by Atomic Force Microscopy. J Cell Physiol. 232, 19-26 (2017).
- Hutter, J. L., Bechhoefer, J. Calibration of atomic-force microscope tips. Review of Scientific Instruments. 64, 1868-1873 (1993).
- Lomakina, E. B., et al. Rheological analysis and measurement of neutrophil indentation. Biophys J. 87, 4246-4258 (2004).
- Alcaraz, J., et al. Correction of Microrheological Measurements of Soft Samples with Atomic Force Microscopy for the Hydrodynamic Drag on the Cantilever. Langmuir. 18, 716-721 (2002).
- Daniels, B. R., Masi, B. C., Wirtz, D. Probing single-cell micromechanics in vivo: the microrheology of C. elegans developing embryos. Biophys J. 90, 4712-4719 (2006).
- Kalwarczyk, T., et al. Comparative analysis of viscosity of complex liquids and cytoplasm of mammalian cells at the nanoscale. Nano Lett. 11, 2157-2163 (2011).
- Soroldoni, D., et al. Genetic oscillations. A Doppler effect in embryonic pattern formation. Science. 345, 222-225 (2014).
- He, B., et al. Apical constriction drives tissue-scale hydrodynamic flow to mediate cell elongation. Nature. 508, 392-396 (2014).
- Johansen, P. L., et al. Optical micromanipulation of nanoparticles and cells inside living zebrafish. Nat Commun. 7, 10974 (2016).
