Summary
La mancanza di strumenti per misurare le proprietà dei materiali e parametri tensionale in vivo impedisce la convalida loro ruoli durante lo sviluppo. Abbiamo impiegato la microscopia a forza atomica (AFM) e rilevamento delle nanoparticelle di quantificare caratteristiche meccaniche sulla cella tuorlo intatto zebrafish embrione durante epiboly. Questi metodi sono affidabili e ampiamente applicabile evitando interventi intrusivi.
Abstract
Chiarire i fattori che dirigono l'organizzazione spazio-temporale dell'evoluzione tessuti è uno degli scopi principali nello studio dello sviluppo. Varie proposte sostengono di essere stati importanti contributi alla comprensione delle proprietà meccaniche delle cellule e dei tessuti nella loro organizzazione spazio-temporale in diversi processi morfogenetici e di sviluppo. Tuttavia, a causa della mancanza di strumenti affidabili e accessibili per misurare le proprietà dei materiali e parametri tensionale in vivo, convalida di queste ipotesi è stata difficile. Qui presentiamo metodi che impiegano la microscopia a forza atomica (AFM) e particle tracking con l'obiettivo di quantificare le proprietà meccaniche della cella tuorlo intatto zebrafish embrione durante epiboly. Epiboly è un processo inerente allo sviluppo conservato precoce cui studio è facilitata dalla trasparenza dell'embrione. Questi metodi sono ampiamente applicabili, affidabile e semplice da implementare poiché essi superare gli interventi intrusivi che potrebbero influire sulla meccanica del tessuto. È stata applicata una strategia semplice per il montaggio di campioni, registrazione di AFM e iniezioni di nanoparticelle e il rilevamento. Questo approccio rende questi metodi facilmente adattabile ad altre volte inerente allo sviluppo o organismi.
Introduction
I principi fisici alla base del controllo biomeccanico di processi morfogenetici sono in gran parte indefiniti. Mentre studi biomeccanici a livello molecolare e cellulare stanno raccogliendo un considerevole slancio, l'esplorazione dei parametri biomeccanici a livello del tessuto/organismo è a sua infanzia. Idrodinamica regressione1 o Video microscopia di forza2 permettono ai ricercatori di distinguere le forze attive e passive, mentre laser microchirurgia3o la microscopia a forza atomica (AFM) meno intrusiva di cellule dissociate4 o in vivo 5 o nanoparticelle microrheology6 consentire l'anticipazione di un tessuto proprietà meccaniche e le risposte.
AFM è una tecnica topografica tridimensionale con risoluzione atomica ad alta risoluzione di rugosità superficiale e rispetto dalla deflessione di suggerimenti a sbalzo a contatto con una superficie sondati7. Diverse metodologie che impiegano AFM sono stati sviluppati per studiare proprietà di superficie, compresa la misurazione di attrito, le forze di adesione e proprietà viscoelastiche dei materiali diversi. Recentemente, AFM è emerso come un potente strumento per recuperare le informazioni sulle proprietà meccaniche dei campioni biologici. In particolare, AFM non invadente può estrarre il modulo di taglio complesse da singole cellule applicando oscillatori rientranze con un micro suggerimento attaccato a uno sbalzo di noto curvatura costante8. Questo ci permette di dedurre le forze risultanti. Eppure, AFM non è univoco e diverse metodologie consentono di estrarre dati reologici e proprietà meccaniche da singole celle (ad esempio, micropipetta aspirazione9, magnetico torsione cytometry (MTC)10o uniassiale trazione test11).
Ancora, l'applicazione di queste nuove metodologie a complessi processi morfogenetici non è semplice. Le sfide principali affrontate nel determinare le proprietà meccaniche dei tessuti embrionali sono il piccolo (µm a mm), morbido (nel 102 - 104 Pa gamma) e natura visco-elastico (dando luogo a fenomeni dipendenti dal tempo) del materiale12. È pertanto importante adeguare i metodi impiegati per la determinazione delle proprietà meccaniche (rigidezza, viscosità, adesione) per il caso specifico di embrioni e di organismi in via di sviluppo. Due questioni importanti devono essere prese in considerazione quando si analizzano reologici approcci nello studio dello sviluppo: per evitare interferenze invadente e per fornire facile accessibilità. In questo scenario, l'aspirazione micropipetta, MTC e prove di trazione presentano limitazioni. Nel primo caso, all'elevata deformabilità che soffre di una cella potrebbe alterare le proprietà fisiologiche e meccaniche9. Nel secondo caso, la necessità di aderire saldamente al tessuto sperimentale di un substrato per garantire che le sollecitazioni impresse deformano il citoscheletro localmente potrebbe anche introdurre effetti sullo stato di attivazione delle cellule e, quindi, nelle loro caratteristiche meccaniche10 . Approcci di trazione monoassiali, ultimi sono limitati dalla geometria di sviluppare organismi e accessibilità11.
AFM sembra essere più adatto per lo studio dei processi di sviluppo in quanto permette lo studio di campioni biologici direttamente nel loro ambiente naturale senza alcuna preparazione del campione ingombrante. Inoltre, come dissociazione di tessuti embrionali è generalmente difficile, la ridotta dimensione delle sonde AFM fornisce un alto grado di versatilità con nessuna limitazione nella scelta del tipo di media (acquoso o non acquoso), la temperatura del campione o prodotto chimico composizione del campione. AFM è abbastanza versatile per essere applicato a domini di grandi dimensioni e scale del tempo ed è stato impiegato per recuperare le proprietà materiali dei tessuti in condizioni fisiologiche o distinte fasi di sviluppo. Tessuti intero nativi come arterie13 o ossa14 sono state studiate dal punto di vista topografico e in alcuni casi, come la sclera, proprietà meccaniche sono stati anche estratto15. Topografia è stato esplorato anche in streaming in embrioni permettendo la visualizzazione di, per esempio, la riorganizzazione a cellula durante la morfogenesi in Xenopus16. Protocolli della preparazione del campione globale, ultimo sono state sviluppate per determinare i parametri meccanici durante diversi processi di sviluppo. La nanoindentazione mappe sono state generate su sezioni di tessuto nativo non fissati per il pulcino embrionali digerente11; Proprietà adesive e meccaniche estratto per le singole celle di ectoderma, mesoderma ed endoderma progenitrici isolate da gastrulating zebrafish embrioni4; misurazioni di rigidità per l'epiblasto e linea primitiva su espianti da embrioni aviari17; e un modello distinto di gradienti di rigidità sono definiti direttamente nel cervello embrionale di Xenopus5.
Un salto di qualità notevole per l'applicazione di AFM per esplorare lo sviluppo embrionale può venire da avvicinando semplici accessibili processi morfogenetici. Epiboly di zebrafish è un evento essenziale e conservato, in cui diversi tessuti coordinano in uno spazio ristretto sferico per dirigere l'espansione del blastoderm in poche ore. Al momento della comparsa di zebrafish epiboly (fase sferica), uno strato superficiale di cellule, lo strato avvolgente (EVL), copre una calotta semi-sferica di blastomeri centrata sul polo animale dell'embrione che si siede su una cellula sinciziale tuorlo massiccia. Epiboly consiste dell'espansione corticale ward vegetale dell'EVL, cellule profonde (DCs) il blastoderm, e lo strato esterno della cellula sinciziale tuorlo (E-YSL) intorno al tuorlo. Epiboly si conclude con la chiusura dell'EVL e i controller di dominio al palo vegetal18,19,20. Come e dove le forze sono generate durante epiboly e come sono accoppiate a livello globale non è ancora chiaro1,21.
Qui descriviamo in dettaglio come applicare AFM per dedurre proprietà meccanica passiva del tessuto durante la progressione di epiboly in zebrafish tuorlo delle cellule in vivo. A tale scopo, abbiamo impiegato le piccole microsfere attaccate al cantilever AFM come sonde. Questo consente il recupero di informazioni locale precise all'interno della superficie delle cellule di tuorlo non uniforme e di studiare tensionale gradienti e le loro dinamiche nel tempo. Si avvicina a AFM alternativi come quelli che usano Cuneo cantilever22, saranno dati locali non rendering che sono sufficientemente precisi. La tecnica di Cuneo, che richiede le abilità di manipolazione molto attenta ad incollare una fetta più grande della dimensione del campione all'estremità del cantilever, non è adatta per il sondaggio dell'embrione (~ 2 volte più grande rispetto alla lunghezza dello sbalzo) meccanica.
Modellazione e caratterizzare le proprietà viscoelastiche delle cellule in modo qualitativo e quantitativo consente una migliore comprensione dei loro biomeccanica. Da un punto di vista biomeccanico, è essenziale comprendere epiboly e non solo richiesta conoscenza sulle misurazioni di tensione corticale e dinamiche, che possono essere estratti da AFM; così c'è bisogno di informazioni sulle proprietà biofisiche del tessuto. Per estrarre queste informazioni, una varietà di cellula reologia tecniche sono state sviluppate nel corso degli anni al fine di caratterizzare i diversi tipi di cellule sotto diverse condizioni fisiologiche23. Essi includono AFM, MTC e pinzette ottiche (OT). Questi metodi, tuttavia, sono stati dimostrati inadeguati per mesoscopiche analisi a scala di embrioni o di organi. In alternativa, abbiamo adattato con successo nanoparticle tracking microrheology6 per in vivo misure reologiche. Questa tecnica analizza gli spostamenti browniani delle singole particelle e vengono dedotte le proprietà locali micromeccanici.
Insieme microrheology AFM e nanoparticelle consentono la definizione delle dinamiche tensionale corticale e proprietà meccaniche interne del tuorlo durante epiboly. Queste informazioni approva pienamente un modello in cui anisotropo stress si sviluppa in conseguenza delle differenze nella risposta deformazione dell'EVL e strato citoplasmico tuorlo (YCL) alla contrazione di actomiosina isotropo della corteccia E-YSL è essenziale per il movimento netto direzionale della progressione EVL ed epiboly1.
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Protocol
Tutti i passaggi di protocollo descritti di seguito seguono le indicazioni di cura degli animali delle nostre istituzioni.
1. Zebrafish cultura
- Allevare e mantenere zebrafish adulto in condizioni standard.
Nota: AB e TL embrioni di tipo selvaggio sono stati utilizzati per questo studio. - Raccogliere gli embrioni e farli crescere a 28,5 ° C in E3 embrione medio24. Loro fase secondo morfologia come descritto in precedenza19.
2. atomic Force Microscopy
- Manuale dechorionate in scena gli embrioni di zebrafish (di età diverse secondo interessi individuali). Rimuovere chorions con due pinze sottili e taglienti (Vedi Tabella materiali).
- Il corion utilizzando una pinza di presa e fare uno strappo in essa con le altre pinze. Poi, tenendo il corion in una regione opposta a quella dello strappo, spingere l'embrione delicatamente attraverso l'apertura.
- Eseguire il dechorionation sotto un dissezione stereomicroscopio con un range impostabile di ingrandimento tra 8 X e 50 X.
- Montare gli embrioni per AFM
- Preparare una soluzione di agarosio al 2% nel mezzo di embrione e riempire una scatola di Petri 35mm con questo. Lasciare solidificare. Fare piccoli fori di 1.5 mm di diametro (due volte le dimensioni dell'embrione) e profondità di circa 350 µm (metà delle dimensioni dell'embrione) con una pinza sottile nel letto dell'agarosi.
- Posizionare gli embrioni in poke fatta nello strato di agarosio e assicurare che sono in luogo di diffondere intorno a una soluzione di 0,5% basso dell'agarosi nel mezzo di embrione di fusione. Versare questa soluzione intorno solo gli embrioni per fissarle nei fori.
- Prima l'agarosi di basso punto di fusione si solidifica a temperatura ambiente, ruotare gli embrioni in modo tale che la regione di interesse per essere sondati da AFM dovrà affrontare verso l'alto (Figura 1A).
- Esaminare gli embrioni di AFM
- Individuare e gli embrioni in di Petri che impiegano un obiettivo X 20 in un microscopio a forza atomica invertito dell'immagine (Vedi Tabella materiali25) a temperatura ambiente (23-24 ° C).
Nota: Gli embrioni vengono mantenuti attive immerso nel mezzo di embrione e attaccato al letto dell'agarosi. - Sonda di superficie delle cellule di tuorlo di casted embrioni che impiegano sferiche perle di polistirolo di 4,5 µm di diametro collegato a un cantilever con una costante primavera nominale di 0.01 N/m. impostare l'ampiezza di picco-picco di oscillazione a sbalzo a 5 µm e la sua frequenza di 1 Hz.
- Raccogliere dati per ogni regione per essere testato in diverse posizioni e in vari embrioni, come una routine, per una media di dati.
Nota: Un buon punto di partenza è a cinque posizioni situati al centro e gli angoli di un quadrato di µm 10 µm x 10 controllando la posizione a sbalzo con gli azionatori piezo-elettrici XY del microscopio AFM della sonda. Raccolta dati e la formazione immagine ha preso circa 20 minuti per embrione. Registrazione dei dati in diverse regioni della superficie delle cellule di embrione tuorlo, ad es., il palo vegetal o diverse regioni vicino al margine di cellule EVL (Figura 1B e 1C), può essere solo fatto impiegando esemplari distinti orientati in modo diverso.
- Individuare e gli embrioni in di Petri che impiegano un obiettivo X 20 in un microscopio a forza atomica invertito dell'immagine (Vedi Tabella materiali25) a temperatura ambiente (23-24 ° C).
- Calcolare le forze
- Misurare lo spostamento verticale del cantilever AFM (z) con sensori estensimetrici accoppiati per azionatori piezo-elettrici e la sua flessione (d) utilizzando un fotodiodo quadrante dal metodo ottico leva con il software di controllo del microscopio (Vedi Tabella materiali 25).
- Utilizzare la pendenza di una curva d-z ottenuta da dati raccolti da una regione nuda del vetrino coprioggetti per calibrare la correlazione tra il segnale di fotodiodo e la deflessione del cantilever (d).
Nota: Lo spostamento verticale misurato è uguale la deflessione a sbalzo e la pendenza rappresenta la sensibilità di deflessione della leva ottica26. - Dedurre che la costante elastica a sbalzo (k) dalle fluttuazioni termiche come precedentemente descritto27.
- Come si calcola il rientro del campione (h):
h = (z - zc) -(d - di) (1)
Nota: Qui zc è la posizione del punto di contatto e dfuori è l'offset del fotodiodo. - Calcolare la forza (F) su cantilever come:
F = k · d (2)
- Calcolare la tensione della corteccia in termini di un modello di liquido-palloncino costituito da uno strato elastico di tensione corticale Tc che racchiude un liquido viscoso. In questo modello, per piccole intaccature (in rispetto alla dimensione dell'embrione), la forza aumenta proporzionalmente4,,28 , come:
F = 4 π Tc[(Rb / Re) + 1)] h (3)
Nota: Qui Rb è il raggio del cordolo e Re è il raggio dell'embrione. Per l'embrione di zebrafish, come il raggio dell'embrione (400 µm) è a due ordini di grandezza maggiori di quella del tallone (2,25 µm), questa equazione può essere approssimata come:
F = 4 π Tc h (4)- Calcolare vigore il tensionamento-rientro (F-h) curve in ogni regione di cella embrione tuorlo per cinque diverse misure puntuali.
- Calcolare la Tc per ogni F-h curva di raccordo minimi quadrati non lineari. Per l'analisi statistica, la tensione corticale Tc calcolata deve essere mediato da diversi F- curveh .
- Misurare le proprietà viscoelastiche (Reologia) della corteccia applicando ampiezza bassa (100 nm) oscillazioni multifrequenza durante AFM è composta da onde sinusoidali di diverse frequenze25.
- Calcolare un efficace modulo complesso g*(ƒ) nel dominio della frequenza, le curve di rientro di forza come:
g * (f) = [F(f) / h(f)]- ifb (5)
qui i è l'unità immaginaria e F(f) e h(f) sono gli spettri di frequenza (f) di forza e di rientro. b è la correzione per il trascinamento viscoso su cantilever estratte dalle oscillazioni applicate sulla superficie. - Separato g*(ƒ) in parti reali e immaginarie, come:
g * (Ƒ) = g' (f) + ig' (f) (6)
em > g'(f) è il modulo elastico ed è una misura dell'energia elastica memorizzata e recuperata per ciclo di oscillazione. g' (f) è il modulo viscoso che rappresenta l'energia dissipata. - Calcolare la tangente di perdita, che fornisce un indice di solido-come (< 1) o simil-liquido (> 1) comportamento del materiale, come:
g' (f) / g' (f) (7)
Nota: Con questo tipo di misurazione, è possibile estrarre i parametri che indicano come viscoso ed elastico come è il materiale sondato. Anche se leggermente b dipende dalla distanza dell'estremità del cantilever alla superficie, dati i valori molto bassi di g´ ´ esposto dal tuorlo cella (vedere Figura 2D qui sotto), piccole variazioni di b hanno un impatto trascurabile le misure29.
- Calcolare un efficace modulo complesso g*(ƒ) nel dominio della frequenza, le curve di rientro di forza come:
3. particle Tracking Microrheology
-
Eseguire microiniezione di particella nella cella tuorlo
- Fabbrichi i microaghi su misura utilizzando un estrattore orizzontale micropipetta e capillare in vetro borosilicato (Vedi Tabella materiali).
- Preparare i microaghi che hanno un diametro esterno di 1,00 mm, un diametro interno di 0,58 mm e una lunghezza di 10 cm utilizzando impostazioni di estrattore: pressione: 500; Calore: 510; Pull: 65; Velocità: 25; Tempo: 50.
- Preparare una piastra di Petri di iniezione creando corsie di rientro dritto in un 1% di agarosio nel letto medio dell'embrione che impiegano muffe fatte su ordinazione (Vedi Tabella materiali).
- Capovolgere gli stampini e metterli sulla superficie del gel di agarosio liquido e rimuovere gli stampi, una volta che il gel si è solidificato. Dispensare gli embrioni nelle scanalature fatta dalla muffa in agarosio sotto un dissezione stereomicroscopio con ingrandimenti 1.2.
Nota: La larghezza e la progettazione degli stampi abilitare gli embrioni per self-allineare.
- Capovolgere gli stampini e metterli sulla superficie del gel di agarosio liquido e rimuovere gli stampi, una volta che il gel si è solidificato. Dispensare gli embrioni nelle scanalature fatta dalla muffa in agarosio sotto un dissezione stereomicroscopio con ingrandimenti 1.2.
- Prima dell'iniezione, quasi completamente rimuovere il mezzo per facilitare l'iniezione (la tensione superficiale che l'embrione/corion incolli all'ago durante la rimozione dopo l'iniezione).
- Microinject nanoparticelle fluorescenti (raggio un = 100 nm, Vedi Tabella materiali) diluito in acqua (1:1, 000) nella parte vegetale della cella embrione tuorlo (Figura 3A).
- Regolare la micropipetta con micromanipolatori precisione e iniettare le perline con un microinjector automatico con controlli di tempo e pressione (Vedi Tabella materiali). Impostare la pressione tra 10 e 20 psi.
- Prima di iniettare la soluzione di perlina, calibrare il volume da iniettare (0,5 nL) misurando la dimensione delle gocce consegnato dalla microinjector con un micrometro oggetto 1 x 0,01 mm (Vedi la Tabella materiali).
- Impiegare un ingrandimento di 1.6 X nella dissezione stereomicroscopio per visualizzare gli embrioni durante le iniezioni, che vengono eseguite a temperatura ambiente.
- Fabbrichi i microaghi su misura utilizzando un estrattore orizzontale micropipetta e capillare in vetro borosilicato (Vedi Tabella materiali).
-
Valutare il comportamento viscoelastico del tuorlo registrando le fluttuazioni termiche
- Dechorionate gli embrioni iniettati come nel passaggio 2.1 e incorporarli in un basso di 0,5% fusione punto agarosio in soluzione medio embrione a 30 ° C. In seguito, trasferirli su piastre di fondo di vetro (Vedi Tabella materiali) e orientare e spingerli verso il coprioggetto quando l'agarosio è ancora liquido.
Nota: Quando l'agarosio si solidifica a temperatura ambiente, gli embrioni sono pronti per essere imaged. - Posizionare gli embrioni montati nelle piastre di fondo di vetro sul palco di un microscopio invertito confocale 2h dopo microiniezione. Catturare le immagini delle nanoparticelle per 26 s a una frequenza di campionamento di 25 Hz con un obiettivo X 63 a temperatura ambiente in un microscopio confocale invertito che impiegano il software microscopio commerciale standard (dimensione dei pixel = 166 nm, immagini catturate ogni 40 ms).
- Calcolare la posizione di centroidi le particelle e definire le loro traiettorie nel tempo con il plugin TrackMate dell'open source software ImageJ (Figura 3B).
- Calcolare il dislocamento di Mean Square bidimensionale (MSD) di ogni particella con software su misura6,30 come:
< Δr2 (τ) > = < [x(t + τ) - x(t)]2 + [y(t + τ) - y(t)]2> (8)
Nota: Qui t è il tempo trascorso e il tempo di ritardo. In un liquido viscoso puro, il MSD aumenta inversamente con viscosità (ν) secondo la relazione di Stokes-Einstein:
< Δr2 (τ) > = 4kB Tτ/ 6πνa, (9)
dove T è la temperatura assoluta.
- Dechorionate gli embrioni iniettati come nel passaggio 2.1 e incorporarli in un basso di 0,5% fusione punto agarosio in soluzione medio embrione a 30 ° C. In seguito, trasferirli su piastre di fondo di vetro (Vedi Tabella materiali) e orientare e spingerli verso il coprioggetto quando l'agarosio è ancora liquido.
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Representative Results
Misure di tensione corticale
Per ogni punto di misura, cinque curve di forza-spostamento (F-z) sono state acquisite da AFM di dilagare il cantilever a 1 Hz con un'ampiezza di picco-picco di 5 µm (velocità = 10 µm/s) fino a un rientro massimo di ~ 2 µm. Questa procedura stava prendendo meno di 20 minuti e non è stata colpita dalla progressione di epiboly. Ogni condizione sperimentale è stato testato in almeno 5 embrioni.
Le curve di forza-spostamento registrate sulla cella tuorlo dell'embrione, al contrario a quelli corrispondenti a molle circostante agarose, esibiscono una relazione lineare proporzionale (R2 > 0,999) (Figura 2A). Abbiamo effettuato ulteriori set di controllo F-z curve a 3 µm/s e 30 µm/s e scartato una potenziale dipendenza di tensione corticale Tc la velocità dello sbalzo. Tc aumentati solo del 13% (p < 0.01, t-test) quando la velocità è stata ridotta da 10 a 3 µm/s e non ha mostrato alcun cambiamento significativo quando aumentata da 10 a 30 µm/s.
Curve di forza-rientro (F-h) registrate a una velocità a sbalzo di 10 µm/s sulla cella tuorlo erano quasi lineare e dotato di un modello di liquido-palloncino (Figura 2B)1. Questo attacco ha permesso il calcolo dei valori assoluti di tensione superficiale media (pN/µm) in epiboly diverse fasi e in posizioni diverse rispetto al bordo EVL (identificato in luce trasmessa) (tabella 1).
Reologia della corteccia
Le differenze tra il rientro e la ritrazione delle curve di forza-spostamento (F-z) (Figura 2) indicano un comportamento viscoelastico della corteccia delle cellule dell'embrione tuorlo. Bassa ampiezza (100 nm) multifrequenza oscillazione misure forniscono le informazioni per calcolare il modulo complesso efficace g*(ƒ) di superficie delle cellule di tuorlo e suoi componenti elastici e viscosi (Vedi protocollo di cui sopra).
La reologia di corteccia della cella di tuorlo embrione di zebrafish è dominata da un comportamento solido-come con il modulo viscoso 5 volte inferiori rispetto al modulo elastico1. Questo comportamento non è frequenza dipendente, sia per l'elastico (ANOVA, p = 0,123), o per il modulo viscoso (ANOVA, p = 0,719) (Figura 2D).
Reologia del tuorlo
La viscosità del tuorlo è stata calcolata applicando l'equazione (5) ai dati MSD ottenuti dalle nanoparticelle di rilevamento (Vedi Figura 4A-B). il MSD delle fluttuazioni termiche delle nanoparticelle fluorescenti incorporate nel tuorlo esibisce una dipendenza proporzionale il lasso di tempo τ, coerente con il comportamento di un liquido newtoniano. La viscosità di taglio efficace del tuorlo, che è collegata inversamente con i coefficenti di diffusione di massa delle nanoparticelle, era 129 Mpa · s.
Figura 1: AFM delle cellule di zebrafish tuorlo in vivo. (A) diagramma che descrive il set up impiegato per sondare la corteccia di cella del tuorlo di zebrafish di AFM. Dechorionated embrioni di diverse età erano a metà strada inserita nei fori creati in blocchi di agarosio su misura, ruotato in un particolare orientamento e sigillato ai bordi con basso punto di fusione dell'agarosi. Le cellule di tuorlo sono state sondate con sferiche perle di polistirolo attaccati a un cantilever (rosso). (B) embrione al 50% epiboly che metà incorporata in agarosio sondate con un cantilever (falso colorato in rosso) al Polo vegetal. (C) un embrione equivalente a quella in B, sondato dalla cella di tuorlo in una regione vicino al margine celle EVL. Scala bar = 100 µm (B e C). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Zebrafish embrione tuorlo delle cellule corticale tensione e reologia. (A) forza [deflessione (d)]-spostamento (z) curve ottenute per un embrione rappresentativo come la punta a sbalzo si avvicina e contatti il campione [la superficie di agarosio (controllo) in blu] e di superficie delle cellule di tuorlo in rosso. (B) forza curve di rientro (F-h) (n = 3 embrioni, 3 misurazioni per ogni embrione ad una distanza di 10 µm da altro. Ogni misurazione rappresenta la media dei 5 curve) in forma con un modello di liquido-palloncino (da riferimento1). Si noti l'aumento lineare della deflessione a contatto con la superficie di cellule di embrione tuorlo. La linea nera tratteggiata indica il raccordo al modello (da cui la tensione corticale viene dedotto). (C) approssimazione (rosso) e le curve di forza-spostamento di ritrazione (viola) per un embrione rappresentativo. Frecce rosse e viola curve puntano al regime temporale della raccolta dati. La freccia a due punte sottolinea la differenza tra l'avvicinamento e la ritrazione valori di deflessione che puntano al carattere viscoelastico della corteccia. (D) viscoelasticità della corteccia cella tuorlo (n = 5 embrioni). Modulo complesso efficace (g *) estratte da oscillazioni multifrequenza misure AFM (da 1). Simboli rossi rappresentano il modulo elastico (g'), e simboli blu definiscono il modulo viscoso (g″), rispettivamente. Dire ed errore Standard (SE) vengono visualizzati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Microrheology di monitoraggio delle particelle. (A) nanoparticelle fluorescenti vengono iniettate nella cella di tuorlo di embrioni di zebrafish al 50% epiboly. (B) gli spostamenti sono stati monitorati per singole nanoparticelle distribuite casualmente all'interno il tuorlo (a sinistra). Corso di tempo delle traiettorie tipiche delle nanoparticelle (centroidi) incorporato all'interno il tuorlo (2 esempi) passeggiate aleatorie mostre che sono caratteristici di diffusione viscoso. Barra della scala = 100 µm (A); 1 µm (B, a sinistra); 200 nm (B, destra). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Microrheology del tuorlo di embrioni di zebrafish. (A) DMS di singole nanoparticelle (n = 99) esibiscono una dipendenza approssimativamente lineare con ritardo. (B) media ± errore standard MSDs di nanoparticelle e viscosità del tuorlo. Ensemble media MSDs (media - linea rossa ± SE) del carattere prevalentemente viscoso nanoparticella popolazione esposizioni. La pendenza lineare del rapporto riflette le proprietà diffusive delle nanoparticelle. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Tensione (pN/mm) media ± SE | % di Epiboly | |||
| 40-50 | 60-70 | 80-90 | ||
| Distanza a margine EVL | 20 μm (E-YSL) | - | 60 ± 7 | - |
| 40 μm (YCL) | 67 ± 11 | 72 ± 5 | 110 ± 7 | |
| Vegetal Pole | - | 75 ± 3 | - | |
| n = 3 embrioni (5 tacche su ciascuno) per ogni condizione | ||||
Tabella 1: Distribuzione spazio-temporale tensione alla superficie delle cellule di tuorlo durante Epiboly.
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Discussion
Qui indichiamo che le proprietà del materiale e alcuni parametri biomeccanici della cella tuorlo zebrafish durante epiboly possono essere prontamente stimati mediante AFM e nanoparticelle microrheology.
Mentre AFM è stato impiegato per recuperare le caratteristiche reologiche di cellule e tessuti in condizioni fisiologiche4,5,25,28, qui abbiamo sviluppato un protocollo per l'applicazione di AFM intatto nello sviluppo embrioni che abbiamo impiegato per testare la superficie delle cellule di tuorlo dell'embrione di zebrafish durante epiboly.
Per le nostre misurazioni AFM, l'orientamento degli embrioni era garantito da metà incorporandole in basso dell'agarosi fusione. Ancora, l'incorporamento di agarosio non ha colpito misure AFM. La rigidità di agarosio è stata misurata tramite sondaggio la sua superficie con una punta sferica. Abbiamo trovato un modulo di Young (E) di 4,2 0,2 Pa per questo gel inserendo le curve forza-rientro con la Hertz contattare modello di una sfera rientri una superficie piana di un corpo elastico. Dato che la E 3g', l'agarosio era 50 più morbido rispetto alla corteccia di cella di tuorlo (Figura 2D). Pertanto, considerando il spessore limitato e molto bassa rigidità, le misurazioni AFM registrate in cima l'embrione sembrano essere estremamente affidabile.
È importante notare che recupero di valori assoluti per tensione corticale da dati AFM richiede estrema cura su per quanto riguarda il montaggio di modello meccanico. Nel caso la cella di tuorlo di zebrafish, con la sua composizione unica con uno strato di citoplasmico ricchi di microtubuli esterno che comprende una massa di tuorlo altamente viscoso, abbiamo eludere questo problema utilizza un modello di liquido-palloncino costituito da un elastico corteccia che racchiude un liquido viscoso. Questo modello è stato precedentemente utilizzato per stimare la tensione corticale di leucociti con micropipetta aspirazione28, cellule progenitrici sferica da embrioni di zebrafish gastrulating frastagliati con sferica AFM punte4e le cellule HeLa con AFM utilizzando incuneato cantilever22.
Abbiamo stimato la tensione corticale della cella tuorlo rientrando la sua superficie con una piccola punta sferica commercialmente disponibile. Questa piccola sonda ci ha permesso di misurare direttamente le differenze regionali in tensione corticale. Come descritto in precedenza, forza-rientro dati sono stati interpretati in termini di un modello di liquido-palloncino minimo (EQ. 2). Le curve forza registrato sulla superficie del gel e le cellule con una punta sferica aumentano con rientro come una legge di potenza con un esponente di 3/2. Al contrario, abbiamo trovato un rapporto di forza proporzionale-rientro molto ben attrezzato con EQ. 2 (Figura 2B). La piccola dependence di Tc velocità a sbalzo e il basso g' /g' ratio (Figura 2D) indica che la meccanica di corteccia è dominato da un comportamento elastico.
Meccanica di tuorlo indipendentemente sono state sondate con microparticella reologia. L'aumento lineare di MSD osservato riflette chiaramente un comportamento viscoso puro. Si deve osservare che la viscosità delle soluzioni di polimero dipende dalle dimensioni della sonda31. Di conseguenza, il valore della viscosità di tuorlo che abbiamo misurato con una sonda di 100 nm nel raggio un po' potrebbero differire da molecolare (per esempio, reagiscono in depolarizzazione) o misure macroscopiche. Presi insieme, questi risultati forniscono l'appoggio importante per l'adeguatezza del modello liquido-palloncino e la robustezza delle misurazioni di viscosità di tensione e tuorlo corticale.
Abbiamo ragione che questo approccio può essere facilmente estesa per misurare meccanica blastoderm negli embrioni stessi o ad altri punti di tempo inerente allo sviluppo in zebrafish e, infine, ad altri organismi. Questa approssimazione dipenderà solo ingegneria delle procedure di montaggio appropriato (Vedi riferimento32) facilitare l'accesso di AFM sonde nei posti giusti al momento giusto. Ancora, il movimento continuo della maggior parte delle cellule e dei tessuti durante lo sviluppo dovrebbe essere preso in considerazione in qualsiasi applicazione per altri modelli di sviluppo. I movimenti delle cellule renderà l'applicazione di questi metodi molto più impegnativo.
In alcuni casi, AFM in vivo sarebbe inapplicabile se non possono essere risolti problemi di accessibilità. Sia in adulti e gli embrioni in via di sviluppo, le cellule sono in gran parte inaccessibili. Così, per testare le proprietà biofisiche in situ, è imperativo di impiegare metodi non richiedendo diretto contatto. Nanoparticle tracking microrheology soddisfa questi requisiti6. Questa tecnica si basa sull'analisi ad alta risoluzione spaziale e temporale degli spostamenti browniani delle singole particelle. Le proprietà di micromeccanica locale del fluido viscoelastico che circonda queste nanoparticelle è un riflesso diretto della misura e lasso di tempo-dipendenza della loro MSDs. Questo approccio è già stato applicato allo sviluppo di organismi e ha contribuito a determinare il carattere altamente viscoso del c. elegans embrione citoplasma30. Abbiamo scoperto che un tuorlo di zebrafish Visualizza proprietà equivalenti con embrioni di c. elegans , anche se la sua viscosità è due ordini di grandezza inferiori. Recentemente è stata segnalata una dipendenza di tempo lineare di MSD con simili valori di viscosità di tuorlo a quelli del tuorlo zebrafish in Drosophila33.
Anche se non abbiamo esplorare questa possibilità noi stessi, iniettate nanoparticelle non rivestite e rivestite recentemente sono state impiegate come bersagli di pinzette ottiche in zebrafish larve34. Micromanipolazione non invasiva all'interno di un intero-organismo può dare spunti non solo diretti in interazioni cellula ma in proprietà meccaniche e attività non accessibili utilizzando approcci esistenti.
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Disclosures
Gli autori dichiarano senza concorrenti interessi finanziari o altri conflitti di interesse.
Acknowledgments
Ringraziamo Amayra Hernández-Vega e Philippe-Alexandre Pouille per partecipare alla configurazione di base per questi protocolli. Ringraziamo anche la piattaforma di Imaging molecolare dalla IBMB-PCB, Xavier Esteban e membri del laboratorio per il continuo supporto. Il programma di gruppi consolidati della Generalitat de Catalunya e DGI e Consolider sovvenzioni dal Ministero dell'economia e competitività della Spagna all'EMB e DN supportato questo lavoro.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Inverted optical microscope | Nikon | TE2000 | Visualization of the sample and AFM cantilever |
| Atomic force microscope (AFM) | Custom made | - | Any commercialized AFM could be employed |
| Inverted Confocal microscope | Zeiss | LSM780 | Nanorheology data collection |
| Agarose D1 Low EEO | Conda | 8016.00 | Casting embryos |
| Ultrapure LMP Agarose (low melting) | Invitrogen | 16520-100 | Securing embryos |
| Zebrafish Microinjection and Transplantation Molds | World Precision Instruments | Z-MOLDS | Casting embryos. Custom made with the original dimensions can also be employed |
| Dumont 5 Forceps | FST | 11251-20 | 1.5 mm diameter |
| Si3N4 cantilever | Novascan | PT.GS | Measuring the embryo by AFM. Spherical tip: 4.5 µm diameter and k=0.01 N/m |
| Fluorescent nanoparticles | Life Technologies | FluoSpheres F8811, | For tracking nanorheology |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | P-2000 | Fabricating tailored microneedles |
| Borosilicate capillary glass | Warner Instruments | G100TF-4 | Fabricating tailored microneedles |
| Micromanipulator | Narishige | MN-153 | Manipulating the micropipette |
| Microinjector | Eppendorf | FemtoJet Express | Controlling injection time and pressure |
| Stereomicroscope | Leica | DFC365FX | Visualization of the embryos during injection |
| Analysis Software | MathWorks | Matlab | Analyzing AFM and particle tracking data |
| Zebrafish | AB and TL wild type | - | Strains employed for embryo collection |
| Glass Bottom Plates | Mat Tek | P35G-0.170-14-C | Mounting embryos for nanorheology data collection |
| Stage micrometer | FST | 29025-02 | Measuring injection volume |
References
- Hernandez-Vega, A., et al. Polarized cortical tension drives zebrafish epiboly movements. EMBO J. 36, 25-41 (2017).
- Brodland, G. W., et al. Video force microscopy reveals the mechanics of ventral furrow invagination in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 22111-22116 (2010).
- Grill, S. W. Growing up is stressful: biophysical laws of morphogenesis. Curr Opin Genet Dev. 21, 647-652 (2011).
- Krieg, M., et al. Tensile forces govern germ-layer organization in zebrafish. Nat Cell Biol. 10, 429-436 (2008).
- Koser, D. E., et al. Mechanosensing is critical for axon growth in the developing brain. Nat Neurosci. 19, 1592-1598 (2016).
- Wirtz, D. Particle-tracking microrheology of living cells: principles and applications. Annu Rev Biophys. 38, 301-326 (2009).
- de Pablo, P. J., Carrión-Vázquez, M. Imaging Biological Samples with Atomic Force Microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 2014, 167-177 (2014).
- Roca-Cusachs, P., et al. Rheology of passive and adhesion-activated neutrophils probed by atomic force microscopy. Biophys J. 91, 3508-3518 (2006).
- Evans, E., Yeung, A. Apparent viscosity and cortical tension of blood granulocytes determined by micropipet aspiration. Biophys J. 56, 151-160 (1989).
- Fabry, B., et al. Time scale and other invariants of integrative mechanical behavior in living cells. Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys. 68, 041914 (2003).
- Kashef, J., Franz, C. M. Quantitative methods for analyzing cell-cell adhesion in development. Dev Biol. 401, 165-174 (2015).
- Chevalier, N. R., et al. Measuring the micromechanical properties of embryonic tissues. Methods. 94, 120-128 (2016).
- Reichlin, T., et al. Investigating native coronary artery endothelium in situ and in cell culture by scanning force microscopy. J Struct Biol. 152, 52-63 (2005).
- Rho, J. Y., Tsui, T. Y., Pharr, G. M. Elastic properties of osteon and trabecular bone measured by nanoindentation. J Biomech. 31, 21 (1998).
- Grant, C. A., et al. Surface characterisation and biomechanical analysis of the sclera by atomic force microscopy. J Mech Behav Biomed Mat. 4, 535-540 (2011).
- Efremov, Y. M., et al. Atomic force microscopy of living and fixed Xenopus laevis embryos. Micron. 42, 840-852 (2011).
- Henkels, J., et al. Spatiotemporal Mechanical Variation Reveals Critical Role for Rho Kinase During Primitive Streak Morphogenesis. Ann Biomed Eng. 41, 421-432 (2013).
- Solnica-Krezel, L. Gastrulation in zebrafish -- all just about adhesion? Curr Opin Genet Dev. 16, 433-441 (2006).
- Kimmel, C. B., et al.
- Rohde, L. A., Heisenberg, C. P. Zebrafish gastrulation: cell movements, signals, and mechanisms. Int Rev Cytol. 261, 159-192 (2007).
- Campinho, P., et al. Tension-oriented cell divisions limit anisotropic tissue tension in epithelial spreading during zebrafish epiboly. Nat Cell Biol. 15, 1405-1414 (2013).
- Fischer-Friedrich, E., et al. Quantification of surface tension and internal pressure generated by single mitotic cells. Sci Rep. 4, 6213 (2014).
- Moeendarbary, E., Harris, A. R. Cell mechanics: principles, practices, and prospects. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 6, 371-388 (2014).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. Eugene, OR. (2000).
- Alcaraz, J., et al. Microrheology of human lung epithelial cells measured by atomic force microscopy. Biophys J. 84, 2071-2079 (2003).
- Jorba, I., et al. Probing Micromechanical Properties of the Extracellular Matrix of Soft Tissues by Atomic Force Microscopy. J Cell Physiol. 232, 19-26 (2017).
- Hutter, J. L., Bechhoefer, J. Calibration of atomic-force microscope tips. Review of Scientific Instruments. 64, 1868-1873 (1993).
- Lomakina, E. B., et al. Rheological analysis and measurement of neutrophil indentation. Biophys J. 87, 4246-4258 (2004).
- Alcaraz, J., et al. Correction of Microrheological Measurements of Soft Samples with Atomic Force Microscopy for the Hydrodynamic Drag on the Cantilever. Langmuir. 18, 716-721 (2002).
- Daniels, B. R., Masi, B. C., Wirtz, D. Probing single-cell micromechanics in vivo: the microrheology of C. elegans developing embryos. Biophys J. 90, 4712-4719 (2006).
- Kalwarczyk, T., et al. Comparative analysis of viscosity of complex liquids and cytoplasm of mammalian cells at the nanoscale. Nano Lett. 11, 2157-2163 (2011).
- Soroldoni, D., et al. Genetic oscillations. A Doppler effect in embryonic pattern formation. Science. 345, 222-225 (2014).
- He, B., et al. Apical constriction drives tissue-scale hydrodynamic flow to mediate cell elongation. Nature. 508, 392-396 (2014).
- Johansen, P. L., et al. Optical micromanipulation of nanoparticles and cells inside living zebrafish. Nat Commun. 7, 10974 (2016).
