Summary
Le manque d’outils pour mesurer les propriétés des matériaux et des paramètres ligatures en vivo empêche de valider leurs rôles au cours du développement. Nous avons utilisé la microscopie à force atomique (AFM) et suivi des nanoparticules pour quantifier les caractéristiques mécaniques sur la cellule de jaune de œuf embryon intact zebrafish durant l’épibolie. Ces méthodes sont fiables et largement applicable en évitant des interventions intrusives.
Abstract
Élucider les facteurs qui orientent l’organisation spatio-temporelle de l’évolution des tissus est l’un des buts principaux de l’étude du développement. Diverses propositions prétendent avoir été importantes contributions à la compréhension des propriétés mécaniques des cellules et des tissus dans leur organisation spatio-temporelle dans différents processus morphogénétiques et de développement. Toutefois, en raison du manque d’outils fiables et accessibles pour mesurer les propriétés des matériaux et des paramètres ligatures en vivo, valider ces hypothèses a été difficile. Nous présentons ici des méthodes utilisant la microscopie à force atomique (AFM) et suivi dans le but de quantifier les propriétés mécaniques de la cellule de jaune de œuf embryon intact zebrafish durant l’épibolie de particules. Épibolie est un processus de développement précoce conservé dont l’étude est facilitée par la transparence de l’embryon. Ces méthodes sont simples à mettre en œuvre, fiable et largement applicable puisqu’ils surmontent des interventions intrusives qui pourraient influer sur la mécanique des tissus. Une stratégie simple a été appliquée pour le montage d’échantillons, l’enregistrement de l’AFM et des injections de nanoparticules et de suivi. Cette approche rend ces méthodes facilement adaptable à d’autres fois du développement ou les organismes.
Introduction
Les principes physiques qui sous-tendent le contrôle biomécanique des processus morphogénétiques sont en grande partie non définies. Alors que des études biomécaniques au niveau moléculaire et cellulaire sont rassemblent élan considérable, l’exploration des paramètres biomécaniques au niveau tissulaire/organisme est à ses balbutiements. Hydrodynamiques régression1 ou vidéo microscopie de Force2 permettent aux chercheurs de distinguer les forces actives et passives, tandis que de microchirurgie laser3, ou la moins intrusive microscopie à force atomique (AFM) de cellules dissociées4 ou en vivo 5 ou nanoparticules microrhéologie6 permettre l’anticipation d’un tissu propriétés mécaniques et les réponses.
AFM est une technique topographique en trois dimensions avec une haute résolution atomique résoudre la rugosité et la conformité de la déviation de conseils en porte-à-faux lors du contact avec une surface sondé7. Différentes méthodes employant l’AFM ont été développés pour étudier les propriétés de surface, y compris mesure de frottement, adhérence des forces et des propriétés viscoélastiques des matériaux diversifiés. Récemment, l’AFM a émergé comme un outil puissant pour récupérer des informations sur les propriétés mécaniques des échantillons biologiques. En particulier, AFM peut extraire non invasive le module de cisaillement complexe de cellules individuelles en appliquant des indentations oscillatoires avec un embout micro attaché au bras de levier du connu flexion constante8. Cela nous permet de déduire les forces qui en résultent. Pourtant, l’AFM n’est pas unique et différentes méthodologies permettent d’extraire des données rhéologiques et mécaniques de cellules individuelles (p. ex., Micropipette aspiration9, magnétique torsion cytometry (MTC)10ou uniaxiales traction essai11).
Pourtant, l’application de ces nouvelles méthodes aux processus morphogénétiques complexes n’est pas simple. Les principaux défis rencontrés lors de la détermination des propriétés mécaniques des tissus embryonnaires sont les petits (µm à mm), doux (dans les 102 - 104 Pa rang) et la nature visco-élastique (donnant lieu à des phénomènes dépendant du temps) de la matière12. Il est donc important d’adapter les méthodes employées pour la détermination des propriétés mécaniques (rigidité, viscosité, adhérence) pour le cas spécifique des embryons et des organismes en développement. Deux questions importantes doivent être pris en considération lors de l’analyse rhéologiques approches pour étudier le développement : pour éviter toute interférence intrusive et de fournir un accès facile. Dans ce scénario, aspiration de micropipette, MTC et essai de traction présentent des limites. Dans le premier cas, la déformation importante qui souffre d’une cellule susceptible de modifier ses propriétés physiologiques et mécaniques9. Dans le second cas, la nécessité d’adhérer fermement le tissu expérimental à un substrat pour s’assurer que les contraintes appliquées déforment le cytosquelette localement pourrait également introduire des effets sur l’état d’activation des cellules et, par conséquent, dans leurs caractéristiques mécaniques10 . Dernières approches traction uniaxiales sont limitées par la géométrie de développer des organismes et accessibilité11.
AFM semble mieux convenir pour l’étude des processus de développement car elle permet l’étude d’échantillons biologiques directement dans leur milieu naturel sans aucune préparation de l’échantillon encombrant. En outre, dissociation des tissus embryonnaires est généralement difficile, la taille réduite des sondes AFM fournit un haut degré de polyvalence sans limitation dans le choix du type de milieu (aqueuse ou non aqueuses), température de l’échantillon ou chimique composition de l’échantillon. AFM est suffisamment polyvalent pour être appliquée à vastes domaines et d’échelles de temps et a été employé pour récupérer les propriétés des matériaux des tissus dans des conditions physiologiques ou stades distincts. Les tissus ensemble natifs comme artères13 ou OS14 ont été étudiées d’un point de vue topographique et dans certains cas, comme la sclère, propriétés mécaniques ont également été consulté le15. Topographie a également été explorée dans les embryons vivants permettant la visualisation, par exemple, cellule du réarrangement d’au cours de la morphogenèse in Xenopus16. Protocoles de préparation témoin dernier, Global ont été développés afin de déterminer les paramètres mécaniques au cours de différents processus de développement. Cartes de nanoindentation ont été générées sur des sections de tissu non fixées natif pour le poussin embryonnaire tube digestif11; propriétés adhésives et mécaniques Récupérée pour individuels ectoderme, mésoderme et endoderme progéniteurs isolés des embryons de poisson-zèbre gastrulating4; mesures de rigidité effectuées pour l’épiblaste et de la ligne primitive sur des explants d’embryons aviaires17; et une nette tendance de dégradés de rigidité définis directement dans le cerveau embryonnaire de Xenopus5.
Un saut qualitatif important d’application AFM pour explorer le développement embryonnaire peut-être provenir de l’approche simples processus morphogénétiques accessibles. Poisson zèbre épibolie est un événement essentiel et conservé, dans lequel les différents tissus coordonnent dans un espace restreint et sphérique de diriger l’expansion de la blastoderme en quelques heures. Dès l’apparition du poisson-zèbre épibolie (stade sphérique), une couche superficielle de cellules, la couche enveloppante (EVL), couvre un plafond semi-sphérique de blastomères centrée sur le pôle animal de l’embryon, assis sur une cellule syncytial massif jaune d’oeuf. Épibolie consiste en l’expansion corticale ward végétal de l’EVL, les cellules profondes (DCs) du blastoderme et la couche externe de la cellule de jaune de œuf syncytial (E-YSL) autour du jaune. Épibolie se termine par la fermeture de l’EVL et les contrôleurs de domaine à la pole vegetal18,19,20. Comment et où les forces sont générés durant l’épibolie et comment ils sont couplés à l’échelle mondiale ne sont pas encore clair1,21.
Ici, nous décrivons en détail comment appliquer AFM pour inférer les propriétés tissu mécanique passive au cours de la progression dans le poisson-zèbre jaune épibolie cellulaire in vivo. Pour ce faire, nous avons utilisé des microsphères petits attachés à encorbellements AFM comme sondes. Ceci permet la récupération d’informations locales précises au sein de la surface des cellules non uniforme jaune de œuf et d’étudier les gradients de tension et leur dynamique au fil du temps. AFM alternative approches telles que celles à l’aide de cale encorbellements22, sera rendu pas aux données locales qui sont assez précises. La technique du coin, qui exige des compétences de manipulation très prudent pour coller une cale plus grande que la taille de l’échantillon à l’extrémité du levier, n’est pas bien adaptée pour sonder l’embryon (~ 2 fois plus grande que la longueur du levier) mécanique.
Modélisation et à caractériser les propriétés viscoélastiques des cellules de façon qualitative et quantitative permet une meilleure compréhension de leur biomécanique. D’un point de vue biomécanique, il est essentiel de comprendre l’épibolie et pas seulement demande connaissance des mesures de tension corticale et dynamiques, qui peuvent être extraites par l’AFM ; ainsi, il y a besoin d’informations sur les propriétés biophysiques du tissu. Pour extraire ces informations, une variété de cellule rhéologie techniques ont été développés au cours des années afin de caractériser les différents types de cellules sous différentes conditions physiologiques23. Citons, entre autres, AFM, MTC et pinces optiques (OT). Ces méthodes, cependant, ont fait leurs preuves insuffisantes pour mésoscopique des analyses à l’échelle d’embryons ou d’organes. Comme alternative, nous avons adapté avec succès les suivi des nanoparticules microrhéologie6 pour in vivo des mesures rhéologiques. Cette technique analyse les déplacements browniens des particules individuelles et déduit les propriétés locales micromécaniques.
Ensemble microrhéologie AFM et nanoparticules permettent la définition de dynamique corticale des ligatures et des propriétés mécaniques internes du jaune durant l’épibolie. Cette information souscrit pleinement à un modèle dans lequel les contraintes anisotropes se développe en raison des différences dans la réponse de déformation de l’EVL et la couche cytoplasmique de jaune d’oeuf (YCL) à la contraction de l’actomyosine isotrope du cortex E-YSL est essentielle pour le mouvement directionnel net de l’EVL et épibolie progression1.
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Protocol
Toutes les étapes du protocole décrits ci-dessous suivent les directives de protection des animaux de nos institutions.
1. Culture de poisson-zèbre
- Reproduire et maintenir le poisson-zèbre adulte dans des conditions normales.
Remarque : Les embryons de type sauvage AB et TL ont été utilisés pour cette étude. - Collecte des embryons et cultivez-les à 28,5 ° C à l’E3 embryon moyenne24. Leur stade selon morphologie comme décrit précédemment19.
2. atomic Force Microscopy
- Manuellement les dechorionate mis en scène des embryons de poisson-zèbre (des âges différents selon les intérêts individuels). Enlever les chorions avec deux pinces fines et pointus (voir Table des matières).
- Saisissez le chorion à l’aide d’une pince et faire une larme dedans avec l’autre pince. Puis, tenant le chorion dans une région opposée à celle de la déchirure, pousser l’embryon doucement dans l’ouverture.
- Effectuer la dechorionation sous un stéréomicroscope dissection avec une portée réglable de grossissement de 8 X à 50 X.
- Monter les embryons pour AFM
- Préparer une solution de 2 % d’agarose dans le milieu de l’embryon et remplir une boîte de Petri 35 mm avec cela. Laisser solidifier. Faire des petits trous de 1,5 mm de diamètre (deux fois la taille d’embryon) et environ 350 µm de profondeur (l’embryon demi-taille) avec une pince fine dans le lit d’agarose.
- Placez les embryons dans les pokes faits dans la couche de gel d’agarose et assurer qu’ils fondent en place en répandant autour d’une solution faible de 0,5 % d’agarose dans le milieu de l’embryon. Verser cette solution autour juste les embryons pour les immobiliser dans les trous.
- Avant que l’agarose de la bas point de fusion se solidifie à température ambiante, faire pivoter les embryons de telle sorte que la région d’intérêt à être sondé par AFM feront face vers le haut (Figure 1 a).
- Examiner les embryons par AFM
- Localiser et les embryons dans la boîte de Pétri employant un objectif 20 X dans un Microscope à Force atomique inversé d’images (voir le Tableau des matériaux25) à température ambiante (23-24 ° C).
Remarque : Les embryons sont perpétuées immergé dans le milieu de l’embryon et attaché au lit d’agarose. - Sonde de surface de la cellule de jaune d’oeuf d’embryons casted utilisant des billes de polystyrène sphériques 4,5 µm de diamètre attaché au bras de levier avec une constante de ressort nominale de 0,01 N/m. définir l’amplitude crête à crête d’oscillation en porte-à-faux à 5 µm et sa fréquence de 1 Hz.
- Collecter des données pour chaque région devrait être testé dans différentes positions et à plusieurs embryons, comme une routine, pour une moyenne de données.
Remarque : Un bon point de départ est de sonder les cinq positions situées au milieu et dans les coins d’un carré de 10 µm x 10 µm en contrôlant la position en porte-à-faux avec les actionneurs piezo XY du microscope AFM. Imagerie et collecte des données a pris environ 20 min par embryon. Enregistrement des données dans différentes régions de la surface de la cellule embryonnaire jaune, par exemple, le pôle végétal ou différentes régions à proximité de la marge de cellules EVL (Figure 1 b et 1C), n’est possible en utilisant des échantillons distincts orientés différemment.
- Localiser et les embryons dans la boîte de Pétri employant un objectif 20 X dans un Microscope à Force atomique inversé d’images (voir le Tableau des matériaux25) à température ambiante (23-24 ° C).
- Calculer les forces
- Mesurer le déplacement vertical du levier AFM (z) avec des capteurs de jauge de contrainte couplés à actionneurs piézo et son déplacement (d) à l’aide d’une photodiode quadrant par la méthode optique levier avec le logiciel de contrôle de microscope (voir Table des matières ( 25).
- La pente d’une courbe d-z obtenue à partir des données recueillies dans une région nue d’une lamelle de verre permet de calibrer la corrélation entre le signal de la photodiode et la déformation de porte-à-faux (d).
Remarque : Le déplacement vertical mesuré est égale à la déviation en porte-à-faux et la pente représente la sensibilité de la déviation du levier optique26. - Déduire la constante de ressort cantilever (k) des fluctuations thermiques comme décrit précédemment27.
- Calculer l’indentation de l’échantillon (h) comme :
h = (z - zc) -(d - dhors) (1)
NOTE : Ici zc est la position du point de contact et darrêt correspond à l’offset de la photodiode. - Calculer la force (F) sur le cantilever comme :
F = k · m (2)
- Calculer la tension du cortex selon un modèle de liquide-ballon consistant en une couche élastique de tension corticale Tc renfermant un liquide visqueux. Dans ce modèle, pour petites indentations (par rapport à la taille de l’embryon), force augmente proportionnellement4,,28 , comme :
F = 4π Tc[(Rb / Re) + 1)] h (3)
NOTE : Ici Rb est le rayon de la perle et Re est le rayon de l’embryon. Pour l’embryon de poisson zèbre, comme le rayon de l’embryon (400 µm) est de deux ordres de grandeur plus grands que celui de la perle (2,25 µm), cette équation peut être approchée comme :
F = 4π Tc h (4)- Calculer la force de tension-indentation (F-h) courbes dans chaque région de cellule embryonnaire vitellin pour cinq différents point de mesures.
- Calculer le Tc pour chaque F-h courbe par moindres carrés non linéaires montage. Pour l’analyse statistique, la tension corticale Tc calculé doit être en moyenne de l’autre F-h courbes.
- Mesurer les propriétés viscoélastiques (rhéologie) du cortex en appliquant de faible amplitude (100 nm) oscillations de fréquences multiples au cours de l’AFM composé d’ondes sinusoïdales de fréquences différentes,25.
- Calculer un module complexe efficace g*(ƒ) dans le domaine fréquentiel partir des courbes de retrait de force comme :
g * (f) = [F(f) / h(f)]- ifb (5)
ici j’ai est l’unité imaginaire, et F(f) et h(f) sont les spectres de fréquence (f) de la force et de la mise en retrait. b est la correction pour la traînée visqueuse sur le cantilever extraite les oscillations appliquées sur la surface. - Distinctes g*(ƒ) en parties réelles et imaginaires, comme :
g * (Ƒ) = g' (f) + ig'' (f) (6)
em > g'(f) est le module d’élasticité et est une mesure de l’énergie élastique stockée et récupérée par cycle d’oscillation. g'' (f) est le module visqueux qui prend en compte l’énergie dissipée. - Calculer la tangente de perte, ce qui fournit un indice de la solide-like (< 1) ou liquide (> 1) comportement de la matière, comme :
g'' (f) / g' (f) (7)
Remarque : Avec ce type de mesure, il est possible d’extraire les paramètres indiquant comment visqueux et élastique comment est le matériau le sondé. Bien que b dépend légèrement de la distance de l’extrémité du levier à la surface, étant donné les très faibles valeurs de g´´ exposées par le jaune cell (voir la Figure 2D ci-dessous), de petites variations de b ont un impact négligeable les mensurations29.
- Calculer un module complexe efficace g*(ƒ) dans le domaine fréquentiel partir des courbes de retrait de force comme :
3. particules suivi microrhéologie
-
Effectuer la microinjection de particules dans la cellule oeuf
- Fabriquer des micro-aiguilles sur mesure à l’aide d’une horizontale de micropipettes et capillaire en verre borosilicaté (voir Table des matières).
- Préparer des micro-aiguilles qui ont un diamètre extérieur de 1. 00 mm, un diamètre intérieur de 0,58 mm et une longueur de 10 cm à l’aide des paramètres de l’extracteur : pression : 500 ; Chaleur : 510 ; Pull : 65 ; Vitesse : 25 ; Temps : 50.
- Préparer un plat de Pétri injection en créant des voies de droite mise en retrait dans une agarose à 1 % dans le lit moyen embryon employant des moules faits personnalisés (voir la Table des matières).
- Retournez les moules et les placer sur le dessus du gel d’agarose liquide et retirer les moules dès que le gel se solidifie. Pipetter les embryons dans les rainures faites par le moule dans l’agarose sous un stéréomicroscope dissection à un grossissement de X 1,2.
NOTE : La largeur et la conception des moules permettent les embryons à s’aligner.
- Retournez les moules et les placer sur le dessus du gel d’agarose liquide et retirer les moules dès que le gel se solidifie. Pipetter les embryons dans les rainures faites par le moule dans l’agarose sous un stéréomicroscope dissection à un grossissement de X 1,2.
- Avant l’injection, supprimer presque complètement le support afin de faciliter l’injection (la tension superficielle empêche l’embryon/chorion de coller à l’aiguille lorsque vous l’enlevez après l’injection).
- Microinject de nanoparticules fluorescentes (rayon un = 100 nm, voir Table des matières) dilué dans l’eau (1 / 1 000) dans la partie végétale de la cellule de jaune de œuf embryon (Figure 3 a).
- Ajuster la micropipette avec micromanipulateurs précision et injecter les billes avec un microinjector automatique avec contrôles de pression et de temps (voir Table des matières). Réglez la pression entre 10 et 20 lb/po².
- Avant d’injecter la solution de perle, calibrer le volume à injecter (0,5 nL) en mesurant la taille des gouttelettes envoyées par le microinjector avec un micromètre 1 x 0. 01 mm (voir la Table des matières).
- Utiliser un grossissement de 1, 6 X dans la dissection stéréomicroscope pour visualiser les embryons pendant les injections, qui sont effectuées à température ambiante.
- Fabriquer des micro-aiguilles sur mesure à l’aide d’une horizontale de micropipettes et capillaire en verre borosilicaté (voir Table des matières).
-
Évaluer le comportement viscoélastique du jaune en enregistrant les fluctuations thermiques
- Dechorionate les embryons microinjectés comme dans l’étape 2.1 et les intégrer dans une dépression de 0,5 % melting point d’agarose dans une solution moyenne embryon à 30 ° C. Ensuite, transférer sur des plaques à fond de verre (voir Table des matières) et orienter et poussez-les vers le couvre-objet lorsque l’agarose est encore liquide.
Remarque : Lorsque l’agarose se solidifie à température ambiante, les embryons sont prêts à être photographié. - Placer les embryons montés dans les plaques de fond de verre sur la scène d’un microscope confocal inversé 2 h après microinjection. Capturer des images des nanoparticules pour 26 s à une fréquence d’échantillonnage de 25 Hz avec un objectif X 63 à température ambiante dans un microscope confocal inversé employant le logiciel de microscope commercial standard (taille du pixel = 166 nm, images capturées chaque 40 ms).
- Calculer la position du centre de gravité des particules et de définir leurs trajectoires au fil du temps avec le plugin TrackMate de l’open source, logiciels ImageJ (Figure 3 b).
- Calculer le déplacement de Mean Square bidimensionnelle (TMS) de chaque particule avec logiciel sur mesure6,30 , comme :
< Δr2 (τ) > = < [x(t + τ) - x(t)]2 + [y(t + τ) - y(t)]2> (8)
NOTE : Ici t est le temps écoulé et le décalage dans le temps. Dans un liquide visqueux pur, le MSD augmente inversement avec viscosité (ν) selon la relation d’Einstein-Stokes :
< Δr2 (τ) > = 4kB Tτ/ 6πνa, (9)
où T est la température absolue.
- Dechorionate les embryons microinjectés comme dans l’étape 2.1 et les intégrer dans une dépression de 0,5 % melting point d’agarose dans une solution moyenne embryon à 30 ° C. Ensuite, transférer sur des plaques à fond de verre (voir Table des matières) et orienter et poussez-les vers le couvre-objet lorsque l’agarose est encore liquide.
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Representative Results
Mesures de tension corticale
Pour chaque point de mesure, cinq courbes de force-déplacement (F-z) ont été acquises par l’AFM par la montée en puissance du cantilever à 1 Hz avec une amplitude crête-à-crête de 5 µm (vitesse = 10 µm/s) jusqu'à une échancrure maximale d’environ 2 µm. Cette procédure prend moins de 20 min et n’était pas affectée par la progression de l’épibolie. Chaque condition expérimentale a été testée au moins 5 embryons.
Les courbes de force-déplacement enregistrés sur la cellule de jaune de œuf embryon, au contraire à ceux correspondant à l’agarose mou environnant, présentent une relation linéaire proportionnelle (R2 > 0,999) (Figure 2 a). Nous avons réalisé des séries supplémentaires de contrôle F-z courbes à 3 µm/s et 30 µm/s et jeté une dépendance potentielle corticaux tension Tc sur la vitesse du levier. Tc a augmenté seulement de 13 % (p < 0,01, t-test) quand la vitesse est passée de 10 à 3 µm/s et n’ont pas montré de changement significatif quand est passé de 10 à 30 µm/s.
Les courbes de force-indentation (F-h) enregistrés à une vitesse en porte-à-faux de 10 µm/s sur la cellule oeuf étaient presque linéaire et muni d’un modèle de liquide-ballon (Figure 2 b)1. Ce montage a permis le calcul des valeurs absolues de la moyenne tension superficielle (pN/µm) à des stades différents épibolie et à des positions différentes par rapport à la pointe de l’EVL (identifiées sous lumière transmise) (tableau 1).
Rhéologie du cortex
Les différences entre la mise en retrait et la rétraction des courbes de force-déplacement (F-z) (Figure 2) indiquent un comportement viscoélastique du cortex cellulaire embryonnaire vitellin. Faible amplitude (100 nm) multifréquence oscillation mesures fournissent les informations pour calculer le module complexe efficace g*(ƒ) de surface de la cellule oeuf et ses composantes élastiques et visqueux (voir le protocole ci-dessus).
La rhéologie de cortex dans la cellule de jaune d’oeuf d’embryon de poisson zèbre est dominée par un comportement de type solide avec le module visqueux 5 fois plus faible que le module élastique1. Ce comportement n’est pas fréquence dépendant, soit pour l’élastique (ANOVA, p = 0,123), ou pour le module visqueux (ANOVA, p = 0.719) (Figure 2D).
Rhéologie du jaune
La viscosité du jaune a été calculée en appliquant l’équation (5) les données de MSD obtenus à partir de nanoparticules de suivi (voir la Figure 4 a-B). Le MSD des fluctuations thermiques des nanoparticules fluorescentes intégrés dans le jaune montre une dépendance proportionnelle sur le décalage dans le temps τ, cohérent avec le comportement d’un liquide newtonien. La viscosité de cisaillement efficace du jaune, qui est inversement proportionnelle aux coefficients de diffusion en vrac des nanoparticules, était 129 mPa·s.
Figure 1 : AFM de cellules de jaune de œuf de poisson-zèbre in vivo. (A) schéma décrivant l’ensemble des salariés pour sonder le cortex de cellule oeuf poisson zèbre par AFM. Déchorionés embryons d’âges différents se trouvaient à mi-chemin insérés dans les trous créé en blocs personnalisés d’agarose, tourné dans une orientation particulière et scellés sur les bords avec l’agarose de la bas point de fusion. Les cellules de jaune d’oeuf ont été hybridés avec des billes de polystyrène sphériques attachés au bras de levier (rouge). (B) embryon à 50 % épibolie que moitié incorporée dans l’agarose hybridés avec bras de levier (faux coloré en rouge) au pôle vegetal. (C) un embryon équivalent à celui en B, sondé à la cellule de jaune de œuf dans une région proche de la marge de cellules EVL. Barreaux de l’échelle = 100 µm (B et C). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2. Zebrafish embryonnaire vitellin cellule corticale tension et la rhéologie. (A) Force [déflexion (d)]-courbes (z) obtient pour un embryon représentatif comme l’extrémité en porte-à-faux s’approche et entre en contact avec l’échantillon [la surface du gel d’agarose (contrôle) en bleu] et la surface des cellules jaune en rouge. (B) la Force des courbes de retrait (F-h) (n = 3 embryons, 3 mesures par embryon à une distance de 10 µm les uns des autres. Chaque mesure représente la moyenne des 5 courbes) correspondent à un modèle de liquide-ballon (de référence1). Noter l’augmentation linéaire de déflexion lors du contact avec la surface de la cellule embryonnaire vitellin. La ligne pointillée noire montre le montage du modèle (d'où la tension corticale est déduite). (C) rapprochement (rouge) et des courbes de force-déplacement de rétraction (violet) pour un embryon représentant. Courbe les flèches rouges et violets pointent vers le régime temporel de collecte de données. La double-flèche met en évidence la différence entre l’approche et la rétraction des valeurs de flèche pointant vers le caractère viscoélastique du cortex. Viscoélasticité (D) du cortex cellulaire jaune de œuf (n = 5 embryons). Module complexe efficace (g *) extrait des oscillations multifréquence mesures AFM (à partir de 1). Symboles rouges représentent le module d’élasticité (g'), et les symboles bleus définissent le module visqueux (g″), respectivement. Moyenne et écart-type (SE) sont affichés. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3. Microrhéologie suivi de particules. (A) nanoparticules fluorescentes sont injectées dans la cellule oeuf d’embryons de poisson-zèbre à 50 % épibolie. (B) les déplacements ont été suivis pendant des nanoparticules individuels répartis au hasard dans le jaune d’oeuf (à gauche). Évolution temporelle des trajectoires typiques des nanoparticules (centroïdes) intégrée dans le jaune d’oeuf (2 exemples) marches aléatoires de pièce qui sont caractéristiques de diffusion visqueuse. Echelle = 100 µm (A) ; 1 µm (B, à gauche) ; 200 nm (B, droit). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4. Microrhéologie du jaune d’embryon de poisson zèbre. (A) FS des nanoparticules individuels (n = 99) présentent une dépendance approximativement linéaire avec décalage dans le temps. (B) moyenne ± écart-type FS de nanoparticules et de la viscosité du jaune. Ensemble en moyenne FS (moyenne - ligne rouge ± ÉT) du caractère essentiellement visqueux NANOPARTICULE population expositions. La pente linéaire de la relation reflète les propriétés diffusives des nanoparticules. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Moyenne tension (pN/mm) ± écart type | % d’épibolie | |||
| 40-50 | 60-70 | 80-90 | ||
| Distance à la marge EVL | 20 μm (E-YSL) | - | 60 ± 7 | - |
| 40 μm (YCL) | ± 67 11 | 72 ± 5 | 110 ± 7 | |
| Pôle végétal | - | 75 ± 3 | - | |
| n = 3 embryons (5 entailles sur chaque) pour chaque condition | ||||
Tableau 1 : Distribution de Tension spatio-temporelle à la surface de la cellule oeuf durant l’épibolie.
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Discussion
Ici, nous montrons que les propriétés du matériau et certains paramètres biomécaniques de la cellule de jaune de œuf de poisson-zèbre durant l’épibolie peuvent être facilement estimées par l’AFM et nanoparticules microrhéologie.
Alors que l’AFM a été employé pour récupérer des caractéristiques rhéologiques des cellules et des tissus dans des conditions physiologiques4,5,25,28, ici, nous avons développé un protocole d’application AFM au développement intact embryons que nous avons utilisé pour tester la surface des cellules de l’embryon de poisson zèbre jaune durant l’épibolie.
Pour nos mesures de l’AFM, l’orientation des embryons était garantie par la moitié de leur incorporation dans l’agarose de fusion faible. Pourtant, incorporation d’agarose n’affecta pas mesures AFM. La rigidité de l’agarose a été mesurée en sondant sa surface avec un embout sphérique. Nous avons trouvé un module d’Young (E) de 4,2 0,2 Pa pour ce gel en ajustant les courbes force-indentation avec le Hertz contacter le modèle d’une sphère mise en retrait d’une surface plane d’un corps élastique. Étant donné E 3g', l’agarose est 50 fois plus doux que le cortex cellulaire de jaune d’oeuf (Figure 2D). Par conséquent, compte tenu de son épaisseur limitée et rigidité très faible, les mesures d’AFM enregistrées au sommet de l’embryon semblent être extrêmement fiables.
Il est important de noter que récupérer les valeurs absolues des tensions corticale de données AFM exige un soin extrême au sujet de l’ajustage de précision de modèle mécanique. Dans le cas de la cellule de jaune d’oeuf de poisson zèbre, grâce à sa composition unique avec une couche externe de cytoplasmique riche en microtubules qui englobe une masse jaune très visqueux, nous contourner ce problème en utilisant un modèle de liquide-ballon consistant en un cortex élastique entourant une liquide visqueux. Ce modèle a été utilisé précédemment pour estimer la tension corticale des leucocytes avec une micropipette aspiration28, les cellules progénitrices sphérique gastrulating embryons de poisson-zèbre en retrait avec sphérique AFM conseils4et les cellules HeLa avec AFM à l’aide de pommé cantilever22.
Nous avons estimé la tension corticale de la cellule oeuf par indentation sa surface avec une petite pointe sphérique disponible dans le commerce. Cette petite sonde nous a permis de mesurer directement les différences régionales en tension corticale. Comme décrit ci-dessus, les données de force-indentation ont été interprétées en termes d’un modèle de liquide-ballon minimal (EQ. 2). Courbes de force enregistrement sur la surface des gels et des cellules avec un embout sphérique augmentent avec indentation comme une loi de puissance avec un exposant de 3/2. En revanche, nous avons constaté une relation proportionnelle force-indentation très bien équipée avec 2 EQ (Figure 2 b). Le peu de dépendance du Tc sur la vitesse de la luge et le bas g'' /g' ratio (Figure 2D) indique que la mécanique de cortex est dominée par un comportement élastique.
Mécanique de jaune d’oeuf ont été indépendamment hybridée avec rhéologie de microparticules. L’augmentation linéaire des TMS observée reflète clairement un comportement visqueux pur. Il est à noter que la viscosité des solutions polymères dépend de la taille de la sonde31. Par conséquent, la valeur de la viscosité de jaune d’oeuf, nous avons mesuré avec une sonde de 100 nm de rayon peut quelque peu différer de moléculaire (p. ex., réagissent en dépolarisation) ou mesures macroscopiques. Pris ensemble, ces résultats constituent un appui solide à l’adéquation du modèle ballon-liquide et la robustesse des corticales mesures de viscosité tension et jaune d’oeuf.
Nous raisonnons que cette approche pourrait être facilement étendue pour mesurer la mécanique blastoderme chez les embryons mêmes ou à d’autres points de la durée du développement dans le poisson-zèbre et, éventuellement, à d’autres organismes. Cette approximation dépendra uniquement des procédures de montage appropriées (voir référence32) d’ingénierie facilitant l’accès de l’AFM probes aux bons endroits au bon moment. Pourtant, le mouvement continu de la plupart des cellules et des tissus au cours du développement devrait être tenu compte dans n’importe quelle application à d’autres modèles de développement. Mouvements de la cellule fera l’application de ces méthodes beaucoup plus difficile.
Dans certains cas, AFM en vivo serait inapplicable si les problèmes d’accessibilité ne peuvent être surmontées. Tant chez les embryons en développement et les adultes, les cellules sont en grande partie inaccessibles. Ainsi, pour tester les propriétés biophysiques in situ, est impératif de recourir à des méthodes non exigeant direct contact. Nanoparticules de suivi microrhéologie remplit ces exigences6. Cette technique est basée sur l’analyse à haute résolution spatiale et temporelle des déplacements browniens des particules individuelles. Les propriétés locales micromécanique du fluide viscoélastique qui entoure ces nanoparticules est un reflet direct de la mesure et le décalage dans le temps-dépendance à l’égard de leurs fiches signalétiques. Cette approche a déjà été appliquée aux organismes de développement et a contribué à déterminer le caractère hautement visqueux des elegans de Caenorhabditis embryon cytoplasme30. Nous avons découvert qu’un poisson zèbre jaune affiche des propriétés équivalentes avec des embryons de c. elegans , bien que sa viscosité est de deux ordres de grandeur inférieurs. Une dépendance de temps linéaire de MSD avec des valeurs similaires de viscosité de jaune de œuf à celles du poisson-zèbre jaune a récemment signalée chez Drosophila33.
Même si il ne pas explorer cette possibilité nous-mêmes, injection de nanoparticules revêtus et non revêtus ont récemment travaillés comme cibles des pinces optiques dans de larves de poisson zèbre34. Micromanipulation non-invasifs à l’intérieur d’un ensemble-organisme peut donner des idées non seulement directes dans les interactions cellulaires, mais sur les propriétés mécaniques et les activités non accessibles à l’aide d’approches existantes.
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Disclosures
Les auteurs déclarent pas concurrentes d’intérêts financiers ou autres conflits d’intérêts.
Acknowledgments
Nous remercions Amayra Hernández-Vega et Philippe-Alexandre Pouille pour avoir participé à la mise en place de la base de ces protocoles. Nous remercions également la plate-forme d’imagerie moléculaire du IBMB-PCB, Xavier Esteban et de membres du laboratoire pour un soutien continu. Le programme de groupes consolidés de la Generalitat de Catalunya et la DGI et la Consolider subventions accordées par le ministère de l’économie et la compétitivité de l’Espagne à l’EMB et DN a soutenu ce travail.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Inverted optical microscope | Nikon | TE2000 | Visualization of the sample and AFM cantilever |
| Atomic force microscope (AFM) | Custom made | - | Any commercialized AFM could be employed |
| Inverted Confocal microscope | Zeiss | LSM780 | Nanorheology data collection |
| Agarose D1 Low EEO | Conda | 8016.00 | Casting embryos |
| Ultrapure LMP Agarose (low melting) | Invitrogen | 16520-100 | Securing embryos |
| Zebrafish Microinjection and Transplantation Molds | World Precision Instruments | Z-MOLDS | Casting embryos. Custom made with the original dimensions can also be employed |
| Dumont 5 Forceps | FST | 11251-20 | 1.5 mm diameter |
| Si3N4 cantilever | Novascan | PT.GS | Measuring the embryo by AFM. Spherical tip: 4.5 µm diameter and k=0.01 N/m |
| Fluorescent nanoparticles | Life Technologies | FluoSpheres F8811, | For tracking nanorheology |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | P-2000 | Fabricating tailored microneedles |
| Borosilicate capillary glass | Warner Instruments | G100TF-4 | Fabricating tailored microneedles |
| Micromanipulator | Narishige | MN-153 | Manipulating the micropipette |
| Microinjector | Eppendorf | FemtoJet Express | Controlling injection time and pressure |
| Stereomicroscope | Leica | DFC365FX | Visualization of the embryos during injection |
| Analysis Software | MathWorks | Matlab | Analyzing AFM and particle tracking data |
| Zebrafish | AB and TL wild type | - | Strains employed for embryo collection |
| Glass Bottom Plates | Mat Tek | P35G-0.170-14-C | Mounting embryos for nanorheology data collection |
| Stage micrometer | FST | 29025-02 | Measuring injection volume |
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