Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

تصور تشكيل الالتصاق في الخلايا من خلال متقدم الغزل مجهرية Fluorescence انعكاس الداخلية القرص--المجموع

Published: January 21, 2019 doi: 10.3791/58756
Automatic Translation
1, 1
1UKE Microscopy Imaging Facility, University Medical Center Hamburg-Eppendorf

Summary

مجهر متقدمة تسمح سريعة وعالية الدقة التصوير على حد سواء، من غشاء البلازما معزولة وحجم داخل الخلايا المحيطة بها، وسيقدم. يسمح إدماج الغزل القرص ومجموع التأمل الداخلي fluorescence مجهرية في الإعداد واحد يعيش تجارب التصوير في معدلات اقتناء عالية تصل إلى 3.5 ثانية لكل صورة المكدس.

Abstract

في الخلايا الحية، العمليات مثل تشكيل التصاق تنطوي على تغييرات هيكلية واسعة في غشاء البلازما وداخل الخلية. من أجل تصور هذه الأحداث ديناميكية للغاية، تم الجمع بين اثنين من التقنيات التكميلية الخفيفة الميكروسكوب أن السماح بتصوير سريع لعينات حية: الغزل القرص المجهري (SD) لتسجيل حجم سريعة وعالية الدقة والتأمل الداخلي الإجمالي الأسفار (TIRF) الفحص المجهري للترجمة الدقيقة والتصور من غشاء البلازما. سيظهر بروتوكول تصوير شاملة وكاملة لتوجيه من خلال إعداد العينة ومعايرة المجهر وتكوين الصور واقتناء، وأسفر متعدد الألوان SD-TIRF سلسلة التصوير العيش مع ارتفاع القرار الزمانية. وترد جميع خطوات تجهيز الصورة اللازمة لتوليد datasets التصوير حية متعددة الأبعاد، أي تسجيل ومجموعة من القنوات الفردية، في ماكرو الذاتي مكتوب لبرمجيات المصدر المفتوح إيماجيج. تصوير البروتينات الفلورية أثناء بدء تشغيل ونضوج التصاق المجمعات، وكذلك تشكيل شبكة cytoskeletal أكتين، استخدمت كدليل على المبدأ لهذا النهج المبتكر. تركيبة عالية الدقة 3D الفحص المجهري و TIRF قدمت وصفاً مفصلاً لهذه العمليات المعقدة داخل البيئة الخلوية، وفي الوقت نفسه، التعريب الدقيق للجزيئات المرتبطة بغشاء من الكشف، بارتفاع نسبة الإشارة إلى الخلفية.

Introduction

أيامنا، بتطوير تقنيات الفحص المجهري الخفيفة توفير تصوير القرار السامي/سوبر في ثابت والعينة الحية سريعاً. تقنيات فائقة القرار مثل حفز الانبعاثات استنفاد (STED)، منظم إضاءة مجهرية (SIM) وصور في تفعيل التعريب مجهرية (النخيل) أو إعادة البناء الضوئي العشوائية المباشرة مجهرية (العاصفة)، على التوالي، هي المتاحة تجارياً وتمكين تصوير هياكل سوبسيلولار عرض التفاصيل تقريبا في الحجم الجزيئي1،2،3،4،،من56. ومع ذلك، هذه النهج ما زالت محدودة الانطباق لتجارب التصوير الحية التي تحتاج إلى تصور مع إطارات متعددة في الثانية وسرعة اقتناء كميات كبيرة. أنواع مختلفة من عمليات ديناميكية للغاية تنظم عبر غشاء البلازما، مثل إندو-/الرقابة أو الالتصاق أو الهجرة أو إشارات، تحدث مع سرعة عالية داخل وحدات التخزين الخلوية الكبيرة. مؤخرا، من أجل ملء هذه الفجوة، كان أسلوب الفحص المجهري متكاملة المقترحة للغزل يسمى القرص-TIRF (SD-TIRF)7. بالتفصيل، تصاريح TIRF الفحص المجهري لعزل على وجه التحديد وتعريب8،غشاء البلازما9، بينما مجهرية SD واحدة من أكثر المسائل حساسية وسرعة يعيش تقنيات التصوير للتصور وتتبع سوبسيلولار العضيات في10،السيتوبلازم11. المزيج من كلا تقنيات التصوير في إعداد واحد قد تحققت فعلا في12،الماضي13، بيد المجهر المعروضة هنا (الشكل 1) وأخيراً يفي بمعايير القيام بتجارب التنمية المستدامة-TIRF التصوير الحي العمليات المذكورة آنفا على 3 إطارات في الثانية وسرعة. منذ هذا المجهر متاحة تجارياً، والهدف من هذه المخطوطة هو وصف في التفاصيل وتوفير أدوات مفتوحة المصدر وبروتوكولات للحصول على الصور والتسجيل والتصور المرتبطة بالفحص المجهري SD-TIRF.

يستند الإعداد مجهر مقلوب متصلة بوحدات الفحص اثنين عبر منافذ مستقلة-المنفذ الأيسر مرتبط بوحدة التنمية المستدامة والمنفذ مرة أخرى إلى وحدة الماسح الضوئي TIRF وصور--تنشيط/-تبييض التجارب. أشعة الليزر تصل إلى 6 (405/445/488/515/561/640 nm) يمكن أن تستخدم للإثارة. للإثارة والكشف عن إشارة الأسفار، أما علامة x 100/60 x أو زيت NA1.45/NA1.49 النفط الهدف TIRF، على التوالي، وقد استخدمت. الضوء المنبعثة هو تقسيم بواسطة مرآة مزدوج اللون (561 نانومتر طويلة-تمرير أو 514 nm منذ فترة طويلة-تمرير) وتتم تصفيتها بواسطة تمرير الفرقة مرشحات مختلفة (55 نانومتر واسعة تركزت في 525 نانومتر، 54 نانومتر واسعة تركزت في 609 نانومتر للأسفار الأخضر والأحمر، على التوالي) وضعت أمام اثنين كام م-مكافحة التصحر المناقصات الإلكترونية. يرجى ملاحظة أنه يتم سرد المزيد من التفاصيل الفنية حول برنامج الإعداد في زوبياك et al. 7. في تكوين TIRF، يتم نقل وحدة التنمية المستدامة خارج مسار الضوء داخل حوالي 0.5 s حيث أنه يمكن استخدام نفس اثنين من الكاميرات للكشف، مما يتيح سرعة التبديل بين طرائق التصوير اثنين مقارنة بحوالي 1 ثانية الذي تم الإعلام عنه في الماضي13 < /c2 >. تتيح هذه الميزة إمكانية اكتساب متزامنة مزدوجة القناة، وهكذا 4 القنوات SD-TIRF التصوير السرعة لا مثيل لها في السابق ويمكن تنفيذها بدقة. وعلاوة على ذلك، المواءمة بين التنمية المستدامة و TIRF الصور لا لزوم لها. محاذاة الصورة بين اثنين من الكاميرات، ومع ذلك، قد يمكن فحصها قبل البدء التجربة وتصحيحها إذا لزم الأمر. في البروتوكول التالية، تم تنفيذ روتين تصحيح تسجيل في ماكرو ImageJ الذاتي مكتوب. وعلاوة على ذلك، الماكرو صمم أساسا للسماح لمرئيات متزامنة TIRF الآدمية رغم أبعاد مختلفة والتنمية المستدامة. اقتناء البرمجيات نفسها لم تقدم هذه الميزات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-إعداد الخلايا

  1. يومين قبل التجربة، بذور الخلايا 3 * 105 هيلا أو NIH3T3 في 2 مل متوسطة النمو الكامل كل جيدا لوحة الخلية 6-جيدا-والثقافة. ضمان أن يتم التعامل مع الخلايا في غطاء الاندفاق الصفحي في جميع أنحاء هذا البروتوكول.
  2. يوم واحد قبل التجربة، إعداد الكواشف تعداء وفقا لتوصيات الشركة المصنعة أو بروتوكولا تجريبيا العزم، مثلاً:
    1. تمييع 1 ميكروغرام من ليفيكت طلب تقديم العروض وتخفيض 1 ميكروغرام من يفب-فينكولين في مجموعها 200 ميليلتر المتوسطة المصل. دوامة الكاشف تعداء بإيجاز، إضافة 4 ميليلتر للحمض النووي 200 ميليلتر ودوامه مرة أخرى. احتضان هذا المزيج تعداء لمدة 15-20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    2. إضافة مزيج تعداء كاملة دروبويسي مباشرة إلى الخلايا. مزيج من الهز اللوحة ووضعها مرة أخرى في الحاضنة.
  3. في يوم التجربة، إعداد العينة لتصوير مباشر:
    1. تعد حلاً ميكروغرام/مل 10 من فيبرونيكتين في برنامج تلفزيوني لمعطف سطح الزجاج صحن أسفل الزجاج 35 ملم. استخدم فقط كوفيرسليبس الزجاج 0.17 ملم ذات جودة عالية لتحقيق الأداء الأمثل TIRF وتجنب الأطباق أسفل البلاستيك. إجازة الحل على الزجاج السطحية لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، ثم إزالته واسمحوا الطبق أيردري.
    2. تمييع حل خرز متعدد فلورسنت 0.1 ميكرومتر لكثافة 1.8 × 109 جزيئات كل مل بالماء المقطر وإضافة الحل بالنسبة 30-60 ثانية إلى سطح الزجاج فيبرونيكتين المغلفة. إزالة الحل فورا وترك الطبق أيردري.
      ملاحظة: هذه الخطوة ضروري فقط إذا كان ينبغي العثور على الطائرة TIRF قبل البذر الخلايا و/أو للحصول على صورة مرجع 2-لون لتسجيل صورة تستند إلى حبة.
    3. إعداد حل حمض الأسكوربيك (أإ) 0.1 M وتمييع لتركيز نهائي من 0.1 ملم في النمو المتوسطة (أإ-المتوسطة). ضع الحل في حمام مائي 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: استخدام محسن للأسفار خلية الثقافة المتوسطة إذا كان ذلك ممكناً، مثل كما خالية من فينولريد و (ريبو) خفضت فلافين والمتوسط. AA هو عامل مؤكسدة المضادة التي يمكن أن تقلل من الآثار سمي ضيائي أثناء التصوير مباشرة14. نحن اختبرت بنجاح في هذا التحليل، أي المزيد من الخلايا تبدو صحية ضمن الشروط المطبقة من دون إضافة AA. ومع ذلك، تم خفض الرقم الهيدروجيني للوسط 0.17 درجة الحموضة الوحدات.
    4. تغسل الخلايا مع 2 مل برنامج تلفزيوني، إضافة 250 ميليلتر يدتا التربسين وانتظر حتى يتم الخلايا تماما منفصلة (2-3 دقيقة في حاضنة 37 درجة مئوية). ريسوسبيند الخلايا بعناية في 1 مل قبل استعد AA والمتوسط مع ماصة وإضافته إلى 4 مل AA-المتوسطة في أنبوب ثقافة خلية 15 مل. وضع تعليق خلية مع غطاء فتحه قليلاً في حاضنة تعيين إلى 37 درجة مئوية و 5% CO2 محيط المجهر.
    5. أضف 1 مل قبل استعد AA المتوسطة الطبق أسفل الزجاج ووضعه في صاحب المجهر ساخنة مسبقاً (انظر الفقرة التالية).

2-يعيش التصوير

  1. بدء تشغيل مراقبة البيئة من المجهر تحقيق استقرار 37 درجة مئوية، 5% CO2 والأجواء الرطبة.
    ملاحظة: هنا، غرفة حضانة أعلى مرحلة صغيرة وقد استخدمت أن إعدادات مستقرة المسموح بها ضمن حوالي 15 دقيقة أكبر الحاضنات سوف تحتاج مزيدا من الوقت لتحقيق ظروف مستقرة.
  2. إصلاح كافة الحصول على الإعدادات في المجهر قبل تطبيق تعليق الخلية:
    1. تعيين الفاصل الزمني إلى 30 ثانية، وأن مدة 60-90 دقيقة بتنشيط وظيفة التركيز التلقائي للأجهزة القائمة على التركيز التلقائي لكل نقطة الوقت (القيمة "1").
    2. ضبط التعرض الكاميرا والكسب، فضلا عن قوة الليزر لكل قناة. الحصول على مستويات عالية، ووقت التعرض المنخفضة والليزر منخفض الطاقة يوصي تقليل سمية صور.
      ملاحظة: البيانات المقدمة هنا حصل مع التعرض 200 مرض التصلب العصبي المتعدد، والوصول إلى مستوى 500 و 20% الليزر السلطة التي تساوي كثافة الإثارة من 0.5 W/cm ² ل 488 نانومتر و 1 ث/cm ² ل 561 نيوتن متر، على التوالي.
    3. تعيين z-المكدس لقنوات الغزل-القرص إلى 10 ميكرون مع 0.4 ميكرومتر التباعد. إلغاء تنشيط z-مداخن للقنوات TIRF. مجموعة السفلي-الإزاحة إلى "0"، أي أن الطائرة أدنى ستكون موضع تركيز الأجهزة التركيز التلقائي.
    4. تنشيط وظيفة متعددة النقاط "مرحلة المواقف".
      ملاحظة: ما يصل إلى 3 وظائف يمكن أن تسجل في فاصل زمني ق 30.
  3. البحث عن الخرز الفلورسنت مع إضاءة الفلورسنت برنامج التحصين الموسع في العين أو على شاشة الكمبيوتر، ثم تنشيط قناة TIRF واحدة وتعيين زاوية الإضاءة إلى قيمة التي تشير إلى الإضاءة TIRF. تنشيط التركيز التلقائي عن طريق الضغط على زر في لوحة مجهر وضبط التركيز مع عجلة الإزاحة. اكتساب من dataset 2-لون، أي TIRF 488 و TIRF-561، لتسجيل الصورة اللاحقة المستندة إلى حبة (انظر النقطة 3.1).
    1. اختياري: لضمان إضاءة TIRF، إضافة ميكروليتيرس عدد قليل من تعليق الخرز متعدد الألوان الفلورية بحرية عائمة (انظر النقطة 1.3.2.). تنشيط عرض حي لقناة TIRF وزيادة زاوية الإضاءة. سوف تختفي الخرز غير ملتصقة وراء زاوية حرجة، ضمان إضاءة TIRF صحيح8.
  4. مزيج تعليق الخلية مرة أخرى بعكس الأنبوبة المغلقة 2-3 مرات، وتطبيق 1 مل الخلايا إلى الطبق التصوير.
  5. العثور بسرعة على خلايا transfected مزدوجة مع انخفاض مستوى الإضاءة الفلورسنت برنامج التحصين الموسع. مركز الخلايا في المعاينة الكاميرا مباشرة باستخدام الإضاءة الحقل مشرق ووضع علامة على موضع. العثور على آخر 1-2 النقاط المثيرة للاهتمام وحفظها إلى قائمة المواقع.
    ملاحظة: في البداية، الخلايا بسهولة فصل بسبب الحركة المرحلة، ومن ثم تعيين مواقع 4-5 وإعادة التحقق من كل شيء قبل البدء في الحصول على الصور. وبعد ذلك، تجاهل مواقف 1-2.
  6. بدء الحصول على البيانات عن طريق النقر فوق الزر "التسلسل".

3-صورة مرحلة ما بعد المعالجة في إيماجيج

  1. من أجل توليد هايبرستاك التسجيل مجاناً في فيجي15، لقد كتب ماكرو باسم "التنمية المستدامة-TIRF_helper" التي يمكن تطبيقها إلى 2-4 قناة SD-TIRF timelapse مجموعات البيانات. حفظ الملف "SD-TIRF_helper_JoVE.ijm" في فيجي المجلد الفرعي "وحدات الماكرو" ثم تشغيل الماكرو بالنقر فوق أمر القائمة "الإضافات > وحدات الماكرو > تشغيل...".
    1. إذا قنوات اللون بحاجة إلى تصحيح التسجيل، حدد الخيار وإنشاء مرجع تسجيل المستندة إلى حبة جديد (ملف تاريخي) أو استخدام ملف موجود تم إنشاؤه من قبل.
      ملاحظة: سيتم تطبيق البرنامج المساعد توربوريج16 للأسفار الخرز الصور مرجع. قم بتثبيت البرنامج المساعد في البرمجيات فيجي وفقا للمبادئ التوجيهية العامة لعمليات تثبيت البرنامج المساعد.
    2. استيراد البيانات مع المستورد بيو-الأشكال واختيار هايبرستاك كخيار لعرض. تحميل dataset الصورة، حدد SD-السلسلة في الخطوة الأولى، وفي سلسلة TIRF في الخطوة الثانية. فيجي سيتم عرض البيانات حسب موقف القناة والمرحلة، أي تظهر عادة جميع القنوات SD وجميع القنوات TIRF كما هايبرستاك واحدة لكل موقف المرحلة التي تم تحديدها.
      ملاحظة: استيراد البيانات من الممكن من الأنواع المختلفة من الملفات، على سبيل المثال سلسلة TIFF أو ملف تعتمد على منصة أنواع مثل *.nd. لا يمكن التعرف على نوع الملف فقط إذا تم تصديرها لا باقتناء البرمجيات كتنسيق TIFF مستقلة، ضغط أقل.
    3. تطبيق تصحيح التسجيل على القنوات الخاصة بكل منها بتحميل الملف بمعالم محددة سلفا.
    4. حدد جدول البحث عن اللون المطلوب (لوط) لكل قناة SD--و TIRF ودمجها في هايبرستاك واحدة ومتعددة الأبعاد.
      ملاحظة: أثناء معالجة الأقنية TIRF، تتم إضافة عدد z-الطائرات مع قيم الصفر كثافة أعلى أسفل الطائرة التي تتناسب مع عدد الطائرات z في SD dataset. تعد هذه الخطوة هامة لتصور هايبرستاك النهائي. هذه المنهجية الصحيح، منذ عمق الإضاءة TIRF (أقل من 200nm7) أصغر من حجم المكدس SD z-الخطوة (400 نانومتر).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

بغية إظهار إمكانيات تصوير SD-TIRF، وضعت تحليل ينبغي أن تكشف عن المنظمة الزمانية مجمعات التصاق الخلايا المصفوفة وتفاعلها مع سيتوسكيليتون خلال الالتصاق الخلوي. ولذلك، تمسكا هيلا أو، بدلاً من ذلك، NIH3T3 تم transfected الخلايا مع يفب-فينكولين وليفياكت طلب تقديم العروض ح 18-24، تريبسينيزيد والمصنف على الزجاج المغلفة فيبرونيكتين أسفل الأطباق. هذه خطوط الخلايا اختيرت cytoskeleton وضوحاً ومتانة أعلى في تجارب التصوير الحي تعارض، على سبيل المثال، الخلايا الأولية. تلك التي قد لا تصمد أمام التصوير في حالة حساسة جداً كما بعد العلاج التربسين. في المجهر، اختيرت يفب/طلب تقديم العروض-وإذ يعرب عن الخلايا وعملية الالتصاق لوحظت خلال 60 دقيقة الوقت الفاصل بين (الشكل 2 وأفﻻم 1 و 2). هذه المقايسة محددة إلا نادراً، وعدم وضوح وصف بالأدب17،18. وعلاوة على ذلك، تشكيل التصاق معظمها تم التحقيق في مثل ترحيل الخلايا19،20. وبالتالي، نحن بحاجة إلى التكيف مع هذه المنهجية (خط الخلية، طلاء، المتوسطة، تكوين) من أجل القيام بالتجارب المبينة في هذه الورقة.

كما هو متوقع، كانت الخلايا على شكل جولة في بداية وإلا تمسكا ضعيفة، في حين نتوءات غشاء الاستشعار عن البيئة وجعل الاتصال مع الركازة. تعزيز الاتصالات الخلية-مصفوفة بسرعة على تشكيل ما يسمى الالتصاقات الوليدة20،21 (الشكل 2A، القناة TIRF-488، والوقت دقيقة نقطة 0-4، 5). هذه الأخيرة هياكل مثل بقعة، فينكولين--الإيجابية في الجانب البطني للخلية. وكانت الهياكل واضحة للعيان في الصور TIRF. في بداية تشكيل الالتصاق، أكتين كانت توزع بالتساوي في الخلية، وعدم ترجمة هذه المجمعات المبكر (الشكل 2A، قناة SD-561). على مدى الزمن، توسيع المجمعات الالتصاق ونضجت الالتصاقات المحورية (الشكل 2). هذه الهياكل ممدود اتضحت الغالب في محيط الخلية (الأرقام 2 ألف + باء) ونتج عن القوات التي كانت تمارسها ألياف الميوسين الأمازون. وبدأت هذه الألياف للاتصال بالمجمعات الالتصاق، وبالتالي سحب منهم نحو مركز الخلية وحفز تعزيز خلية-مصفوفة الالتصاقات، فضلا عن تجميع ألياف الأكتين21. على ما يبدو، دكت الخلية أيضا نتيجة لتكوين شبكة أكتين (الشكل 2A، عرض XZ). SD-تصوير تثبيتهم لأن طريقة الاختيار هنا، كما أنه يسمح بتصور هذه العملية مع حساسية عالية، القرار المكانية، ومن وجهة نظر كاملة. في تقرير سابق17، TIRF وحدها يمكن أن تسمح فقط التكهن حول أصل الالتصاقات الطرفية، بينما كشف التصوير SD TIRF وضوح ارتباطها مع فيلوبوديا (الشكل 2B، وقت نقطة 17 دقيقة، رأس السهم الأبيض). في الواقع، أصبحت ألياف الأكتين الخارجة سينتريبيتالي من الالتصاقات التنسيق مرئية بعد 27 دقيقة (الشكل 2B، رأس السهم الأصفر).

ومع ذلك، تحتاج إعدادات اقتناء هذه التجارب، أي اكتساب السرعة، وكسب كثافة والكشف عن الإثارة، تقييم دقيق. الفاصل الزمني 30 s/تيميبوينت، تمكن اكتساب نقطة متعددة، يظهر أن تكون مثالية، في حين أن كثافة الإشعاع الليزر الإثارة (بين 0.5-1 ث/cm ²) ينبغي أن يؤخذ قيد النظر الحاسمة. يعرض الشكل 2D خلية في موضع آخر في نفس التجربة التي لم تعلق على الركازة. قد يكون من الممكن أن تؤثر تأثيرات سمي ضيائي بيولوجيا الخلية هنا، مما أسفر أخيرا عن الغشاء الفقاعي بعد حوالي 60 دقيقة، ربما تشبه المبرمج (فيلم 2). وهذا يوضح مدى حساسية الخلايا مرة أخرى يمكن الرد على الضيائية وأنه من المهم إيجاد توازن جيد بين كمية الضوء التي وضعت في والمعلومات التي يجري اتخاذها. تقليل قوة الليزر، قد يكون عدد الصور في كدسة z أو زيادة المكاسب الاستراتيجية الصحيحة للحد من الضيائية. كافة هذه الإعدادات، بيد أن تعدل على مستوى الذي لا يزال يسمح لتحقيق ما يكفي من القرار وإشارة إلى نسبة الضوضاء، مما يتيح لاستخراج معلومات كمية من انقضاء الوقت المسجل.

Figure 1
رقم 1: التخطيطي الرسم من الإعداد TIRF التنمية المستدامة. ألف التنمية المستدامة وضع التصوير: تقترن ليزر مختلفة 6 (405/445/488/515/561/640nm، الأخضر الخطوط) إلى وحدة المسح الضوئي [كنفوكل] (CSU)، مرورا بالتنمية المستدامة (موقف 'في') وفي مكعب عامل تصفية فارغة في الجسم المجهر (MIC). ومن المتوقع انبعاث الأسفار من العينة (المواصفات) من خلال الثقوب للتنمية المستدامة وانقسام بمرايا مزدوج اللون مختلفة، مثلاً لاقتناء المتزامنة الأخضر/الأحمر أو الأصفر/سماوي، إلى اثنين من الكاميرات CCD م مختلفة (C1 و C2). مرشحات الأسفار توضع أمام الكاميرات (غير معروضة). وضع التصوير TIRF باء : خطوط الليزر تقترن في الماسح الضوئي TIRF (TIRF). مقسم شعاع متعدد الأسطر في هيئة التصنيع العسكري يوجه الشعاع للعينة وانبعاث الضوء يتجاوز SD ('خارج') لانتقال مكبر. الأسفار يتم الكشف عن الكاميرات نفسها والانبعاثات بتصفية أ هو موضح وقد تم تعديل هذا الرقم من زوبياك وآخرون. 7 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: نتائج تشكيل ينتشر والتصاق الخلية استخدام الفحص المجهري SD-TIRF الممثل. ألف هيلا الخلية transfected مزدوجة الإعراب عن طلب تقديم العروض-ليفيكت (القناة الحمراء، والتنمية المستدامة-561) ويفب-فينكولين (قناة الأخضر، TIRF-488) كانت كوفيرسليبس تريبسينيزيد وإعادة المصنف على الزجاج فيبرونيكتين المغلفة. ويصبح تشكيل التصاق العيان، بدءاً من 0 دقيقة أن تتطور لتصبح أكبر الالتصاقات التنسيق بعد حوالي 5 دقائق مع الالتصاقات الوليدة الصغيرة (النقاط الإيجابية فينكولين). أكتين القشرية من الواضح بعد حوالي 10 دقائق، ويمتد في محيط الخلايا (انظر إطارات في 12 و 24، 5 دقائق). باء رأي تضخيم المنطقة محاصر في (إطار في 45 دقيقة) يصور انتشار الخليوي والانتقال من الالتصاقات الوليدة للتنسيق، فضلا عن الالتصاقات المرتبطة فيلوبوديا (السهم الأبيض) وتشكيل الألياف الإجهاد (انظر الإطار في 27 دقيقة، رأس السهم الأصفر). جيم كيموجراف خط أصفر متقطع رسمها في ألف- دال (صور--) التأثيرات السمية على الخلايا أو الخلايا غير صحية وإلا يمكن السماح لهم لا نعلق على الركازة. شروط التصوير يجب أن يكون تقييمها نقديا بغية استبعاد الضيائية. شريط المقياس = 5 ميكرومتر (في ألف ودال) و 2 ميكرومتر (في ب وج). آراء XZ في ألف ودال هي إسقاطات متعامد المستخرجة من الخطوط البيضاء المتقطعة المرسومة فيه (أسفل = الركازة). وكانت الصور خطيا تعزيز التباين وتصفيتها الوسيط مع نواة 3 × 3. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Movie 1
الفيلم 1: 3D-التعمير في التسلسل timelapse في الشكل 2 أ. وصدر في تسلسل الصور مع 3D برامج التصوير. المدة: دقيقة 42.5 حيازة معدل: اقتنى مكدسات SD TIRF مزدوجة القناة 2 في الدقيقة (إطارات 56 في المجموع). من فضلك انقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بالزر الأيمن التحميل.)

Movie 2
2 فيلم: فيلم تسلسل timelapse في الشكل 2 جيم المدة: 60 دقيقة معدل اقتناء: اقتنى مكدسات SD TIRF مزدوجة القناة 2 في الدقيقة (إطارات 56 في المجموع). من فضلك انقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بالزر الأيمن التحميل.)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وفي هذه الورقة عرض أول نجاح تنفيذ الفحص المجهري SD و TIRF في تكوين مناسب لإجراء تجارب التصوير خلية حية، أي الحصول على ارتفاع معدلات مثل 2 رصات الصور SD-TIRF في الدقيقة في مرحلة مختلفة 3 تم الحصول على المناصب، المقابلة لمجموعة إطارات 168 (حوالي 3 إطارات في الثانية الواحدة)،. وصف مجاهر SD TIRF القليلة التي كانت سابقا12،13، أساسا من عدم وجود سرعة تصوير عالية بما فيه الكفاية لمتابعة العمليات الخلوية في 3D التي الأزمنة أقل من 2 s كل مكدس الصورة ضروري غالباً. الإعداد المقدمة يمكن تحقيق معدلات التصوير تصل إلى 0.78 رصات الصور في الثانية الواحدة، ومعدلات 3.5 s كل كومة صورة كبيرة في تجارب حية تم التحقيق حويصلة 3D ديناميات أظهر7. بالإضافة إلى ذلك، قد السابقة SD TIRF مجاهر واحد فقط للكشف عن كل تصوير الوضع، الحد من زيادة السرعة للمقتنيات متعدد القنوات. من الناحية الفنية، في تلك النظم التي يمكن تنفيذها تكوين طريقة العرض انقسام أيضا تسمح اقتناء اللون المزدوج المتزامن مع كاميرا واحدة. هذا، ومع ذلك، يسمح التصوير فقط نصف مجال الرؤية. طرق أخرى لإنتاج مجموعات البيانات متعددة الأبعاد مع ارتفاع القرار الزمانية مثل تصوير ويديفيلد جنبا إلى جنب مع deconvolution أو مجهرية 3D القرار العظمى، أي 3D سيم أو شعرية الورقة الخفيفة الميكروسكوب22، 23، قد تكون بدائل صالحة. بيد التصوير على أساس deconvolution يمكن بسهولة إدخال الصورة التحف في امتلاك نسبة الإشارة إلى الضوضاء منخفضة (كما هو الحال خلال غالباً ما يعيش التصوير التطبيقات)، والقرار فائقة 3D لايف تصوير لا تزال من الناحية الفنية مسهب و المهمة الصعبة. في عرض أعمال متقدمة الإعداد SD-TIRF7، كان يستفاد من وحدة التنمية المستدامة التي تتيح نقل المزدوج-القرص داخل وخارج مسار الكشف. يوفر هذا التكوين اثنين من الفوائد الرئيسية: أولاً، يمكن استخدام نفس اثنين من الكاميرات للكشف عن التنمية المستدامة و TIRF الإشارات، مما يؤدي إلى تداخل عالية الدقة اثنين من هذه القنوات. ثانيا، عدم حظر الثقوب القرص الغزل أي ضوء الانبعاثات عند التشغيل في وضع اقتناء TIRF (للحصول على مزيد من التفاصيل، انظر الشكل 1B)، وبالتالي زيادة كفاءة جمع هامة لتصوير حية حساسة عالية. ومن ثم فهذا التكوين البصري غير مواتية لتنفيذ أي نوع من TIRF مجهرية (مثل إضاءة زاوية متغير أو ثابت) إلى القائمة مجاهر SD التي تسمح لتجاوز وحدة التنمية المستدامة. وعلاوة على ذلك، يمكن تشغيل الماسح الضوئي TIRF المستخدمة في وضع ما يسمى القدرة، حيث يمكن أن تسجل قناتين TIRF في نفس الوقت (كما هو موضح في زوبياك et al. 7)، مسرعة حتى كذلك الحصول على بيانات متعدد القنوات.

واحدة من أكبر مزايا استخدام TIRF هو أنه من الممكن مع هذه المنهجية، ترجمة الإشارات القادمة من غشاء الخلية أثناء حياة خلية التصوير التجربة بدقة أعلى. في الواقع، بينما منهجية مثل توفر سيم أفضل z-تقطيع وهكذا ثابت عزلة أفضل من غشاء الخلية في عينات، في الخلية الحية التصوير تجارب الأسى زيادة/انخفاض إشارة الأسفار من العضيات التي تقترب من/ ترك الواجهة TIRF يسمح التعريب أكثر تحديداً ودقة لغشاء الخلية. دقة الترجمة، أن لم يكن لا يزال كمياً ويعد بأن يكون أقل من 150-200 نانومتر، العديد من الطيات أي النطاق المكاني للحقل تلاش.

حاليا حد من الأسلوب هو الوقت اللازم لإزالة وحدة القرص الغزل من مسار الضوء وبدء اكتساب TIRF، أي 0.5 s. ويحد هذا التأخير الفاصل الزمني الأدنى بين اثنين الاستحواذ على التوالي. من الناحية الفنية، سيكون من الممكن للحد من هذا التأخير من خلال تجاوز القرص مع مثل جالفو-مرايا ومما يخفض اقتناء عموما في كل دورة التنمية المستدامة-TIRF. أيضا، قد تسمح أحدث جيل الكاميرات مرات التعرض لانخفاض في نسبة الإشارة إلى الضوضاء عالية. ومن ثم يمكن تحسين الأداء العام لهذا الإعداد لا تزال الناقوس بترقية مكونات الأجهزة. من وجهة نظر التصوير، ومع ذلك، هناك عدة طرق أخرى لتقليل وقت الامتلاك (بالترتيب التنازلي): تجنب مواقف متعددة، خفض الارتفاع z-المكدس، زيادة z-المباعدة بين الولادات، وتقليل زمن التعرض (زيادة اكتساب واستخدام ربما binning)، يقصر المسافة بين مواقف اقتناء، وتنشيط التلقائي-التركيز فقط كل نقطة الوقت n th (n > 1). وعلى الرغم من القيود الفعلية، إذا كافة المعلمات التي يتم تقييمها بعناية، فمن الممكن استخدام SD-TIRF التصوير لتعقب وترجمه سريعة التحرك الحويصلات الخلوية، كما عرضت في زوبياك et al. 7.

وعلاوة على ذلك، قدم في هذه الورقة بروتوكول يصف اقتناء الروتينية لمجموعة بيانات التنمية المستدامة-TIRF قناة واحدة. باستخدام الماكرو المتوفرة، يمكن تصدير البيانات الأولية في ملف TIFF مفرد يحتوي على كافة القنوات SD--و TIRF. تسجيل الصورة في حد ذاته ليس ضروريا؛ ومع ذلك، من المهم أن كل من الكاميرات يتم محاذاة تحديداً فيما يتعلق ببعضها البعض. يمكن سحب التحولات بكسل (الترجمة والتناوب) التي كشفت وصححت داخل الماكرو المتوفرة. خوارزمية التصحيح يجعل استخدام صورة مرجعية متعددة القنوات الخرز الفلورسنت له أن يسجل فقط قبل البدء التجربة. في الملف الناتج، يتم تعيين الطائرة TIRF أدنى مستوى متبوعاً برقم صفر لكثافة الطائرات التي هي مطابقة أبعاد التنمية المستدامة-القناة. ولذلك من المهم الحصول على البيانات، كما ورد في البروتوكول، حيث يشبه الطائرة TIRF المصورة الطرف الأدنى من z-المكدس لقناة SD.

وأخيراً النظام يمكن أن يحتمل أن يمتد نمطية سيم أو أدخل مؤخرا زاوية المتعددة تيرفم24،25 إلى زيادة القرار المكانية. ومع ذلك، زيادة القرار المكانية يمكن، وفقا للحالي أحدث، إلا على حساب بسرعة أبطأ من تصوير. لكل خلية حية تصوير التجارب التي من المهم ترجمة الهياكل في غشاء البلازما لو صيانة عالية الدقة المكانية لحجم الخلايا المتبقية، الإعداد SD TIRF الموصوفة هنا وسيلة سهلة لدمج، متوفرة بسهولة الحل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

ونحن نشكر كثيرا المجتمع العلمي للجامعة الطبية مركز هامبورغ-ايبندورف لدعم منا مع العينات للتقييم. هي: نحن نشكر "سابين ويندورست" لخلايا NIH3T3، موردورست أندريا يفب-فينكولين ورودولف الإيطاليون لطلب تقديم العروض-ليفيكت.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Microscope and accessories
SD-TIRF microscope Visitron Systems
Ti with perfect focus system Nikon Inverted microscope stand
CSU-W1 T2 Yokogawa Spinning disk unit in dual-camera configuration
iLAS2  Roper Scientific TIRF/FRAP scanner
Evolve  Photometrix EM-CCD cameras
PiezoZ stage Ludl Electronic Products Motorized Z stage
Bioprecision2 XY stage Ludl Electronic Products Motorized XY stage
Stage top incubation chamber Okolab Bold Line Temperature, CO2 and humidity supply
Cell culture
HeLa cervical cancer cells DSMZ ACC-57
NIH3T3 fibroblasts DSMZ ACC-59
Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS) Gibco 14190144
Trypsin-EDTA 0.05% Gibco 25300054
Dulbecco's Modified Eagle Medium + GlutaMAX-I (DMEM) Gibco 31966-021
OptiMEM Gibco 31985070 Reduced serum medium
Fetal calf serum (FCS) Gibco 10500064
Penicillin/Streptomycin (PenStrep) Gibco 15140148
Full growth medium (DMEM supplemented with 10% FCS and 1% PenStrep)
TurboFect ThermoFisher Scientific R0531 Transfection reagent
Ascorbic acid (AA) Sigma A544-25G
6-well cell culture plate Sarstedt 83.392
Glass bottom dishes MatTek P35G-1.5-10-C 35mm, 0.17mm glass coverslip
Fibronectin, bovine plasma ThermoFisher Scientific 33010018
Neubauer improved chamber VWR 631-0696
TetraSpeck beads ThermoFisher Scientific T7279
Plasmids
RFP-Lifeact Maren Rudolph, Institute of Medical Microbiology, University Medical Center Hamburg Eppendorf, Germany
YFP-Vinculin Andrea Mordhorst, Institute of Medical Microbiology, University Medical Center Hamburg Eppendorf, Germany
Software and plugins
VisiView Visitron Systems Version 3
ImageJ Version 1.52c
Turboreg plugin http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/
Macro "SD-TIRF_helper_JoVE.ijm" this publication https://github.com/bzobiak/ImageJ
Volocity PerkinElmer Version 6.2.2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Optics Letters. 19 (11), 780 (1994).
  2. Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
  3. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), New York, N.Y. 1642-1645 (2006).
  4. Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophysical Journal. 91 (11), 4258-4272 (2006).
  5. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature methods. 3 (10), 793-796 (2006).
  6. van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nature protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).
  7. Zobiak, B., Failla, A. V. Advanced spinning disk-TIRF microscopy for faster imaging of the cell interior and the plasma membrane. Journal of Microscopy. 269 (3), 282-290 (2018).
  8. Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. Journal of Cell Science. 123 (21), 3621-3628 (2010).
  9. Burchfield, J. G., Lopez, J. A., Vallotton, P., William, E. Exocytotic vesicle behaviour assessed by total internal reflection fluorescence microscopy. Traffic. 11 (4), 429-439 (2010).
  10. Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M. Spinning-disk confocal microscopy. present technology and future trends. Methods in Cell Biology. 123, 153-175 (2014).
  11. Murray, J. M., Appleton, P. L., Swedlow, J. R., Waters, J. C. Evaluating performance in three-dimensional fluorescence microscopy. Journal of Microscopy. 228 (3), 390-405 (2007).
  12. Trache, A., Lim, S. -M. Integrated microscopy for real-time imaging of mechanotransduction studies in live cells. Journal of Biomedical Optics. 14 (3), 034024 (2009).
  13. Stehbens, S., Pemble, H., Murrow, L., Wittmann, T. Imaging intracellular protein dynamics by spinning disk confocal microscopy. Methods in Enzymology. , 293-313 (2012).
  14. Waldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., Van De Linde, S., Sauer, M. Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy. Scientific Reports. 5, 1-12 (2015).
  15. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  16. Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).
  17. Partridge, M. A. Initiation of attachment and generation of mature focal adhesions by integrin-containing filopodia in cell spreading. Molecular Biology of the Cell. 17 (10), (2006).
  18. Dubin-Thaler, B. J., Giannone, G., Döbereiner, H. G., Sheetz, M. P. Nanometer analysis of cell spreading on matrix-coated surfaces reveals two distinct cell states and STEPs. Biophysical Journal. 86 (3), 1794-1806 (2004).
  19. Choi, C. K., Vicente-Manzanares, M., Zareno, J., Whitmore, L. A., Mogilner, A., Horwitz, A. R. Actin and α-actinin orchestrate the assembly and maturation of nascent adhesions in a myosin II motor-independent manner. Nature Cell Biology. 10 (9), 1039-1050 (2008).
  20. Bachir, A. I., Zareno, J., Moissoglu, K., Plow, E. F., Gratton, E., Horwitz, A. R. Integrin-associated complexes form hierarchically with variable stoichiometry in nascent adhesions. Current Biology. 24 (16), 1845-1853 (2014).
  21. Sun, Z., Guo, S. S., Fässler, R. Integrin-mediated mechanotransduction. Journal of Cell Biology. 215 (4), 445-456 (2016).
  22. Shao, L., Kner, P., Rego, E. H., Gustafsson, M. G. L. Super-resolution 3D microscopy of live whole cells using structured illumination. Nat. Methods. 8 (12), 1044-1046 (2011).
  23. Chen, B. -C., et al. Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346 (6208), 1257998-1257998 (2014).
  24. Fu, Y., Winter, P. W., Rojas, R., Wang, V., McAuliffe, M., Patterson, G. H. Axial superresolution via multiangle TIRF microscopy with sequential imaging and photobleaching. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (16), 4368-4373 (2016).
  25. Boulanger, J., et al. Fast high-resolution 3D total internal reflection fluorescence microscopy by incidence angle scanning and azimuthal averaging. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (48), 17164-17169 (2014).

Tags

الهندسة الحيوية، العدد 143، الغزل القرص، TIRF، ومضان المجهري، تصوير متعددة، المتكاملة للفحص المجهري، الفحص المجهري ثلاثي الأبعاد، تصميم الإضاءة، نشر، التصاق
تصور تشكيل الالتصاق في الخلايا من خلال متقدم الغزل مجهرية Fluorescence انعكاس الداخلية القرص--المجموع
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zobiak, B., Failla, A. V.… More

Zobiak, B., Failla, A. V. Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (143), e58756, doi:10.3791/58756 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter