Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

להמחיש אדהזיה היווצרות בתאים באמצעות מתקדם ספינינג מיקרוסקופ פלורסצנטיות השתקפות פנימית דיסק-סיכום

Published: January 21, 2019 doi: 10.3791/58756
Automatic Translation
1, 1
1UKE Microscopy Imaging Facility, University Medical Center Hamburg-Eppendorf

Summary

הדמיה של קרום פלזמה מבודדים הן, אמצעי האחסון תאיים שמסביב, המיקרוסקופ המשוכלל כי היתר ברזולוציה גבוהה ומהירה יוצגו. השילוב של ספינינג דיסק וסיכום השתקפות פנימית פלורסצנטיות מיקרוסקופ בהגדרת אחד מאפשר ניסויים הדמיה חיה במחירים רכישה גבוהה עד 3.5 לשנייה בכל אוסף תמונות.

Abstract

בתאים חיים, תהליכים כגון היווצרות אדהזיה כרוך ביצוע שינויים מבניים נרחב קרום פלזמה ואת החלק הפנימי של התא. על מנת להמחיש את האירועים דינמי מאוד, חברו יחד שתי שיטות משלימות מיקרוסקופ אור לאפשר הדמיה מהיר של דגימות בשידור חי: ספינינג דיסק מיקרוסקופ (אס די) עבור ברזולוציה גבוהה ומהירה נפח הקלטה של החזרה גמורה מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית (TIRF) עבור לוקליזציה מדויק והדמיה של קרום פלזמה. פרוטוקול דימות מקיף ושלם יוצג עבור המנחה דרך הכנת הדוגמא, מיקרוסקופ כיול, התמונה היווצרות ורכישה, וכתוצאה מכך צבע רב SD-TIRF בשידור חי סדרת הדמיה עם רזולוציה גבוהה-עתיים. כל השלבים עיבוד דפוס תמונה נחוץ ליצירת רב ממדית datasets הדמיה בשידור חי, כלומר רישום ושילוב של והערוצים, ניתנים במאקרו עצמית בכתב עבור תוכנת קוד פתוח ImageJ. ההדמיה של חלבונים פלורסנט במהלך החניכה, ההבשלה של מתחמי אדהזיה, כמו גם היווצרות של הרשת cytoskeletal אקטין, שימש הוכחה של עיקרון עבור גישה חדשנית זו. השילוב של מיקרוסקופיית תלת-ממד ברזולוציה גבוהה TIRF סיפק תיאור מפורט של התהליכים המורכבים האלה בתוך הסביבה התאית, באותו הזמן, לוקליזציה מדויק של מולקולות ממברנה-הקשורים מזוהה עם גבוה יחס אות-כדי-ברקע.

Introduction

הימים שלנו, מיקרוסקופ אור טכניקות הדמיה ברזולוציה גבוהה/סופר ב קבוע מתן הדגימה החיה מפתחים במהירות. סופר-רזולוציה טכניקות כגון גירוי פליטה דלדול (STED), הבנוי תאורה מיקרוסקופ (SIM), צילום-הפעלת מיקרוסקופ לוקליזציה (דקל) או מיקרוסקופית ישירה סטוכסטי שחזור אופטי (סערה), בהתאמה, הם זמינים מסחרית ולאפשר הדמיה של מבנים subcellular מציג פרטים כמעט על סולם מולקולרית1,2,3,4,5,6. עם זאת, גישות אלה עדיין מוגבלת הישימות לניסויים הדמיה בשידור חי, שבו צריך כמויות גדולות, ניתן לאבחן עם מספר מסגרות לכל השני מהירות הרכישה. סוגים שונים של תהליכים דינאמיים מאוד מוסדרים דרך קרום פלזמה, למשל אנדו- / אקסוציטוזה, הדבקות, העברה או איתות, מתרחשות במהירות גבוהה תוך תאית בנפחים גדולים. לאחרונה, על מנת למלא את הפער הזה, טכניקה משולבת מיקרוסקופ היה המוצע ספינינג שנקרא דיסק-TIRF (SD-TIRF)7. בפירוט, מיקרוסקופ TIRF היתרי במיוחד לבודד, בתרגום של קרום פלזמה8,9, בעוד SD מיקרוסקופ הוא אחד של רגיש ביותר ומהיר לחיות טכניקות הדמיה הדמיה ומעקב של organelles subcellular10,הציטופלסמה11. השילוב של שתי טכניקות הדמיה בכיוונון יחידה כבר כבר הבנתי את העבר12,13, לעומת זאת, המיקרוסקופ המובאת כאן (איור 1) סוף סוף עונה על הקריטריונים כדי לבצע ניסויים SD-TIRF הדמיה בשידור חי התהליכים הנ ל- 3 מסגרות לכל השני מהירות. מאז מיקרוסקופ זה זמין מסחרית, המטרה של כתב יד זה היא לתאר בפרטים ולספק כלי קוד פתוח ופרוטוקולים ייבוא תמונות, רישום של ויזואליזציה הקשורים עם מיקרוסקופ SD-TIRF.

הגדרת מבוסס על מיקרוסקופ הפוכה מחוברת סריקה שתי יחידות באמצעות יציאות עצמאיות - הנמל שמאל קשורה יחידת SD והנמל בחזרה את יחידת הסורק עבור TIRF וצילום-הפעלה/הלבנת-ניסויים. עד 6 לייזרים (405/445/488/515/561/640 ננומטר) יכול לשמש עירור. עבור עירור וזיהוי של האות פלורסצנטיות, או 100 x / NA1.45 שמן או 60 x / NA1.49 שמן TIRF המטרה, בהתאמה, יש כבר מועסקים. האור הנפלט הוא מפוצל על ידי מראה ודיקרואיק זוהר (561 nm פס ארוך או לונג nm 514-מעבר...), מסוננים על ידי הלהקה לעבור מסננים שונים (55 ננומטר רחב מרוכז בכל 525 nm, 54 nm רחב מרוכז בכל 609 ננומטר על ידי קרינה פלואורסצנטית ירוק ואדום, בהתאמה) הניח לפני EM-CCD מצלמת שני תקופות. הינכם מתבקשים לשים לב כי לקבלת פרטים טכניים נוספים אודות הגדרת רשומים Zobiak. et al. 7. בתצורה TIRF, יחידת SD עזב את נתיב האור בתוך בערך 0.5 s כך שתי מצלמות אותו יכול לשמש לצורך זיהוי, ומאפשר מעבר מהיר יותר בין שתי שיטות הדמיה בהשוואה בסביבות 1 s שדווח בעבר13 < /c2 >. תכונה זו מאפשרת רכישה סימולטני ערוץ כפול, ובכך 4 ערוצי SD-TIRF הדמיה ב בעבר לא תואמות מהירות, דיוק יכול להתבצע. יתר על כן, יישור בין תמונות SD ו- TIRF אינה נחוצה. יישור תמונה בין שתי מצלמות, אך יש לבדוק לפני תחילת הניסוי, תוקן במידת הצורך. בפרוטוקול הבא, שיגרה תיקון הרישום בוצע במאקרו ImageJ עצמית בכתב. יתר על כן, המאקרו בעיקר נועדה לאפשר ויזואליזציה סימולטני של SD, TIRF datasets למרות שלהם dimensionality שונים. רכישת התוכנה עצמה לא סיפקו תכונות אלה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת תאים

  1. יומיים לפני הניסוי, זרע תאים 3 * 105 הלה או NIH3T3 2 מ של מדיום הגידול מלא בכל טוב של צלחת 6-ובכן תא-תרבות. ודא כי התאים מתבצע במסגרת תא למינארי לאורך כל פרוטוקול זה.
  2. יום אחד לפני הניסוי, הכן את ריאגנטים תרביות תאים על פי ההמלצות של היצרן או פרוטוקול מדעית נחוש, למשל:
    1. למהול 1 µg של RFP-Lifeact, 1 µg של YFP-Vinculin סך של 200 µL מופחת סרום בינוני. מערבולת הכימית תרביות תאים בקצרה, להוסיף 4 µL 200 µL DNA ו מערבולת שוב. דגירה המיקס תרביות תאים למשך 15-20 דקות בטמפרטורת החדר.
    2. הוסף את המיקס כולו תרביות תאים dropwise ישירות אל התאים. לערבב ע י ניעור לצלחת ומניחים אותו בחזרה לתוך החממה.
  3. ביום של הניסוי, הכן את הדגימה עבור הדמיה בשידור חי:
    1. להכין פתרון µg/mL 10 של fibronectin ב- PBS כדי להרגיע את משטח זכוכית צלחת תחתית זכוכית 35 מ מ. השתמש רק באיכות גבוהה 0.17 מ מ coverslips זכוכית דקה לקבלת ביצועים מיטביים TIRF והימנע מנות התחתון מפלסטיק. לעזוב הפתרון על משטח הזכוכית של פני השטח במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן להסיר אותו ולתת המנה מילה נהדרת...
    2. לדלל פתרון חרוזים מרובי פלורסנט מיקרומטר 0.1 צפיפות של 1.8 x 10 חלקיקים9 לכל מ ל מים מזוקקים ולהוסיף את הפתרון עבור 30-60 s השטח מצופים fibronectin זכוכית. להסיר לאלתר את הפתרון, מילה נהדרת לתת המנה.
      הערה: השלב זה נחוץ רק אם המטוס TIRF צריך להימצא לפני זריעה תאים ו/או לרכוש תמונת ייחוס 2-צבע לרישום תמונה המבוססת על חרוז.
    3. להכין פתרון חומצה אסקורבית (AA) 0.1 M, למהול אותו כדי ריכוז סופי של 0.1 מ"מ מדיום הגידול (AA-בינוני). מקם את הפתרון באמבט מים 37 º C.
      הערה: השתמש תא הממוטבים פלורסצנטיות תרבות בינוני במידת האפשר, כזה כמו ללא phenolred, (ribo-) בינוני פלווין-מופחתת. AA הוא סוכן אנטי מחמצן שיכולים להפחית תופעות פוטוטוקסי במהלך דימות חיים14. בדקנו אותה בהצלחה ב- assay זו, דהיינו עוד תאים הופיע בריא בתנאים להחיל יותר ללא תוספת AA. עם זאת, ה-pH של המדיום הונמך 0.17 יחידות pH.
    4. לשטוף את התאים עם 2 מ"ל PBS, להוסיף 250 µL טריפסין-EDTA ולחכות עד התאים הם לגמרי מנותק (2-3 דקות בתוך חממה 37 ° C). Resuspend התאים בזהירות 1 מ"ל מראש חימם AA-בינוני עם פיפטה ולהוסיף אותו 4 מ ל AA-בינוני בשפופרת התרבות התא 15 מ"ל. מקום התליה תא עם מכסה פתוחה מעט אינקובטור נקבע ל- 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 באזור המיקרוסקופ.
    5. להוסיף 1 מ"ל מראש חימם AA-בינוני למנה התחתון זכוכית ולמקם אותו האוחז המיקרוסקופ מחומם מראש (ראה סעיף הבא).

2. הדמיה חיה

  1. הפעל שליטה סביבתי של המיקרוסקופ להשגת יציבה-37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 ואווירה לח.
    הערה: כאן, תא הדגירה העליון במה קטנה כבר בשימוש בהגדרות יציב מותרים בתוך כ-15 דק חממות גדול יותר יהיה עליך עוד פעם כדי להשיג תנאים יציבים.
  2. לתקן את כל ההגדרות רכישה בהמיקרוסקופ לפני התליה תא מוחל:
    1. להגדיר את מרווח הזמן 30 s וכן את משך הזמן עד 60-90 דקות להפעיל את הפונקציה מיקוד אוטומטי של מבוססי חומרה-מיקוד האוטומטי על כל נקודת זמן (ערך "1").
    2. להתאים את החשיפה מצלמה, רווח, כמו גם את עוצמת הלייזר עבור כל ערוץ. רווח גבוה רמות, לייזר נמוך עוצמה וזמן חשיפה נמוכה recommendable להפחית רעילות צילום.
      הערה: הנתונים המוצגים כאן נרכשה עם חשיפה 200 ms, להשיג רמה 500 ו- 20% לייזר כוח השווה לעירור עוצמות של 0.5 W/cm ² עבור 488 ננומטר, 1 W/cm ² עבור 561 nm, בהתאמה.
    3. הגדר הערימה-z עבור הערוצים ספינינג-disk 10 מיקרומטר עם מרווח מיקרומטר 0.4. בטל את הבחירה להפעיל z-ערימות עבור הערוצים TIRF. ההיסט התחתון מוגדר "0", כלומר המישור הנמוך יהיה המיקום המוקד של פוקוס האוטומטי חומרה.
    4. להפעיל את הפונקציה multi-point "הבמה עמדות".
      הערה: עד 3 עמדות ניתן להקליט במרווח זמן s 30.
  3. למצוא את החרוזים פלורסנט עם תאורה פלורסנט-אפי את העינים או על גבי מסך המחשב, ולאחר מכן להפעיל את ערוץ TIRF אחד, לקבוע את זווית תאורה לערך מציין TIRF תאורה. להפעיל את פוקוס האוטומטי על-ידי לחיצה על הכפתור בלוח מיקרוסקופ והתאימו את המוקד עם ההגה היסט. רוכשים של הנתונים (dataset) 2-צבע, כלומר TIRF-488, TIRF-561, לרישום תמונה המבוססת על חרוז עוקבות (ראה הצבע 3.1).
    1. אופציונלי: כדי להבטיח תאורה TIRF, הוסף כמה microliters של ההשעיה חרוזים ססגוניות פלורסנט בחופשיות צף (ראה הצבע 1.3.2.). הפעל את התצוגה בשידור חי של ערוץ TIRF ולהגדיל את זווית תאורה. החרוזים שאינם מחסידי ייעלמו מעבר הזווית הקריטית, הקפדה על תאורה נכונה TIRF8.
  4. לערבב התליה תא שוב על ידי היפוך הצינור סגור 2 - 3 פעמים, ולהחיל 1 מ"ל של התאים על המנה הדמיה.
  5. למצוא במהירות כפולה-transfected תאים עם תאורה epi-פלורסנט ברמה נמוכה. מרכז את התאים בתצוגה המקדימה מצלמה בשידור חי באמצעות תאורה שדה בהיר, לסמן את המיקום. למצוא עוד 1-2 נקודות עניין ולשמור אותם לרשימת עמדות.
    הערה: בהתחלה, התאים בקלות ניתן לנתק עקב התנועה הבמה, ומכאן להגדיר עמדות 4-5, לבדוק מחדש כל לפני תחילת ייבוא תמונות. לאחר מכן, להתעלם 1-2 עמדות.
  6. התחל הנתונים על-ידי לחיצה על כפתור "רצף".

3. התמונה שלאחר עיבוד ב- ImageJ

  1. על מנת ליצור hyperstack ללא רישום של פיג'י15, מאקרו בשם "SD-TIRF_helper" נכתב כי ניתן ליישם datasets timelapse SD-TIRF של ערוץ 2-4. שמור את הקובץ "SD-TIRF_helper_JoVE.ijm" בפיג'י תיקיית משנה "מאקרו", הפעל את המאקרו באמצעות לחיצה על פקודת התפריט "תוספים > פקודות מאקרו > הפעל...".
    1. אם ערוצי הצבע צריך תיקון הרישום, בחר באפשרות צור הפניה חדשה המבוססת על חרוז רישום (קובץ. ציון) או להשתמש בקובץ קיים שנוצר לפני.
      הערה: ה-plugin turboreg16 יוחלו על ידי קרינה פלואורסצנטית חרוזים הפניה תמונות. התקן את התוסף פיג'י תוכנה על פי הנחיות כלליות עבור תוסף התקנות.
    2. לייבא את הנתונים עם היבואן ביו-תבניות ובחר hyperstack כאפשרות הצפייה. לטעון את התמונה ערכת הנתונים, בחר סדרת ה SD-הצעד הראשון, סדרת ה-TIRF בשלב השני. פיג'י יציג את הנתונים הממוינים לפי ערוץ ואת הבמה עמדה, כלומר בדרך כלל כל SD-ערוצי, TIRF כל-הערוצים יופיע כמו hyperstack אחת עבור כל מיקום הבמה שנבחר.
      הערה: ייבוא נתונים אפשרית על סוגי קבצים שונים, למשל סדרת-TIFF או קובץ תלויי פלטפורמה סוגי כגון * .nd. ניתן לזיהוי סוג הקובץ רק אם זה לא יוצאו על ידי רכישת תוכנת בתור עצמאית, דחיסה-פחות בתבנית TIFF.
    3. להחיל את התיקון רישום על הערוצים בהתאמה על-ידי טעינת קובץ ציוני שנקבע מראש.
    4. בחר את טבלת חיפוש צבעים בצבע הרצוי (LUT) עבור כל ערוץ SD - ו TIRF, למזג אותן hyperstack יחיד, רב-מימדי.
      הערה: במהלך העיבוד של ערוצי TIRF, מספר z-מטוסים עם אפס ערכי העוצמה מתווספות על גבי המישור התחתון שתואם עם המספר של z-מטוסים ב- SD dataset. שלב זה חשוב עבור הפריט החזותי של hyperstack הסופית. מתודולוגיה זו נכונה, מאז עומק התאורה TIRF (פחות מ- 200nm7) הוא קטן יותר מהגודל z-צעד של הערימה SD (400 ננומטר).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כדי להראות הפוטנציאל של SD-TIRF הדמיה, שוזמינותו פותחה זה לחשוף את הארגון-עתיים תא מטריצה אדהזיה מתחמי והאינטראקציה שלהם עם שלד התא במהלך אדהזיה הסלולר. לכן, מחסידי הלה או, לחילופין, NIH3T3 התאים היו transfected עם YFP-Vinculin ו- RFP-Lifeact עבור ה' 18-24, trypsinized, נזרע על גבי זכוכית מצופים fibronectin התחתון מנות. שורות תאים אלה נבחרו עבור שלד התא בולטת שלהם ועמידות גבוהה יותר בניסויים הדמיה בשידור חי, בניגוד, לדוגמה, ראשי תאים. אלה לא יכול לעמוד. הדמיה במצב מאוד רגיש כפי שהם לאחר הטיפול טריפסין המיקרוסקופ, תאים YFP/RFP-הבעת ' נבחרו, תהליך אדהזיה ציין במהלך 60 דקות זמן לשגות (איור 2 , סרטים 1 ו- 2). Assay הספציפי הזה לעיתים נדירות וברור לא תואר ב17,ספרות18. יתר על כן, היווצרות אדהזיה בעיקר נחקר, למשל העברת תאים19,20. לפיכך, היינו צריכים להסתגל מתודולוגיה זו (שורת התאים, ציפוי, בינוני, קומפוזיציה) על מנת לבצע את הניסויים המתוארים במאמר זה.

כצפוי, התאים היו בצורת עגול-ההתחלה ואת רק מחסידי חלש, ואילו ממברנה בליטות היו חש את הסביבה ולהפוך קשר עם המצע. תא-מטריקס הקשר התחזק במהירות על היווצרות של20,הידבקויות nascent כביכול21 (איור 2 א, ערוץ TIRF-488, זמן נקודות 0-4.5 דקות). האחרונים הם מבנים כמו ספוט, Vinculin-חיובית על הצד הבטני של התא. המבנים נראו בבירור של תמונות TIRF. בתחילת היווצרות אדהזיה, אקטין היה מופץ באופן שווה בתוך התא, לא בתרגום כדי אלה מתחמי מוקדם (איור 2 א, ערוץ SD-561). במרוצת הזמן, מתחמי אדהזיה מוגדלים, הבשיל כדי הדבקויות מוקד (איור 2C). מבנים מאורכים אלה היו לכאורה בעיקר בפריפריה של התא (דמויות 2A + B), נבעה הכוחות היו שהופעל על ידי סיבי היא-צולבות הקישור חוטים שרירן. סיבים אלו החלו להתחבר מתחמי אדהזיה, ובכך למשוך אותם לכיוון מרכז התא וגרימת התחזקות משמעותית של התא-מטריקס הדבקויות, כמו גם את bundling של סיבי אקטין21. ככל הנראה, התא משוטחים גם בשל היווצרות רשת אקטין (איור 2 א, תצוגה XZ). SD-הדמיה proofed להיות לשיטת הבחירה כאן, כמו זה אפשר להמחיש את התהליך הזה עם רגישות גבוהה, רזולוציה מרחבית, מנקודת מבט מלא. הקודם ח17, TIRF לבד רק יכול לתת לשער מה המקור של הדבקויות היקפיים, ואילו הדמיה SD-TIRF גילה את השיוך שלו עם filopodia (איור 2B, נקודת זמן 17 דקות, ראש חץ לבן). אכן, סיבי אקטין המתעוררים centripetally הידבקויות מוקד הפך גלוי לאחר 27 דקות (איור 2B, ראש חץ צהוב).

עם זאת, ההגדרות רכישה של ניסויים אלה, כלומר רכישה מהירות, עירור העוצמה, גלאי רווח, צורך להעריך בזהירות. מרווח הזמן של 30 s/timepoint, המאפשרת ריבוי נקודת הרכישה, שנראה אידיאלי, בעוד עוצמת קרינת הלייזר עירור (בין 0.5-1 W/cm ²) צריך לקחת תחת שיקול מכריע. איור דו-ממדי מציג תא תפקיד שונה אותו ניסוי שנכשל כדי לצרף המצע. זה יכול להיות אפשרי כי תופעות פוטוטוקסי מושפעות הביולוגיה של התא, אשר הביא בסופו של דבר ממברנה בעבוע לאחר בסביבות 60 דקות, כנראה הדומה אפופטוזיס (2 סרטים) זה הבהיר שוב תאים כמה רגיש יכול להגיב phototoxicity, זה חשוב כדי למצוא שאיזון טוב בין כמות האור להכניס והמידע נלקח. להפחית את עוצמת הלייזר, מספר תמונות ב- z-מחסנית או להגדיל את הרווח יכול להיות האסטרטגיה הנכונה הפחתת phototoxicity. כל ההגדרות האלה, עם זאת, צריך להיות מותאם ברמה כזו עדיין מאפשרת להשיג מספיק רזולוציה, אות יחס הרעש, המאפשר לחלץ מידע כמותי של הזמן המתועד לשגות.

Figure 1
איור 1: הסכימטי של ההתקנה SD-TIRF. א במצב הדמיה SD: קווי לייזר שונים 6 (405/445/488/515/561/640nm, ירוק קווים) הם מצמידים את קונאפוקלית סריקה ליחידה (CSU), עוברים את SD (מיקום 'IN'), קוביית מסנן ריק בגוף מיקרוסקופ (MIC). פליטת קרינה פלואורסצנטית מן הדגימה (SPEC) מוקרן דרך לחורים המתאימים של SD, פיצול על-ידי מראות ודיקרואיק זוהר שונים, למשל עבור רכישת סימולטני ירוק/אדום או צהוב/ציאן, על גבי שתי מצלמות EM-CCD שונים (C1 ו- C2). מסנני קרינה פלואורסצנטית ממוקמים מול המצלמות (לא מוצג). B. TIRF במצב הדמיה: קווי לייזר הם ביחד לתוך הסורק TIRF (TIRF). מפצל מרובת קרן בהמיקרופון מנחה את הקורה כדי הדגימה, פליטת אור עוקף את SD ('OUT') עבור שידור מוגדל. קרינה פלואורסצנטית מאותרים על ידי המצלמות אותו ואת פליטת המסננים שמתואר א איור זה השתנה מ Zobiak et al. 7 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: תוצאות נציג להק תא בהפצת ובשימוש אדהזיה באמצעות מיקרוסקופ SD-TIRF. א transfected כפול התא הלה לבטא RFP-Lifeact (ערוץ אדום, SD-561) ו YFP-Vinculin (ערוץ ירוק, TIRF-488) היו coverslips trypsinized, הזריעה מחדש על גבי fibronectin מצופה זכוכית דקה. היווצרות אדהזיה הופך להיות גלויות, החל עם הדבקויות המתהווה קטנה (כתמים Vinculin-חיוביים) 10 דקות זה להתפתח הדבקויות מוקד גדול אחרי בערך 5 דקות. אקטין קורטיקלית ניכר אחרי בערך 10 דקות והוא משתרע בפריפריה של התאים (ראה מסגרות דקות 12 ו- 24.5). B. להציג את מוגדל של האזור מסגרת במסגרת (45 דקות) מתארת תא מתפשט, המעבר הדבקויות המתהווה אל מוקד וכן הקשורים filopodia הידבקויות (חץ לבן) ויצירת מתח סיבים (ראה את המסגרת ב 27 דקות, חץ צהוב). ג Kymograph של קו מקווקו צהוב שצוירו בא ד (צילום-) ההשפעות הרעילות על תאים או תאים בריאים אחרת תוכל לאפשר להם להיכשל לצרף המצע. הדמיה תנאים חייבים להעריך באופן ביקורתי כדי לא לכלול phototoxicity. סרגל קנה מידה = 5 מיקרומטר (ב- A ו- D) ו 2 מיקרומטר (ב B ו- C). התצוגות XZ בתוך A ו D הן ההשתקפויות orthogonal מופק קווים מקווקווים לבן שצויר בו (תחתון = המצע). תמונות היו באופן ליניארי חדות משופרת, חציון-מסוננים עם קרנל 3 x 3. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Movie 1
סרט 1: 3D-שחזור של הרצף timelapse איור 2 א. רצף תמונות היה מעובד עם 3D הדמיה תוכנה. משך: 42.5 הגבלת קצב רכישת: ערוץ כפול 2 SD-TIRF ערימות לדקה (56 מסגרות סה כ) נרכשו. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)

Movie 2
סרט 2: סרט של הרצף timelapse איור 2 ג משך: 60 הגבלת קצב רכישת: ערוץ כפול 2 SD-TIRF ערימות לדקה (56 מסגרות סה כ) נרכשו. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

נייר זה הוצג יישומו המוצלח הראשון של מיקרוסקופיית SD ו- TIRF תצורה מתאים לביצוע ניסויים הדמיה התא בשידור חי, כלומר רכישה גבוהה המחירים כגון 2 SD-TIRF אוספי תמונות לדקה בשלב שונה 3 עמדות, המקביל סך של מסגרות 168 (בסביבות 3 מסגרות לשנייה), נרכשו. מיקרוסקופים SD-TIRF כמה שהיו שתוארה לעיל12,13, בעיקר חוסר מהירות הדמיה גבוה מספיק כדי לעקוב אחר תהליכים תאיים תלת-ממד שבו רזולוציה טמפורלית של פחות מ 2 s לכל תמונה מחסנית הוא לעתים קרובות הכרחי. הגדרת שהוצגו ניתן להשיג הדמיה המחירים עד 0.78 אוספי תמונות לשניה, המחירים של 3.5 לשנייה בכל אוסף תמונות גדול בניסויים חיים dynamics שלפוחית 3D חוקר כבר הפגינו7. בנוסף, מיקרוסקופים SD-TIRF הקודם היה גלאי אחד בלבד לכל הדמיה מצב, הפחתת עוד יותר את המהירות לרכישות רב ערוצית. טכנית, במערכות האלה שיכול להיות מיושם על תצורת התצוגה המפוצלת גם המאפשר רכישת כפול-צבע בו זמנית עם מצלמה בודדת. זאת, לעומת זאת, היתר הדמיה של רק חצי שדה הראייה. שיטות אחרות כדי לייצר datasets רב-מימדי עם רזולוציה גבוהה-עתיים כגון הדמיה widefield בשילוב עם deconvolution או מיקרוסקופ ברזולוציה סופר 3D, דהיינו תלת-ממד ה-SIM או סריג אור גיליון מיקרוסקופ22, 23, ייתכן אלטרנטיבות תקפות. עם זאת, דימות מבוסס deconvolution יכול בקלות להציג תמונה חפצים ברכישות יחס אות לרעש נמוכה (כמו זה בדרך כלל המקרה במהלך לחיות הדמיה יישומים), רזולוציה סופר 3D חי הדמיה הוא עדיין טכנית elaborative ו משימה מאתגרת. במימוש שהוצגו התקנה מתקדמות SD-TIRF7, נלקח יתרון של יחידת SD המאפשר העברה הכפולה-הדיסק בין הנתיב זיהוי. תצורה זו מספקת שני יתרונות עיקריים: ראשית, שתי מצלמות אותו יכול לשמש כדי לזהות SD ואת TIRF לסמן, אשר התוצאות חפיפה ברמת דיוק גבוהה של שני ערוצים אלה. שנית, לחורים המתאימים של הדיסק מסתובב אינם חוסמים כל פליטת האור כאשר פועל במצב רכישת TIRF (לקבלת פרטים נוספים, ראה איור 1B), ובכך מגדילים את יעילות אוסף חשוב עבור הדמיה חיים רגיש גבוהה. ומכאן, תצורה זו אופטי הוא נוחים ליישום כל סוג של מיקרוסקופ TIRF (למשל תאורה זווית משתנה או קבוע) לתוך מיקרוסקופים-SD הקיים לאפשר עקיפת יחידת SD. יתר על כן, הסורק TIRF בשימוש ניתן להפעיל במצב להריץ כביכול, שבו שני ערוצים TIRF ניתן לרשום בו זמנית (כפי שמוצג Zobiak et al. 7), מהירות יותר למעלה רכישת נתונים רב ערוצית.

אחד היתרונות הגדולים ביותר של העסקת TIRF הוא, עם מתודולוגיה זו, זה אפשרי להתאים לשפה בדייקנות הגבוהה האות מגיע קרום התא במהלך החיים תא הדמיה הניסוי. ואכן, תוך מתודולוגיה SIM מספק כדאי z-חלוקתה, ובכך לבידוד טוב יותר של קרום התא ב קבוע דגימות, בתא חי הדמיה ניסויים של מעריכי הגדלה/הפחתה של קרינה פלואורסצנטית האיתות organelles מתקרב / עוזב את ממשק TIRF מותר לוקליזציה ספציפי ומדויק יותר של קרום התא. הדיוק לוקליזציה, אמנם לא עדיין לכמת, מבטיח להיות קיפולים רבים קטנים יותר 150-200 ננומטר, כלומר הטווח המרחבי של השדה אוונסנס.

עד מהרה מגבלה של השיטה הוא הזמן הדרוש כדי להסיר את יחידת דיסק מסתובב מהנתיב אור ולהתחיל את רכישת TIRF, דהיינו 0.5 s. עיכוב זה מגביל את מרווח הזמן המינימלי בין שתי רכישות רצופות. . טכנית, זה צריך להיות אפשרי להפחית את עיכוב זה דרך לעקוף את הדיסק עם מראות galvo למשל , ובכך להקטין את הרכישה הכוללת בכל מחזור SD-TIRF. בנוסף, חדשות יותר מצלמות הדור עלול לאפשר פעמים חשיפה מופחתת ביחס אות לרעש גבוה. לפיכך, הביצועים הכוללים של תוכנית התקנה זו ניתן לשפר עדיין relevantly על ידי שדרוג רכיבי החומרה. נקודת המבט הדמיה, עם זאת, ישנם מספר דרכים אחרות כדי למזער את רכישת זמן (בסדר יורד): להימנע תפקידים מרובים, להפחית את גובה z-מחסנית, להגדיל את z-המרווח, לצמצם את זמן החשיפה (עלייה לקבל, יכול להשתמש binning), לקצר את המרחק בין עמדות רכישה, הפעל את auto-ההתמקדות רק בכל נקודת זמן ה-n (n > 1). למרות מגבלות בפועל, אם בכל הפרמטרים האלו מוערכים בקפידה, זה אפשרי להשתמש SD-TIRF הדמיה עבור מעקב אחר ואת ההתאמה לשפות אחרות נע מהר שלפוחית הסלולר, כפי שהוצג ב-. Zobiak et al. 7.

יתר על כן, נייר זה פרוטוקול המתאר הרכישה הוצג השגרתי של מבנה נתונים SD-TIRF ערוץ אחד. שימוש במאקרו שסופקו, ניתן לייצא נתונים גולמיים בקובץ יחיד TIFF-המכיל את כל הערוצים SD - ו TIRF. התמונה ההרשמה היא כשלעצמה לא נחוץ; עם זאת, חשוב כי שתי המצלמות מיושרים במדויק ביחס אחד לשני. הנותרים משמרות פיקסל (תרגום וסיבוב) ועוזרת תוקנה בתוך המאקרו שסופקו. האלגוריתם תיקון עושה שימוש תמונת ייחוס רב ערוצית של חרוזים פלורסנט צריך להיות מוקלט רק לפני תחילת הניסוי. בקובץ שנוצר, המטוס TIRF מוגדרת ברמה הנמוכה ואחריו מספר אפס מטוסים בעוצמה אשר תואמים את-ממדיות של SD-הערוץ. לכן, חשוב לרכוש את הנתונים, כפי שמתואר בספר הפרוטוקול, איפה המטוס TIRF הדמיה דומה לקצה התחתון של z-המחסנית להגדיר עבור הערוץ SD.

סוף סוף המערכת יכול פוטנציאלי להאריך על ידי מודול ה-SIM או הציג לאחרונה זווית מרובה TIRFM24,25 כדי להגדיל עוד יותר את הרזולוציה המרחבית. עם זאת, הגובה והרזולוציה המרחבית יכולה להיות מושגת, בהתאם הנוכחי משוכללת, רק במחיר של מהירות איטית יותר הדמיה. עבור כל התא חי הדמיה ניסויים שבהם חשוב למקם מבנים ב קרום פלזמה אם כי שמירה על רזולוציה מרחבית גבוהה של אמצעי האחסון הסלולר הנותרים, הגדרת SD-TIRF המתואר כאן הוא קל להשתלב, זמינים פתרון.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

אנו מודים מאוד הקהילה המדעית של אוניברסיטת רפואי במרכז המבורג-גלאים לתמיכה אותנו עם דגימות להערכה. כלומר, אנחנו תודה סבין Windhorst תאי NIH3T3, אנדריאה Mordhorst עבור YFP-Vinculin ו- Maren רודולף עבור RFP-Lifeact.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Microscope and accessories
SD-TIRF microscope Visitron Systems
Ti with perfect focus system Nikon Inverted microscope stand
CSU-W1 T2 Yokogawa Spinning disk unit in dual-camera configuration
iLAS2  Roper Scientific TIRF/FRAP scanner
Evolve  Photometrix EM-CCD cameras
PiezoZ stage Ludl Electronic Products Motorized Z stage
Bioprecision2 XY stage Ludl Electronic Products Motorized XY stage
Stage top incubation chamber Okolab Bold Line Temperature, CO2 and humidity supply
Cell culture
HeLa cervical cancer cells DSMZ ACC-57
NIH3T3 fibroblasts DSMZ ACC-59
Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS) Gibco 14190144
Trypsin-EDTA 0.05% Gibco 25300054
Dulbecco's Modified Eagle Medium + GlutaMAX-I (DMEM) Gibco 31966-021
OptiMEM Gibco 31985070 Reduced serum medium
Fetal calf serum (FCS) Gibco 10500064
Penicillin/Streptomycin (PenStrep) Gibco 15140148
Full growth medium (DMEM supplemented with 10% FCS and 1% PenStrep)
TurboFect ThermoFisher Scientific R0531 Transfection reagent
Ascorbic acid (AA) Sigma A544-25G
6-well cell culture plate Sarstedt 83.392
Glass bottom dishes MatTek P35G-1.5-10-C 35mm, 0.17mm glass coverslip
Fibronectin, bovine plasma ThermoFisher Scientific 33010018
Neubauer improved chamber VWR 631-0696
TetraSpeck beads ThermoFisher Scientific T7279
Plasmids
RFP-Lifeact Maren Rudolph, Institute of Medical Microbiology, University Medical Center Hamburg Eppendorf, Germany
YFP-Vinculin Andrea Mordhorst, Institute of Medical Microbiology, University Medical Center Hamburg Eppendorf, Germany
Software and plugins
VisiView Visitron Systems Version 3
ImageJ Version 1.52c
Turboreg plugin http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/
Macro "SD-TIRF_helper_JoVE.ijm" this publication https://github.com/bzobiak/ImageJ
Volocity PerkinElmer Version 6.2.2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Optics Letters. 19 (11), 780 (1994).
  2. Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
  3. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), New York, N.Y. 1642-1645 (2006).
  4. Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophysical Journal. 91 (11), 4258-4272 (2006).
  5. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature methods. 3 (10), 793-796 (2006).
  6. van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nature protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).
  7. Zobiak, B., Failla, A. V. Advanced spinning disk-TIRF microscopy for faster imaging of the cell interior and the plasma membrane. Journal of Microscopy. 269 (3), 282-290 (2018).
  8. Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. Journal of Cell Science. 123 (21), 3621-3628 (2010).
  9. Burchfield, J. G., Lopez, J. A., Vallotton, P., William, E. Exocytotic vesicle behaviour assessed by total internal reflection fluorescence microscopy. Traffic. 11 (4), 429-439 (2010).
  10. Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M. Spinning-disk confocal microscopy. present technology and future trends. Methods in Cell Biology. 123, 153-175 (2014).
  11. Murray, J. M., Appleton, P. L., Swedlow, J. R., Waters, J. C. Evaluating performance in three-dimensional fluorescence microscopy. Journal of Microscopy. 228 (3), 390-405 (2007).
  12. Trache, A., Lim, S. -M. Integrated microscopy for real-time imaging of mechanotransduction studies in live cells. Journal of Biomedical Optics. 14 (3), 034024 (2009).
  13. Stehbens, S., Pemble, H., Murrow, L., Wittmann, T. Imaging intracellular protein dynamics by spinning disk confocal microscopy. Methods in Enzymology. , 293-313 (2012).
  14. Waldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., Van De Linde, S., Sauer, M. Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy. Scientific Reports. 5, 1-12 (2015).
  15. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  16. Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).
  17. Partridge, M. A. Initiation of attachment and generation of mature focal adhesions by integrin-containing filopodia in cell spreading. Molecular Biology of the Cell. 17 (10), (2006).
  18. Dubin-Thaler, B. J., Giannone, G., Döbereiner, H. G., Sheetz, M. P. Nanometer analysis of cell spreading on matrix-coated surfaces reveals two distinct cell states and STEPs. Biophysical Journal. 86 (3), 1794-1806 (2004).
  19. Choi, C. K., Vicente-Manzanares, M., Zareno, J., Whitmore, L. A., Mogilner, A., Horwitz, A. R. Actin and α-actinin orchestrate the assembly and maturation of nascent adhesions in a myosin II motor-independent manner. Nature Cell Biology. 10 (9), 1039-1050 (2008).
  20. Bachir, A. I., Zareno, J., Moissoglu, K., Plow, E. F., Gratton, E., Horwitz, A. R. Integrin-associated complexes form hierarchically with variable stoichiometry in nascent adhesions. Current Biology. 24 (16), 1845-1853 (2014).
  21. Sun, Z., Guo, S. S., Fässler, R. Integrin-mediated mechanotransduction. Journal of Cell Biology. 215 (4), 445-456 (2016).
  22. Shao, L., Kner, P., Rego, E. H., Gustafsson, M. G. L. Super-resolution 3D microscopy of live whole cells using structured illumination. Nat. Methods. 8 (12), 1044-1046 (2011).
  23. Chen, B. -C., et al. Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346 (6208), 1257998-1257998 (2014).
  24. Fu, Y., Winter, P. W., Rojas, R., Wang, V., McAuliffe, M., Patterson, G. H. Axial superresolution via multiangle TIRF microscopy with sequential imaging and photobleaching. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (16), 4368-4373 (2016).
  25. Boulanger, J., et al. Fast high-resolution 3D total internal reflection fluorescence microscopy by incidence angle scanning and azimuthal averaging. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (48), 17164-17169 (2014).

Tags

בביו-הנדסה גיליון 143 ספינינג דיסק TIRF קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ הדמיה מרובים משולב מיקרוסקופ מיקרוסקופיה תלת מימד עיצוב תאורה מתפשטת אדהזיה
להמחיש אדהזיה היווצרות בתאים באמצעות מתקדם ספינינג מיקרוסקופ פלורסצנטיות השתקפות פנימית דיסק-סיכום
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zobiak, B., Failla, A. V.… More

Zobiak, B., Failla, A. V. Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (143), e58756, doi:10.3791/58756 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter