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Bioengineering

उन्नत कताई डिस्क के माध्यम से कोशिकाओं में आसंजन गठन visualizing-कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी

Published: January 21, 2019 doi: 10.3791/58756
Automatic Translation
1, 1
1UKE Microscopy Imaging Facility, University Medical Center Hamburg-Eppendorf

Summary

एक उंनत माइक्रोस्कोप कि दोनों के तेज और उच्च संकल्प इमेजिंग की अनुमति, अलग प्लाज्मा झिल्ली और आसपास के intracellular मात्रा, प्रस्तुत किया जाएगा । एक सेटअप में डिस्क कताई और कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के एकीकरण उच्च अधिग्रहण की दर पर लाइव इमेजिंग प्रयोगों की अनुमति देता है छवि स्टैक प्रति ३.५ s करने के लिए ।

Abstract

जीवित कोशिकाओं में, आसंजन गठन जैसे प्रक्रियाओं प्लाज्मा झिल्ली और सेल इंटीरियर में व्यापक संरचनात्मक परिवर्तन शामिल हैं । इन अत्यधिक गतिशील घटनाओं कल्पना करने के लिए, दो पूरक प्रकाश माइक्रोस्कोपी तकनीक है कि जीने के नमूनों की तेजी से इमेजिंग की अनुमति संयुक्त थे: तेज और उच्च संकल्प मात्रा रिकॉर्डिंग और कुल आंतरिक प्रतिबिंब के लिए कताई डिस्क माइक्रोस्कोपी (एसडी) प्रतिदीप्ति (TIRF) सटीक स्थानीयकरण और प्लाज्मा झिल्ली के दृश्य के लिए माइक्रोस्कोपी । एक व्यापक और पूर्ण इमेजिंग प्रोटोकॉल नमूना तैयारी, माइक्रोस्कोप अंशांकन, छवि गठन और अधिग्रहण, उच्च spatio-लौकिक संकल्प के साथ बहु रंग एसडी TIRF लाइव इमेजिंग श्रृंखला में जिसके परिणामस्वरूप के माध्यम से मार्गदर्शन के लिए दिखाया जाएगा । बहु-आयामी लाइव इमेजिंग डेटासेट उत्पन्न करने के लिए सभी आवश्यक छवि पोस्ट-प्रोसेसिंग कदम, अर्थात पंजीकरण और व्यक्तिगत चैनलों के संयोजन, खुले स्रोत सॉफ्टवेयर ImageJ के लिए एक स्व-लिखित मैक्रो में प्रदान की जाती हैं । दीक्षा और आसंजन परिसरों की परिपक्वता के दौरान फ्लोरोसेंट प्रोटीन की इमेजिंग, साथ ही साथ actin cytoskeletal नेटवर्क के गठन, इस उपंयास दृष्टिकोण के लिए सिद्धांत का एक सबूत के रूप में इस्तेमाल किया गया था । उच्च संकल्प 3 डी माइक्रोस्कोपी और TIRF के संयोजन सेलुलर वातावरण के भीतर इन जटिल प्रक्रियाओं का एक विस्तृत विवरण प्रदान की है और, एक ही समय में, एक उच्च के साथ पता चला झिल्ली से जुड़े अणुओं की सटीक स्थानीयकरण संकेत करने वाली पृष्ठभूमि अनुपात ।

Introduction

हमारे दिन, प्रकाश माइक्रोस्कोपी उपलब्ध कराने की तकनीक उच्च/सुपर संकल्प इमेजिंग स्थिर और रहने वाले नमूने में तेजी से विकसित कर रहे हैं । इस तरह के रूप में उत्तेजित उत्सर्जन घट (STED), संरचित दीप्ति माइक्रोस्कोपी (सिम) और फोटो-सक्रियण स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी (पाम) या प्रत्यक्ष stochastic ऑप्टिकल पुनर्निर्माण माइक्रोस्कोपी (तूफान) के रूप में सुपर संकल्प तकनीक, क्रमशः कर रहे हैं व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है और सेलुलर संरचनाओं की इमेजिंग सक्षम लगभग आणविक पैमाने पर विवरण दिखा1,2,3,4,5,6। हालांकि, इन approaches अभी भी सीमित करने के लिए लाइव इमेजिंग प्रयोगों जिसमें बड़ी मात्रा में एकाधिक फ़्रेम प्रति सेकंड प्राप्ति की गति के साथ विज़ुअलाइज़ करने की आवश्यकता है । अत्यधिक गतिशील प्लाज्मा झिल्ली के माध्यम से विनियमित प्रक्रियाओं की किस्मों, जैसे इंडो-/exocytosis, आसंजन, प्रवास या संकेतन, बड़े सेलुलर संस्करणों के भीतर उच्च गति के साथ होते हैं । हाल ही में, आदेश में इस अंतर को भरने के लिए, एक एकीकृत माइक्रोस्कोपी तकनीक का प्रस्ताव किया गया था कताई डिस्क-TIRF (एसडी-TIRF)7। विस्तार में, विशेष रूप से अलग करने के लिए TIRF माइक्रोस्कोपी परमिट और प्लाज्मा झिल्ली स्थानीयकरण8,9, जबकि एसडी माइक्रोस्कोपी के दृश्य और ट्रैकिंग के लिए सबसे संवेदनशील और तेजी से लाइव इमेजिंग तकनीकों में से एक है कोशिका द्रव्य10,11में सेल् फी organelles । एक सेटअप में दोनों इमेजिंग तकनीकों का संयोजन पहले से ही पिछले12,13में महसूस किया गया है, तथापि, माइक्रोस्कोप यहां प्रस्तुत (1 आंकड़ा) अंत में मानदंडों को पूरा करने के लिए लाइव इमेजिंग एसडी-TIRF प्रयोगों प्रदर्शन aforementioned प्रक्रियाओं की दूसरी गति के अनुसार 3 तख्ते पर । इस माइक्रोस्कोप के बाद से व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है, इस पांडुलिपि का लक्ष्य विवरण में वर्णन और छवि अधिग्रहण, पंजीकरण के लिए खुला स्रोत उपकरण और प्रोटोकॉल प्रदान करने के लिए है, और दृश्य एसडी TIRF माइक्रोस्कोपी के साथ जुड़े.

सेटअप स्वतंत्र बंदरगाहों के माध्यम से दो स्कैन इकाइयों से जुड़े एक औंधा माइक्रोस्कोप पर आधारित है-बाएँ बंदरगाह एसडी यूनिट और TIRF और फोटो-सक्रियण/ब्लीचिंग प्रयोगों के लिए स्कैनर इकाई के लिए वापस बंदरगाह से जुड़ा हुआ है. अप करने के लिए 6 पराबैंगनीकिरण (405/445/488/515/561/640 एनएम) उत्तेजना के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । उत्तेजना और प्रतिदीप्ति संकेत का पता लगाने के लिए, या तो एक 100x/ना 1.45 तेल या 60x/ना 1.49 तेल TIRF उद्देश्य, क्रमशः, कार्यरत किया गया है । उत्सर्जित प्रकाश एक dichroic मिरर द्वारा विभाजित है (५६१ एनएम लंबे समय से गुजारें या ५१४ एनएम लंबे समय से गुजारें) और विभिंन बैंड से गुजारें फिल्टर द्वारा फ़िल्टर (५५ एनएम व्यापक ५२५ एनएम पर केंद्रित है, ५४ एनएम वाइड हरे और लाल प्रतिदीप्ति के लिए ६०९ एनएम पर केंद्रित, क्रमशः) दो EM-सीसीडी कैम के सामने रखा युग. कृपया ध्यान दें कि सेटअप के बारे में अधिक तकनीकी जानकारी Zobiak एट अल में सूचीबद्ध हैं । 7. TIRF विंयास में, एसडी इकाई के लगभग ०.५ एस के भीतर प्रकाश पथ से बाहर चला गया है ताकि एक ही दो कैमरों का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, तेजी से दो इमेजिंग विधियों के बीच लगभग 1 s है कि पिछले 13 में बताया गया था की तुलना में स्विचन की अनुमति< /c2 >. इस सुविधा दोहरे चैनल एक साथ अधिग्रहण, इस प्रकार 4 चैनल एसडी-TIRF इमेजिंग पहले बेजोड़ गति और सटीकता पर प्रदर्शन किया जा सकता है सक्षम बनाता है । इसके अलावा, एसडी और TIRF छवियों के बीच संरेखण अनावश्यक है । दो कैमरों के बीच छवि संरेखण, तथापि, के लिए प्रयोग शुरू करने से पहले की जांच की है और यदि आवश्यक सही । निम्न प्रोटोकॉल में एक पंजीकरण सुधार रूटिन एक स्व-लिखे ImageJ मैक्रो में लागू किया गया था । इसके अलावा, मैक्रो मुख्य रूप से अपने अलग आयामीता के बावजूद एसडी और TIRF डेटासेट के एक साथ दृश्य की अनुमति देने के लिए बनाया गया था । अधिग्रहण सॉफ्टवेयर खुद इन सुविधाओं प्रदान नहीं किया ।

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Protocol

1. कोशिकाओं की तैयारी

  1. प्रयोग करने के लिए दो दिन पहले, बीज 3 * 105 हेला या NIH3T3 कोशिकाओं को एक 6-well सेल संस्कृति प्लेट की अच्छी तरह से प्रति पूर्ण विकास मध्यम के 2 मिलीलीटर में । सुनिश्चित करें कि इस प्रोटोकॉल के दौरान एक लामिना फ्लो हूड में कोशिकाओं को नियंत्रित कर रहे हैं ।
  2. एक दिन पहले प्रयोग करने के लिए, निर्माता की सिफारिशों या एक empirically निर्धारित प्रोटोकॉल, उदाहरणके अनुसार अभिकर्मक एजेंट तैयार:
    1. आरएफपी-Lifeact और 1 µ g के YFP-Vinculin के 1 µ g को पतला करने के लिए कुल २०० µ l घटाए गए सीरम मीडियम. भंवर अभिकर्मक रिएजेंट संक्षेप में, 4 µ एल जोड़ने के लिए २०० µ एल डीएनए और भंवर फिर से । कमरे के तापमान पर 15-20 मिनट के लिए अभिकर्मक मिश्रण की मशीन ।
    2. पूरे अभिकर्मक मिश्रण dropwise सीधे कोशिकाओं को जोड़ें । थाली मिलाते हुए मिश्रण और यह मशीन में वापस जगह है ।
  3. प्रयोग के दिन, लाइव इमेजिंग के लिए नमूना तैयार करें:
    1. ३५ mm ग्लास बॉटम डिश के कांच की सतह को कोट करने के लिए पंजाब में fibronectin के 10 µ g/mL सॉल्यूशन तैयार करें । इष्टतम TIRF प्रदर्शन के लिए केवल उच्च गुणवत्ता ०.१७ mm ग्लास coverslips का उपयोग करें और प्लास्टिक नीचे व्यंजन से बचें । कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए कांच की सतह पर समाधान छोड़ दो, तो इसे हटा दें और पकवान हवा सूखी ।
    2. आसुत जल में एक ०.१ µm बहु-फ्लोरोसेंट मोतियों का एक घनत्व के लिए समाधान १.८ x 109 प्रति मिलीलीटर कणों को पतला और fibronectin-लेपित कांच की सतह के लिए 30-60 एस के लिए समाधान जोड़ें । तुरंत समाधान निकालें और पकवान हवा सूख जाने ।
      नोट: यह कदम केवल अगर TIRF विमान बोने की कोशिकाओं से पहले पाया जाना चाहिए और/या एक 2-मनका आधारित छवि पंजीकरण के लिए रंग संदर्भ छवि प्राप्त करने के लिए आवश्यक है ।
    3. एक ०.१ मीटर ascorbic एसिड (एए) समाधान तैयार करें और यह विकास मध्यम (ए. ए.-मध्यम) में ०.१ मिमी की एक अंतिम एकाग्रता को पतला । एक ३७ ° c पानी स्नान में समाधान प्लेस ।
      नोट: यदि संभव हो तो प्रतिदीप्ति-ऑप्टिमाइज़ किए गए कक्ष संस्कृति माध्यम का उपयोग करें, जैसे phenolred-मुक्त और (राइबो-) फ्लेविन-कम मध्यम । ए. ए. विरोधी ऑक्सीकरण एजेंट है कि लाइव इमेजिंग14के दौरान phototoxic प्रभाव को कम कर सकते है । हम इसे सफलतापूर्वक इस परख में परीक्षण किया है, यानी अधिक कोशिकाओं को ए. ए. इसके अलावा बिना से लागू शर्तों के तहत स्वस्थ दिखाई दिया । हालांकि, इस माध्यम का पीएच ०.१७ पीएच इकाइयों द्वारा कम किया गया था ।
    4. 2 मिलीलीटर पंजाबियों के साथ कोशिकाओं को धो लें, २५० µ l Trypsin-EDTA जोड़ें और कोशिकाओं को पूरी तरह से अलग कर रहे हैं जब तक प्रतीक्षा (2-3 एक ३७ डिग्री सेल्सियस मशीन में मिनट). कोशिकाओं को ध्यान से 1 मिलीलीटर प्री-गरम ए. ए.-मध्यम में एक पिपेट के साथ resuspend और यह 4 मिलीलीटर ए. ए.-मध्यम में एक 15 मिलीलीटर सेल संस्कृति ट्यूब में जोड़ें । एक मशीन में एक थोड़ा खोला ढक्कन के साथ सेल निलंबन प्लेस ३७ ° c और 5%2 सह माइक्रोस्कोप के आसपास के क्षेत्र में सेट ।
    5. 1 मिलीलीटर पूर्व गर्म ए. ए.-मध्यम गिलास नीचे पकवान को जोड़ें और यह पूर्व गरम माइक्रोस्कोप के धारक में जगह (अगले पैरा देखें) ।

2. लाइव इमेजिंग

  1. एक स्थिर ३७ डिग्री सेल्सियस, 5% सह2 और आर्द्र वातावरण को प्राप्त करने के लिए माइक्रोस्कोप के पर्यावरणीय नियंत्रण प्रारंभ करें ।
    नोट: यहाँ, एक छोटे से मंच शीर्ष मशीन चैंबर के बारे में 15min के भीतर स्थिर सेटिंग्स की अनुमति दी है कि इस्तेमाल किया गया है. बड़े मशीन अधिक समय के लिए स्थिर परिस्थितियों को प्राप्त करने की आवश्यकता होगी ।
  2. सेल निलंबन लागू होने से पहले माइक्रोस्कोप पर सभी अधिग्रहण सेटिंग्स को ठीक करें:
    1. 30 s और अवधि के लिए 60-90 मिनट के लिए समय अंतराल सेट करें । प्रत्येक समय बिंदु (मान "1") के लिए हार्डवेयर-आधारित ऑटो-फोकस का स्वत:-फ़ोकस करने वाला फ़ंक्शन सक्रिय है ।
    2. कैमरा जोखिम और लाभ, साथ ही हर चैनल के लिए लेजर शक्ति को समायोजित करें । उच्च लाभ के स्तर, कम जोखिम समय और कम लेजर शक्ति फोटो विषाक्तता को कम करने के लिए सिफारिश कर रहे हैं.
      नोट: यहां प्रस्तुत आंकड़ों २०० एमएस एक्सपोजर, लाभ स्तर ५०० और 20% लेजर शक्ति है कि ०.५ w/सेमी ² के लिए ४८८ एनएम और 1 w/सेमी ² के लिए ५६१ एनएम, क्रमशः के लिए उत्तेजना तीव्रता के बराबर के साथ अधिग्रहीत किया गया था ।
    3. ०.४ µm रिक्ति के साथ 10 µm के लिए स्पिनिंग-डिस्क चैनल के लिए z-स्टैक सेट करें । De-सक्रिय z-TIRF चैनलों के लिए ढेर । नीचे-ऑफ़सेट सेट करने के लिए "0", यानी सबसे कम विमान हार्डवेयर ऑटो फोकस की फोकस स्थिति होगी ।
    4. बहु बिंदु समारोह "चरण स्थिति" सक्रिय करें ।
      नोट: 3 पदों के लिए एक 30 एस समय अंतराल में दर्ज किया जा सकता है ।
  3. आंख पर या कंप्यूटर स्क्रीन पर महामारी फ्लोरोसेंट रोशनी के साथ फ्लोरोसेंट मोतियों का पता लगाएं, तो एक TIRF चैनल को सक्रिय करने और एक मूल्य है कि TIRF रोशनी का अर्थ है रोशनी कोण सेट । खुर्दबीन पैनल पर बटन धक्का और ऑफसेट पहिया के साथ ध्यान समायोजित द्वारा ऑटो फोकस को सक्रिय करें । एक 2-रंग डेटासेट, यानी TIRF-४८८ और TIRF-५६१, बाद में मनका आधारित छवि पंजीकरण के लिए प्राप्त (बिंदु ३.१ देखें) ।
    1. वैकल्पिक: TIRF रोशनी सुनिश्चित करने के लिए, आज़ादी से चल फ्लोरोसेंट बहुरंगा मोती निलंबन के कुछ microliters जोड़ें (बिंदु 1.3.2 देखें.) । एक TIRF चैनल के लाइव दृश्य को सक्रिय करने और रोशनी कोण में वृद्धि । गैर अनुयाई मोती महत्वपूर्ण कोण से परे गायब हो जाएगा, एक सही TIRF रोशनी8सुनिश्चित करना ।
  4. बंद ट्यूब 2-3 बार पलटने से सेल सस्पेंशन फिर से मिक्स, और इमेजिंग डिश के लिए कोशिकाओं के 1 मिलीलीटर लागू होते हैं ।
  5. जल्दी से कम स्तर महामारी-फ्लोरोसेंट रोशनी के साथ डबल transfected कोशिकाओं को खोजने के लिए । उज्ज्वल क्षेत्र रोशनी का उपयोग कर लाइव कैमरा पूर्वावलोकन में कोशिकाओं केंद्र और स्थिति को चिह्नित करें । ब्याज की एक और 1-2 अंक पाते है और उंहें पदों की सूची में सहेजें ।
    नोट: शुरुआत में, कोशिकाओं को आसानी से मंच आंदोलन की वजह से अलग कर सकते हैं, इसलिए सेट 4-5 पदों और छवि अधिग्रहण शुरू करने से पहले सभी फिर से जांच करें । बाद में, 1-2 पदों को त्यागें ।
  6. "अनुक्रम" बटन पर क्लिक करके डेटा प्राप्ति प्रारंभ करें ।

3. छवि पोस्ट-ImageJ में प्रसंस्करण

  1. फिजी15में पंजीकरण-मुक्त hyperstack उत्पन्न करने के लिए, "SD-TIRF_helper" नाम का एक मैक्रो लिखा गया है जिसे 2-4 चैनल SD-TIRF डीकॉक डेटासेट पर लागू किया जा सकता है । फ़ाइल सहेजें "SD-TIRF_helper_JoVE. ijm" फिजी उप-फ़ोल्डर "मैक्रोज़" में और मेनू आदेश "प्लगइंस > मैक्रोज़ > चलाएँ..." पर क्लिक करके मैक्रो चलाएँ ।
    1. यदि रंग चैनल पंजीकरण सुधार की जरूरत है, विकल्प का चयन करें और एक नया मनका आधारित पंजीकरण संदर्भ (ऐतिहासिक फ़ाइल) बनाने या पहले बनाया गया था कि एक मौजूदा फ़ाइल का उपयोग करें ।
      नोट: turboreg प्लगइन16 प्रतिदीप्ति मोती संदर्भ छवियों के लिए लागू किया जाएगा । प्लगइन प्रतिष्ठानों के लिए सामांय दिशा निर्देशों के अनुसार फिजी सॉफ्टवेयर में प्लगइन स्थापित करें ।
    2. जैव-स्वरूपों आयातक के साथ डेटा आयात करें और एक को देखने के विकल्प के रूप में hyperstack चुनें । छवि डेटासेट लोड, पहले चरण में एसडी श्रृंखला का चयन करें, और दूसरे चरण में TIRF-श्रृंखला । फिजी चैनल और मंच की स्थिति के अनुसार क्रमबद्ध डेटा प्रदर्शित करेगा, यानी सामान्य रूप से सभी एसडी चैनलों और सभी TIRF-चैनलों का चयन किया गया है कि हर चरण की स्थिति के लिए एक hyperstack के रूप में दिखाते हैं.
      नोट: डेटा आयात विभिंन फ़ाइल प्रकारों से संभव है, उदाहरण के लिए TIFF-श्रृंखला या प्लेटफ़ॉर्म-निर्भर फ़ाइल प्रकार जैसे *. nd । फ़ाइल प्रकार नहीं पहचाना जा सकता केवल यदि यह स्वतंत्र, संपीड़न-कम TIFF स्वरूप के रूप में प्राप्ति सॉफ़्टवेयर द्वारा निर्यात नहीं किया गया था ।
    3. पूर्व-निर्धारित लैंडमार्क फ़ाइल को लोड करके पंजीकरण सुधार संबंधित चैनलों पर लागू करें ।
    4. हर एसडी और TIRF चैनल के लिए वांछित रंग देखो अप तालिका (LUT) का चयन करें और उन्हें एक एकल, बहु-आयामी hyperstack में विलय ।
      नोट: TIRF चैनलों के प्रसंस्करण के दौरान, शूंय तीव्रता मूल्यों के साथ z-विमानों की एक संख्या के नीचे विमान है कि एसडी डेटासेट में जेड विमानों की संख्या के साथ मैच के शीर्ष पर जोड़ रहे हैं । यह चरण अंतिम hyperstack के दृश्यावलोकन के लिए महत्वपूर्ण है. यह पद्धति सही है, क्योंकि TIRF रोशनी की गहराई (200nm7से कम) एसडी स्टैक (४०० एनएम) के z-चरण आकार से छोटी है ।

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Representative Results

आदेश में एसडी-TIRF इमेजिंग की क्षमता दिखाने के लिए, एक परख विकसित किया गया था कि सेल के spatio-लौकिक संगठन-मैट्रिक्स आसंजन परिसरों और सेलुलर आसंजन के दौरान cytoskeleton के साथ उनके संपर्क प्रकट करना चाहिए । इसलिए, अनुयाई हेला या, वैकल्पिक रूप से, NIH3T3 कोशिकाओं को YFP-Vinculin और आरएफपी-Lifeact के लिए 18-24 ज, trypsinized के साथ transfected और fibronectin-लेपित ग्लास नीचे व्यंजन पर वरीयता प्राप्त थे । इन सेल लाइनों उनके स्पष्ट cytoskeleton और लाइव इमेजिंग प्रयोगों में उच्च मजबूती के लिए चुना गया था, उदाहरण के लिए, प्राथमिक कोशिकाओं । वे बहुत संवेदनशील हालत में इमेजिंग सामना नहीं के रूप में वे trypsin उपचार के बाद हो सकता है । माइक्रोस्कोप पर, YFP/आरएफपी-एक्सप्रेस कोशिकाओं का चयन किया गया और आसंजन एक 60min समय चूक (चित्रा 2 और फिल्मों 1 और 2) के दौरान मनाया । इस विशिष्ट परख शायद ही कभी और साहित्य17,18में स्पष्ट रूप से वर्णित नहीं किया गया है । इसके अलावा, आसंजन गठन ज्यादातर जैसे कोशिकाओं को पलायन19,20में जांच की गई है । इस प्रकार, इस समाचार पत्र में वर्णित प्रयोगों को पूरा करने के लिए हमें इस पद्धति (सेल लाइन, कोटिंग, मीडियम, संरचना) को ढालने की आवश्यकता थी ।

के रूप में की उंमीद थी, कोशिकाओं को गोल आकार शुरुआत में थे और केवल कमजोर अनुयाई, जबकि झिल्ली की दखलंदाजी पर्यावरण संवेदन और सब्सट्रेट के साथ संपर्क बना रहे थे । तथाकथित नवजात आसंजन20,21 (चित्रा 2a, TIRF-४८८ चैनल, समय अंक 0-4.5 मिनट) के गठन पर सेल मैट्रिक्स संपर्क जल्दी मजबूत । बाद के स्थान की तरह हैं, Vinculin-कक्ष के ventral पक्ष में सकारात्मक संरचनाओं । संरचनाओं TIRF छवियों में स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे थे । आसंजन गठन की शुरुआत में, actin समान रूप से सेल में वितरित किया गया था और इन प्रारंभिक परिसरों (चित्रा 2a, एसडी-५६१ चैनल) के लिए स्थानीयकरण नहीं था । समय के दौरान, आसंजन परिसरों बढ़े और फोकल आसंजन (चित्रा 2c) के लिए परिपक्व । इन लंबी संरचनाओं मुख्य रूप से सेल की परिधि में स्पष्ट किया गया (आंकड़े 2a + बी) और बलों है कि अकटो-मायोसिन फाइबर द्वारा लागू किया गया से परिणामस्वरूप । इन तंतुओं आसंजन परिसरों से कनेक्ट करने के लिए शुरू कर दिया, जिससे उन्हें सेल केंद्र की ओर खींच और सेल-मैट्रिक्स आसंजन की मजबूती के रूप में के रूप में अच्छी तरह से actin फाइबर21के bundling उत्प्रेरण. जाहिर है, सेल भी actin नेटवर्क गठन (चित्रा 2a, XZ दृश्य) का एक परिणाम के रूप में चपटा । एसडी-इमेजिंग के लिए यहां पसंद की विधि होने का सबूत है, क्योंकि यह उच्च संवेदनशीलता, स्थानिक संकल्प और एक पूर्ण परिप्रेक्ष्य से इस प्रक्रिया visualizing की अनुमति दी । एक पिछली रिपोर्ट17में, अकेले TIRF केवल परिधीय आसंजन के मूल के बारे में अटकलें कर सकते हैं, जबकि एसडी-TIRF इमेजिंग स्पष्ट रूप से filopodia (चित्रा बी1, समय बिंदु 17 मिनट, सफेद arrowhead) के साथ अपने सहयोग से पता चला । दरअसल, actin फोकल आसंजन से उभरते centripetally फाइबर 27 मिनट (चित्रा बी, पीला arrowhead) के बाद दिखाई बन गया ।

हालांकि, इन प्रयोगों, यानी अधिग्रहण गति, उत्तेजना तीव्रता और डिटेक्टर लाभ के अधिग्रहण सेटिंग्स, सावधानी से मूल्यांकन करने की आवश्यकता है । 30 s/timepoint के अंतराल, बहु बिंदु अधिग्रहण को सक्षम करने, आदर्श प्रतीत होता है, जबकि उत्तेजना लेजर के विकिरण तीव्रता (0.5-1 W/सेमी ² के बीच) के लिए महत्वपूर्ण विचार के तहत उठाए जाने की जरूरत है । चित्रा 2d एक ही प्रयोग है कि सब्सट्रेट करने के लिए संलग्न करने में विफल में एक अलग स्थिति में एक सेल प्रदर्शित करता है । यह संभव हो सकता है कि phototoxic प्रभाव सेल यहां के जीव विज्ञान प्रभावित है, जो अंत में लगभग ६० मिनट के बाद bubbling झिल्ली में हुई, शायद apoptosis (फिल्म 2) जैसी । यह फिर से स्पष्ट कैसे संवेदनशील कोशिकाओं phototoxicity प्रतिक्रिया कर सकते है और यह है कि प्रकाश की मात्रा में डाल दिया और जानकारी बाहर ले जाया जा रहा है के बीच एक अच्छा संतुलन खोजने के लिए महत्वपूर्ण है बनाया । लेजर शक्ति को कम करने, एक z-स्टैक में छवियों की संख्या या लाभ में वृद्धि phototoxicity को कम करने के लिए सही रणनीति हो सकती है. इन सभी सेटिंग्स, तथापि, एक स्तर है कि अभी भी पर्याप्त संकल्प और शोर अनुपात के लिए संकेत प्राप्त करने की अनुमति देता है पर समायोजित किया जाना चाहिए, दर्ज समय चूक से मात्रात्मक जानकारी निकालने के लिए सक्षम करने से ।

Figure 1
चित्रा 1: एसडी-TIRF सेटअप के योजनाबद्ध ड्राइंग । A. SD इमेजिंग मोड: 6 अलग लेजर लाइनों (405/445/488/515/561/640nm, हरी लाइनों) फोकल स्कैनिंग यूनिट (CSU), एसडी (स्थिति ' में ') और माइक्रोस्कोप शरीर (MIC) में एक खाली फिल्टर घन के माध्यम से गुजर में युग्मित कर रहे हैं । नमूना (युक्ति) से प्रतिदीप्ति उत्सर्जन एसडी के pinholes के माध्यम से पेश किया है और अलग dichroic दर्पण द्वारा विभाजित, के लिए जैसे हरे/लाल या पीले/सियान एक साथ अधिग्रहण, दो अलग EM-सीसीडी कैमरे (C1 और C2) पर । प्रतिदीप्ति फिल्टर कैमरों के सामने रखा जाता है (नहीं दिखाया गया है) । B. TIRF इमेजिंग मोड: लेजर लाइनों TIRF स्कैनर (TIRF) में युग्मित कर रहे हैं । MIC में एक बहु लाइन बीम अलगानेवाला नमूना करने के लिए बीम निर्देशन और उत्सर्जन प्रकाश अधिकतम संचरण के लिए एसडी (' बाहर ') बाईपास. प्रतिदीप्ति में वर्णित एक ही कैमरे और उत्सर्जन फिल्टर द्वारा पता लगाया है । यह आंकड़ा Zobiak एट अलसे संशोधित किया गया है । 7 कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: सेल प्रसार और आसंजन गठन के प्रतिनिधि परिणाम एसडी-TIRF माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर । ए डबल-transfected हेला सेल एक्सप्रेस आरएफपी-Lifeact (लाल, एसडी-५६१ चैनल) और YFP-Vinculin (ग्रीन, TIRF-४८८ चैनल) trypsinized और फिर से fibronectin-लेपित ग्लास coverslips पर वरीयता प्राप्त थे । आसंजन गठन आसानी से दिखाई देता है, छोटे नवजात आसंजन के साथ शुरू (Vinculin-सकारात्मक धब्बे) 0 मिनट कि लगभग 5 मिनट के बाद बड़ा फोकल आसंजन में विकसित । Cortical actin लगभग 10 मिनट के बाद स्पष्ट है और कोशिकाओं की परिधि में फैली हुई है (12 और २४.५ मिनट में फ्रेम देखें) । B. बॉक्सिंग क्षेत्र के एक (४५ मिनट में फ्रेम) में बढ़ाया देखने के प्रसार और नवजात से फोकल आसंजन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से filopodia-जुड़े आसंजन (सफेद arrowhead) और तनाव फाइबर गठन के संक्रमण सेल का चित्रण (27 मिनट में फ्रेम देखें, पीली arrowhead) । ग . Kymograph में खींची गई धराशायी पीली लाइन के ए. डी. (फोटो-) कोशिकाओं या अंयथा अस्वस्थ कोशिकाओं पर विषाक्त प्रभाव उंहें सब्सट्रेट करने के लिए संलग्न करने के लिए असफल दे सकते हैं । इमेजिंग शर्तों phototoxicity बाहर करने के लिए गंभीर मूल्यांकन किया जाना है । स्केल बार = 5 µm (ए और डी में) और 2 µm (बी और सी में) । ए और डी में XZ विचार ओर्थोगोनल अनुमानों के धराशायी सफेद लाइनों से निकाले गए उसमें खींचा (नीचे = सब्सट्रेट). छवियां रैखिक इसके विपरीत थे-बढ़ाया और औसत-एक 3x3 कर्नेल के साथ फ़िल्टर । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Movie 1
मूवी 1:3 डी-अंजीर. 2a में डीकॉक अनुक्रम का पुनर्निर्माण । छवि अनुक्रम 3 डी इमेजिंग सॉफ्टवेयर के साथ प्रदान किया गया था । अवधि: ४२.५ min. अधिग्रहण दर: 2 दोहरे चैनल एसडी-TIRF स्टैक प्रति मिनट (कुल में ५६ फ्रेम) का अधिग्रहण किया गया । कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

Movie 2
मूवी 2: डीकॉक अनुक्रम की मूवी अंजीर. 2c में । अवधि: ६० min. अधिग्रहण दर: 2 दोहरे चैनल एसडी-TIRF स्टैक प्रति मिनट (कुल में ५६ फ्रेम) का अधिग्रहण किया गया । कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

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Discussion

इस पत्र में एसडी और TIRF माइक्रोस्कोपी का पहला सफल कार्यान्वयन लाइव सेल इमेजिंग प्रयोगों के प्रदर्शन के लिए उपयुक्त एक विन्यास में प्रस्तुत किया गया था, जैसे कि 2 एसडी-TIRF छवि के रूप में उच्च अधिग्रहण दर प्रति मिनट 3 अलग मंच पर ढेर पदों, १६८ फ्रेम (लगभग प्रति सेकंड 3 फ्रेम) की कुल करने के लिए इसी, अधिग्रहीत किया गया । कुछ एसडी TIRF सूक्ष्मदर्शी कि पहले12,13, मुख्य रूप से पर्याप्त रूप से उच्च इमेजिंग गति की कमी बताई गई 3 डी में सेलुलर प्रक्रियाओं का पालन करने के लिए जो छवि ढेर प्रति से कम 2 एस के एक लौकिक संकल्प अक्सर आवश्यक है । प्रस्तुत सेटअप इमेजिंग दर प्राप्त कर सकते है अप करने के लिए ०.७८ छवि ढेर प्रति सेकंड, और ३.५ एस की दरों में बड़े छवि 3 डी पुटिका गतिशीलता की जांच जी प्रयोगों में ढेर7प्रदर्शन किया गया है । इसके अतिरिक्त, पिछले एसडी TIRF माइक्रोस्कोप इमेजिंग मोड के अनुसार केवल एक डिटेक्टर था, आगे मल्टी चैनल अधिग्रहण के लिए गति को कम करने. तकनीकी तौर पर, उन प्रणालियों में एक विभाजन देखें विंयास लागू किया जा सकता है कि भी एक साथ दोहरे रंग अधिग्रहण एक कैमरा के साथ की अनुमति देता है । यह, तथापि, देखने के क्षेत्र के केवल आधे के इमेजिंग की अनुमति होगी । widefield इमेजिंग deconvolution या 3 डी सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी, यानी 3d SIM या जाली प्रकाश शीट माइक्रोस्कोपी के साथ संयोजित जैसे उच्च spatio-लौकिक रिज़ॉल्यूशन के साथ बहु-आयामी डेटासेट का उत्पादन करने के लिएअन्य विधियाँ, 23, वैध विकल्प हो सकता है । हालांकि, deconvolution आधारित इमेजिंग आसानी से कम संकेत करने वाली शोर अनुपात अधिग्रहण में छवि कलाकृतियों परिचय कर सकते हैं (के रूप में यह अक्सर लाइव इमेजिंग अनुप्रयोगों के दौरान मामला है), और सुपर संकल्प 3 डी लाइव इमेजिंग अभी भी एक तकनीकी रूप से विस्तार है और चुनौतीपूर्ण कार्य । एक उंनत एसडी-TIRF सेटअप7के प्रस्तुत बोध में, लाभ एक एसडी इकाई है कि दोहरे डिस्क में और पता लगाने के रास्ते से बाहर ले जाने की अनुमति देता है की गई थी । इस विंयास दो प्रमुख लाभ प्रदान करता है: सबसे पहले, एक ही दो कैमरों एसडी और TIRF संकेत है, जो इन दो चैनलों के एक उच्च परिशुद्धता ओवरलैप में परिणाम का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । दूसरा, कताई डिस्क के pinholes किसी भी उत्सर्जन जब TIRF अधिग्रहण मोड में संचालन प्रकाश ब्लॉक नहीं है (अधिक जानकारी के लिए, चित्र 1bदेखें), इस प्रकार उच्च संवेदनशील लाइव इमेजिंग के लिए महत्वपूर्ण संग्रह दक्षता बढ़ रही है । इसलिए, इस ऑप्टिकल विंयास एसडी इकाई को नजरअंदाज करने की अनुमति है कि मौजूदा एसडी-सूक्ष्मदर्शी में TIRF माइक्रोस्कोपी (जैसे चर या निश्चित कोण रोशनी) के किसी भी प्रकार को लागू करने के लिए अनुकूल है । इसके अलावा, इस्तेमाल किया TIRF स्कैनर तथाकथित समय साझा मोड, जहां दो TIRF चैनल एक साथ दर्ज किया जा सकता है में चला जा सकता है (के रूप में Zobiak एट अलमें दिखाया गया है । 7), और मल्टी चैनल डेटा के अधिग्रहण की गति ।

TIRF रोजगार का सबसे बड़ा लाभ में से एक यह है कि, इस पद्धति के साथ, यह एक जीवन कोशिका इमेजिंग प्रयोग के दौरान सेल झिल्ली से आने वाले संकेत उच्चतम परिशुद्धता के साथ स्थानीयकरण संभव है । वास्तव में, जबकि सिम की तरह एक पद्धति एक बेहतर z-अनुभाग प्रदान करता है और इस प्रकार निश्चित नमूनों में कोशिका झिल्ली के बेहतर अलगाव, लाइव सेल इमेजिंग प्रयोगों में organelles आ से प्रतिदीप्ति संकेत के घातीय बढ़ती/ TIRF इंटरफ़ेस छोड़ने के सेल झिल्ली के अधिक विशिष्ट और सटीक स्थानीयकरण की अनुमति दी । स्थानीयकरण परिशुद्धता, हालांकि अभी भी नहीं quantified, कई परतों 150-200 एनएम, यानी evanescence क्षेत्र की स्थानिक रेंज से छोटे होने का वादा किया ।

वर्तमान में विधि की एक सीमा को प्रकाश पथ से कताई डिस्क इकाई को हटाने और TIRF अधिग्रहण, अर्थात् ०.५ एस शुरू करने के लिए आवश्यक समय है । यह विलंब दो क्रमिक प्राप्ति के बीच न्यूनतम समय अंतराल को सीमित करता है । तकनीकी तौर पर, यह संभव होना चाहिए galvo के साथ डिस्क बाईपास के माध्यम से इस देरी को कम करने के दर्पण और इस तरह एसडी-TIRF चक्र के अनुसार कुल अधिग्रहण कम । इसके अलावा, नई पीढ़ी कैमरों उच्च संकेत करने वाली शोर अनुपात में कम जोखिम समय की अनुमति हो सकती है । इसलिए, इस सेटअप के समग्र प्रदर्शन अभी भी प्रासंगिक हार्डवेयर घटकों को नवीनीकृत करने से सुधारा जा सकता है । देखने के इमेजिंग बिंदु से, तथापि, वहां कई अंय तरीके अधिग्रहण समय कम करने के लिए कर रहे है (अवरोही क्रम में): कई पदों से बचें, z-ढेर ऊंचाई को कम करने, z-रिक्ति को बढ़ाने के लिए, जोखिम को कम समय (वृद्धि लाभ और संभवतः उपयोग बिन्नी), अधिग्रहण की स्थिति के बीच की दूरी को छोटा करें, ऑटो-फोकस केवल हर n-th समय बिंदु (n > 1) को सक्रिय । वास्तविक सीमाओं के बावजूद, अगर उन सभी मापदंडों सावधानी से मूल्यांकन कर रहे हैं, यह ट्रैकिंग और तेजी से चलती सेलुलर बुलबुले स्थानीयकृत के लिए एसडी-TIRF इमेजिंग का उपयोग करने के लिए संभव है, के रूप में Zobiak एट अल में प्रस्तुत किया । 7.

इसके अलावा, इस पत्र में एक प्रोटोकॉल है कि एक एकल चैनल एसडी-TIRF डेटासेट के अधिग्रहण दिनचर्या का वर्णन प्रस्तुत किया गया था । प्रदान किए गए मैक्रो का उपयोग कर, raw डेटा एक एकल TIFF में निर्यात किया जा सकता-फ़ाइल सभी SD-और TIRF चैनल युक्त । छवि पंजीकरण से प्रति आवश्यक नहीं है; हालांकि, यह महत्वपूर्ण है कि दोनों कैमरों ठीक एक दूसरे के संबंध के साथ गठबंधन कर रहे हैं । शेष पिक्सेल परिवर्तन (अनुवाद और रोटेशन) का पता लगाया जा सकता है और प्रदान की मैक्रो के भीतर सही । सुधार एल्गोरिथ्म एक बहु फ्लोरोसेंट मोतियों की है कि सिर्फ प्रयोग शुरू करने से पहले दर्ज किया जाना है चैनल संदर्भ छवि का उपयोग करता है । परिणामी फ़ाइल में, TIRF विमान सबसे कम स्तर पर सेट किया गया है जिसके बाद शून्य तीव्रता वाले विमानों की संख्या होती है जो एसडी-चैनल की आयामीता से मेल खाती है । इसलिए, यह डेटा प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है, के रूप में प्रोटोकॉल में उल्लिखित, जहां imaged TIRF विमान एसडी चैनल के लिए सेट z-स्टैक के निचले छोर जैसा दिखता है ।

अंत में प्रणाली संभवतः एक सिम मॉड्यूल या हाल ही में शुरू की बहु कोण TIRFM24,25 से आगे स्थानिक संकल्प बढ़ाने के लिए बढ़ाया जा सकता है । हालांकि, स्थानिक संकल्प की वृद्धि प्राप्त किया जा सकता है, कला की वर्तमान स्थिति के अनुसार, केवल एक धीमी इमेजिंग गति की कीमत पर । सभी लाइव सेल इमेजिंग प्रयोगों में यह प्लाज्मा झिल्ली पर संरचनाओं स्थानीयकरण हालांकि शेष सेलुलर मात्रा के उच्च स्थानिक संकल्प को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है, यहाँ वर्णित एसडी-TIRF सेटअप एक आसान एकीकृत करने के लिए है, आसानी से उपलब्ध समाधान.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम बहुत विश्वविद्यालय चिकित्सा केंद्र हैंबर्ग के वैज्ञानिक समुदाय धंयवाद हमें मूल्यांकन के लिए नमूनों के साथ समर्थन के लिए Eppendorf । अर्थात्, हम NIH3T3 कोशिकाओं के लिए सबीन Windhorst, Andrea Mordhorst के लिए YFP-Vinculin और मरेन रूडोल्फ आरएफपी-Lifeact के लिए धंयवाद ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Microscope and accessories
SD-TIRF microscope Visitron Systems
Ti with perfect focus system Nikon Inverted microscope stand
CSU-W1 T2 Yokogawa Spinning disk unit in dual-camera configuration
iLAS2  Roper Scientific TIRF/FRAP scanner
Evolve  Photometrix EM-CCD cameras
PiezoZ stage Ludl Electronic Products Motorized Z stage
Bioprecision2 XY stage Ludl Electronic Products Motorized XY stage
Stage top incubation chamber Okolab Bold Line Temperature, CO2 and humidity supply
Cell culture
HeLa cervical cancer cells DSMZ ACC-57
NIH3T3 fibroblasts DSMZ ACC-59
Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS) Gibco 14190144
Trypsin-EDTA 0.05% Gibco 25300054
Dulbecco's Modified Eagle Medium + GlutaMAX-I (DMEM) Gibco 31966-021
OptiMEM Gibco 31985070 Reduced serum medium
Fetal calf serum (FCS) Gibco 10500064
Penicillin/Streptomycin (PenStrep) Gibco 15140148
Full growth medium (DMEM supplemented with 10% FCS and 1% PenStrep)
TurboFect ThermoFisher Scientific R0531 Transfection reagent
Ascorbic acid (AA) Sigma A544-25G
6-well cell culture plate Sarstedt 83.392
Glass bottom dishes MatTek P35G-1.5-10-C 35mm, 0.17mm glass coverslip
Fibronectin, bovine plasma ThermoFisher Scientific 33010018
Neubauer improved chamber VWR 631-0696
TetraSpeck beads ThermoFisher Scientific T7279
Plasmids
RFP-Lifeact Maren Rudolph, Institute of Medical Microbiology, University Medical Center Hamburg Eppendorf, Germany
YFP-Vinculin Andrea Mordhorst, Institute of Medical Microbiology, University Medical Center Hamburg Eppendorf, Germany
Software and plugins
VisiView Visitron Systems Version 3
ImageJ Version 1.52c
Turboreg plugin http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/
Macro "SD-TIRF_helper_JoVE.ijm" this publication https://github.com/bzobiak/ImageJ
Volocity PerkinElmer Version 6.2.2

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References

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Zobiak, B., Failla, A. V.… More

Zobiak, B., Failla, A. V. Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (143), e58756, doi:10.3791/58756 (2019).

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