Summary
Um microscópio avançado que permitem rápida e de alta resolução de imagem de ambos, a membrana plasmática isolada e o volume intracelular circundante, será apresentado. A integração de giro do disco e total microscopia de fluorescência de reflexão interna em uma configuração permite experiências de imagens ao vivo em taxas de aquisição elevado até 3.5 s por pilha de imagem.
Abstract
Em células vivas, processos tais como a formação de aderência envolvem grandes mudanças estruturais na membrana plasmática e o interior da célula. Para visualizar estes eventos altamente dinâmicos, duas técnicas de microscopia de luz complementares que permitem rápida imagem latente de amostras ao vivo foram combinadas: girando microscopia de disco (SD) para a gravação do volume rápido e de alta resolução e reflexão interna total microscopia de fluorescência (TIRF) para visualização da membrana plasmática e localização exacta. Um protocolo de imagem abrangente e completo será mostrado para guiar a aquisição, calibração de microscópio, formação de imagem e preparação da amostra, resultando em uma série de imagens ao vivo de cor multi SD-TIRF com alta resolução espaço-temporal. Todas as etapas de pós-processamento de imagem necessária para gerar multidimensional datasets de imagens ao vivo, ou seja, o registro e a combinação dos canais individuais, são fornecidas em uma macro auto escrita para o open source software ImageJ. A imagem latente de proteínas fluorescentes durante a iniciação e a maturação dos complexos de adesão, bem como a formação da rede do citoesqueleto de actina, foi utilizado como prova de princípio para esta nova abordagem. A combinação de microscopia 3D de alta resolução e TIRF forneceu uma descrição detalhada destes processos complexos dentro do ambiente celular e, ao mesmo tempo, localização exacta das moléculas da membrana-associado detectado com um alto relação de sinal-para-plano de fundo.
Introduction
Nossos dias, técnicas de microscopia de luz, fornecendo imagens de resolução alta/super no fixo e espécime vivo estão se desenvolvendo rapidamente. Técnicas de super-resolução como estimularam emissão depleção (STED), estruturada iluminação microscopia (SIM) e microscopia de localização de foto-ativação (PALM) ou microscopia direta reconstrução óptica estocástico (Tempestade), respectivamente, são comercialmente disponíveis e permitir a geração de imagens de estruturas subcelulares, mostrando detalhes quase na escala molecular1,2,3,4,5,6. No entanto, essas abordagens ainda limitados aplicabilidade para experiências de imagens ao vivo, em que grandes volumes precisam ser visualizado com múltiplos frames por segunda velocidade de aquisição. Variedades de processos altamente dinâmicos, regulamentados através da membrana plasmática, por exemplo, endo- / exocitose, adesão, migração ou sinalização, ocorrem com alta velocidade dentro de grandes volumes de celulares. Recentemente, a fim de preencher esta lacuna, uma técnica de microscopia integrado foi proposto girando chamado disco-TIRF (SD-TIRF)7. No detalhe, microscopia TIRF permite especificamente isolar e localizar a membrana plasmática8,9, enquanto SD microscopia é um dos mais sensíveis e rápido viver técnicas de imagem para a visualização e acompanhamento das organelas subcelulares na citoplasma10,11. A combinação de ambas as técnicas de imagem em uma única instalação já foi realizada no últimos12,13, no entanto, o microscópio aqui apresentado (Figura 1) finalmente cumpre os critérios para realizar experimentos de SD-TIRF de imagens ao vivo os processos acima mencionados em 3 frames por segunda velocidade. Desde que este microscópio é comercialmente disponível, o objetivo deste manuscrito é descrever em detalhes e fornecer ferramentas open source e protocolos para aquisição de imagens, registro e visualização associada a microscopia SD-TIRF.
A instalação é baseada em um microscópio invertido ligado a varredura duas unidades através de portas independentes - porta esquerda está ligada à unidade SD e porta traseira para a unidade do scanner para TIRF e foto-ativação/branqueamento experimentos. Lasers de até 6 (405/445/488/515/561/640 nm) pode ser usado para a excitação. Excitação e detecção do sinal de fluorescência, ou um 100 x / óleo NA1.45 ou 60 x / óleo NA1.49 objetivo TIRF, respectivamente, têm sido empregadas. A luz emitida é dividida por um espelho dicroico (561 nm-passe longo ou 514 nm long-pass) e filtrado por vários filtros passa-banda (55 nm de largura centrada em 525 nm, 54 nm de largura centrada em 609 nm para fluorescência verde e vermelha, respectivamente) colocado na frente da cam CCD EM dois épocas. Por favor, note que os detalhes mais técnicos sobre a instalação estão listados na Zobiak et al 7. na configuração TIRF, a unidade de SD é movido para fora o trajeto da luz dentro de cerca de 0,5 s para que as mesmas duas câmeras podem ser usadas para a deteção, permitindo a comutação rápida entre as duas modalidades de imagem em comparação com cerca de 1 s, o que foi relatado no passado13 < /C2 >. Este recurso permite a aquisição simultânea de canal duplo, assim, 4 canais SD-TIRF imagem no anteriormente velocidade incomparável e precisão pode ser executada. Além disso, o alinhamento entre imagens SD e TIRF é desnecessário. Alinhamento de imagem entre as duas câmaras, no entanto, deve ser verificada antes de iniciar o experimento e corrigidos, se necessário. No seguinte protocolo, uma rotina de correção de registro foi implementada em uma macro auto escrita do ImageJ. Além disso, a macro foi principalmente projetada para permitir uma visualização simultânea do SD - e datasets TIRF apesar de sua dimensionalidade diferente. O software de aquisição não fornecer esses recursos.
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Protocol
1. preparação das células
- Dois dias antes do experimento, as sementes de 3 * 105 HeLa ou NIH3T3 células em 2 mL do meio de crescimento cheio por alvéolo de uma placa de cultura de pilha 6-poços. Certifique-se de que as células são tratadas em uma capa de fluxo laminar em todo este protocolo.
- Um dia antes do experimento, prepare os reagentes de transfecção de acordo com as recomendações do fabricante ou um protocolo empiricamente determinado, por exemplo:
- Diluir 1 µ g de RFP-Lifeact e 1 µ g/ml de YFP-vinculina um total de 200 µ l reduzida média de soro. Vórtice o reagente de transfeccao brevemente, adicionar 4 µ l a 200 µ l DNA e vórtice novamente. Incube a mistura de Transfeccao para 15-20 min à temperatura ambiente.
- Adicione a mistura de transfeccao toda gota a gota diretamente para as células. Misture agitando a placa e colocá-lo de volta para a incubadora.
- No dia do experimento, prepare a amostra para a geração de imagens ao vivo:
- Prepare uma 10 µ g/mL solução de fibronectina em PBS para revestir a superfície de vidro de um prato de fundo de vidro de 35 mm. Use somente alta qualidade 0,17 mm as lamelas de vidro para um desempenho ideal TIRF e evite pratos de plástico inferior. Deixe a solução na superfície do vidro por 30 min à temperatura ambiente, então remova-o e deixe o prato deixe secar naturalmente.
- Diluir uma solução de grânulos multi fluorescente 0.1 µm com uma densidade de 1,8 x 109 partículas por mL de água destilada e adicionar a solução para 30-60 s para a superfície de vidro revestido de fibronectina. Imediatamente remover a solução e deixe o prato deixe secar naturalmente.
Nota: Este passo é necessário somente se o avião TIRF deve ser encontrado antes da semeadura de células e/ou adquirir uma imagem de referência de 2 cores para registro de imagem baseada em talão. - Preparar uma solução de 0,1 M de ácido ascórbico (AA) e diluir para uma concentração final de 0,1 mM em um meio (AA-médio). Coloque a solução em banho maria a 37 ° C.
Nota: Use otimizado fluorescência meio de cultura celular se possível, tais como phenolred-livre e (ribo) flavin-reduzida e médias. AA é um agente antioxidante que pode reduzir efeitos fototóxicos durante a geração de imagens ao vivo14. Nós temos testado com sucesso neste ensaio, ou seja, mais células apareceram saudáveis sob as condições aplicadas do que sem adição de AA. No entanto, o pH do meio foi reduzido por 0,17 unidades de pH. - Lavar as células com 2 mL de PBS, adicionar 250 µ l do Trypsin-EDTA e espere até que as células são totalmente separada (2-3 min em uma incubadora de 37 ° C). Ressuspender as células cuidadosamente 1ml pré aquecido AA-médio com uma pipeta e adicioná-lo ao mL 4 AA-médio em um tubo de cultura de células de 15 mL. Coloque a suspensão de células com uma tampa um pouco aberta na incubadora conjunto para 37 ° C e 5% CO2 nos arredores do microscópio.
- Adicionar 1 mL pré-aquecido AA-médio para o prato fundo de vidro e coloque-o no suporte do microscópio pré-aquecido (ver parágrafo seguinte).
2. ao vivo imagens
- Inicie o controle ambiental do microscópio para alcançar uma estável a 37 ° C, 5% de CO2 e atmosfera úmida.
Nota: Aqui, uma câmara de incubação superior pequeno palco tem sido usada que permitido configurações estáveis dentro de cerca de 15 min. de incubadoras maiores precisará de mais tempo para alcançar condições estáveis. - Corrigi todas as configurações de aquisição no microscópio antes de aplicar a suspensão de células:
- Definir o intervalo de tempo de 30 s e a duração de 60-90 min. activar a função de focagem automática do autofoco baseado em hardware para cada ponto do tempo (valor "1").
- Ajuste a exposição da câmera e ganho, bem como a potência do laser para cada canal. Alto ganho de níveis, tempo de exposição baixo e do laser de baixa potência são recomendáveis para reduzir a toxicidade de foto.
Nota: Os dados aqui apresentados foi adquiridos com exposição de 200 ms, ganho de nível 500 e 20% do laser de potência igual a intensidades de excitação de 0.5 W/cm ² para 488 nm e 1 W/cm ² para 561 nm, respectivamente. - Defina a z-pilha para os canais de disco giratório para 10 µm com espaçamento de 0,4 µm. Desactivação da z-pilhas para os canais TIRF. Defina o deslocamento inferior para "0", ou seja, o avião mais baixo será a posição do foco da ferragem autofoco.
- Active a função de multi-ponto "posições de estágio".
Nota: Até 3 posições podem ser gravadas em um intervalo de tempo de 30 s.
- Encontrar os grânulos fluorescentes com iluminação epi-fluorescente para a ocular ou na tela do computador, em seguida, ativar um canal TIRF e definir o ângulo de iluminação para um valor que indica a iluminação TIRF. Ativar o foco automático pressionando o botão no painel do microscópio e ajustar o foco com a roda de deslocamento. Adquirir um conjunto de dados 2-cor, ou seja, TIRF-488 e TIRF-561, para registro de imagem baseada em grânulo subsequentes (ver ponto 3.1).
- Opcional: Para garantir iluminação TIRF, adicione alguns microlitros de suspensão de grânulos multicolor fluorescente livremente flutuante (ver ponto 1.3.2.). Ativar a exibição ao vivo de um canal de TIRF e aumentar o ângulo de iluminação. Os grânulos não-aderente desaparecerá para além do ângulo crítico, garantindo uma correta TIRF iluminação8.
- Misturar a suspensão celular novamente invertendo o tubo fechado-2 - 3 vezes e aplicar 1 mL das células para o prato de imagem.
- Rapidamente encontre células transfectadas-duplo com baixa iluminação nível de epi-fluorescente. Centralize as células na visualização de câmera ao vivo usando a iluminação de campo claro e marque a posição. Encontrar mais 1-2 pontos de interesse e salvá-los para a lista de posições.
Nota: No início, as células facilmente podem desanexar devido ao movimento de palco, portanto, definir posições de 4-5 e re-Verifique tudo antes de iniciar a aquisição de imagens. Em seguida, descarte o 1-2 posições. - Inicie a aquisição de dados, clicando no botão "Sequência".
3. pós-processamento de a imagem no ImageJ
- A fim de gerar uma hyperstack sem registro em FIJI15, uma macro denominada "SD-TIRF_helper" foi escrita que pode ser aplicado a conjuntos de dados o timelapse de SD-TIRF canal 2-4. Salve o arquivo "SD-TIRF_helper_JoVE.ijm" em a FIJI sub-pasta "macros" e execute a macro clicando no comando de menu "Plugins > Macros > executar...".
- Se os canais de cor precisam de correção de registro, selecione a opção e criar uma nova referência de registro baseado em grânulo (arquivo de ponto de referência) ou usar um arquivo existente que foi criado antes.
Nota: O plugin de turboreg16 será aplicada às imagens de referência de grânulos de fluorescência. Instale o plugin no software de FIJI, de acordo com as orientações gerais para as instalações do plugin. - Importar os dados com o importador de bio-formatos e escolher hyperstack como uma opção de visualização. Carregar o conjunto de dados de imagem, selecione a série SD na primeira etapa e a série TIRF na segunda etapa. FIJI exibirá os dados classificados por canal e fase de posição, ou seja, normalmente todos os SD-canais e todos os canais-TIRF mostram-se como um hyperstack para todas as posições de estágio que foi seleccionada.
Nota: Importação de dados é possível a partir de vários tipos de arquivo, por exemplo, TIFF-série ou plataforma-dependente arquivo tipos tais como * nd. O tipo de arquivo não pode ser reconhecido apenas se ele não foi exportado pelo software de aquisição como independente, menos compressão formato TIFF. - Aplica a correção de registo para os respectivos canais carregando o arquivo Marcos pré-determinado.
- Selecione a tabela do Look-up de cor desejada (LUT) para todos os canais SD - e TIRF e mesclá-las em um hyperstack único, multi-dimensional.
Nota: Durante o processamento dos canais TIRF, um número de aviões-z com zero valores de intensidade é adicionado no topo o plano de fundo que corresponde com o número de aviões-z no dataset SD. Este passo é importante para a visualização de hyperstack o final. Esta metodologia está correta, desde a profundidade da iluminação TIRF (menos de 200nm7) é menor que o tamanho de z-passo da pilha SD (400 nm).
- Se os canais de cor precisam de correção de registro, selecione a opção e criar uma nova referência de registro baseado em grânulo (arquivo de ponto de referência) ou usar um arquivo existente que foi criado antes.
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Representative Results
Para mostrar o potencial da imagem SD-TIRF, que desenvolveu um ensaio que deveria revelar a organização espaço-temporal de complexos de adesão célula-matriz e sua interação com o citoesqueleto durante a adesão celular. Portanto, aderente HeLa ou, alternativamente, NIH3T3 células foram transfectadas com YFP-vinculina e RFP-Lifeact para 18-24 h, trypsinized e semeado em pratos de fundo de vidro revestido de fibronectina. Estas linhas de célula foram escolhidas para seus pronunciado citoesqueleto e maior robustez em experimentos de imagem ao vivo, opôs-se, por exemplo, as células primárias. Aqueles não podem resistir a imagem latente em condição muito sensível como são após o tratamento de tripsina. No microscópio, células YFP/RFP-expressando foram Selecionadodas e o processo de adesão observada durante 60min de um lapso de tempo (Figura 2 e filmes 1 e 2). Este ensaio específico raramente e claramente não foi descrito na literatura17,18. Além disso, a formação de aderência principalmente tem sido pesquisada em , por exemplo, migração de células19,20. Assim, precisamos adaptar esta metodologia (linha celular, revestimento, médio, composição) a fim de realizar as experiências descritas neste documento.
Como esperado, as células foram redondas no início e apenas fracamente aderente, Considerando que as saliências de membrana foram sentindo o ambiente e fazendo contato com o substrato. Contatos de célula-matriz rapidamente reforçaram mediante a formação de aderências nascente chamada20,21 (Figura 2A, canal TIRF-488, tempo pontos 0-4.5 min). Os últimos são estruturas como local, vinculina positiva no lado ventral da célula. As estruturas foram claramente visíveis nas imagens TIRF. No início da formação de aderência, actina foi distribuída uniformemente na célula e não localizar para estes primeiros complexos (Figura 2A, canal SD-561). Ao longo do tempo, complexos de adesão alargada e amadureceram para aderências focais (Figura 2). Estas estruturas alongadas foram predominantemente evidentes na periferia da célula (figuras 2A + B) e resultaram de forças que eram exercidas por fibras de acto-miosina. Estas fibras começaram a ligar para os complexos de adesão, assim, puxando-os para o centro da célula e induzindo o reforço das aderências célula-matriz, bem como a agregação das fibras de actina21. Aparentemente, a célula achatada também como resultado da formação de rede de actina (Figura 2A, exibição XZ). SD-imagem latente à prova para ser o método de escolha, pois permitiu Visualizar este processo com alta sensibilidade, resolução espacial e de uma perspectiva completa. Em um relatório anterior17, TIRF sozinho poderia apenas que especular sobre a origem das adesões periféricas, enquanto imagens SD-TIRF revelaram claramente a sua associação com filopodia (Figura 2B, ponto tempo 17 min, seta branca). Com efeito, as fibras de actina emergindo centripetamente aderências focais tornaram-se visíveis após 27 min (Figura 2B, a ponta da seta amarela).
No entanto, as configurações de aquisição destas experiências, ou seja, velocidade de aquisição, ganho de intensidade e detector de excitação, precisam ser cuidadosamente avaliadas. O intervalo de 30 s/Commit, permitindo aquisição de multi ponto, parece ser ideal, enquanto a intensidade de radiação do laser da excitação (entre 0.5-1 W/cm ²) precisa ser levado em consideração crítica. Figura 2D exibe uma célula em uma posição diferente na experiência mesma que falha ao anexar ao substrato. É possível que efeitos fototóxicos afetado a biologia da célula, que finalmente resultou na membrana borbulhando após cerca de 60 min, provavelmente semelhante a apoptose (filme 2). Isto deixou claro mais uma vez como sensíveis células pode reagir a fototoxicidade e que é importante encontrar em que um bom equilíbrio entre a quantidade de luz colocar e a informação que está sendo retirado. Reduzindo a potência do laser, o número de imagens em um z-pilha ou aumentando o ganho pode ser a estratégia correta para a redução de fototoxicidade. Todas essas configurações, no entanto, devem ser ajustadas a um nível que permite ainda alcançar suficiente resolução e sinal à relação de ruído, permitindo extrair informações quantitativas do lapso de tempo gravado.
Figura 1: esquemático desenho da instalação do SD-TIRF. R. modo de imagem SD: as 6 linhas de laser diferentes (linhas de 405/445/488/515/561/640nm, verde) são acopladas à unidade de varredura confocal (CSU), passando através do SD (posição 'IN') e um cubo de filtro vazio no organismo microscópio (MIC). Emissão de fluorescência do provete (SPEC) é projetada através dos furos do SD e dividida por espelhos dicroicos diferentes, por exemplo, para aquisição simultânea verde/vermelho ou amarelo/ciano, em duas diferentes câmeras EM-CCD (C1 e C2). Filtros de fluorescência são colocados na frente das câmeras (não mostradas). B. modo de imagem TIRF: as linhas de laser são acopladas no scanner TIRF (TIRF). Um divisor de feixe de várias linhas no MIC direciona o feixe para a amostra e a emissão de luz ignora o SD ('OUT') para transmissão maximizada. Fluorescência é detectada pelas câmeras mesmas e emissão de filtros descritos em A. Esta figura foi modificada de Zobiak et al. 7 Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: resultados representativos da formação de disseminação e adesão de células usando microscopia de SD-TIRF. R. duplo-transfectadas HeLa célula expressar RFP-Lifeact (canal vermelho, SD-561) e YFP-vinculina (canal verde, 488-TIRF) eram as lamelas de trypsinized e re-semeado em vidro revestido de fibronectina. Formação de adesão torna-se facilmente visível, começando com pequenas aderências nascentes (manchas vinculina-positivo) em 10 minutos que se desenvolvem em aderências focais maiores após cerca de 5 minutos. Actina cortical é aparente após cerca de 10 minutos e estende-se na periferia das células (ver quadros a 24,5 e 12 minutos). B. A visão ampliada da região encaixotada em um (quadro em 45 minutos) retrata a célula se espalhando e a transição de aderências nascentes para focal, bem como aderências associada filopodia (seta branca) e formação de fibras de estresse (ver quadro aos 27 minutos, ponta de seta amarela). C. Kymograph da linha tracejada amarela desenhada em m. (Foto-) Efeitos tóxicos sobre células ou caso contrário insalubre podem deixá-los a deixar de anexar ao substrato. Condições de imagem devem ser avaliados criticamente a fim de excluir a fototoxicidade. Barra de escala = 5 µm (na e D) e 2 µm (em B e C). Os pontos de vista XZ em A e D são as projecções ortogonais, extraídas de linhas tracejadas brancas desenhadas nele (fundo = substrato). Imagens foram linearmente contraste aprimorado e mediana-filtrados com um kernel de 3 x 3. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Filme 1: 3D-reconstrução da sequência de timelapse no Fig. 2A. A sequência de imagem foi renderizada com 3D software de imagem. Duração: taxa de aquisição de 42,5 min.: 2 pilhas de SD-TIRF dual channel por minuto (56 frames no total) foram adquiridas. Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)
Movie 2: filme da sequência timelapse na Fig. 2 C. Duração: taxa de aquisição 60 min.: 2 pilhas de SD-TIRF dual channel por minuto (56 frames no total) foram adquiridas. Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)
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Discussion
Neste trabalho foi apresentado a primeira implementação bem sucedida da microscopia SD e TIRF em uma configuração adequada para a realização de experiências imagem de célula viva, ou seja, taxas de aquisição elevado, tais como 2 pilhas de imagem SD-TIRF por minuto 3 fase diferente posições, correspondentes a um total de 168 quadros (cerca de 3 quadros por segundo), foram adquiridas. Os microscópios de SD-TIRF alguns que eram anteriormente descrito12,13, principalmente a falta de velocidade de imagem suficientemente alta para acompanhar os processos celulares em 3D em que uma resolução temporal de menos de 2 s por pilha de imagem muitas vezes é necessário. A configuração apresentada pode alcançar taxas de imagem até 0,78 pilhas de imagem por segundo e as taxas de 3.5 s por pilha de imagem grande em experiências ao vivo investiga vesículas 3D dinâmica ter sido demonstrado7. Além disso, microscópios de SD-TIRF anteriores tinham apenas um detector por modo, reduzindo ainda mais a velocidade para aquisições de multi-canal de imagem. Tecnicamente, nesses sistemas, que uma divisão da exibição configuração poderia ser implementada que também permite aquisição simultânea de duplo-cor com uma única câmera. Isto, no entanto, permitiria a imagem de apenas metade do campo de visão. Outros métodos para produzir conjuntos de dados multidimensionais com alta resolução espaço-temporal, tais como widefield imagem combinada com deconvolução ou microscopia de super-resolução 3D, ou seja, 3D SIM ou malha folha de luz microscopia22, 23, podem ser alternativas válidas. No entanto, geração de imagens baseada em deconvolução facilmente pode introduzir artefatos de imagem nas aquisições de baixa relação sinal-ruído (como é frequentemente o caso durante live aplicativos de imagem), e super resolução 3D ao vivo de imagem é ainda um tecnicamente elaborativo e tarefa desafiadora. Na realização de um avançado de configuração SD-TIRF7apresentada, foi tirar partido de uma unidade SD que permite mover o disco duplo dentro e fora do caminho da deteção. Essa configuração fornece dois benefícios principais: em primeiro lugar, as mesmas duas câmeras podem ser usadas para detectar a SD TIRF sinal, que resulta em uma sobreposição de alta precisão destes dois canais. Em segundo lugar, os furos do disco girando não bloqueia qualquer luz de emissão quando operando em modo de aquisição TIRF (para mais detalhes, ver figura 1B), aumentando assim a eficiência de coleta importante para geração de imagens ao vivo do elevado-sensível. Portanto, essa configuração óptica é favorável para a implementação de qualquer tipo de microscopia TIRF (por exemplo, iluminação de ângulo fixo ou variável) em SD-microscópios existentes que permitem ignorando a unidade SD. Além disso, o scanner TIRF usado pode ser executado no modo de chamada time-sharing, onde dois canais TIRF podem ser gravadas simultaneamente (como mostrado em Zobiak et al. 7), por excesso de velocidade mais a aquisição de dados multi-canal para cima.
Uma das maiores vantagens de empregar TIRF é que, com esta metodologia, é possível localizar com maior precisão o sinal proveniente da membrana celular durante uma célula de vida experiência de imagem. Com efeito, enquanto uma metodologia como SIM oferece um melhor z-seccionamento e, portanto, melhor isolamento da membrana celular em fixo amostras, na célula viva imagem experimentos o exponencial aumentando/diminuindo o sinal de fluorescência com organelas se aproximando / deixando a interface TIRF permitiu a localização mais precisa e específica da membrana celular. A precisão de localização, embora não ainda quantificada, promete ser de muitas dobras menores do que 150-200 nanômetro, ou seja, a escala espacial do campo de evanescence.
Atualmente uma limitação do método é o tempo necessário para remover a unidade de disco giratório do caminho de luz e começar a TIRF aquisição, ou seja, 0,5 s. Este atraso limita o intervalo de tempo mínimo entre duas aquisições consecutivas. Tecnicamente, deve ser possível reduzir este atraso através de ignorando o disco com por exemplo galvo-espelhos e diminuindo assim a aquisição global por ciclo de SD-TIRF. Também, novas câmeras de geração podem permitir tempos de exposição reduzida em alta relação sinal-ruído. Portanto, o desempenho geral desta configuração pode ser melhorado ainda relevante por atualizar os componentes de hardware. Do ponto de vista de imagem, no entanto, existem várias outras maneiras de minimizar o tempo de aquisição (em ordem decrescente): evitar múltiplas posições, reduzir a altura z, aumentar o espaçamento de z, minimizar o tempo de exposição (aumento de ganho e possivelmente usar binning), encurtar a distância entre as posições de aquisição, ativar o auto-foco apenas todos os pontos de tempo de n-ésimo (n > 1). Apesar das limitações reais, se todos os parâmetros são avaliados cuidadosamente, é possível usar SD-TIRF imagem para rastreamento e localização movendo rápido vesículas celulares, tal como apresentado no Zobiak et al 7.
Além disso, neste trabalho, um protocolo que descreve a aquisição rotina de um canal único SD-TIRF dataset foi apresentada. Usando a macro fornecida, dados brutos podem ser exportados em um único arquivo TIFF contendo todos os canais SD - e TIRF. Registro de imagem é por si só não é necessário; no entanto, é importante que ambas as câmaras estão precisamente alinhadas em relação uns aos outros. Restantes turnos de pixel (translação e rotação) podem ser detectados e corrigidos dentro da macro fornecida. O algoritmo de correção faz uso de uma imagem de referência de multi-canal de grânulos fluorescentes que tem que ser gravado pouco antes de iniciar o experimento. No arquivo resultante, o avião TIRF situa-se no nível mais baixo, seguido de um número de zero aviões de intensidade que estão combinando a dimensionalidade do SD-canal. Portanto, é importante obter os dados, conforme descrito no protocolo, onde o avião TIRF imagem assemelha-se a extremidade inferior da pilha-z definida para o canal SD.
Finalmente o sistema poderia ser potencialmente estendido um módulo SIM ou o recentemente introduzido multi-ângulo TIRFM24,25 para aumentar ainda mais a resolução espacial. No entanto, aumento de resolução espacial pode ser alcançado, de acordo com o atual estado da arte, só à custa de uma velocidade mais lenta de imagem. Para a célula viva experiências na qual é fundamental localizar estruturas na membrana plasmática, embora mantendo a alta resolução espacial do restante volume celular de imagem, a configuração de SD-TIRF descrita aqui é um fácil de integrar, prontamente disponível solução.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Agradecemos muito a comunidade científica da Universidade Medical Center Hamburg-Eppendorf nos apoiar com amostras para avaliação. Ou seja, agradecemos-Sabine Windhorst NIH3T3 células, Andrea Mordhorst para YFP-vinculina e Maren Rudolph para RFP-Lifeact.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope and accessories | |||
| SD-TIRF microscope | Visitron Systems | ||
| Ti with perfect focus system | Nikon | Inverted microscope stand | |
| CSU-W1 T2 | Yokogawa | Spinning disk unit in dual-camera configuration | |
| iLAS2 | Roper Scientific | TIRF/FRAP scanner | |
| Evolve | Photometrix | EM-CCD cameras | |
| PiezoZ stage | Ludl Electronic Products | Motorized Z stage | |
| Bioprecision2 XY stage | Ludl Electronic Products | Motorized XY stage | |
| Stage top incubation chamber | Okolab | Bold Line | Temperature, CO2 and humidity supply |
| Cell culture | |||
| HeLa cervical cancer cells | DSMZ | ACC-57 | |
| NIH3T3 fibroblasts | DSMZ | ACC-59 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 14190144 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Gibco | 25300054 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium + GlutaMAX-I (DMEM) | Gibco | 31966-021 | |
| OptiMEM | Gibco | 31985070 | Reduced serum medium |
| Fetal calf serum (FCS) | Gibco | 10500064 | |
| Penicillin/Streptomycin (PenStrep) | Gibco | 15140148 | |
| Full growth medium (DMEM supplemented with 10% FCS and 1% PenStrep) | |||
| TurboFect | ThermoFisher Scientific | R0531 | Transfection reagent |
| Ascorbic acid (AA) | Sigma | A544-25G | |
| 6-well cell culture plate | Sarstedt | 83.392 | |
| Glass bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-10-C | 35mm, 0.17mm glass coverslip |
| Fibronectin, bovine plasma | ThermoFisher Scientific | 33010018 | |
| Neubauer improved chamber | VWR | 631-0696 | |
| TetraSpeck beads | ThermoFisher Scientific | T7279 | |
| Plasmids | |||
| RFP-Lifeact | Maren Rudolph, Institute of Medical Microbiology, University Medical Center Hamburg Eppendorf, Germany | ||
| YFP-Vinculin | Andrea Mordhorst, Institute of Medical Microbiology, University Medical Center Hamburg Eppendorf, Germany | ||
| Software and plugins | |||
| VisiView | Visitron Systems | Version 3 | |
| ImageJ | Version 1.52c | ||
| Turboreg plugin | http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/ | ||
| Macro "SD-TIRF_helper_JoVE.ijm" | this publication | https://github.com/bzobiak/ImageJ | |
| Volocity | PerkinElmer | Version 6.2.2 |
References
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