Summary
Een geavanceerde Microscoop waarmee snel en met hoge resolutie zal imaging van zowel de geïsoleerde plasmamembraan en de omliggende intracellulaire volume, worden gepresenteerd. De integratie van de draaiende schijf en de totale interne reflectie fluorescentie microscopie in één installatie kunt levende imaging experimenten bij hoge acquisitie tarieven tot 3.5 s per afbeeldingsstapel.
Abstract
In levende cellen betrokken processen zoals hechting vorming uitgebreide structurele veranderingen in het plasma-membraan en het interieur van de cel. Om te visualiseren deze hoogdynamische gebeurtenissen, twee complementaire lichte microscopie technieken waarmee snelle beeldvorming van live monsters werden gecombineerd: draaiende schijf microscopie (SD) voor snelle en hoge resolutie opname en totale interne reflectie de microscopie van de fluorescentie (TIRF) voor precieze lokalisatie en visualisatie van het plasma-membraan. Een uitgebreide en volledige imaging protocol wordt getoond voor begeleiden door bereiding van de monsters, Microscoop kalibratie, beeldvorming en overname, wat resulteert in meerdere kleuren SD-TIRF levende imaging serie met hoge spatio-temporele resolutie. Alle nodige afbeelding nabewerking stappen voor het genereren van de multi-dimensionale levende imaging datasets, d.w.z. de registratie en de combinatie van de afzonderlijke kanalen, vindt u in een zelfgeschreven macro voor de open sourcesoftware ImageJ. De beeldvorming van fluorescente proteïnen tijdens initiatie en rijping van hechting complexen, alsmede de vorming van het cytoskeletal netwerk van actine, werd gebruikt als een bewijs van beginsel voor deze nieuwe aanpak. De combinatie van hoge resolutie 3D microscopie en TIRF verstrekt een gedetailleerde beschrijving van deze complexe processen binnen de cellulaire omgeving en, tegelijkertijd, precieze lokalisatie van de membraan-geassocieerde moleculen met een hoog ontdekt verhouding signaal-naar-achtergrond.
Introduction
Onze dagen, de lichte microscopie technieken bieden hoge/super resolutie beeldvorming in vaste en levende specimen evolueren snel. Super resolutie technieken zoals gestimuleerd emissie uitputting (STED), gestructureerd verlichting microscopie (SIM) en foto-activering lokalisatie microscopie (PALM) of directe stochastische optische wederopbouw microscopie (STORM), respectievelijk, zijn verkrijgbare en inschakelen van de beeldvorming van subcellular structuren details weergeven bijna op de moleculaire schaal1,2,3,4,5,6. Deze benaderingen nog steeds hebben echter slechts beperkt toepasbaarheid voor levende imaging experimenten waarbij grote hoeveelheden moeten worden gevisualiseerd met meerdere beelden per tweede overname snelheid. Soorten hoogdynamische processen geregeld via het plasma-membraan, bijvoorbeeld endo- / exocytose, hechting, migratie of signalering, optreden met hoge snelheid binnen grote cellulaire volumes. Onlangs, was een geïntegreerde microscopie techniek om te vullen deze kloof, voorgestelde genaamd draaiende schijf-TIRF (SD-TIRF)7. In detail vliegvergunningen TIRF microscopie specifiek isoleren en lokaliseren van het plasmamembraan8,9, terwijl SD microscopie een van de meest gevoelige en snel is leven beeldvormingstechnieken voor de visualisatie en tracking van subcellular organellen in het cytoplasma10,11. De combinatie van beide beeldvormingstechnieken in een enkele setup is al gerealiseerd in de afgelopen12,13, echter de Microscoop gepresenteerd hier (figuur 1) tot slot voldoet aan de criteria voor het uitvoeren van levende imaging SD-TIRF-experimenten van de bovengenoemde processen ter 3 raamwindow via tweede snelheid. Aangezien deze Microscoop commercieel beschikbaar is, wordt het doel van dit manuscript te beschrijven in detail en open source tools en protocollen voorzien in Beeldacquisitie, registratie en visualisatie SD-TIRF microscopie gekoppeld is.
De setup is gebaseerd op een omgekeerde Microscoop verbonden met twee scan eenheden via autonome havens - de linker poort is gekoppeld aan de eenheid van de SD en de achterste poort scannereenheid voor TIRF en foto-activation /-bleken experimenten. Maximaal 6 lasers (405/445/488/515/561/640 nm) kan worden gebruikt voor excitatie. Excitatie en opsporing van het signaal van de fluorescentie, ofwel een 100 x / NA1.45 olie of 60 x / NA1.49 olie TIRF doelstelling, respectievelijk, zijn tewerkgesteld. Het uitgestraalde licht is gesplitst door een dichroïde spiegel (561 nm long pass of 514 nm long pass) en gefilterd door diverse band pass filters (55 nm breed gecentreerd op 525 nm, 54 nm breed gecentreerd op 609 nm voor groene en rode fluorescentie, respectievelijk) geplaatst voor de twee EM-CCD-cam tijdperken. Houd er rekening mee dat er meer technische details over de setup staan in Zobiak et al. 7. in TIRF de configuratie, de SD-eenheid wordt verplaatst vanuit het licht pad binnen circa 0,5 s zodat het dezelfde twee camera's kunnen worden gebruikt voor de detectie, waardoor sneller schakelen tussen de twee beeldvormende modaliteiten vergeleken met circa 1 s dat werd gerapporteerd in het verleden13 < /C2 >. Deze functie mogelijk maakt dual channel gelijktijdige overname, dus 4 kanalen SD-TIRF denkbaar ter eerder ongeëvenaarde snelheid en nauwkeurigheid kan worden uitgevoerd. Bovendien is de uitlijning tussen SD en TIRF beelden overbodig. Uitlijning van afbeelding tussen de twee camera's, maar moet worden gecontroleerd voordat het experiment en eventueel worden hersteld. In het volgende protocol, werd een registratie correctie routine geïmplementeerd in een zelfgeschreven ImageJ macro. Bovendien, de macro werd voornamelijk ontworpen om een gelijktijdige visualisatie van SD- en TIRF datasets ondanks hun verschillende dimensionaliteit. De acquisitie software zelf hebben deze functies niet verstrekt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. bereiding van cellen
- Twee dagen voorafgaand aan het experiment, seed 3 * 105 HeLa of NIH3T3 cellen in 2 mL zuiver volledige groeimedium per putje van de plaat van een 6-well-celkweek. Ervoor dat de cellen in de kap van een laminaire flow in dit protocol worden verwerkt.
- Een dag voorafgaand aan het experiment, bereiden de transfectie reagentia volgens de aanbevelingen van de fabrikant of een empirisch bepaald protocol, bijvoorbeeld:
- Verdun RFP-Lifeact 1 µg en 1 µg voor YFP-Vinculin in een totaal van 200 µL verminderde serum medium. Vortex de transfectiereagens kort, 4 µL 200 µL DNA en vortex opnieuw toevoegen. De transfectie mix gedurende 15-20 minuten bij kamertemperatuur incuberen.
- De gehele transfectie mix ontkleuring rechtstreeks toevoegen aan de cellen. Meng door schudden van de plaat en plaats het terug in de incubator.
- Op de dag van het experiment, voor levende imaging met bereiden van het monster:
- Bereid een 10 µg/mL oplossing van fibronectine in PBS jas van het glasoppervlak van een 35 mm glas onder schotel. Gebruik alleen hoge kwaliteit 0,17 mm glas coverslips voor optimale prestaties van de TIRF en Vermijd van kunststof bodem gerechten. Laat de oplossing op het glasoppervlak voor 30 minuten bij kamertemperatuur, vervolgens wegnemen op en laat de schotel drogen.
- Verdun een 0.1 µm multi fluorescerende kralen oplossing met een dichtheid van 1,8 x 109 deeltjes per mL in gedistilleerd water en voeg de oplossing voor 30-60-s aan de fibronectine-gecoate glazen oppervlak. Onmiddellijk verwijderen van de oplossing en laat de schotel drogen.
Opmerking: Deze stap is alleen nodig als de TIRF vlak vóór het zaaien van de cellen en/of te verwerven van een 2-kleur referentiebeeld voor kraal gebaseerde beeldregistratie moet worden gevonden. - Bereid een oplossing 0,1 M ascorbinezuur (AA) en Verdun het tot een uiteindelijke concentratie van 0,1 mM in groeimedium (AA-medium). Plaats de oplossing in een waterbad 37 ° C.
Opmerking: Gebruik fluorescentie-geoptimaliseerde cel kweekmedium indien mogelijk, deze als phenolred-vrij en (ribo-) flavin verminderde medium. AA is een anti-oxiderende agent die fototoxische effecten tijdens live imaging14kan verminderen. Wij hebben het met succes getest in deze test, d.w.z. meer cellen gezonde onder de voorwaarden toegepast verscheen dan zonder toevoeging van AA. De pH van het medium werd echter verlaagd door 0,17 pH-eenheden schommelen. - Wassen van de cellen met 2 mL PBS, voeg 250 µL trypsine-EDTA en wacht totdat de cellen volledig zijn vrijstaand (2-3 min in een incubator 37 ° C). Resuspendeer de cellen zorgvuldig in 1 mL pre AA-medium opgewarmd met een pipet en toevoegen aan 4 mL AA-medium in een tube van 15 mL cel cultuur. Plaats de celsuspensie met een lichtjes geopende deksel in een incubator ingesteld op 37 ° C en 5% CO2 in de nabijheid van de Microscoop.
- Voeg 1 mL vooraf opgewarmd AA-medium aan de glazen bodem schotel en plaats deze in de houder van de voorverwarmde Microscoop (zie volgende paragraaf).
2. levende imaging
- Start de omgevingscontrole van de Microscoop te bereiken van een stabiele 37 ° C en 5% CO2 vochtige atmosfeer.
Opmerking: Hier, een klein podium top incubatie kamer is gebruikt dat toegestane stabiele instellingen binnen ongeveer 15 min. grotere starterscentra zal meer tijd nodig om te bereiken van stabiele omstandigheden. - Alle overname-instellingen herstellen in de Microscoop voordat de celsuspensie wordt toegepast:
- De tijd-interval instelt op 30 s en de duur van 60-90 min. activeren de functie auto-nadruk van de hardware gebaseerde auto-focus voor elk punt van de tijd (waarde "1").
- Het aanpassen van de belichting van de camera en winst, evenals de kracht van de laser voor elk kanaal. Hoog krijgen niveaus, geringe blootstellingstijd en lage laser macht zijn aan te bevelen om foto-toxiciteit.
Opmerking: De hier gepresenteerde gegevens overgenomen met 200 ms blootstelling, niveau 500 en 20% laser macht die gelijk is aan de excitatie intensiteiten van 0.5 W/cm² voor 488 nm en 1 W/cm² voor 561 nm, respectievelijk. - De z-stack voor de draaiende schijf-kanalen instellen op 10 µm met 0.4 µm afstand. -Activeren z-stacks voor de TIRF-kanalen. Stel de onderkant-offset op "0", dat wil zeggen de laagste vliegtuig zal worden de positie van de focus van de hardware-autofocus.
- Activeer de multi-point functie "podium posities".
Opmerking: Maximaal 3 posities kunnen worden opgenomen in een 30 s tijdsinterval.
- Vinden de fluorescerende kralen met epi-belichting fluorescerende verlichting op het oculair of op het computerscherm, dan activeren van één TIRF-kanaal en de lichtinvalshoek instelt op een waarde die duidt op TIRF verlichting. De autofocus activeren door het indrukken van de knop op het paneel van de Microscoop en de focus met de offset wiel aan te passen. Verwerven van een 2-kleur dataset, d.w.z. TIRF-488 en TIRF-561, voor latere kraal gebaseerde beeldregistratie (zie punt 3.1).
- Optioneel: Om ervoor te zorgen TIRF verlichting, voeg een paar microliters van de vrij zwevende fluorescerende multicolor kralen schorsing (zie punt 1.3.2.). Activeren van de live view van een TIRF-kanaal en het verhogen van de lichtinvalshoek. De niet-aanhanger kralen verdwijnt dan de kritische hoek, zorgen voor een juiste TIRF verlichting8.
- Meng de celsuspensie weer door het omkeren van de gesloten buis 2 - 3 keer en toepassen van 1 mL van de cellen op de imaging schotel.
- Vind snel dubbel-transfected cellen met lage niveau epi-belichting fluorescerende verlichting. Centreren van de cellen in de voorvertoning van de live camera met heldere veld verlichting en markeer de positie. Nog 1-2 punten van belang vinden en ze opslaan op de lijst van de posities.
Opmerking: Aan het begin, de cellen gemakkelijk kunnen loskoppelen als gevolg van beweging van de fase, dus 4-5 posities ingesteld en opnieuw controleren al voordat Beeldacquisitie. Daarna Gooi 1-2 posities. - Data-acquisitie starten door te klikken op de knop "Volgorde".
3. na beeldverwerking in ImageJ
- Oog op het genereren van een registratie-gratis hyperstack in FIJI15, is een macro genaamd "SD-TIRF_helper" geschreven dat kan worden toegepast op 2-4 kanaal SD-TIRF timelapse datasets. Sparen het dossier "SD-TIRF_helper_JoVE.ijm" in de FIJI sub-folder "macro's" en voer de macro door te klikken op de menuopdracht "Plugins > macro's > uitvoeren...".
- Als de kleurkanalen nodig registratie correctie, selecteert u de optie en maakt een nieuwe kraal gebaseerde registratie verwijzing (landmark-bestand) of gebruik een bestaand bestand dat is gemaakt voordat.
Opmerking: De turboreg plugin16 zal gelden voor fluorescentie kralen referentie afbeeldingen. Installeer de plugin in FIJI software volgens de algemene richtsnoeren voor plugin installaties. - De gegevens met de importeur van bio-formaten importeren en kies hyperstack als een weergaveoptie. Laden van de dataset van de afbeelding, selecteert u de SD-serie in de eerste stap, en de TIRF-serie in de tweede stap. FIJI, worden de gegevens gesorteerd op kanaal en de fase positie, dat wil zeggen normaal alle SD-kanalen en alle TIRF-kanalen worden weergegeven als een hyperstack voor elke fase positie die is geselecteerd weergegeven.
Opmerking: Gegevens importeren is mogelijk van verschillende bestandstypen, bijvoorbeeld TIFF-serie of platformafhankelijke bestand typen zoals * .nd. Het bestandstype wordt niet herkend, alleen als het niet door de software van de overname als onafhankelijke, compressie-minder TIFF-indeling geëxporteerd. - De registratie-correctie toepassen door de respectieve kanalen door het laden van het bestand vooraf bepaalde monumenten.
- Selecteer de gewenste kleur look-up tabel (LUT) voor elke zender die SD- en TIRF en samenvoegen tot een enkele, multi-dimensionale hyperstack.
Opmerking: Tijdens de verwerking van de TIRF kanalen, een aantal z-vliegtuigen met nulwaarden intensiteit worden toegevoegd op de top van het bodem-vliegtuig dat met het aantal z-vliegtuigen in de SD-dataset overeenkomt. Deze stap is belangrijk voor de visualisatie van de laatste hyperstack. Deze methodologie klopt, sinds de diepte van de TIRF verlichting (minder dan 200nm7) is kleiner dan de z-stap-grootte van de SD-stack (400 nm).
- Als de kleurkanalen nodig registratie correctie, selecteert u de optie en maakt een nieuwe kraal gebaseerde registratie verwijzing (landmark-bestand) of gebruik een bestaand bestand dat is gemaakt voordat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om aan te tonen van het potentieel van SD-TIRF imaging, dat een test werd ontwikkeld die moet onthullen de spatio-temporele organisatie van cel-matrix hechting complexen en hun interactie met het cytoskelet tijdens cellulaire hechting. Daarom aanhanger HeLa of, subsidiair, NIH3T3 cellen werden transfected met YFP-Vinculin en RFP-Lifeact voor 18-24 h, trypsinized en ontpit op fibronectine-gecoate glazen bodem gerechten. Deze cellijnen werden gekozen voor hun uitgesproken cytoskelet en hogere robuustheid in levende imaging experimenten tegenstelling tot, bijvoorbeeld, primaire cellen. Die kunnen niet weerstaan beeldvorming in zeer gevoelige voorwaarde zoals ze na trypsine behandeling zijn. Bij de Microscoop, YFP/RFP-uiten cellen werden geselecteerd en het proces van hechting waargenomen tijdens een 60min time-lapse (Figuur 2 en films 1 en 2). Deze specifieke bepaling is zelden en niet duidelijk beschreven in de literatuur17,18. Hechting vorming heeft bovendien meestal onderzocht in bijvoorbeeld cellen19,20te migreren. Dus moesten we passen deze methode (cellijn coating, medium, samenstelling) ter vervulling van de experimenten die in dit artikel wordt beschreven.
Zoals verwacht, cellen waren rond-gevormde aan het begin en slechts zwak aanhanger, terwijl membraan uitsteeksels werden sensing van het milieu en het maken van contact met de ondergrond. Cel-matrix contacten versterkt snel na de vorming van zogenaamde ontluikende verklevingen20,21 (figuur 2A, TIRF-488 kanaal, tijd punten 0-4,5 min). De laatste zijn plek-achtige Vinculin-positieve structuren aan de ventrale zijde van de cel. De structuren zijn duidelijk zichtbaar in de beelden van de TIRF. In het begin van de vorming van de hechting, actine was gelijkmatig verdeeld in de cel en deed niet lokaliseren op deze vroege complexen (figuur 2A, SD-561 kanaal). In de loop der tijd, hechting complexen uitgebreid en verviel aan focal verklevingen (figuur 2C). Deze langgerekte structuren waren overwegend duidelijk aan de rand van de cel (cijfers 2A + B) en het gevolg is van de krachten die uitgeoefend werden door acto-myosin vezels. Deze vezels begon te verbinden met de hechting complexen, aldus trekken ze naar het centrum van de cel en inducerende de versterking van de cel-matrix verklevingen evenals de bundeling van actine vezels21. De cel afgevlakt blijkbaar, ook als gevolg van actine netwerk vorming (figuur 2A, XZ weergave). SD-imaging ondoorlaatbaar om de methode van keuze hier, als het toegestaan visualiseren dit proces met hoge gevoeligheid, ruimtelijke resolutie en vanuit een volledige perspectief. In een vorige verslag17, kon TIRF alleen alleen laten speculeren over de oorsprong van perifere verklevingen, overwegende dat SD-TIRF imaging duidelijk zijn associatie met filopodia (figuur 2B, tijdstip 17 min, witte pijlpunt gebleken). Inderdaad, werd de actine vezels opkomende centripetaal van focal verklevingen na 27 min (figuur 2B, gele pijlpunt) zichtbaar.
De overname-instellingen van deze experimenten, dwz overname snelheid, excitatie-intensiteit en detector winst, moeten echter zorgvuldig worden geëvalueerd. Het interval van 30 s/timepoint, waardoor multi punt acquisitie, lijkt te zijn ideaal, terwijl de intensiteit van de straling van de excitatie-laser (tussen de 0,5-1 W/cm²) moet worden genomen in kritieke kwestie. Figuur 2D wordt een cel weergegeven op een andere positie in hetzelfde experiment dat niet hechten op de ondergrond. Het wellicht mogelijk dat fototoxische effecten beïnvloed de biologie van de cel hier, die uiteindelijk resulteerde in het membraan borrelen na circa 60 min, waarschijnlijk lijkt op apoptosis (Movie 2). Dit maakte opnieuw duidelijk hoe gevoelig cellen kan reageren op fototoxiciteit en dat het is belangrijk te vinden die een goede balans tussen de hoeveelheid licht in plaatsen en de informatie wordt genomen. Het verminderen van de macht van de laser, zou het aantal beelden in een z-stapel of verhoging van de winst de juiste strategie voor de vermindering van de fototoxiciteit. Al deze instellingen, echter moeten worden aangepast op een niveau waarmee nog bereiken van voldoende resolutie en de signaal / ruisverhouding, kwantitatieve om informatie te extraheren uit de opgenomen time-lapse inschakelen.
Figuur 1: schematische tekening van de SD-TIRF setup. A. SD imaging modus: de 6 verschillende laserlijnen (405/445/488/515/561/640nm, groene lijnen) worden gekoppeld in de confocale scanning unit (CSU), passeren de SD (positie 'IN') en een leeg filter kubus in het lichaam van de Microscoop (MIC). Fluorescentie emissie uit het monster (SPEC) naar verwachting door de gaatjes van de SD en split door verschillende dichroïde spiegels, bijvoorbeeld voor groen/rood of geel/cyaan gelijktijdige aanschaf, op twee verschillende EM-CCD-camera's (C1 en C2). Fluorescentie filters worden geplaatst voor de camera's (niet afgebeeld). B. TIRF imaging modus: de laserlijnen in de TIRF scanner (TIRF) zijn gekoppeld. Een multi-lijn balk splitter in de microfoon stuurt de bundel met het model en de uitstoot licht mijdt de Security Descriptor ('OUT') voor gemaximaliseerd transmissie. Fluorescentie is gedetecteerd door de dezelfde camera's en uitstoot filters beschreven in A. Dit cijfer is gewijzigd van Zobiak et al. 7 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: representatieve resultaten van hechting aan en verspreiding celvorming met behulp van microscopie van SD-TIRF. A. Double-transfected HeLa cellen uiten RFP-Lifeact (rood, SD-561 kanaal) en YFP-Vinculin (groen, TIRF-488 kanaal) waren trypsinized en opnieuw geplaatste op fibronectine beklede glas coverslips. Vorming van de hechting zichtbaar gemakkelijk, beginnend met kleine ontluikende verklevingen (Vinculin-positieve plekken) op 0 minuten die tot grotere focal verklevingen na circa 5 minuten uitgroeien. Corticale actine blijkt na circa 10 minuten en strekt zich uit aan de rand van de cellen (Zie frames op 12 en 24,5 minuten). B. de vergrote weergave van de boxed Gewest in een (frame op 45 minuten) toont de verspreiding van de cel en de overgang van ontluikende aan focal verklevingen, alsmede filopodia-geassocieerde verklevingen (witte pijlpunt) en stress productieproces (zie kader op 27 minuten, gele pijlpunt). C. Kymograaf van de gele stippellijn getekend in A. D. (Foto-) Toxische effecten op cellen of anders ongezonde cellen kunnen laten mislukken te hechten op de ondergrond. Imaging voorwaarden moeten kritisch worden geëvalueerd om uit te sluiten van fototoxiciteit. Schaal bar = 5 µm (a en D) en 2 µm (in B en C). De standpunten van de XZ in A en D zijn de orthogonale projecties geëxtraheerd uit de witte streepjeslijnen daarin getrokken (bodem = substraat). Beelden waren lineair contrast-enhanced en mediaan-gefilterd met een 3 x 3-kernel. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Film 1: 3D-reconstructie van de volgorde van de timelapse in Fig. 2A. De beeldenreeks werd teruggegeven met 3D imaging-software. Duur: 42.5 min. verwerving tarief: 2 dual channel SD-TIRF stapels per minuut (56 frames in totaal) werden verworven. Gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Movie 2: film voor de timelapse sequence in Fig. 2 C. Duur: 60 min. verwerving tarief: 2 dual channel SD-TIRF stapels per minuut (56 frames in totaal) werden verworven. Gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In deze paper werd de eerste succesvolle implementatie van SD en TIRF microscopie in een configuratie die geschikt zijn voor het uitvoeren van de levende cel imaging experimenten, dat wil zeggen hoge acquisitie tarieven zoals 2 SD-TIRF-afbeeldingsstapels per minuut 3 verschillende stadium gepresenteerd posities, overeenkomend met in totaal 168 frames (circa 3 beelden per seconde), werden verworven. De paar SD-TIRF-microscopen die waren eerder beschreven12,13, vooral gebrek aan voldoende hoge imaging snelheid te volgen van cellulaire processen in 3D waarin een temporele resolutie van minder dan 2 s per afbeeldingsstapel is vaak noodzakelijk. De gepresenteerde setup kan bereiken imaging tarieven tot 0.78 afbeeldingsstapels per seconde, en de tarieven van 3.5 s per grote afbeeldingsstapel in live experimenten behandelende 3D vesikel dynamiek geweest aangetoond7. Bovendien had de vorige SD-TIRF microscopen slechts één detector per imaging modus, verdere vermindering van de snelheid voor meerkanaals overnames. Technisch, in die systemen die een gesplitste weergave configuratie kan worden uitgevoerd ook waarmee gelijktijdige overname van de dual-kleur met een enkele camera. Dit zou evenwel toestaan dat beeldvorming van slechts de helft van het gezichtsveld. Andere methoden voor de productie van multi-dimensionale datasets met hoge spatio-temporele resolutie, zoals widefield imaging gecombineerd met deconvolutie of 3D super resolutie microscopie, dat wil zeggen 3D SIM-kaart of rooster licht blad microscopie22, 23, misschien wel geldige alternatieven. Deconvolutie gebaseerde beeldvorming kan echter gemakkelijk leiden tot artefacten van de afbeelding in lage signal-to-noise verhouding overnames (zoals vaak het geval tijdens live beeldtoepassingen), en super resolutie 3D imaging live is nog steeds een technisch elaborative en uitdagende taak. In de gepresenteerde realisatie van een geavanceerde SD-TIRF setup7, werd gebruik gemaakt van een SD-eenheid waarmee de dual-schijf in en uit het detectie-pad verplaatsen. Deze configuratie biedt twee grote voordelen: ten eerste de dezelfde twee camera's kunnen worden gebruikt om te ontdekken de SD en TIRF signaal, wat resulteert in een hoge precisie-overlapping van deze twee kanalen. Ten tweede, de gaatjes van de draaiende schijf niet blokkeren geen uitstoot licht wanneer uitgevoerd in de modus van TIRF overname (voor meer details, Zie figuur 1B), waardoor de collectie efficiëntie belangrijk voor hoog-gevoelige levende imaging. Deze optische configuratie is dus gunstig voor het uitvoeren van elke vorm van TIRF microscopie (b.v. variabele of vaste hoek verlichting) in bestaande SD-microscopen waarmee het omzeilen van de SD-eenheid. Bovendien, de gebruikte TIRF-scanner kan worden uitgevoerd in de modus van de zogenaamde time-sharing, waar twee TIRF kanalen gelijktijdig kunnen worden opgenomen (zoals aangegeven in Zobiak et al.. 7), snelheidsovertredingen verder omhoog de verwerving van meerkanaals gegevens.
Een van de grootste voordelen van het gebruik van TIRF is dat met deze methode, is het mogelijk om te lokaliseren met hoogste precisie het signaal vanuit de celmembraan tijdens een leven cel imaging experiment. Inderdaad, terwijl een methodologie als SIM een beter z biedt-segmenteren en dus betere isolatie van de celmembraan in vaste monsters, in levende cellen imaging experimenten de exponentiële verhogen/verlagen van het signaal van de fluorescentie van organellen naderen / verlaten van de TIRF-interface toegestaan meer concrete en precieze lokalisatie van de celmembraan. De precisie van de lokalisatie, hoewel niet nog gekwantificeerd, beloften worden vele plooien kleiner dan 150-200 nm, d.w.z. het ruimtelijk bereik van het veld van evanescence.
Momenteel is een beperking van de methode is de tijd die nodig is te verwijderen van de schijfeenheid spinnen uit het licht weg en beginnen met de overname van de TIRF, dat wil zeggen 0,5 s. Deze vertraging beperkt het minimale interval tussen twee opeenvolgende overnames. Technisch, moet het mogelijk zijn om deze vertraging door het overslaan van de schijf met bijvoorbeeld galvo-spiegels en aldus verminderen de totale overname per SD-TIRF cyclus. Ook, nieuwere generatie camera's mogelijk verminderde blootstelling tijden op hoge signaal-/ ruisverhouding. Vandaar, de algehele prestaties van deze opstelling nog relevantly kan worden verbeterd door een upgrade van de hardwarecomponenten. Vanuit de imaging oogpunt, echter, er zijn verschillende andere manieren om te minimaliseren van de tijd van de overname (in aflopende volgorde): voorkomen van meerdere posities, verminderen de z-stapel hoogte, de z-tussenafstanden, minimaliseren belichtingstijd (verhoging krijgen en eventueel gebruiken weggooien), verkorten van de afstand tussen de standpunten van de overname, activeert de auto-focus alleen elke n-de tijdstip (n > 1). Ondanks de beperkingen van het werkelijke, als alle deze parameters worden zorgvuldig geëvalueerd, is het mogelijk gebruik van SD-TIRF imaging voor het volgen en lokaliseren van snel bewegende cellulaire blaasjes, als aangegeven in Zobiak et al. 7.
Bovendien werd in dit document een protocol waarin de overname routine van een één-kanaals SD-TIRF dataset gepresenteerd. Met behulp van de meegeleverde macro, kunnen onbewerkte gegevens worden geëxporteerd in een TIFF-bestand met alle kanalen van de SD- en TIRF. Beeldregistratie is per se niet noodzakelijk; het is echter belangrijk dat beide camera's juist zijn uitgelijnd ten opzichte van elkaar. Resterende pixel verschuivingen (omzetting en -rotatie) kan worden ontdekt en gecorrigeerd binnen de meegeleverde macro. De correctie algoritme maakt gebruik van een meerkanaals referentiebeeld van fluorescerende parels die moet worden opgenomen net voordat het experiment. In het resulterende bestand, is het vliegtuig TIRF ingesteld op laagste niveau gevolgd door een aantal nul intensiteit vliegtuigen die zijn bijpassende de dimensionaliteit van de SD-zender. Daarom, is het belangrijk te verwerven van de gegevens, zoals beschreven in het protocol, waar het verbeelde TIRF vliegtuig lijkt op de onderkant van de z-stack instellen voor de SD-zender.
Tot slot kon het systeem worden potentieel uitgebreid met een SIM-module of de onlangs geïntroduceerde multi hoek TIRFM24,25 tot verdere verhoging van de ruimtelijke resolutie. Verhoging van de ruimtelijke resolutie kan echter worden bereikt, volgens de huidige stand van de techniek, alleen ten koste van een langzamer imaging snelheid. Voor alle levende cellen die experimenten waarin het is cruciaal voor het lokaliseren van structuren op het plasma-membraan, zij het handhaven van hoge ruimtelijke resolutie van de resterende cellulaire volume imaging, is de hier beschreven SD-TIRF setup een eenvoudig te integreren, direct beschikbaar oplossing.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken sterk de wetenschappers van de University Medical Center Hamburg-Eppendorf voor het steunen van ons met monsters voor evaluatie. Namelijk, wij danken Sabine Windhorst voor NIH3T3 cellen, Andrea Mordhorst voor YFP-Vinculin en Maren Rudolph voor RFP-Lifeact.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope and accessories | |||
| SD-TIRF microscope | Visitron Systems | ||
| Ti with perfect focus system | Nikon | Inverted microscope stand | |
| CSU-W1 T2 | Yokogawa | Spinning disk unit in dual-camera configuration | |
| iLAS2 | Roper Scientific | TIRF/FRAP scanner | |
| Evolve | Photometrix | EM-CCD cameras | |
| PiezoZ stage | Ludl Electronic Products | Motorized Z stage | |
| Bioprecision2 XY stage | Ludl Electronic Products | Motorized XY stage | |
| Stage top incubation chamber | Okolab | Bold Line | Temperature, CO2 and humidity supply |
| Cell culture | |||
| HeLa cervical cancer cells | DSMZ | ACC-57 | |
| NIH3T3 fibroblasts | DSMZ | ACC-59 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 14190144 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Gibco | 25300054 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium + GlutaMAX-I (DMEM) | Gibco | 31966-021 | |
| OptiMEM | Gibco | 31985070 | Reduced serum medium |
| Fetal calf serum (FCS) | Gibco | 10500064 | |
| Penicillin/Streptomycin (PenStrep) | Gibco | 15140148 | |
| Full growth medium (DMEM supplemented with 10% FCS and 1% PenStrep) | |||
| TurboFect | ThermoFisher Scientific | R0531 | Transfection reagent |
| Ascorbic acid (AA) | Sigma | A544-25G | |
| 6-well cell culture plate | Sarstedt | 83.392 | |
| Glass bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-10-C | 35mm, 0.17mm glass coverslip |
| Fibronectin, bovine plasma | ThermoFisher Scientific | 33010018 | |
| Neubauer improved chamber | VWR | 631-0696 | |
| TetraSpeck beads | ThermoFisher Scientific | T7279 | |
| Plasmids | |||
| RFP-Lifeact | Maren Rudolph, Institute of Medical Microbiology, University Medical Center Hamburg Eppendorf, Germany | ||
| YFP-Vinculin | Andrea Mordhorst, Institute of Medical Microbiology, University Medical Center Hamburg Eppendorf, Germany | ||
| Software and plugins | |||
| VisiView | Visitron Systems | Version 3 | |
| ImageJ | Version 1.52c | ||
| Turboreg plugin | http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/ | ||
| Macro "SD-TIRF_helper_JoVE.ijm" | this publication | https://github.com/bzobiak/ImageJ | |
| Volocity | PerkinElmer | Version 6.2.2 |
References
- Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Optics Letters. 19 (11), 780 (1994).
- Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), New York, N.Y. 1642-1645 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophysical Journal. 91 (11), 4258-4272 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature methods. 3 (10), 793-796 (2006).
- van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nature protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).
- Zobiak, B., Failla, A. V. Advanced spinning disk-TIRF microscopy for faster imaging of the cell interior and the plasma membrane. Journal of Microscopy. 269 (3), 282-290 (2018).
- Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. Journal of Cell Science. 123 (21), 3621-3628 (2010).
- Burchfield, J. G., Lopez, J. A., Vallotton, P., William, E. Exocytotic vesicle behaviour assessed by total internal reflection fluorescence microscopy. Traffic. 11 (4), 429-439 (2010).
- Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M. Spinning-disk confocal microscopy. present technology and future trends. Methods in Cell Biology. 123, 153-175 (2014).
- Murray, J. M., Appleton, P. L., Swedlow, J. R., Waters, J. C. Evaluating performance in three-dimensional fluorescence microscopy. Journal of Microscopy. 228 (3), 390-405 (2007).
- Trache, A., Lim, S. -M. Integrated microscopy for real-time imaging of mechanotransduction studies in live cells. Journal of Biomedical Optics. 14 (3), 034024 (2009).
- Stehbens, S., Pemble, H., Murrow, L., Wittmann, T. Imaging intracellular protein dynamics by spinning disk confocal microscopy. Methods in Enzymology. , 293-313 (2012).
- Waldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., Van De Linde, S., Sauer, M. Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy. Scientific Reports. 5, 1-12 (2015).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).
- Partridge, M. A. Initiation of attachment and generation of mature focal adhesions by integrin-containing filopodia in cell spreading. Molecular Biology of the Cell. 17 (10), (2006).
- Dubin-Thaler, B. J., Giannone, G., Döbereiner, H. G., Sheetz, M. P. Nanometer analysis of cell spreading on matrix-coated surfaces reveals two distinct cell states and STEPs. Biophysical Journal. 86 (3), 1794-1806 (2004).
- Choi, C. K., Vicente-Manzanares, M., Zareno, J., Whitmore, L. A., Mogilner, A., Horwitz, A. R. Actin and α-actinin orchestrate the assembly and maturation of nascent adhesions in a myosin II motor-independent manner. Nature Cell Biology. 10 (9), 1039-1050 (2008).
- Bachir, A. I., Zareno, J., Moissoglu, K., Plow, E. F., Gratton, E., Horwitz, A. R. Integrin-associated complexes form hierarchically with variable stoichiometry in nascent adhesions. Current Biology. 24 (16), 1845-1853 (2014).
- Sun, Z., Guo, S. S., Fässler, R.
- Shao, L., Kner, P., Rego, E. H., Gustafsson, M. G. L. Super-resolution 3D microscopy of live whole cells using structured illumination. Nat. Methods. 8 (12), 1044-1046 (2011).
- Chen, B. -C., et al. Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346 (6208), 1257998-1257998 (2014).
- Fu, Y., Winter, P. W., Rojas, R., Wang, V., McAuliffe, M., Patterson, G. H. Axial superresolution via multiangle TIRF microscopy with sequential imaging and photobleaching. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (16), 4368-4373 (2016).
- Boulanger, J., et al. Fast high-resolution 3D total internal reflection fluorescence microscopy by incidence angle scanning and azimuthal averaging. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (48), 17164-17169 (2014).
