Summary
신속 하 고 높은 해상도 허용 하는 고급 현미경, 고립 된 플라즈마 멤브레인와 주변 세포내 볼륨의 이미지를 제시 한다. 회전 디스크 및 총 내부 반사 형광 현미경 검사 법 한 설정의 통합 3.5까지 높은 수집 속도에서 라이브 이미징 실험을 허용 이미지 스택 당 s.
Abstract
살아있는 세포에 접착 형성 등 프로세스 원형질 막과 세포 내부에 광범위 한 변화를 포함 한다. 이러한 높은 동적 이벤트를 시각화 하기 위해 라이브 샘플의 빠른 이미지를 허용 하는 두 가지 보완 가벼운 현미경 검사 법 기술을 결합 했다: 회전 하는 디스크 현미경 (SD) 및 고해상도 볼륨 녹음 및 총 내부 반사 형광 (TIRF) 정확한 현지화 및 원형질 막의 시각화에 대 한 현미경 검사 법 포괄적이 고 완전 한 이미징 프로토콜 샘플 준비, 현미경 교정, 이미지 형성 및 취득 안내, 다 색 SD TIRF 라이브 이미징 시리즈 높은 spatio 시간적 해상도 결과 대 한 표시 됩니다. 모든 필요한 이미지 후 처리 단계 다차원 라이브 이미징 데이터 집합, 즉 등록 및 개별 채널의 조합 생성 ImageJ의 오픈 소스 소프트웨어에 대 한 자체 서 면된 매크로에 제공 됩니다. 개시 동안 형광 단백질의 이미징 및 접착 단지의 성숙 뿐만 아니라 말라 cytoskeletal 네트워크의 형성이 새로운 접근에 대 한 원리의 증거로 사용 되었다. 셀룰러 환경에서 하 고, 동시에, 높은 감지 막 관련 된 분자의 정확한 지 방화에 이러한 복잡 한 프로세스에 대 한 자세한 설명을 제공 하는 높은 해상도 3D 현미경 및 TIRF의 조합 신호-배경 비율입니다.
Introduction
우리의 일, 가벼운 현미경 검사 법 기술 고정에 높은/슈퍼 해상도 이미징 및 살아있는 견본을 제공 하는 급속 하 게 개발 하고있다. 와 같은 슈퍼 해상도 기법 자극 방출 소모 (호텔 위치), 구조화 조명 현미경 (SIM) 및 사진 활성화 지역화 현미경 (팜) 또는 직접 확률적 광학 재건 현미경 (폭풍), 각각, 있다 상업적으로 사용할 수 있는 활성화의 subcellular 구조는 분자 규모1,2,3,4,,56에 거의 정보를 보여주는 영상. 그러나,이 접근 아직도 있는 대용량 두 번째 수집 속도 여러 프레임 구상 될 필요가 라이브 이미징 실험에 대 한 적용을 제한 했다. 원형질 막, 예를 들어 엔도-를 통해 규제 하는 매우 동적 프로세스의 다양성 / exocytosis, 접착, 마이그레이션 또는 신호, 고속 대용량 세포 내에서 발생. 최근,이 격차를 채우기 위해 통합된 현미경 검사 법 기술이 했다 제안된 라는 회전 디스크-TIRF (SD-TIRF)7. 자세하게, TIRF 현미경 특별히 분리와 원형질 막8,9지역화, SD 현미경 검사 법은 가장 중요 한 중 하나 빠른 라이브 이미징 기술을 시각화 및 추적에 대 한 허용 세포질10,11subcellular 세포. 그러나 단일 설치에 두 이미징 기술 조합 지난12,13에서 이미 실현 되어,, (그림 1)을 여기에 제시 된 현미경은 마침내 라이브 이미징 SD TIRF 실험을 수행 하 기준을 충족합니다 두 번째 속도 초당 3 프레임에서 상기 프로세스. 이 현미경 상업적으로 사용할 수 있기 때문에,이 원고의 목표 세부 사항에서 설명 하는 이미지 수집, 등록, 및 시각화 SD TIRF 현미경과 관련 된 오픈 소스 도구와 프로토콜을 제공입니다.
설치는 독립 포트를 통해 두 검색 단위에 연결 된 거꾸로 한 현미경 기반-왼쪽된 포트 TIRF와 사진-정품 인증/표백 SD 장치 및 스캐너 장치를 후면 포트에 연결 되어 실험. 최대 6 레이저 (405/445/488/515/561/640 nm) 여기에 사용할 수 있습니다. 여기 및 형광 신호, 어느 100 x의 탐지 / NA1.45 기름이 나 60 x / NA1.49 오일 TIRF 목표, 각각, 고용 되어 있다. 내보낸된 빛 dichroic 거울 (561 nm 긴 통과 또는 514 nm 긴 패스)에 의해 분할과 다양 한 대역 통과 필터에 의해 필터링 (55 nm 넓은 중심으로 525 nm, 54 nm 넓은 가운데 609에 녹색과 적색 형광에 대 한 nm 각각) 두 EM-CCD 카메라 앞 시대입니다. Zobiak 외 에 설치에 대 한 더 많은 기술적인 세부 사항 나열 된 note 하시기 바랍니다 7. TIRF 구성에서 SD 단위 0.5 경 내에서 가벼운 경로에서 이동 s 검색 동일한 두 카메라를 사용할 수 있도록 1 년경에 비해 두 이미징 형식 사이의 빠른 전환 수 있도록 과거에 보고 된 s13 < /c2 >. 이 기능을 통해 듀얼-채널 동시 수집, 따라서 4 채널 SD TIRF 이미징 이전에 최고 속도 및 정확성을 수행할 수 있습니다. 또한, SD 및 TIRF 이미지 사이의 정렬 필요 하지 않습니다. 하지만 두 카메라 사이의 이미지 정렬, 실험을 시작 하기 전에 확인 하 고 필요한 경우 수정 있다. 다음 프로토콜에서 등록 수정 루틴 자체 서 면된 ImageJ 매크로에 구현 되었습니다. 또한, 매크로 주로 SD-및 그들의 다른 차원에도 불구 하 고 데이터 집합 TIRF의 동시 시각화 수 있도록 설계 되었습니다. 수집 소프트웨어 자체는 이러한 기능을 제공 하지 않았다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1입니다. 셀의 준비
- 실험에 앞서 2 일 씨 2 ml 당 6-잘 세포 배양 접시의 가득 차 있는 성장 매체의 3 * 105 헬러 또는 NIH3T3 세포. 셀이이 프로토콜을 통해 층 류 두건에 처리 됩니다 확인 하십시오.
- 실험 전에 언젠가 경험적으로 결정된 프로토콜 예:또는 제조업체의 권장 사항을 transfection 시 약 준비:
- RFP Lifeact의 1 µ g을 희석 하 고 1 µ g YFP Vinculin의 200 µ L의 총에서 감소 혈 청 매체. 소용돌이 transfection 시 간단히, 추가 4 µ L 200 µ L DNA와 소용돌이를 다시 합니다. 실 온에서 15-20 분 transfection 믹스를 품 어.
- 셀에 직접 dropwise 전체 transfection 믹스를 추가 합니다. 접시를 흔들어 혼합 하 고 다시는 인큐베이터에 배치.
- 실험 당일, 라이브 영상에 대 한 샘플을 준비:
- Fibronectin 코트 35 m m 유리 하단 접시의 유리 표면에 PBS에의 10 µ g/mL 솔루션을 준비 합니다. TIRF 성능 최적화를 위해 고품질 0.17 m m 유리 coverslips만을 사용 하 고 플라스틱 하단 요리를 피하십시오. 실 온에서 30 분은 다음 그것을 제거 하 고 하자 접시 건조 솔루션 유리 표면에 둡니다.
- 증류수에 mL 당 109 입자 x 1.8 밀도 0.1 µ m 다중 형광 구슬 솔루션을 희석 하 고 fibronectin 코팅 유리 표면에 30-60 s에 대 한 솔루션을 추가 합니다. 즉시 솔루션을 제거 하 고 건조 하는 게 요리.
참고:이 단계는 세포를 뿌리기 전에 또는 비드 기반 이미지 등록 2 색 참조 이미지를 얻으려고 TIRF 비행기를 찾을 수 있어야 하는 경우에 필요. - 0.1 m M ascorbic 산 (AA) 솔루션을 준비 하 고 성장 매체 (금주 모임-매체)에 0.1 m m의 최종 농도에 희석. 37 ° C 물 욕조에 솔루션 장소.
참고: 사용 하 여 형광 최적화 된 세포 배양 가능 하면 같은 phenolred-무료 (ribo-) 플 라빈 감소 매체. AA는 안티 산화 에이전트 라이브 이미징14동안 phototoxic 효과 줄일 수 있습니다. 우리는이 분석 결과, 즉 더 많은 세포 보다 AA 추가 없이 적용 하는 조건 하에서 건강 한 등장에 그것을 성공적으로 테스트 했습니다. 그러나, 매체의 pH 0.17 pH 단위에 의해 낮아졌다. - 2 mL PBS로 세포 세척, 추가 250 µ L 트립 신-EDTA와 대기 셀 때까지 완전히 분리 (37 ° C 배양 기에서 2-3 분). Resuspend 셀 1 mL에 신중 하 게 미리는 피 펫과 AA-매체를 예 열 하 고 15 mL 셀 문화 관에서 4 mL AA 매체에 추가. 현미경 주변 37 ° C, 5% CO2 로 설정 하는 인큐베이터에 약간 열린된 뚜껑으로 세포 현 탁 액을 넣습니다.
- 1 mL 중 유리 하단 접시에 AA-매체를 예 열 하 고 미리가 열된 현미경의 소유자에 추가 (다음 단락 참조).
2. 라이브 영상
- 안정적인 37 ° C, 5% CO2 와 습 한 분위기를 달성 하기 위해 현미경의 환경 제어를 시작 합니다.
참고: 여기, 작은 무대 최고의 보육 실 사용 되었습니다 약 15 분 더 큰 부 화기 내의 허용된 안정적인 설정을 안정 조건 달성 하기 위해 더 많은 시간이 필요 합니다. - 셀 서 스 펜 션 적용 되기 전에 모든 수집 설정을 현미경에서 수정:
- 30 시간 간격 설정 s 및 60-90 분에 기간 하드웨어 기반 자동-초점의 모든 시간 포인트 (값 "1")에 대 한 자동 초점 기능을 활성화.
- 카메라 노출 및 이득, 뿐만 아니라 모든 채널에 대 한 레이저 파워를 조정 합니다. 수준 높은 이득, 낮은 노출 시간 및 낮은 레이저 힘은 사진 독성을 줄이기 위해 추천.
참고: 여기에 제시 된 데이터는 200 ms 노출 인수 되었다, 레벨 500 20% 레이저 전력 0.5 W/² 488 대의 여기 농도 같게 하 이득 및 561 대 1 W/² nm, 각각. - 0.4 µ m 간격을 가진 10 µ m z-스택 회전 디스크 채널에 대 한 설정 합니다. -Z-스택 TIRF 채널에 대 한 활성화 합니다. "0", 즉 낮은 비행기로 맨 아래 오프셋 설정의 하드웨어 자동 초점 초점 위치 될 것입니다.
- 멀티 포인트 기능 "무대 위치"를 활성화 합니다.
참고: 3 순위까지 기록할 수 있습니다 30 s 시간 간격.
- 눈에서 또는 컴퓨터 화면에 피 형광 조명 형광 구슬 찾기 다음 하나의 TIRF 채널을 활성화 하 고 TIRF 조명을 나타내는 값으로 조명 각도 설정. 현미경 패널에 버튼을 누르면 자동 초점을 활성화 하 고 오프셋 휠 초점을 조정 합니다. 2 색 데이터 집합, 즉 TIRF-488 및 취득 TIRF-561, 후속 구슬 기반 이미지 등록 (참조 3.1 포인트).
- 선택 사항: TIRF 조명, 추가 자유롭게 떠 있는 형광 색 구슬 서 스 펜 션의 몇 가지 microliters (참조 포인트 1.3.2.). TIRF 채널의 라이브 뷰를 활성화 하 고 조명 각도 증가. 비 점착 구슬 올바른 TIRF 조명8를 보장 하는 중요 한 각도 넘어 사라질 것 이다.
- 다시 반전 닫힌된 튜브, 2-3 시간 여 세포 현 탁 액을 혼합 하 고 이미징 접시에 셀의 1 mL를 적용.
- 신속 하 게 낮은 수준의 피 형광 조명 더블 페 셀을 찾을. 밝은 분야 조명을 사용 하 여 라이브 카메라 미리 보기에 있는 셀을 중심 하 고 위치를 표시 합니다. 관심의 또 다른 1 2 포인트를 찾아서 위치 목록에 저장.
참고: 처음부터, 셀 쉽게 수 분리 단계 운동으로 인해, 따라서 4-5 위치를 설정 하 고 모든 이미지 수집을 시작 하기 전에 다시 확인. 그 후, 1-2 위치를 삭제 합니다. - "순서" 단추를 클릭 하 여 데이터 수집을 시작 합니다.
3. 이미지 후 처리 ImageJ에
- 피지15등록 무료 hyperstack를 생성 하려면 "SD-TIRF_helper" 라는 매크로 2-4 채널 SD TIRF timelapse 데이터 집합에 적용할 수 있는 작성 되었습니다. 하위 폴더 "매크로"는 피지에서 "SD-TIRF_helper_JoVE.ijm" 파일을 저장 하 고 메뉴 명령을 클릭 하 여 매크로 실행 "플러그인 > 매크로 > 실행...".
- 색상 채널 등록 수정 필요, 옵션을 선택 하 고 새로운 비드 기반 등록 기준 (랜드마크 파일) 만들거나 하기 전에 만든 기존 파일을 사용 하 여.
참고: turboreg 플러그인16 형광 구슬 참조 이미지에 적용 됩니다. 플러그인 설치에 대 한 일반적인 지침에 따르면 피지 소프트웨어에 플러그인을 설치 합니다. - 바이오-형식 가져오기 도구를 사용 하 여 데이터를 가져올 하 고 보기 옵션으로 hyperstack를 선택 합니다. 이미지 데이터 집합 로드, 첫 번째 단계와 두 번째 단계에서 TIRF 시리즈에서 SD 시리즈를 선택 합니다. 피지는 채널 및 무대 위치, 즉, 일반적으로 모든 SD 채널 및 모든 TIRF-채널 선정 되었습니다 모든 단계 위치에 대 한 hyperstack로 표시 하 여 정렬 하는 데이터를 표시 합니다.
참고: 데이터 가져오기는 다양 한 파일 형식에서 가능한 예를 들어 TIFF-시리즈 또는 플랫폼 종속 파일과 같은 형식이 *.nd. 파일 형식은 하지 수집 소프트웨어 독립, 압축 없는 TIFF 형식으로 내보낼 경우에 인정 될 수 없습니다. - 미리 정해진된 랜드마크 파일을 로드 하 여 해당 채널을 등록 수정을 적용 됩니다.
- SD-그리고 TIRF 모든 채널에 대 한 원하는 색상 룩 업 테이블 (LUT)을 선택 하 고 단일, 다차원 hyperstack에 그들을 병합.
참고: TIRF 채널의 처리, 중 수 0 강도 값과 z-비행기 z-비행기 SD 데이터 집합의 수와 일치 하는 플레인 위에 추가 됩니다. 이 단계는 최종 hyperstack의 시각화에 대 한 중요 한. 이 방법론은 TIRF 조명의 깊이부터 올바른, (200nm7미만) SD 스택 z 단계 크기 보다 작습니다 (400 nm).
- 색상 채널 등록 수정 필요, 옵션을 선택 하 고 새로운 비드 기반 등록 기준 (랜드마크 파일) 만들거나 하기 전에 만든 기존 파일을 사용 하 여.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
분석 결과 개발 되었다 SD TIRF 이미징의 잠재력을 보여 spatio 시간적 조직 세포 접착 동안 골격와의 상호 작용 및 세포-매트릭스 접착 단지 계시 해야 한다. 따라서, 점착 헬러 또는, 양자 택일로, NIH3T3 세포 YFP Vinculin와 RFP Lifeact 18-24 h에 대 한 페 했다 trypsinized 그리고 fibronectin 코팅 유리 하단 요리에 시드. 이러한 셀 라인 선정 됐다 그들의 발음된 골격 및 높은 견고성에 대 한 라이브 이미징 실험 반대, 예를 들어 1 차 셀. 그는 그들은 트립 신 치료 후 매우 민감한 상태에서 이미징 저항할 수 있습니다. 현미경, YFP/RFP 표현 셀 선정 됐다 고 접착 과정 관찰 60 분 동안 시간 경과 (그림 2 및 영화 1, 2). 이 특정 분석 결과 거의 하지 명확 하 게 설명 문학17,18에. 또한, 접착 대형 주로 예를 들어 셀19,20마이그레이션에 조사 되었습니다. 따라서, 우리는 적응이 방법론 (셀 라인, 코팅, 매체, 구성)이이 문서에서 설명 하는 실험을 수행 하기 위해 필요 합니다.
예상 대로 셀 했다 라운드 모양의 시작과 약하게 부착, 반면 막 돌출을 환경을 감지 하는 기판에 접촉. 세포-매트릭스 연락처 소위 초기 유착20,21 (그림 2A, TIRF-488 채널, 시간 포인트 0-4.5 분)의 형성에 따라 신속 하 게 강화. 후자는 셀의 복 부 측에 자리, Vinculin-양성 구조입니다. 구조는 TIRF 이미지에 명확 하 게 보였다. 접착 대형의 시작에 걸 셀에 균등 하 게 배포 되었다 고이 초기 단지 (그림 2A, SD-561 채널)을 지역화 하지 않았다. 시간의 과정 동안 접착 단지 확대 하 고 초점 유착 (그림 2C)을 성숙. 이러한 길쭉한 구조 (그림 2A + B) 셀의 주변에서 주로 명백한 고 acto myosin 섬유에 의해 발휘 된 힘에서 유래 했다. 이러한 섬유 접착 단지, 그로 인하여 셀 중심 쪽으로 당기 고 유도 하는 세포-매트릭스 유착으로 말라 섬유21의 번들의 강화에 연결 하기 시작 했다. 분명히, 셀도 말라 네트워크 형성 (그림 2A, XZ 보기) 결과로 병합 됩니다. 높은 감도, 공간 해상도 완전 한 관점에서이 과정을 시각화 허용 SD 영상 여기, 선택의 방법으로 커피. 이전 보고서17, TIRF 혼자 수만 하자 주변 유착의 기원에 대 한 추측 반면 SD TIRF 이미징 명확 하 게 밝혀 filopodia (그림 2B, 시간 포인트 17 분, 흰색 화살표)와 연결. 실제로, centripetally 초점 접착에서 신흥 걸 섬유 (그림 2B, 노란색 화살표) 27 분 후 보이게 되었다.
그러나, 이러한 실험, 즉 수집 속도, 자극 강도 및 검출기 이득 수집 설정을 신중 하 게 평가 될 필요가 있다. 30 s/timepoint, 활성화 멀티 포인트 수집 간격 여기 레이저의 방사선 강도 동안 이상적인 것 같다 (0.5-1 사이 W/c m ²)을 중요 한 고려 필요. 그림 2D 기판에 연결 하지 못했습니다 같은 실험에서 다른 위치에 셀을 표시 합니다. Phototoxic 효과 막 60 분, 아마 apoptosis (영화 2)를 닮은 경 후 버블링 결과 마침내 여기, 세포의 생물학을 영향을 수 있습니다. 이 다시 얼마나 민감한 세포를 취소 했다 phototoxicity 반응 수 고 그것이 빛의 양 사이 좋은 균형에 넣어 찾기 및 반출 되 고 정보에 중요 하다. 레이저 전력 감소, z-스택 또는 이득을 증가에 이미지의 번호 phototoxicity를 줄이기 위한 올바른 전략을 수 있습니다. 그러나 이러한 모든 설정, 조정 되어야 한다 충분 한 해상도 및 신호 대 잡음 비율, 달성 허용 수준에서 기록 된 시간 경과에서 정량적 정보를 추출 하는 사용 하도록 설정.
그림 1: 도식 SD TIRF 설치의 그림. A. SD 영상 모드: 6 다른 레이저 라인 (405/445/488/515/561/640nm, 녹색 라인) 공초점 레이저 스캐닝 단위 (CSU), SD (위치 '에')와 현미경 몸 (MIC)에서 빈 필터 큐브 통과로 결합 된다. (사양) 견본에서 형광 방출 SD 및 분할의 핀 홀을 통해 다른 dichroic 거울, 예를 들어 두 개의 다른 EM-CCD 카메라 (C1 및 C2)에 녹색/빨간색 또는 노란색/청록색 동시 취득에 의해 예상 된다. 형광 필터 (표시 되지 않음) 카메라 앞에 배치 됩니다. B. TIRF 이미징 모드: 레이저 라인 TIRF 스캐너 (TIRF)로 결합 된다. 마이크에 다 선 빔 스플리터는 견본을 빔 지시 고 빛 방출 무시 최대화 전송 위한 SD ('밖 으로'). 형광 같은 카메라에서 감지 되 고 방출 필터에서 설명된 1. 이 그림은 Zobiak 외에서 수정 되었습니다. 7 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: SD TIRF 현미경을 사용 하 여 세포 확산 및 접착 대형의 대표적인 결과. A. 더블 페 헬러 셀 RFP-Lifeact (빨강, SD-561 채널) 및 YFP-Vinculin (녹색, TIRF-488 채널) 표현 했다 trypsinized에 다시 시드 fibronectin 코팅 유리 coverslips. 접착 형성 쉽게 표시 하 고, 5 분 경 후 더 큰 초점 유착으로 개발 하는 0 분에서 작은 초기 유착 (Vinculin-긍정적인 명소)로 시작 됩니다. 대뇌 피 질의 걸 10 분 경 후 분명 하 고 (프레임 12 및 24.5 분 참조) 하는 셀의 주변에 확장 합니다. B. 45 분 (프레임)에 박스형 영역의 확대 보기 묘사 세포 확산 및 초점을 초기 유착으로 filopodia 관련 된 유착 (흰색 화살표) 및 긴장 섬유 대형 (27 분, 프레임 참조에서 전환 노란색 화살표)입니다. A. D. 에 그려진 노란 점선의 C. Kymograph (사진-) 셀 또는 그렇지 않으면 건강에 해로운 세포에 독성 효과 기판에 연결에 실패 그들을 알릴 수 있습니다. 이미징 조건 phototoxicity을 제외 하려면 비판적으로 평가 될 수 있다. 눈금 막대 5 µ m = (a에서와 D)와 (B와 C)에 2 µ m. A와 D는 거기에 그려진 흰색 파선에서 추출한 직교 투영 XZ 조회 (하단 기판 =). 이미지는 선형 대비 강화 및 3 x 3 커널을 중간값 필터링 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
영화 1: 그림 2A에서 timelapse 시퀀스의 3 차원 재구성. 이미지 시퀀스는 이미징 소프트웨어 3d 렌더링 되었습니다. 지속 시간: 42.5 분 수집 속도: 분당 (총에서 56 프레임) 2 듀얼 채널 SD TIRF 스택 인수 했다. 이 비디오를 보려면 여기 클릭 하십시오 (다운로드 오른쪽 클릭.)
영화 2: 그림 2 C. timelapse 시퀀스의 영화 소요 시간: 60 분 수집 속도: 분당 (총에서 56 프레임) 2 듀얼 채널 SD TIRF 스택 인수 했다. 이 비디오를 보려면 여기 클릭 하십시오 (다운로드 오른쪽 클릭.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
이 문서에서 라이브 셀 이미징 실험, 즉 높은 수집 속도 3 다른 단계에 분당 2 SD TIRF 이미지 스택 등을 수행 하기 위한 적절 한 구성에서 SD 및 TIRF 현미경의 첫번째 성공적인 구현을 제시 했다 위치, 해당 총 168 프레임 (약 3 프레임 / 초), 하 인수 했다. 했다 몇 SD TIRF 현미경12,13, 주로는 3D에서 세포 프로세스에 따라 충분히 높은 이미징 속도의 부족을 설명한 미만 2의 시간적 해상도 이미지 스택 당 s는 경우가 많습니다. 제시 설치 이미징 최고 초당 0.78 이미지 스택 3.5의 얻을 수 있습니다 3D 기 역학 조사 되었습니다 라이브 실험에 큰 이미지 스택 당 s7을 시연 했다. 또한, 이전 SD TIRF 현미경 이미징 모드, 다중 채널 인수에 대 한 속도 더 줄여 당 하나의 감지기를 했다. 기술적으로, 분할 보기 구성을 구현할 수 있는 시스템에는 또한 허용 한다 동시 듀얼 컬러 취득을 단일 카메라와 함께. 그러나 이것,, 보기의 필드의 절반 밖에의 이미징을 허용 것 이라고 합니다. Widefield 이미징 deconvolution 또는 3D 슈퍼 해상도 현미경, 함께 같은 높은 spatio 시간적 해상도 다차원 데이터 집합을 생성 하는 다른 방법 즉, 3D 시뮬레이션 또는 격자 빛 시트 현미경22, 23을 유효한 대안이 될 수도 있습니다. 그러나, deconvolution 기반 이미징 쉽게 낮은 신호 대 잡음 비율 인수에 이미지 아티팩트를 소개 (그것은 종종 동안 경우 라이브 이미징 응용 프로그램), 3D 라이브 영상 최고 해결책은 아직도 기술적으로 길게 하 고 어려운 작업입니다. 고급 SD TIRF 설치7제시 실현에서 장점은 검색 경로 및 듀얼 디스크를 이동 있도록 SD 단위의 찍은. 이 구성은 두 가지 주요 이점을 제공 합니다: 먼저, 동일한 두 개의 카메라가 SD 및 TIRF 신호,이 두 채널의 높은 정밀 오버랩에서 어떤 결과 감지 하 사용할 수 있습니다. 둘째, 회전 디스크의 핀 홀 차단 하지 않습니다 어떤의 방출 빛 TIRF 획득 모드에서 작동할 때 (자세한 내용은 그림 1B를 참조), 따라서 높은-민감한 라이브 이미징에 대 한 중요 한 수집 효율성을 증가. 따라서,이 광학 구성은 기존 SD-SD 장치를 우회 하는 허용 하는 현미경에 TIRF 현미경 검사 법 (예: 변수 또는 고정 각도 조명)의 어떤 종류를 구현 하기 위한 유리한입니다. 또한, 사용된 TIRF 스캐너에서에서 실행할 수 있습니다 소위 시분할 모드, 어디 두 TIRF 채널 동시에 기록 될 수 있다 (Zobiak 외에서처럼. 7), 과속 추가 멀티 채널 데이터 수집까지.
TIRF 고용의 가장 큰 장점 중 하나입니다,이 방법론 실험 이미징 라이프 셀 동안 세포 막에서 나오는 신호를 높은 정밀도로 지역화 가능. 실제로, SIM는 더 나은 z 구분 하며 따라서 세포 막에서의 더 나은 절연 고정 라이브 셀 이미징 실험에서에서 샘플을 지 수 증가/감소의 접근 하는 세포에서 형광 신호 처럼 방법론 동안 / TIRF 인터페이스를 떠나 더 구체적이 고 정확한 세포 막의 지역화를 허용. 지역화 정밀 하지 비록 여전히 계량, 많은 주름 150-200 nm 보다 작은 수를 약속 즉 소실 필드의 공간 범위.
현재 메서드의 제한 빛에서 회전 디스크 장치를 제거 하 고 TIRF 수집, 즉 0.5 s 시작 하는 데 필요한 시간입니다. 이 지연 2 연속 인수 간의 최소 시간 간격을 제한합니다. 기술적으로, 그것을 줄이기 위해 예 galvo 거울으로 디스크를 우회 하 고 따라서 감소 하는 SD TIRF 주기 당 전체 수집을 통해이 지연 가능 해야 합니다. 또한, 새로운 세대 카메라 높은 신호 대 잡음 비율에서 감소 된 노출 시간을 허용 수 있습니다. 따라서,이 설치 프로그램의 전체 성능은 여전히 relevantly 하드웨어 구성 요소를 업그레이드 하 여 개선할 수 있습니다. 그러나 이미지의 관점에서, 있다 수집 시간 (내림차순)을 최소화 하기 위해 여러 가지 다른 방법으로: 피하 여러 위치, z-스택 높이 줄일, z 간격 증가, (증가 이득 및 가능 하 게를 사용 하 여 노출 시간을 최소화 수집 위치 사이의 거리를 단축, 자동 초점을 활성화 binning), 모든 n 번째 시간 포인트 (n > 1). 실제 제한에도 불구 하 고 이러한 모든 매개 변수는 신중 하 게 평가 하는 경우 그것은 SD TIRF Zobiak 외 에 제시 된으로 추적 하 고 빨리 이동 하는 세포질 소포, 지역화에 대 한 이미지를 사용 하 여 7.
또한,이 종이 인수를 설명 하는 프로토콜에 단일 채널 SD TIRF dataset의 루틴은 제시 했다. 제공 된 매크로 사용 하 여 원시 데이터는 모든 SD-및 TIRF 채널을 포함 하는 단일 TIFF 파일에 내보낼 수 있습니다. 이미지 등록은 se 당 필요 하지 않습니다; 그러나, 그것은 중요 한 두 카메라 서로 관하여 정확 하 게 정렬 됩니다. 나머지 픽셀 교대 (변환 및 회전) 수 감지 되며 제공 된 매크로 내에서 수정. 보정 알고리즘 그냥 실험을 시작 하기 전에 기록 하는 형광 구슬의 다중 채널 참조 이미지를 사용. 결과 파일에 TIRF 비행기는 일치 하는 SD 채널의 차원 0 강도 비행기의 수에 따라 최저 수준에서 설정 됩니다. 따라서, 그것은 데이터를 취득 하는 것이 중요, 프로토콜에 명시 된 대로 군데 TIRF 비행기 z-스택 SD 채널에 대 한 설정의 하단을 닮았다.
마지막으로 시스템 수 잠재적으로 확장할 SIM 모듈 또는 최근에 소개 된 다 각 TIRFM24,25 증가에 의해 공간적 해상도. 그러나, 공간 해상도의 증가 얻을 수 있습니다는 현재 첨단, 느린 이미징 속도 비용만 따라. 모든 라이브 셀 이미징에 그것은 나머지 세포 볼륨의 높은 공간 해상도 유지 이기는 하지만 플라즈마 막에서 구조를 지역화 하는 중요 한 실험, 여기 설명된 SD TIRF 설치는 쉽게 통합, 쉽게 사용할 수 솔루션입니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
우리는 크게 과학계를의 대학 의료 센터 함부르크-Eppendorf 샘플을 평가 대 한 우리를 지원 하기 위한 감사 합니다. 즉, 우리 사 빈 Windhorst NIH3T3 세포, YFP-Vinculin에 대 한 안드레아 Mordhorst와 RFP Lifeact에 대 한 마 렌 루돌프에 대 한 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope and accessories | |||
| SD-TIRF microscope | Visitron Systems | ||
| Ti with perfect focus system | Nikon | Inverted microscope stand | |
| CSU-W1 T2 | Yokogawa | Spinning disk unit in dual-camera configuration | |
| iLAS2 | Roper Scientific | TIRF/FRAP scanner | |
| Evolve | Photometrix | EM-CCD cameras | |
| PiezoZ stage | Ludl Electronic Products | Motorized Z stage | |
| Bioprecision2 XY stage | Ludl Electronic Products | Motorized XY stage | |
| Stage top incubation chamber | Okolab | Bold Line | Temperature, CO2 and humidity supply |
| Cell culture | |||
| HeLa cervical cancer cells | DSMZ | ACC-57 | |
| NIH3T3 fibroblasts | DSMZ | ACC-59 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 14190144 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Gibco | 25300054 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium + GlutaMAX-I (DMEM) | Gibco | 31966-021 | |
| OptiMEM | Gibco | 31985070 | Reduced serum medium |
| Fetal calf serum (FCS) | Gibco | 10500064 | |
| Penicillin/Streptomycin (PenStrep) | Gibco | 15140148 | |
| Full growth medium (DMEM supplemented with 10% FCS and 1% PenStrep) | |||
| TurboFect | ThermoFisher Scientific | R0531 | Transfection reagent |
| Ascorbic acid (AA) | Sigma | A544-25G | |
| 6-well cell culture plate | Sarstedt | 83.392 | |
| Glass bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-10-C | 35mm, 0.17mm glass coverslip |
| Fibronectin, bovine plasma | ThermoFisher Scientific | 33010018 | |
| Neubauer improved chamber | VWR | 631-0696 | |
| TetraSpeck beads | ThermoFisher Scientific | T7279 | |
| Plasmids | |||
| RFP-Lifeact | Maren Rudolph, Institute of Medical Microbiology, University Medical Center Hamburg Eppendorf, Germany | ||
| YFP-Vinculin | Andrea Mordhorst, Institute of Medical Microbiology, University Medical Center Hamburg Eppendorf, Germany | ||
| Software and plugins | |||
| VisiView | Visitron Systems | Version 3 | |
| ImageJ | Version 1.52c | ||
| Turboreg plugin | http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/ | ||
| Macro "SD-TIRF_helper_JoVE.ijm" | this publication | https://github.com/bzobiak/ImageJ | |
| Volocity | PerkinElmer | Version 6.2.2 |
References
- Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Optics Letters. 19 (11), 780 (1994).
- Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), New York, N.Y. 1642-1645 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophysical Journal. 91 (11), 4258-4272 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature methods. 3 (10), 793-796 (2006).
- van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nature protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).
- Zobiak, B., Failla, A. V. Advanced spinning disk-TIRF microscopy for faster imaging of the cell interior and the plasma membrane. Journal of Microscopy. 269 (3), 282-290 (2018).
- Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. Journal of Cell Science. 123 (21), 3621-3628 (2010).
- Burchfield, J. G., Lopez, J. A., Vallotton, P., William, E. Exocytotic vesicle behaviour assessed by total internal reflection fluorescence microscopy. Traffic. 11 (4), 429-439 (2010).
- Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M. Spinning-disk confocal microscopy. present technology and future trends. Methods in Cell Biology. 123, 153-175 (2014).
- Murray, J. M., Appleton, P. L., Swedlow, J. R., Waters, J. C. Evaluating performance in three-dimensional fluorescence microscopy. Journal of Microscopy. 228 (3), 390-405 (2007).
- Trache, A., Lim, S. -M. Integrated microscopy for real-time imaging of mechanotransduction studies in live cells. Journal of Biomedical Optics. 14 (3), 034024 (2009).
- Stehbens, S., Pemble, H., Murrow, L., Wittmann, T. Imaging intracellular protein dynamics by spinning disk confocal microscopy. Methods in Enzymology. , 293-313 (2012).
- Waldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., Van De Linde, S., Sauer, M. Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy. Scientific Reports. 5, 1-12 (2015).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).
- Partridge, M. A. Initiation of attachment and generation of mature focal adhesions by integrin-containing filopodia in cell spreading. Molecular Biology of the Cell. 17 (10), (2006).
- Dubin-Thaler, B. J., Giannone, G., Döbereiner, H. G., Sheetz, M. P. Nanometer analysis of cell spreading on matrix-coated surfaces reveals two distinct cell states and STEPs. Biophysical Journal. 86 (3), 1794-1806 (2004).
- Choi, C. K., Vicente-Manzanares, M., Zareno, J., Whitmore, L. A., Mogilner, A., Horwitz, A. R. Actin and α-actinin orchestrate the assembly and maturation of nascent adhesions in a myosin II motor-independent manner. Nature Cell Biology. 10 (9), 1039-1050 (2008).
- Bachir, A. I., Zareno, J., Moissoglu, K., Plow, E. F., Gratton, E., Horwitz, A. R. Integrin-associated complexes form hierarchically with variable stoichiometry in nascent adhesions. Current Biology. 24 (16), 1845-1853 (2014).
- Sun, Z., Guo, S. S., Fässler, R.
- Shao, L., Kner, P., Rego, E. H., Gustafsson, M. G. L. Super-resolution 3D microscopy of live whole cells using structured illumination. Nat. Methods. 8 (12), 1044-1046 (2011).
- Chen, B. -C., et al. Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346 (6208), 1257998-1257998 (2014).
- Fu, Y., Winter, P. W., Rojas, R., Wang, V., McAuliffe, M., Patterson, G. H. Axial superresolution via multiangle TIRF microscopy with sequential imaging and photobleaching. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (16), 4368-4373 (2016).
- Boulanger, J., et al. Fast high-resolution 3D total internal reflection fluorescence microscopy by incidence angle scanning and azimuthal averaging. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (48), 17164-17169 (2014).
