Summary
该协议描述了在免疫抑制条件下测量继发医院感染的传染性结果的技术,首先通过建立结扎/穿刺小鼠,然后挑战他们与鼻内感染创建一个临床相关的免疫抑制败血症模型。
Abstract
败血症是一种严重而复杂的危及生命的感染,其特征是多个器官的亲炎和抗炎反应之间不平衡。随着疗法的发展,大多数患者在高炎阶段存活,但进展到免疫抑制阶段,这增加了继发性感染的出现。因此,更好地了解脓毒症期间免疫抑制阶段继发性医院获得性感染的发病机制非常重要。这里报道的模型是通过在小鼠中制造双重感染来测试传染性结果。标准外科手术用于通过结扎和穿刺(CLP)诱导多微生物性囊中膜炎,然后对金黄色葡萄球菌进行鼻内感染,以模拟在免疫抑制中发生的肺炎,这是常见的在败血症患者。这种双重模型可以反映长期败血症患者的免疫抑制状态,以及对非典型肺炎继发性感染的易感性。因此,该模型为研究败血症引起的继发性细菌性肺炎的病理生理学提供了一种简单的实验方法,可用于发现脓毒症及其并发症的新疗法。
Introduction
败血症启动宿主亲炎和抗炎过程的复杂相互作用,其特点是高炎反应和随后的免疫功能障碍1,2。败血症是全球卫生优先事项,在重症监护病房(Ioc)中造成大量死亡。据估计,全世界每年脓毒症的发病率超过3000万例,尽管ICU管理取得了进步,但死亡率仍高达30%。2017年,世界卫生组织通过决议,改善这一致命疾病的预防、诊断和管理。然而,最近的研究表明,死亡不是由严重败血症患者的原发性感染引起的,而是由免疫抑制6,7引起的继发性感染(特别是肺炎).因此,迫切需要了解败血症患者为何发展为继发感染的机制,并发现更有效的治疗方法。本文描述了一种双模型,也称为双击模型,用于研究长期败血症患者的免疫抑制现象。
作为多微生物败血症、囊性结扎和穿刺(CLP)研究的黄金标准实验模型,是一种以囊性结扎和穿孔为特征的手术,有助于多微生物性囊炎8、9.病理生理学过程和细胞因子轮廓,以及动力学和量级,类似于临床败血症。结扎的位置、用于穿刺的针体尺寸以及尖刺次数是影响 CLP 后死亡率的主要因素。
肺炎是败血症危重病人死亡的主要原因。引起严重败血症的主要生物类型包括金黄色葡萄球菌(20.5%)、伪多米诺类(19.9%)、肠杆菌(主要是大肠杆菌,16.0%)和真菌(19%)。 同时,最近的研究表明,克阳性生物的发病率在增加,现在几乎和克阴性感染3一样常见。
该协议中描述的方法涉及CLP,作为"第一击"来诱导亚致死多微生物性包炎,表现为免疫抑制。该程序还涉及后续的鼻内灌输S.aureus作为"第二击",以提供一个临床相关的研究平台。
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Protocol
此处描述的所有方法均按照国家卫生指南实验室动物护理和使用研究所执行,并经北达科他大学机构动物护理和使用委员会 (IACUC) 批准。
1. 切卡结扎和穿刺
注:雌性C57BL/6小鼠(体重18-22克;年龄6-8周)随机分为六组:对照组(Ctrl)、感染组(SA为S.aureus)、两个假组和两个CLP组。Ctrl动物没有手术和继发感染伤害。SA 动物在未进行手术的情况下受到金黄色肺感染。假手术的动物接受相同的腹腔切除术与叶黄的阐述(除了cecum既不结扎也不刺穿)。每组8只小鼠用于生存分析,3至5只小鼠用于评估不同时间点的炎症。
- 手术前,用高压灭菌器对所有手术器械和材料进行消毒20分钟,用消毒剂擦拭消毒手术台。要在手术期间建立无菌条件,请用适当的无菌手术窗帘覆盖整个手术区域,并戴上护发罩、外科面罩、防护眼镜、手术服和无菌手套。
- 使用0.1 mL/小鼠氯胺酮(80毫克/千克),木化酶(10毫克/千克)混合物在腹内施用,称重和麻醉小鼠。左手的拇指和食指形成U形位置,从后面平稳而轻柔地接近小鼠的脖子,然后紧紧握住耳朵后面的脖子,使鼠标头高度克制。用小号抓住鼠标的右后腿,用中指和无名指(左手所有的手指)握住身体。
- 通过脚趾捏合检查麻醉的强度,直到四肢没有弯曲。
- 使用电动剃须刀剃下腹部的下象限,并用碘对区域进行消毒。
- 将鼠标放在无菌表面上,使头部朝向操作员。用无菌毛巾在计划好的手术切口上用孔将鼠标浸湿,以保持无菌场。
- 用左下腹部的手术刀进行纵向皮肤切口(约0.5厘米长)。使用小剪刀延长切口(1-2 厘米)。
注意:小心不要穿透围肠腔。 - 进行肌肉内切口,进入腹腔,并允许与相邻的肠道接触cecum。
- 分离腹部左侧的 ( 在大多数情况下 , 这是通过使用钝解剖钳子完成的 ) , 并将其去除无菌窗帘 , 将小肠和大肠留在腹腔中。
注意:避免损害血管。 - 在远端25%的位置将黄异类分明,以产生死亡率相对较低的长期感染。
注意:确保不要将气管阀压合。 - 在血管化区域,在结扎和切质尖之间的中间穿插21G 1 1/2针,通过单穿过穿刺(两个孔)穿孔。
注意:确保不要刺穿血管。 - 取出针头。从渗透孔中轻轻挤出少量粪便,以确保完全厚度穿孔。
注意:在手术过程中注意不要阻塞肠道连续性。 - 将cecum更换到腹腔中。
- 用4-0尼龙手术缝合线将腹部合上两层。通过应用简单的跑步缝合线关闭腹部肌肉,并通过应用简单的中断缝合关闭皮肤。用碘清洁皮肤。
- 在后皮上注入1 mL的预加热(37°C)0.9%无菌正常盐水(NS)溶液,以取代第三个空间损失,并将其放在温暖的垫子上以恢复。
- 将小鼠送回在温控室(22°C)的笼子里,具有12小时的光/暗循环,并免费获得食物和水。每0.5小时监测小鼠至少2小时,然后每6小时监测至少2d,然后每12小时监测3天,或在死地时将其安乐死,以便进行生存分析。
注:术前和术后性失命(蛋白诺啡,每12小时50微克/千克)建议在手术前24小时,直到手术后48小时,9,10。
2.感染S.金尿道的继发性肺部感染
注:除Ctrl和SA组外,在假中和中CLP组中,在CLP后3天存活的小鼠应分别在30μL的细菌悬浮液或NS中施用。SA组中幸存的小鼠应通过细菌悬浮液进行内生培养。
- 通过注射100μL的氯胺酮(45mg/kg)和木拉津(10毫克/千克)溶液麻醉小鼠,并等待小鼠缓慢呼吸。对于慢速注射,针和腹壁之间的穿孔角度小于 30°。
- 在微移液器的帮助下,缓慢和内在地向S.aureus的30μL 1 x 107菌落形成单元(CFU)中吸入吸气。将鼠标的耳放在直立位置,每次缓慢地将 2-3 μL 的细菌悬浮液滴入两个鼻孔。调整释放速率,使鼠标吸气时不形成气泡和脱落。
- 向上和向下抬起鼠标,其头向上和向下,以帮助细菌进入气管。快速而有力地向上移动鼠标,同时轻轻地缓慢地向下移动,以增加重力。重复灌输约15倍,直到所有细菌被吸入,这应该需要10-15分钟每只小鼠。
- 将鼠标放在其背上,头向上放在倾斜的床上用品上(约 35°),观察鼠标,直到其呼吸恢复正常,并且从麻醉和手术中完全恢复。
- 将鼠标放回笼子里,放在温度控制室 (22 °C) 中,具有 12 小时的光/暗循环,并无限制地获取食物和水。
- 第一天每2小时检查一次小鼠状况,手术后4天每12小时检查一次小鼠状况。在垂死期时,在存活期进行生存分析时或感染后24小时对炎症进行评估时,将其安乐死。
3. 分析参数
- 老鼠生存
- 监测小鼠7天。安乐死时,死气沉沉,并产生生存曲线使用卡普兰-迈尔方法11。
- 细菌计数
- SA注射后24小时,从小鼠中收获血液、支气管洗漱液(BALF)和围肠洗浴液(PLF)。随后,将100μL的稀释剂加入营养琼脂板,并在37°C培养它们24小时,以确定细菌菌群计数11,12,13。
- 细胞 因子
注:应根据制造商的说明使用ELISA试剂盒评估小鼠血清和BALF中I-1、IL-6和TNF®的亲炎细胞因子浓度。- 在 96 孔 ELISA 板上涂上 100 μL/孔的不同捕获抗体工作溶液,以运行重复和样品中的三重标准。密封板,并将其放在 4°C 下过夜。
- 使用 255 μL/孔洗涤缓冲液(1x PBS,0.05% 补间-20)清洗板三次。
- 要阻止非特异性结合,添加200μL/井稀释剂。密封板并在室温 (RT) 下孵育 1 小时。
- 准备标准溶液:从1000皮克/mL起进行8次双倍连续稀释。
- 将100 μL/井的标准或样品添加到相应的井中,向空白井添加100 μL/稀释剂。密封板并在 RT 下孵育 2 小时或在 4°C 下孵育 2 小时或过夜。
- 用 255 μL/孔洗涤缓冲液将板 5 倍洗涤。
- 将100μL/井的不同检测抗体工作溶液加入适当的井。密封板并在 RT 下孵育 1 小时。
- 用 255 μL/孔洗涤缓冲液将板 5 倍洗涤。
- 在所有井中加入100 μL/井稀释的HRP溶液。密封板并在 RT 下孵育 30 分钟。
- 用 255 μL/孔洗涤缓冲液将板 5 倍洗涤。
- 添加 100 μL/油井稀释的 TMB 溶液。在 RT 下孵育板远离光线 15 分钟。
- 加入50μL/油井停止溶液(1 M H3PO4)。带板式读卡器,在 450 nm 处读取吸光度。
- 流动细胞仪
- 从 BALF 获取单元格总数。使用 ACK 解毒缓冲液对红细胞进行解毒,并使用 PBS 洗涤 2 倍。
- 然后分析单细胞悬浮液,按流式细胞测定法,如前面描述11。对于表面染色,染色嗜中性粒细胞 (CD11b_GR-1+) 与 APC 抗小鼠 CD11b 和抗小鼠 Gr-1 (Ly-6G/Ly-6C) 抗体。收集至少 3 x 104活的、非碎屑的电池进行分析。
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Representative Results
根据实验设计和程序,C57BL/6小鼠接受中电,3天后,它们被施用细菌(图1)。如图2所示,小鼠在诱发性月炎后,在+12小时后开始死亡。CLP+SA组的两只小鼠和中电组三只小鼠在鼻内S.金尿体灌输前死亡。未感染非感染或假手术小鼠未发现死亡。因此,当小鼠在肺炎前有中电,死亡率要高得多(p < 0.05)。在鼻内细菌挑战(1 x 107 CFU)后,8只小鼠中有3只在SA组和Sham_SA组存活,8只小鼠中有4只在CLP+NS组存活。然而,所有八只老鼠都死于CLP+SA组。相反,Ctrl组和Sham_NS组中的每只鼠标都存活了下来。CLP小鼠在随后受到S.aureus的挑战时,其死亡率较高。中电后金黄色葡萄球菌死亡率(100%)高于感染者(37.5%)或假操作后的 S. aureus (37.5%; p < 0.05)。
如图3所示,在后CLP动物身上观察到严重的坏死,但双击组(CLP+SA)则更是如此。然而,控制中的cecum没有大的变化,也没有一次性与细菌组发生。血液、BALF和PLF被培养,以评估感染S.aureus的小鼠在CLP后3天的肺细菌清除。与假小鼠相比,这种高致死性与中电小鼠血液中的S.aureus CFU显著增加有关(p<0.05;图 4A,C.中CLP_SA小鼠血液中的S.aureus CFU数量和BALF明显大于CLP_NS小鼠(p<0.01;图 4A,B。
对于亲炎细胞因子,结果显示,与单独接受CLP或假手术的小鼠相比,血清IL-1+、IL-6和TNF®在细菌注入脓毒症存活小鼠后24小时,表达水平显著增加小鼠挑战与S.金黄色葡萄球菌 (图5A).然而,在有二次感染的化粪池小鼠的BALF中,亲炎细胞因子略有增加,与对照感染小鼠(SA小鼠)和Sham_SA不同。同时,与SA和Sham_SA小鼠相比,双击小鼠在BALF IL-1+、IL-6和TNF+水平中表现出显著下降的水平(p <0.001;图 5B.
如图6所示,小鼠在感染后24小时被牺牲,通过流动细胞测定检测出BALF中相对中性粒细胞百分比。与仅患S.金尿肺炎的小鼠相比,双击小鼠在BALF中表现出的中性粒细胞显著减少。总体而言,这些数据表明,中电损害宿主免疫反应,导致对继发性细菌性肺炎的易感性增加。
图 1:实验设计。老鼠被随机分成六组。两组在D0进行了结扎和穿刺(CLP),其他组是假操作或未操作。手术后三天(D3),S.aureus [SA, 1 x 107菌落形成单元 (CFU)] 或正常盐水 (NS) 在内施用。 对照组(Ctrl)小鼠没有内向灌输。血液、支气管洗漱液 (BALF) 和围肠洗漱液 (PLF) 在 SA 注射后收获 24 小时,用于细菌计数测定。在7天内观察每组死亡率,进行生存分析。请点击此处查看此图的较大版本。
图 2:鼠标生存。提交CLP或假手术的C57BL/6小鼠在手术后第三天接受S.aureus(SA)或正常盐水(NS)(n = 每组8只小鼠)。对小鼠进行7天的监测,每12小时记录一次死亡率,与沙姆-SA小鼠和SA小鼠相比,卡普兰-迈尔生存曲线、对数级测试(\p<0.05)。"请点击此处查看此图的较大版本。
图 3:鼠标 cecum。继发感染在中电后3天引起。SA感染后24小时,小鼠被牺牲收集结肠组织。显示不同损伤打下的结扎代表性照片。SA = S. aureus;NS = 正常盐水;CLP = 阴层结扎和穿刺。刻度条 = 1 厘米。请点击此处查看此图的较大版本。
图 4:琼脂板的细菌计数和代表性图像。手术后3天,小鼠被内入1 x 107 CFU的S.aureus (SA)(n = 每组3只小鼠)。血液、BALF和PLF在SA注射后24小时被收获,在24小时孵育后确定细菌菌群计数。结果表示为均值 = SEM. 单向方差分析(Tukey 的后位;_p < 0.05;_p < 0.01;#p < 0.001;ns = 不显著)。请点击此处查看此图的较大版本。
图 5:ELISA检测细胞因子分泌。继发感染在中电后3天引起。SA感染后小鼠的IL-1、IL-6和TNF+在血清(A)和BALF(B)中的浓度(n = 每组3只小鼠)。数据以三个实验的平均值 = SEM 形式呈现。单向方差分析(图基的员额;[p < 0.05;\p < 0.01;\p < 0.0001;ns = 不显著)。请点击此处查看此图的较大版本。
图 6:中性粒细胞渗透的代表性频率。在鼻内感染后24小时,小鼠被牺牲以获得BALF(n = 每组3只小鼠)。嗜中性粒细胞的百分比(CD11b+,GR-1=)通过流式细胞测定进行量化,并显示为三个实验的均值 = SEM。单向方差分析(图基的后位;\p < 0.0001;ns = 不显著)。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
作为败血症研究的黄金标准模型,中电具有三种侮辱的组合,包括腹腔切除术造成的组织创伤、因结扎而导致的坏死,以及微生物泄漏导致腹腔炎和易位性腹腔炎引起的感染。细菌进入血液8。因此,CLP 比许多其他模型更能模仿人类败血症的复杂性。然而,目前CLP模式的一个主要限制是不能反映在ICU3、4、5患者中看到的脓毒症的更长期阶段。因此,提出了一种临床相关的双模型(双命中模型),以反映败血症的延迟死亡率,并研究肺继发感染的发病机制。在此协议中,脓毒症是在CLP与S.aureus肺感染结合后3天引起的。在BALF中,双击小鼠的死亡率较高,严重囊肿损伤,血液变弱,BALF细菌清除,低亲炎细胞因子,低中性粒细胞。这导致了严重的败血症,模仿诊所的免疫抑制状态。
以下说明是关键步骤。详细介绍的是如何在相同的条件下产生亚致命性脓毒症。首先,使用雌性小鼠是因为雌性小鼠对CLP的抵抗力比雄性小鼠11强。其次,中电诱导的死亡率取决于几个技术参数,如切牙长度、针根大小和9个刺针的数量。约75%的黄体结扎诱发严重的败血症,60%的黄体结扎诱导中度败血症,结扎25%或更少的黄体结果在轻微败血症9。它选择通过执行温和的CLP(25%,单通穿刺与21G 1 1/2针)来诱导亚致命性败血症11,12来标准化模型。第三,建议流体复苏,以防止因循环崩溃引起的休克和快速死亡,并开发一种超动态动物败血症模型,该模型更密切地模仿人类脓毒症13的血动力剖面。此外,使用镇痛药,如丁丙诺啡,应该从实验和伦理的角度考虑10。
CLP后三天被选择作为时间点,以诱导继发感染,以反映脓毒症的免疫抑制阶段。大多数败血症患者有一个漫长的住院过程,大多数死亡发生在3天以上,许多人然后进入继发医院获得性肺炎,这一贯显示在最近与CLP和P.aeruginosa14.其他实验室先前的研究结果亦显示,在中电后3天,小鼠对继发性灌输细菌有高度敏感性,感染后一天,是过度炎症至免疫抑制的转折点。16.
此外,细菌菌株和灌输的剂量的差异是导致双模型变异的重要因素。菌株和剂量水平的选择基于免疫抑制状态下二次感染实验设计的需要。根据先前的发现,本研究选择了1 x 107 CFU的S.aureus。
为了提高鼻内细菌直接输送到小鼠肺部的效率,应注意注入体积、时间和身体位置。还有其他操作问题可能对实验结果产生巨大影响。这些措施包括保持小鼠直立,每次注入时将多低剂量细菌液体分别注入两个鼻孔,观察液体吸入而不形成气泡,控制吸入速度;快速向上移动鼠标,然后缓慢向下移动,并将鼠标以 45° 角放置以从灌输中恢复。鼻内细菌管理是非侵入性的,有助于防止窒息,增加可及性,提高安全性,并尽量减少手术伤害。
但是,此方法有其局限性。由于这是一个方法学研究,数据尚未讨论临床体征的变化;抗炎细胞因子;以及血液中单核细胞、嗜中性粒细胞和淋巴细胞的数量和功能。实验鼠通常是近亲繁殖的,具有相似的年龄和体重,被安置在特定的无病原体设施中,并且通常没有合并症,如预先存在的免疫抑制。然而,不同的性别、年龄、免疫和营养状况,以及可能的辅助治疗,如患者的抗生素,可能会导致异质的临床结果。考虑到人类患者的异质性,应仔细观察年龄、体重、现有疾病和临床支持性护理等变量。
这种双模型(双击模型)的发展是及时和重要的感染和免疫研究社区,因为它类似于从人类脓毒症的超炎阶段到低炎阶段的进展。它更准确地反映了脓毒症患者继发性肿瘤肺炎的常见临床情景。该模型可能有助于开发新的治疗脓毒症引起的免疫抑制的策略。
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Disclosures
提交人没有财务利益冲突。
Acknowledgments
这项工作得到了国家卫生研究院支持 R01 AI138203-01、AI109317-04、AI101973-01 和 AI097532-01A1 到 M. W.北达科他大学核心设施由NIH赠款(INBRE P20GM103442和COBRE P20GM113123)提供支持。这项工作还得到了国家自然科学基金(81530063)国家重点项目(81530063)对江建新的支持。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有作用。我们感谢马文·莱尔(北达科他大学农村卫生中心)制作了这段视频。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 21 G 1 ½ Needle | BD | BD305167 | |
| ACK lysing buffer | Gibco | A10492-01 | |
| Anti-mouse CD11b antibody | Biolegend | 101201 | |
| Anti-mouse Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) antibody | Biolegend | 108401 | |
| C57BL/6 mice | Harlan (Indianapolis) | C57BL/6NHsd | |
| Desk light | General Supply | General Supply | |
| Disinfecting wipes | Clorox | B07NV5JMCS | |
| Electric razor | General Supply | General Supply | |
| ELISA kits (mouse IL-1β, IL-6 and TNFα) | Invitrogen | 88-7013, 88-7064, and 88-7324 | |
| Iodine | Dynarex | B003U463PY | PVP Iodine Wipes |
| Ketamine | FORT DODGE | NDC 0856-2013-01 | Amine hydrochloride injection |
| Laboratory scale | General Supply | General Supply | |
| LB Agar, Miller | Fisher Scientific | BP1425-500 | Molecular genetics, powder |
| Micropipette | ErgoOne | 7100-1100 | |
| Normal saline | General Supply | General Supply | |
| Polylined towel | CardinalHealth, Convertors | 3520 | Surgical drape, sterile, for single use only |
| Silk suture, 4-0 | DAVIS & GECK | 1123-31 | |
| Small animal needle holder | General Supply | General Supply | |
| Small animal surgery scissors | General Supply | General Supply | |
| Small animal surgical forceps | General Supply | General Supply | |
| Staphylococcus aureus | ATCC | 13301 | |
| Warm pad | General Supply | General Supply | |
| Xylazine | Alfa Aesar | 7361-61-7 |
References
- Singer, M., et al. The Third International Consensus Definitions for Sepsis and Septic Shock (Sepsis-3). JAMA. 315 (8), 801-810 (2016).
- Delano, M. J., Ward, P. A. The immune system's role in sepsis progression, resolution, and long-term outcome. Immunological Reviews. 274 (1), 330-353 (2016).
- Mayr, F. B., Yende, S., Angus, D. C.
- Fleischmann, C., et al. Assessment of Global Incidence and Mortality of Hospital-treated Sepsis. Current Estimates and Limitations. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 193 (3), 259-272 (2016).
- Reinhart, K., et al. Recognizing Sepsis as a Global Health Priority - A WHO Resolution. The New England Journal of Medicine. 377 (5), 414-417 (2017).
- Boomer, J. S., et al. Immunosuppression in patients who die of sepsis and multiple organ failure. JAMA. 306 (23), 2594-2605 (2011).
- Hotchkiss, R. S., Monneret, G., Payen, D. Sepsis-induced immunosuppression: from cellular dysfunctions to immunotherapy. Nature Reviews Immunology. 13 (12), 862-874 (2013).
- Dejager, L., Pinheiro, I., Dejonckheere, E., Libert, C. Cecal ligation and puncture: the gold standard model for polymicrobial sepsis? Trends in Microbiology. 19 (4), 198-208 (2011).
- Rittirsch, D., Huber-Lang, M. S., Flierl, M. A., Ward, P. A. Immunodesign of experimental sepsis by cecal ligation and puncture. Nature Protocols. 4 (1), 31-36 (2009).
- Hugunin, K. M. S., Fry, C., Shuster, K., Nemzek, J. A. Effects of tramadol and buprenorphine on select immunologic factors in a cecal ligation and puncture model. Shock. 34 (3), 250-260 (2010).
- He, S., et al. Annexin A2 Modulates ROS and Impacts Inflammatory Response via IL-17 Signaling in Polymicrobial Sepsis Mice. PLoS Pathogens. 12 (7), 23 (2016).
- Pu, Q. Q., et al. Atg7 Deficiency Intensifies Inflammasome Activation and Pyroptosis in Pseudomonas Sepsis. Journal of Immunology. 198 (8), 3205-3213 (2017).
- Zanotti-Cavazzoni, S. L., et al. Fluid resuscitation influences cardiovascular performance and mortality in a murine model of sepsis. Intensive Care Medicine. 35 (4), 748-754 (2009).
- Chin, W., et al. A macromolecular approach to eradicate multidrug resistant bacterial infections while mitigating drug resistance onset. Nature Communications. 9 (1), 917 (2018).
- Nascimento, D. C., et al. IL-33 contributes to sepsis-induced long-term immunosuppression by expanding the regulatory T cell population. Nature Communications. 8, 14919 (2017).
- Deng, D., et al. Systematic investigation on the turning point of over-inflammation to immunosuppression in CLP mice model and their characteristics. International Immunopharmacology. 42, 49-58 (2017).
