Summary
このプロトコルは、免疫抑制状態の二次病院後天性感染症の根底にある感染結果を測定する技術を説明し、まず、セカルライゲーション/穿刺マウスを確立し、鼻腔内感染に挑戦して、免疫抑制敗血症の臨床的に関連するモデルを作成します。
Abstract
敗血症は、重篤で複雑な生命を脅かす感染症であり、複数の臓器におけるプロ炎症反応と抗炎症反応の不均衡を特徴とする。治療法の開発により、ほとんどの患者は高炎症期を生き延びるが、免疫抑制期に進み、二次感染の出現を増加させる。従って、敗血症時の免疫抑制段階における二次病院後天性感染症の根底にある病因の理解の向上は非常に重要である。報告されたのは、マウスに二重ヒット感染を引き起こして感染の結果をテストするモデルである。標準的な外科的処置は、セカルライゲーションおよび穿刺(CLP)によって多菌性性下膜炎を誘発し、その後、しばしば見られる免疫抑制で起こる肺炎をシミュレートするために黄色ブドウ球菌の鼻腔内感染を誘発するために使用される。敗血症患者で。この二重モデルは、長期敗血症患者に生じる免疫抑制状態および院内性肺炎からの二次感染に対する感受性を反映することができる。したがって、このモデルは敗血症誘発二次細菌性肺炎の病態生理学を調査するための簡単な実験的アプローチを提供し、敗血症およびその合併症に対する新しい治療法の発見に使用することができる。
Introduction
敗血症は、宿主のプロ炎症および抗炎症プロセスの複雑な相互作用を開始し、高炎症反応およびその後の免疫機能障害1、2によって特徴付される。敗血症は、世界的な健康優先事項を表し、集中治療室(ICW)で多数の死亡を引き起こす3.敗血症の発生率は、ICU管理4、5の進歩にもかかわらず、死亡率が30%と高く、世界中で年間3000万症例を超えると推定されています。2017年、世界保健機関(WHO)は、この致命的な疾患の予防、診断、管理を改善する決議を採択しました5。しかし、最近の研究では、死は重症敗血症患者の一次感染によるものではなく、免疫抑制によって引き起こされる二次性れない感染症(特に肺炎)から生じるものであることを示している6、7.したがって、敗血症患者が二次感染を発症する理由のメカニズムを理解し、より効果的な治療法を発見することは急務である。本明細書において、二重ヒットモデルとしても知られ、長期敗血症患者に生じる免疫抑制現象を研究することが記載されている。
多菌性敗血症、精液ライゲーションおよび穿刺(CLP)に関する研究におけるゴールドスタンダード実験モデルとして、多菌性性性性性性閉塞性炎および敗血症に寄与する盲腸リゲーションおよび穿孔を特徴とする手術である8,9.病態生理学的プロセスおよびサイトカインプロファイルは、運動学および大きさと共に、臨床敗血症に類似している。ライゲーションの位置、穿刺に使用される針のサイズ、およびセカル穿刺の数は、CLP後の死亡率に影響を与える主要な要因です。
敗血症性肺炎は敗血症患者の死亡の主な原因である。重症敗血症を引き起こす主な種類の生物には、黄色ブドウ球菌(20.5%)、シュードモナス種(19.9%)、腸内細菌科(主に大腸菌、16.0%)、真菌(19%)が含まれる。一方、最近の研究は、グラム陰性の感染症3とほぼ同じくらい一般的であるグラム陽性生物の発生率の増加を示唆している。
このプロトコルに記載される方法は、CLPを含み、免疫抑制状態を現す亜致死性多菌性性性性性下膜炎を誘発する「最初のヒット」として行われる。この手順はまた、臨床的に関連する研究プラットフォームを提供する「第2のヒット」としてS.aureusのその後の鼻腔内インステルスを含む。
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Protocol
ここに記載されているすべての方法は、実験動物のケアと使用のための国立衛生ガイドに従って行われ、ノースダコタ大学機関動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって承認されました。
1. セカルライゲーションと穿刺
注:雌C57BL/6マウス(体重、18-22g;年齢、6-8週間)は、対照群(Ctrl)、感染群(SA for S.aureus)、2つのシャム群、および2つのCLP群の6つのグループにランダムに分けられる。Ctrl動物は、手術や二次感染の傷害なしに残されています。SA動物は手術なしでS.アウレウス肺感染症を受ける。シャム手術を受けた動物は、盲結液の博覧会と同じ腹腔切除術を受ける(盲結種も穿刺もしない)。生存分析には1群あたり8匹のマウスが使用され、3~5匹のマウスが様々な時点での炎症の評価に使用されます。
- 手術の前に、20分間オートクレーブですべての手術器具および材料を殺菌し、消毒剤の拭き取りで手術台をきれいにし、消毒する。手術中に無菌状態を確立するには、手術場全体を適切な無菌手術用ドレープで覆い、ヘアカバー、外科用マスク、保護眼鏡、外科用ガウン、滅菌手袋を着用してください。
- ケタミンの0.1 mL/マウス(80mg/kg)、キシラジン(10mg/kg)混合物を経経口投与してマウスを計量し麻酔する。左手の親指と人差し指がU字型の位置を形成し、マウスの首を滑らかに優しく後ろから近づき、マウスの頭が強く拘束されないように、耳のすぐ後ろに首を保持します。ピンキーを使用してマウスの右後ろ足を保持し、中指とリングフィンガー(左手からのすべての指)を使用して体を保持します。
- 四肢の屈曲がなくなるまでつま先ピンチで麻酔の強度を確認してください。
- 電気かみそりを使用して腹部の下部象限を剃り、ヨウ素で領域を消毒します。
- マウスを無菌の表面の上に置き、頭部をオペレータから離します。滅菌フィールドを維持するために計画された外科的切開の上に穴を開けた無菌タオルでマウスをドレープします。
- 左下腹部にメスを入れた縦皮膚切開(長さ約0.5cm)を作る。切開(1-2センチメートル)を拡張するために小さなはさみを使用してください。
注意: 胸膜腔に浸透しないように注意してください。 - 骨内切開を行い、腸腔へのアクセスを取得し、隣接する腸で盲腸の暴露を可能にする。
- 腹部の左側の盲腸を分離し(ほとんどの場合、これは鈍い解剖学的鉗子を使用して行われます)、腹腔内の小腸と大腸を残して、無菌のドレープでそれを取り除きます。
注意: 腸間膜血管を損傷しないようにしてください。 - 遠位25%の位置で盲腸をリゲートし、比較的低い死亡率で長期感染を作成する。
注意: イレオセカルバルブをリゲートしないようにしてください。 - 21 G 1 1/2 針で盲腸を、最小血管領域で盲腸のライゲーションと先端の中間に単一のスルースルー穿刺(2つの穴)で穿孔する。
注意: 血管を穿刺しないように注意してください。 - 針を取り外します。完全な厚さの穿孔を保障するために浸透穴から少量の便を穏やかに押し出す。
注意:手順中に腸の連続性を妨げないように注意してください。 - 盲液を腹腔に置き換えます。
- 4-0ナイロン外科縫合糸で2層に腹部を閉じます。単純なランニング縫合糸を適用して腹部の筋肉を閉じ、単純な中断された縫合糸を適用することによって皮膚を閉じます。ヨウ素で肌をきれいにします。
- 1 mLの予め温め(37°C)0.9%の無菌正常生理食生(NS)溶液を皮下に下皮に注入し、第3のスペース損失を交換し、回復するために暖かいパッドの上に置きます。
- 12時間の光/暗いサイクルと食物と水への自由なアクセスと温度制御された部屋(22 °C)でケージの中のマウスを返します。マウスを0.5時間毎に少なくとも2時間、6時間ごとに少なくとも2d、3日間12時間ごとにモニタリングするか、生存分析のためにモリバンドの場合は安楽死させる。
注:手術前および術後の鎮鎮薬(ブプレノルフィン、50 μg/kg皮下12時間毎)は、手術後48時間まで手術前24時間、手術後9、10時間をお勧めします。
2. S.アウレウスに対する二次肺感染症
注:CtrlおよびSA群を除き、シャムおよびCLP群における3日後CLPで生存マウスは、それぞれ30μLの細菌懸濁液またはNSを用いて経口投与されるべきである。SA群の生存マウスは、細菌懸濁液を用いたイントラナスを内在に植え付けるべきである。
- ケタミン(45mg/kg)とキシラジン(10mg/kg)の100μL溶液を精液中注射してマウスを麻酔し、マウスがゆっくりと呼吸するまで待ちます。針と腹壁の間の穿刺角度は遅い注入のための30°未満である。
- マイクロピペットの助けを借りて、吸入時に吸引されるS.aureusの1 x 107コロニー形成ユニット(CFU)の30 μLをゆっくりと内在的に浸透させる。マウスを耳で直立した位置に持ち、毎回2~3μLの細菌懸濁液を両方の鼻孔にゆっくりと落とします。放出速度を調整して、泡を形成せずに吸い込むのにマウスを入れるようにします。
- マウスを上下に上げ、頭を上下に上げ、尾を下にして、細菌が気管に入るのを助けます。マウスをすばやく強く動かし、ゆっくりとゆっくりと動かして重力を高めます。すべての細菌が吸入されるまで約15倍の浸入を繰り返し、マウスごとに10〜15分かかります。
- マウスを背中に置き、斜めの寝具(約35°)に向かい、呼吸が正常に戻るまでマウスを見て、麻酔と手順から完全に回復します。
- マウスを12時間の光/暗いサイクルと食物と水への無制限のアクセスで温度制御された部屋(22 °C)でケージに戻します。
- 初日は2時間おきにマウスの状態を確認し、手術後4日間は12時間ごとに確認してください。生存分析のためのモリバンドの場合、または炎症の評価のための感染後24時間にそれらを安楽死させる。
3. 分析されたパラメータ
- マウスの生存
- マウスを7日間監視します。モリバンドの場合に安楽死させ、カプラン・マイヤー法11を用いて生存曲線を生成する。
- 細菌数
- SA注射後24時間、マウスから血液、気管支体洗浄液(BALF)、および胸膜洗浄液(PLF)を採取する。続いて、栄養寒天プレートに希釈剤の100 μLを加え、24時間37°Cで培養し、細菌コロニー数11、12、13を決定する。
- サイトカイン
注:マウス由来の血清およびBALFにおけるIL-1β、IL-6、およびTNFαの炎症性サイトカイン濃度は、メーカーの指示に従ってELISAキットを使用して評価されるべきである。- 96ウェルELISAプレートを100 μL/ウェルの異なる捕捉抗体作業液でコーティングし、複製およびサンプルを三色にして標準を実行します。プレートを密封し、4°Cで一晩放置します。
- 255 μL/ウェルウォッシュバッファ(1x PBS、0.05%Tween-20)でプレートを3回洗浄します。
- 非特異的結合をブロックするには、200 μL/ウェル希釈剤を追加します。プレートを密封し、室温(RT)で1時間インキュベートします。
- 標準的な解決策を準備する:1000 pg/mLからの8つの2倍の連続希釈。
- 標準またはサンプルの100 μL/ウェルを適切なウェルに追加し、100 μL/ウェルをブランクウェルに希釈します。プレートを密封し、RTで2時間または4°Cで一晩インキュベートします。
- 255 μL/ウェルウォッシュバッファでプレート5xを洗浄します。
- 異なる検出抗体作業溶液の100 μL/ウェルを適切なウェルに追加します。プレートを密封し、RTで1時間インキュベートします。
- 255 μL/ウェルウォッシュバッファでプレート5xを洗浄します。
- 希釈されたHRP溶液の100 μL/ウェルをすべてのウェルに追加します。プレートを密封し、RTで30分間インキュベートします。
- 255 μL/ウェルウォッシュバッファでプレート5xを洗浄します。
- 100 μL/十分に希釈されたTMB溶液を追加します。RTでプレートを光から離して15分間インキュベートします。
- 50 μL/ウェルストップソリューション(1 M H3PO4)を追加します。プレートリーダーで450nmで吸光度を読み取ります。
- フローサイトメトリー
- BALF からセルの合計数を取得します。ACKのライシングバッファーを使用して赤血球をlyseseし、PBSを使用して2xを洗浄します。
- 次に、前述の11としてフローサイトメトリーによって単一細胞懸濁液を分析する。表面染色の場合、APC抗マウスCD11bおよび抗マウスGr-1(Ly-6G/Ly-6C)抗体を用いた染色好中球(CD11b+GR-1+)。分析のために3 x 104の生きている、非破片細胞の最低を集める。
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Representative Results
実験設計および手順に応じて、C57BL/6マウスをCLPに供し、3日後に内細菌を経口投与した(図1)。図2に示すように、マウスは、経口炎の誘導後〜12時間で死亡し始めた。CLP+SA群の2匹のマウスとCLP+NS群の3匹のマウスは、鼻腔内S.アウレウスインチレーションの前に死亡した。感染していないマウスまたはシャム操作マウスでは死亡率は検出されなかった。したがって、マウスが肺炎の前にCLPを有していた場合、死亡率ははるかに高かった(p< 0.05)。鼻腔内細菌チャレンジ(1 x 107 CFU)の後、8匹のマウスのうち3匹がSA群とシャム+SA群の両方で生き残り、8匹中4匹がCLP+NS群で生き残った。しかし、8匹のマウスはすべてCLP+SA群で死亡した。対照的に、Ctrl グループと Sham+NS グループのすべてのマウスは生き残りました。CLPマウスは、その後S.アウレウスに対して挑戦した場合、より多くの死亡率を示した。CLP後のS.アウレウスの死亡率(100%)単独で感染したよりも高かった(37.5%)またはS.aureusは、シャム操作後(37.5%;p<0.05)。
図3に示すように、重篤なカエカム壊死は、CLP後の動物で観察されたが、より多くのダブルヒット群(CLP+SA)からそうした。しかし、コントロールにおける盲腸の大きな変化や細菌群とのシングルヒットはなかった。血液、BALF、およびPLFを培養し、CLP後3日目にS.アウレウスに感染したマウスの肺細菌クリアランスを評価した。この高い致死性は、シャムマウスと比較してCLPマウスの血液およびPLFにおけるS.aureus CFUの有意な増加と関連していた(p< 0.05;図 4A,C)CLP+SAマウスの血液およびBALF中のS.アウレウスCFUの数は、CLP+NSマウス(p< 0.01;図 4A,B)
炎症性サイトカインの場合、血清IL-1β、IL-6、およびTNFαの発現レベルは、CLP単独またはシャム手術を受けたマウスと比較して、敗血症生存マウスにおける細菌注入後24時間で有意に増加したことを示した。S.アウレウス(図5A)に挑戦したマウス。しかし、二次感染を有する敗血症マウスのBALFでは、対照感染マウス(SAマウス)およびシャム+SAとは異なり、炎症性サイトカインがわずかに増加した。一方、ダブルヒットマウスは、SAおよびシャム+SAマウス(p< 0.001;図5B)。
図6に示すように、マウスは感染後24時間で犠牲にし、BALFにおける相対好中球率はフローサイトメトリーにより検出された。ダブルヒットマウスは、S.アウレウス肺炎単独で受けたマウスと比較してBALFにおける好中球の有意な減少を示した。これらのデータは、CLPが宿主の免疫応答を損なうことを示し、その結果、二次細菌性肺炎に対する感受性が高まった。
図 1:実験設計。マウスをランダムに6群に分けた。2つのグループはD0でセカルライゲーションと穿刺(CLP)を受け、他のグループはシャム操作または手術されなかった。手術後3日目(D3)、S.アウレウス[SA,1 x 107コロニー形成ユニット(CFU)]または正常生理生理(NS)を経常に投与した。対照群(Ctrl)マウスは、イントラナス注入されなかった。血液、気管支藻胞洗浄液(BALF)、および胸膜洗浄液(PLF)は、細菌数アッセイに対するSA注射後24時間を採取した。各群の死亡率は、生存分析のために7日間にわたって観察された。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2:マウスの生存。CLPまたはシャム手術に提出されたC57BL/6マウスは、手術後3日目にS.アウレウス(SA)または正常生理生理(NS)を受けた(n=1群あたり8匹)。マウスを7日間モニタリングし、12時間ごとに死亡を記録し、シャム+SAマウスおよびSAマウスと比較して、カプラン・マイヤー生存曲線、対数ランク試験(*p<0.05)を記録した。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3:マウス盲取り。二次感染はCLP後3日目に誘発された。SA感染後24時間、マウスを犠牲にして大腸組織を採取した。異なる傷害ヒットの下でのセカルライゲーションの代表的な写真が示されています。SA = S. アウレウス;NS = 通常の生理生理がある。CLP = セカルライゲーションと穿刺。スケールバー = 1 cm。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 4:寒天プレートの細菌数と代表画像。手術の3日後、マウスをS.アウレウス(SA)の1 x 107 CFU(群当たりn≥3マウス)でイントラナスをイントラナスでイントリュータルした。血液、BALF、およびPLFは、SA注射後24時間を採取し、24時間のインキュベーション後に細菌コロニー数を決定した。結果は平均 ± SEM. 一方通行の分散分析 (Tukey のポストホック; *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ns = 有意ではない) として表されます。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 5: ELISAはサイトカイン分泌を検出した。二次感染はCLP後3日目に誘発された。SA感染後のマウスからの血清中のIL-1β、IL-6、およびTNFαの濃度(群当たりn≥3マウス)。データは、3つの実験の平均±SEMとして提示される。一方通行の ANOVA (Tukey のポストホック; *p < 0.05; **p < 0.01; ****p < 0.0001; ns = 有意ではありません)この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 6:好中球浸透の代表的な頻度。鼻腔内感染後24時間、マウスを屠殺しBALF(群当たりn≥3マウス)を得た。好中球のパーセンテージ(CD11b+、GR-1+)をフローサイトメトリーにより定量し、3回の実験の平均±SEMとして示した。一方通行の分散分析 (Tukey のポストホック; ****p < 0.0001; ns = 有意ではない)この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
敗血症研究のゴールドスタンダードモデルとして、CLPは、腹膜切り変による組織外傷、盲結膜のライゲーションによる壊死、転座による腹膜炎を引き起こす微生物漏出の結果としての感染を含む3つの侮辱の組み合わせを持っています。血液8に細菌の.したがって、CLPは他の多くのモデルよりもヒト敗血症の複雑さを模倣する。しかし、現在のCLPモデルの主な制限は、ICU3、4、5の患者に見られる敗血症のより長い期間を反映できないことである。したがって、敗血症の遅延死亡率を反映し、肺二次感染の根底にあるメカニズムを調査するために、臨床的に関連するデュアルモデル(ダブルヒットモデル)が提案された。このプロトコルでは、敗血症は、CLPとS.アウレウス肺感染を組み合わせて3日後にCLPを誘発した。2ヒットマウスは、より高い死亡率、重度の盲腸損傷、弱体化した血液、BALF細菌クリアランス、低炎症性サイトカイン、およびBALFの低い好中球を示した。これは、クリニックでの免疫抑制状態を模倣する重度の敗血症をもたらした。
次の説明は重要な手順です。詳細に示すのは、同じ条件下で致死性敗血症を生成する方法である。まず、雌マウスは雄マウス11よりもCLPに対して耐性が高いため、雌マウスを用いた。第二に、CLP誘発死亡率は、盲結種の長さ、針の大きさ、セカル穿刺の数9など、いくつかの技術的パラメータに依存する。盲血症の約75%のライゲーションは、重度の敗血症を誘発し、盲液の60%のライゲーションは中間レベル敗血症を誘発し、盲血症の25%以下のライゲーションは軽度の敗血症をもたらす9。軽度のCLP(25%、21G 1 1/2針による単一スルー・スルー穿刺)を行い、致死性敗血症11、12を誘発することによってモデルを標準化することを選択した。第三に、流体蘇生は、循環崩壊によるショックおよび急速な死を防ぎ、ヒト敗血症13の血行力学的プロファイルをより密接に模倣する超動的動物敗血症モデルを開発するために推奨される。さらに、ブプレノルフィンなどの鎮痛薬の使用は、実験的かつ倫理的な観点から考慮されるべきである10.
3日後CLPは敗血症の免疫抑制期を反映する二次感染を誘発するタイムポイントとして選ばれた。敗血症のほとんどの患者は、3日を超えて最も死亡が発生する長引く病院コースを有し、その多くは、P.aeruginosa14と一緒にCLPとの最近の研究で一貫して示された二次病院獲得性肺炎に入ります。.他の研究室からの以前の結果はまた、CLPの3日後に、マウスが二次的な含入細菌に対して高い感受性を示し、感染の1日後に過剰炎症から免疫抑制15への転換点であったことを示す。16.
さらに、細菌株と浸透量の違いは、デュアルモデルにおける変動性を引き起こす重要な要因である。株および用量レベルの選択は、免疫抑制状態の間に二次感染の実験設計の必要性に基づいている。これまでの知見に基づき、本研究ではS.アウレウスの1 x 107 CFUを選択した。
マウス肺への直接鼻腔内細菌送達の効率を改善するために、注入量、時間、および身体位置に注意を払う必要があります。実験の結果に大きな影響を与える可能性のある他の運用上の問題があります。これらは、マウスを直立させ、各吸入の間に両方の鼻孔に複数の低用量細菌液体を別々に投与し、気泡を形成せずに液体の吸入を見て、吸入の速度を制御することを含む。マウスをすばやく上に移動してからゆっくりと下に移動し、45°の角度でマウスを置いて、着込みから回復します。鼻腔内細菌の投与は非侵襲的であり、窒息を防ぎ、アクセシビリティを高め、安全性を向上させ、外科的傷害を最小限に抑えるのに役立ちます。
ただし、この方法には制限があります。これは方法論的研究であるため,臨床徴候の変化に関するデータは議論されていない。抗炎症サイトカイン;血液中の単球、好中球、リンパ球の量と機能。実験マウスは、しばしば繁殖し、同様の年齢および体重を有し、特定の病原体を含まない施設に収容され、一般に既存の免疫抑制などの併存性を有しない。それにもかかわらず、異なる性別、年齢、免疫および栄養状態、および患者の抗生物質などの可能なアジュバント治療は、異種臨床結果をもたらす可能性があります。ヒト患者の不均一性を考慮すると、年齢、体重、既存の疾患、臨床支援ケアなどの変数を注意深く観察する必要があります。
このデュアルモデル(ダブルヒットモデル)の開発は、ヒト敗血症のハイパーから低炎症期への進行に似ているため、感染および免疫研究コミュニティにとってタイムリーかつ重要です。敗血症患者における二次性無病性肺炎の一般的な臨床シナリオをより正確に反映する。このモデルは敗血症誘発免疫抑制のための新しい治療戦略の開発に役立つかもしれない。
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Disclosures
著者は金銭的な利益相反を持っていない。
Acknowledgments
この研究は、国立衛生補助金R01 AI138203-01、AI109317-04、AI101973-01、およびAI097532-01A1からM.W.に支援されました。ノースダコタ大学コア施設はNIH助成金(INBRE P20GM103442およびCOBRE P20GM113123)によって支援されました。この研究はまた、中国国家自然科学財団(81530063)の主要プログラムによって、江沢省に支援されました。資金提供者は、研究の設計、データ収集と分析、出版の決定、または原稿の準備に役割を持ちはありませんでした。私たちは、ビデオを作ってくださったマーヴィン・ライアー(ノースダコタ大学農村保健センター)に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 21 G 1 ½ Needle | BD | BD305167 | |
| ACK lysing buffer | Gibco | A10492-01 | |
| Anti-mouse CD11b antibody | Biolegend | 101201 | |
| Anti-mouse Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) antibody | Biolegend | 108401 | |
| C57BL/6 mice | Harlan (Indianapolis) | C57BL/6NHsd | |
| Desk light | General Supply | General Supply | |
| Disinfecting wipes | Clorox | B07NV5JMCS | |
| Electric razor | General Supply | General Supply | |
| ELISA kits (mouse IL-1β, IL-6 and TNFα) | Invitrogen | 88-7013, 88-7064, and 88-7324 | |
| Iodine | Dynarex | B003U463PY | PVP Iodine Wipes |
| Ketamine | FORT DODGE | NDC 0856-2013-01 | Amine hydrochloride injection |
| Laboratory scale | General Supply | General Supply | |
| LB Agar, Miller | Fisher Scientific | BP1425-500 | Molecular genetics, powder |
| Micropipette | ErgoOne | 7100-1100 | |
| Normal saline | General Supply | General Supply | |
| Polylined towel | CardinalHealth, Convertors | 3520 | Surgical drape, sterile, for single use only |
| Silk suture, 4-0 | DAVIS & GECK | 1123-31 | |
| Small animal needle holder | General Supply | General Supply | |
| Small animal surgery scissors | General Supply | General Supply | |
| Small animal surgical forceps | General Supply | General Supply | |
| Staphylococcus aureus | ATCC | 13301 | |
| Warm pad | General Supply | General Supply | |
| Xylazine | Alfa Aesar | 7361-61-7 |
References
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