Summary
Denne protokol beskriver teknikker til at måle infektiøse resultater underliggende sekundære hospitalserhvervede infektioner i immunsuppressiv tilstand, først ved at etablere cecal ligation/punktering mus derefter udfordre dem med intranasal infektion til at skabe en klinisk relevant model for immun undertrykkelses sepsis.
Abstract
Sepsis, en alvorlig og kompliceret livstruende infektion, er karakteriseret ved en ubalance mellem Pro-og anti-inflammatoriske reaktioner i flere organer. Med udviklingen af terapier, de fleste patienter overlever den hyperinflammatoriske fase, men fremskridt til en immunosuppressiv fase, som øger fremkomsten af sekundære infektioner. Derfor er bedre forståelse af patogenesen underliggende sekundære hospitalserhvervede infektioner i den immunosuppressive fase under sepsis er af enorm betydning. Rapporteret her er en model til at teste infektiøse resultater ved at skabe dobbelt-hit infektioner i mus. En standard kirurgisk procedure anvendes til at inducere polymikrobiel peritonitis ved cecal ligation og punktering (CLP) og efterfulgt af intranasal infektion af Staphylococcus aureus for at simulere lungebetændelse, der forekommer i immunsuppression, som ofte ses hos septiske patienter. Denne dobbelte model kan afspejle den Immunsuppressive tilstand, der forekommer hos patienter med langvarig sepsis og modtagelighed for sekundær infektion fra nosokomiel pneumoni. Derfor, denne model giver en simpel eksperimentel tilgang til at undersøge Patofysiologi af sepsis-induceret sekundær bakteriel lungebetændelse, som kan bruges til at opdage nye behandlinger for sepsis og dens komplikationer.
Introduction
Sepsis indleder et komplekst samspil af Host pro-inflammatoriske og anti-inflammatoriske processer og er karakteriseret ved en hyperinflammatorisk respons og efterfølgende immun dysfunktion1,2. Sepsis er en global sundhedsprioritet og forårsager et stort antal dødsfald i intensivafdelinger (ICUs)3. Incidensen af sepsis skønnes at overstige 30.000.000 tilfælde på verdensplan om året, med dødeligheden så høj som 30% trods fremskridt i ICU Management4,5. I 2017 vedtog Verdenssundhedsorganisationen en resolution, der skulle forbedre forebyggelsen, diagnosticeringen og håndteringen af denne dødelige sygdom5. Nylige undersøgelser har imidlertid vist, at døden ikke skyldes primær infektion hos svære septiske patienter, men snarere fra sekundær nosokomiel infektion (især lungebetændelse), der forårsages af immunsuppression6,7 . Derfor, forstå mekanismerne for, hvorfor septikpatienter udvikle sekundær infektion og opdage mere effektive behandlinger er bydende nødvendigt. Heri, en dobbelt model, også kendt som en dobbelt-hit model, at studere det immunosuppressive fænomen forekommer hos patienter med langvarig sepsis er beskrevet.
Som den gyldne standard eksperimentel model i forskning på polymikrobiel sepsis, cecal ligation og punktering (CLP) er en operation karakteriseret ved cecum ligation og perforation, som bidrager til polymikrobiel peritonitis og sepsis8,9 . Den patofysiologiske proces og cytokin profilerne, sammen med kinetik og størrelsesorden, svarer til klinisk sepsis. Positionen af ligation, nålestørrelse, der anvendes til punktering, og antallet af cecal punkteringer er vigtige faktorer, der påvirker dødeligheden efter CLP.
Den nosokomielle lungebetændelse er den førende årsag til dødelighed blandt kritisk syge patienter med sepsis. Den vigtigste type organismer, der forårsager svær sepsis, omfatter Staphylococcus aureus (20,5%), Pseudomonas Species (19,9%), Enterobacteriacae (hovedsagelig E. coli, 16,0%) og svampe (19%). I mellemtiden, nylige undersøgelser har antydet en stigende forekomst af gram-positive organismer, som nu er næsten lige så almindeligt som gram-negative infektioner3.
Den metode, der er beskrevet i denne protokol involverer CLP, udført som "første hit" for at inducere subletale polymikrobiel peritonitis, som manifesterer en immunsuppression tilstand. Proceduren indebærer også efterfølgende intranasal instillation af S. aureus som det "andet hit" for at levere en klinisk relevant forskningsplatform.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metoder beskrevet her blev udført i overensstemmelse med National Institute of Health guide til pleje og brug af forsøgsdyr og godkendt af University of North Dakota institutionelle dyrepleje og brug udvalg (IACUC).
1. cecal ligation og punktering
Bemærk: kvindelige C57BL/6 mus (vægt, 18-22 g; alder, 6-8 uger) er tilfældigt opdelt i seks grupper: kontrolgruppe (CTRL), infektion gruppe (SA for S. aureus), to Sham grupper, og to CLP grupper. CTRL dyr er tilbage uden kirurgi og sekundære infektion skader. SA-dyr udsættes for S. aureus -Lungeinfektion uden operationen. Sham-betjente dyr gennemgår samme laparotomi med en udstilling af cecum (bortset fra at cecum hverken er ligeret eller punkteret). Otte mus pr. gruppe bruges til overlevelse analyse, og tre til fem mus bruges til vurdering af betændelse på forskellige tidspunkter.
- Før operationen steriliseres alle kirurgiske instrumenter og materialer ved autoklavering i 20 min. Rengør og Desinficer betjenings bordet med desinficerende klude. For at etablere sterile forhold under operationen, dække alle de operative felter med korrekt sterile kirurgiske gardiner, og bære et hår Cover, kirurgisk maske, beskyttende briller, kirurgisk kjole, og sterile handsker.
- Veje og bedøve musen ved hjælp af 0,1 ml/mus af ketamin (80 mg/kg), xylazin (10 mg/kg) blanding intraperitonealt administreret. Med tommel-og pegefinger på venstre hånd, der danner en U-formet position, nærmer sig musens hals bagfra glat og forsigtigt, derefter holde halsen umiddelbart bag ørerne, så muse hovedet er meget behersket. Brug en Pinky til at holde musens højre ryg ben og bruge midten og ring fingre (alle fingre fra venstre hånd) til at holde kroppen.
- Kontroller intensiteten af anæstesi ved tå knivspids indtil ingen bøjning af ekstremiteterne.
- Barbere de nedre kvadranter i maven ved hjælp af en elektrisk barbermaskine og desinficere området med jod.
- Anbring musen på den sterile overflade i en liggende position, hvor hovedet vender væk fra operatøren. Drape musen med sterile håndklæde med hul over det planlagte kirurgiske indsnit at opretholde sterile felter.
- Lav en langsgående hudindsnit (ca. 0,5 cm lang) med en skalpel i venstre nedre abdomen. Brug en lille saks til at udvide indsnittet (1-2 cm).
Forsigtig: pas på ikke at trænge ind i peritonealhulen. - Foretag den intramuskulære indsnit for at få adgang til peritonealhulen og tillade eksponering af cecum med den tilstødende tarm.
- Isoler cecum på venstre side af maven (i de fleste tilfælde, dette gøres ved hjælp af stump anatomiske pincet) og fjerne det på en steril drapere, forlader de små og store tarme i peritonealdialyse hulrum.
Forsigtig: undgå at beskadige mesenteriske blodkar. - Ligate cecum i den distale 25% position for at skabe en længerevarende infektion med relativ lav dødelighed.
Forsigtig: Sørg for ikke at ligere ileocecal-ventilen. - Cecum perforeres med en 21 G 1 1/2 nål ved enkelt gennem-og-gennem punktering (to huller) midt imellem ligationen og spidsen af cecum i det mindst vasculariserede område.
Forsigtig: Sørg for ikke at punktere blodkarrene. - Fjern nålen. Forsigtigt Ekstruderer en lille mængde afføring fra penetrations hullerne for at sikre fuld tykkelse perforering.
Forsigtig: Vær omhyggelig med ikke at hindre tarm kontinuiteten under proceduren. - Udskift cecum i bughulen.
- Luk maven i to lag med 4-0 nylon kirurgiske suturer. Luk mave muskulaturen ved at anvende enkle løbe suturer og lukke huden ved at anvende enkle, afbrudte suturer. Rengør huden med jod.
- Injicer 1 mL forvarmet (37 °C) 0,9% steril normal saltvandsopløsning (NS) på bagsiden subkutant for at erstatte tredje rumtab og Anbring det på en varm pude for at komme sig.
- Vend musene i bur i et temperaturkontrolleret rum (22 °C) med 12 timer lys/mørk cyklus og fri adgang til mad og vand. Overvåg musene hver 0,5 timer i mindst 2 h, derefter hver 6 h for mindst 2 d, derefter hver 12 h i 3 dage, eller aflive dem, når døende for overlevelse analyse.
Bemærk: præ-og postoperativ analgetika (buprenorphin, 50 μg/kg subkutant hver 12. time) anbefales til 24 timer før operationen indtil 48 h efter operationen9,10.
2. sekundær Lungeinfektion med S. aureus
Bemærk: med undtagelse af CTRL-og SA-grupper bør overlevende mus efter 3 dage efter CLP i Sham-og CLP-grupperne administreres intranasalt med henholdsvis 30 μL bakteriel suspension eller NS. De overlevende mus i SA-gruppen skal indpodet intranasalt med den bakterielle suspension.
- Anæstesi musen ved intraperitonealt indsprøjtning 100 μl ketamin (45mg/kg) og xylazin (10 mg/kg) og vente, indtil musen åndedrag langsomt. Punkturvinklen mellem nålen og bugvæggen er mindre end 30 ° for langsom injektion.
- Ved hjælp af en mikropipette, langsomt og intranasalt indgyde med 30 μl 1 x 107 koloni danner enhed (CFU) af S. aureus skal aspireres ved indånding. Hold musen ved ørerne i en opretstående position, langsomt drop 2-3 μL af bakteriel suspension i begge næsebor hver gang. Juster aftræks hastigheden, så musen kan inhalere uden at danne bobler og slippe af.
- Løft musen op og ned, med hovedet op og hale ned, for at hjælpe bakterierne ind i luftrøret. Flyt musen op hurtigt og kraftigt, mens du flytter den ned forsigtigt og langsomt for at øge tyngdekraften. Gentag instillation omkring 15x indtil alle bakterier inhaleres, som bør tage 10-15 min for hver mus.
- Læg musen på ryggen og hovedet op på den vinklede sengetøj (ca. 35 °) og se musen, indtil dens vejrtrækning vender tilbage til normal, og det er helt genvundet fra anæstesi og procedurer.
- Anbring musen tilbage i buret i et temperaturkontrolleret rum (22 °C) med 12 timer lys/mørk cyklus og ubegrænset adgang til mad og vand.
- Kontrollér muse forholdene hver 2 h for den første dag og hver 12 h bagefter i 4 dage efter operationen. Euthanize dem, når døende for overlevelse analyse eller 24 h efter infektion for vurdering af betændelse.
3. analyserede parametre
- Mus overlevelse
- Overvåg musene i 7 dage. Euthanize når døende og generere overlevelse kurver ved hjælp af Kaplan-Meier metoder11.
- Bakterietællinger
- 24 timer efter SA injektion, høst blodet, bronchoalveolær skylning væske (balf), og peritonealdialyse skylning væske (PLF) fra musene. Tilsæt derefter 100 μl af fortynder til næringsstof agar plader og kultur dem ved 37 °c i 24 timer for at bestemme bakterie koloni tæller11,12,13.
- Cytokiner
Bemærk: pro-inflammatoriske cytokin koncentrationer af IL-1β, IL-6 og TNFα i serum og BALF fra mus bør vurderes ved hjælp af ELISA-kits i henhold til producentens anvisninger.- Coat 96 godt ELISA plade med 100 μL/brønd af forskellige Capture antistof arbejds løsning til at køre standarderne i to eksemplarer og prøver i tre eksemplarer. Forsegl pladen og lad den være natten over ved 4 °C.
- Pladen vaskes tre gange med 255 μL/brønd-vaskebuffer (1x PBS, 0,05% Tween-20).
- Hvis du vil blokere ikke-specifik binding, skal du tilføje 200 μL/brønd fortyndingsvæske. Pladen forsegles og inkupereres ved stuetemperatur (RT) i 1 time.
- Klargøring af standardopløsning: 8 2-fold seriefortyndinger fra 1000 PG/mL.
- Der tilsættes 100 μL/brønd af standarder eller prøver til de relevante brønde og 100 μL/brønd af fortyndingsmidlet til de blanke brønde. Pladen forsegles og inkueres ved RT i 2 timer eller natten over ved 4 °C.
- Vask pladen 5x med 255 μL/brønd vask buffer.
- Der tilsættes 100 μL/brønd af forskellige detektionsstofarbejdsopløsninger til de relevante brønde. Forsegl pladen og inkube ved RT i 1 time.
- Vask pladen 5x med 255 μL/brønd vask buffer.
- Der tilsættes 100 μL/brønd af fortyndet HRP-opløsning til alle brønde. Forsegl pladen og inkube ved RT i 30 min.
- Vask pladen 5x med 255 μL/brønd vask buffer.
- Der tilsættes 100 μL/brønd fortyndet TMB-opløsning. Du inkube pladen væk fra lys ved RT i 15 min.
- Der tilsættes 50 μL/brønd stopopløsning (1 M H3po4). Læs absorbans ved 450 Nm med en plade læser.
- Flow cytometri
- Få det totale antal celler fra BALF. Lyse Erytrocytterne ved hjælp af ACK lyserende buffer og vask 2x ved hjælp af PBS.
- Analyser derefter enkelt celle suspensioner af flow cytometri som tidligere beskrevet11. For overfladefarvning, pletter neutrofiler (CD11b + GR-1 +) med APC anti-mus CD11b og anti-mus gr-1 (ly-6G/ly-6C) antistoffer. Saml mindst 3 x 104 levende, ikke-vragrester celler til analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Afhængig af eksperimenterende design og procedurer, C57BL/6 mus blev udsat for CLP, og efter 3 dage, de blev administreret bakterier intranasalt (figur 1). Som vist i figur 2begyndte musene at dø ved ~ 12 h efter induktion af peritonitis. To mus i CLP + SA gruppen og tre mus i CLP + NS gruppen døde før intranasal S. aureus instillation. Der blev ikke påvist nogen dødelighed hos ikke-inficerede mus, der ikke var smittet eller fingerede. Da mus havde CLP før pneumoni, var dødeligheden derfor meget højere (p < 0,05). Efter intranasale bakterier udfordring (1 x 107 CFU), tre af otte mus overlevede i både SA og SHAM + SA grupper, og fire af otte mus OVERLEVEDE i CLP + NS-gruppen. Alle otte mus døde dog i CLP + SA gruppen. I modsætning hertil overlevede hver mus i gruppen CTRL og Sham + NS-gruppen. CLP-mus viste mere dødelighed, da de senere blev udfordret med S. aureus. Dødelighed i S. aureus efter CLP (100%) var højere end inficeret alene (37,5%) eller S. aureus efter Sham-opereret (37,5%; p < 0,05).
Som vist i figur 3blev der observeret svær coecum nekrose hos post-CLP-dyr, men mere fra dobbelt-hit-gruppen (CLP + SA). Der var dog ingen grov ændring af cecum i kontrol eller single-hit med bakterie grupper. Blod, BALF, og PLF blev dyrket for at vurdere lunge bakteriel clearance af mus inficeret med S. aureus 3 dage efter CLP. Denne høje dødelighed var forbundet med signifikant øget S. aureus CFU i blodet og PLF af CLP-mus sammenlignet med Sham-mus (p < 0,05; Figur 4a,C). Antallet af S. aureus CFU i BLODET og BALF i CLP + SA-mus var markant større end CLP + NS-musene (p < 0,01; Figur 4a,B).
For pro-inflammatoriske cytokiner viste resultaterne, at ekspressions niveauerne for serum IL-1β, IL-6 og TNFα steg signifikant ved 24 timer efter bakteriel instillation hos sepsis-overlevende mus sammenlignet med mus, der gennemgik CLP alene eller til den fingerede mus udfordret med S. aureus (figur 5a). Men, de pro-inflammatoriske cytokiner steg lidt i BALF af septikmus med sekundær infektion, adskiller sig fra dem i kontrol-inficerede mus (SA mus) og Sham + SA. I mellemtiden udviste dobbelt ramte mus signifikant reducerede niveauer i BALF IL-1β-, IL-6-og TNFα-niveauerne sammenlignet med både SA-og Sham + SA-mus (p < 0,001; Figur 5b).
Som vist i figur 6blev mus ofret ved 24 timer efter infektion, og den relative neutrofilprocent i balf blev detekteret ved flow cytometri. Dobbelt ramte mus udviste en signifikant reduktion af neutrofiler i BALF sammenlignet med mus, der gennemgik S. aureus pneumoni alene. Samlet set viste disse data, at CLP svækker værtens immunrespons, hvilket resulterede i øget modtagelighed for sekundær bakteriel pneumoni.
Figur 1 : Eksperimentel design. Mus blev tilfældigt inddelt i seks grupper. To grupper gennemgik cecal ligation og punktering (CLP) på d0, og de andre var fingerede eller opererede ikke. Tre dage efter operationen (D3) blev S. aureus [SA, 1 x 107 KOLONIDANNENDE enheder (CFU)] eller normalt saltvand (NS) administreret intranasalt. Kontrolgruppen (CTRL) mus var ikke intranasalt instilled. Blod, bronchoalveolært skylning væske (balf) og peritonealdialyse skylning væske (PLF) blev høstet 24 h efter SA injektion for en bakterie tælle analyse. Dødeligheden i hver gruppe blev observeret i løbet af 7 dage for overlevelse analyse. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Mus overlevelse. C57BL/6-mus, der blev indsendt til enten CLP-eller Sham-kirurgi, fik S. aureus (SA) eller normalt saltvand (NS) på tredjedagen efter operationen (n = 8 mus pr. gruppe). Musene blev overvåget i 7 dage, og dødeligheden blev registreret hver 12 h. Kaplan-Meier-overlevelses kurver, log-Rank-test (* p < 0,05) sammenlignet med Sham + SA-mus og SA-mus. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Mus cecum. Sekundær infektion blev induceret 3 dage efter CLP. 24 h efter SA infektion, blev mus ofret til at indsamle kolon væv. De repræsentative billeder af cecal ligation under forskellige skade hit vises. SA = S. aureus; NS = normalt saltvand; CLP = cecal ligation og punktering. Skala stang = 1 cm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Bakterietællinger og repræsentative billeder af agar-plader. 3 dage efter operationen blev mus intranasalt indpodet med 1 x 107 CFU af S. aureus (SA) (n ≥ 3 mus pr. gruppe). Blod, BALF og PLF blev høstet 24 timer efter SA injektion, og bakterie koloni tællinger blev bestemt efter 24 timer inkubation. Resultaterne udtrykkes som gennemsnit ± SEM. envejs ANOVA (tukey's post hoc; * p < 0,05; * * p < 0,01; * * * p < 0,001; NS = ikke signifikant). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 : Elisa, der detekterer cytokin sekretion. Sekundær infektion blev induceret 3 dage efter CLP. Koncentrationer af IL-1β, IL-6 og TNFα i serum (a) og Balf (B) fra mus efter SA-infektion (n ≥ 3 mus pr. gruppe). Data præsenteres som middel ± SEM af tre eksperimenter. En-vejs ANOVA (Tukey's post hoc; * p < 0,05; * * p < 0,01; * * * * p < 0,0001; NS = ikke signifikant). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6 : Repræsentativ hyppighed af neutrofilpenetration. 24 timer efter intranasal infektion blev mus ofret for at opnå BALF (n ≥ 3 mus pr. gruppe). Procentdelen af neutrofiler (CD11b+, GR-1+) blev kvantificeret ved flow cytometri og vises som middel ± SEM af tre eksperimenter. En-vejs ANOVA (Tukey's post hoc; * * * * p < 0,0001; NS = ikke signifikant). Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Som guld standardmodel for sepsis forskning, har CLP en kombination af tre fornærmelser, herunder væv traumer forårsaget af laparotomi, nekrose på grund af ligation af cecum, og infektion som følge af mikrobiel lækage, der forårsager peritonitis med translokation af bakterier i blodet8. Derfor, CLP efterligner kompleksiteten af humant sepsis bedre end mange andre modeller. Men en væsentlig begrænsning af den nuværende CLP-model er den manglende evne til at afspejle den mere langvarige fase af sepsis set hos patienter i ICU3,4,5. Derfor blev en klinisk relevant Dual model (dobbelt-hit model) foreslået for at afspejle forsinket dødelighed af sepsis og undersøge de mekanismer, der ligger til grund for pulmonal sekundær infektion. I denne protokol blev sepsis induceret ved at kombinere CLP med S. aureus Lungeinfektion på 3 dage efter CLP. To-hit mus udviste højere dødelighed, svær cecum skade, svækket blod, BALF bakterier clearances, lavere pro-inflammatoriske cytokiner, og lavere neutrofiler i BALF. Dette resulterede i svær sepsis, som efterligner immunsuppression status i klinikker.
Følgende beskrivelser er vigtige trin. Vist i detaljer er, hvordan man producerer subletale sepsis under de samme betingelser. For det første blev hunmus brugt, fordi hunmus er mere modstandsdygtige over for CLP end hanmus11. For det andet afhænger CLP-induceret dødelighed af flere tekniske parametre, såsom længden af cecum ligeret, nålestørrelse, og antallet af cecal punkteringer9. Ligation af ca. 75% af cecum inducerer svær sepsis, ligation af 60% af cecum inducerer middel-niveau sepsis, og ligation af 25% eller mindre af cecum resulterer i mindre sepsis9. Det blev valgt at standardisere modellen ved at udføre en mild CLP (25%, enkelt gennem-og-gennem punktur med en 21 G 1 1/2 nål) til at inducere subletale sepsis11,12. Tredje, væske genoplivning anbefales at forhindre chok og hurtig død på grund af cirkulation sammenbrud og udvikle en hyperdynamisk animalsk sepsis model, som mere nøje efterligner hæmodynamisk profil af humant sepsis13. Desuden bør brugen af analgetika, såsom buprenorphin, overvejes ud fra et eksperimentelt og etisk synspunkt10.
Tre dage efter CLP blev valgt som et tidspunkt at inducere sekundær infektion til at afspejle den immunosuppressive fase af sepsis. De fleste patienter med sepsis har en langvarig hospitals kursus med de fleste dødsfald forekommer over 3 dage, og mange derefter indgå sekundær hospitalserhvervet lungebetændelse, som blev konsekvent vist i en nylig undersøgelse med CLP sammen med P. aeruginosa14 . Tidligere resultater fra andre laboratorier viser også, at mus 3 dage efter CLP udviser høj følsomhed over for sekundære indpodet bakterier, og en dag efter infektionen var vendepunktet fra over-inflammation til immunsuppression15, 16. det er
Desuden er forskelle i bakteriestammer og dosering indpodet væsentlige faktorer, der forårsager variabilitet i den dobbelte model. Udvælgelsen af stamme-og dosisniveauer er baseret på behovene i det eksperimentelle design af sekundær infektion under immunsuppressiv status. Baseret på tidligere fund blev 1 x 107 CFU i S. aureus udvalgt til dette studie.
For at forbedre effektiviteten af intranasal bakteriel levering direkte i musens lunger, bør opmærksomheden rettes mod instillation volumen, tid og krop position. Der er andre operationelle spørgsmål, der kan umådelig indflydelse på udfaldet af eksperimentet. Disse omfatter holde musen oprejst, administration af multiple-lav-dosis bakterier væske i begge næsebor separat under hver instillation, ser indånding af væske uden at danne bobler, kontrollere hastigheden af indånding; flytte musen op hurtigt derefter ned langsomt, og om musen på en 45 ° vinkel for at komme sig efter instillation. Intranasal bakterier administration er noninvasiv og hjælper med at forhindre kvælning, øge tilgængelighed, forbedre sikkerheden, og minimere kirurgiske skader.
Men denne metode har sine begrænsninger. Da dette er en metodologisk undersøgelse, er data ikke blevet drøftet om ændringer af kliniske tegn; anti-inflammatoriske cytokiner; og mængde og funktion af monocytter, neutrofiler og lymfocytter i blodet. Laboratorie-mus er ofte indavlede, har lignende aldre og vægte, er anbragt i specifikke patogen-fri faciliteter, og almindeligvis ikke har komorbiditeter, såsom præ-eksisterende immunsuppression. Ikke desto mindre kan forskellige køn, alder, immun-og ernæringsstatus og mulig adjuverende behandling, såsom antibiotika af patienter, resultere i heterogene kliniske resultater. I betragtning af heterogenitet af humane patienter, variabler såsom alder, vægt, præ-eksisterende sygdomme, og klinisk støttende pleje bør overvåges nøje.
Udviklingen af denne dobbelte model (dobbelt-hit model) er rettidig og vigtig for infektionen og immunitet forskning samfund, fordi det ligner progression fra hyper-til hypo-inflammatorisk fase af humant sepsis. Det afspejler det fælles kliniske scenario med en sekundær nosokomiel pneumoni hos patienter med sepsis mere præcist. Denne model kan bidrage til at udvikle nye terapeutiske strategier for sepsis-induceret immunsuppression.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen finansielle interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af nationale institutter for sundhedsydelser R01 AI138203-01, AI109317-04, AI101973-01, og AI097532-01A1 til M. W. Universitetet i North Dakota Core faciliteter blev støttet af NIH tilskud (INBRE P20GM103442 og COBRE P20GM113123). Dette arbejde blev også støttet af Key program af national Nature Science Foundation i Kina (81530063) til Jianxin Jiang. Finansieringskilderne havde ingen rolle i studiedesign, dataindsamling og-analyse, beslutning om udgivelse eller forberedelse af manuskriptet. Vi takker Marvin Leier (Center for Landbo sundhed, University of North Dakota) for at gøre videoen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 21 G 1 ½ Needle | BD | BD305167 | |
| ACK lysing buffer | Gibco | A10492-01 | |
| Anti-mouse CD11b antibody | Biolegend | 101201 | |
| Anti-mouse Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) antibody | Biolegend | 108401 | |
| C57BL/6 mice | Harlan (Indianapolis) | C57BL/6NHsd | |
| Desk light | General Supply | General Supply | |
| Disinfecting wipes | Clorox | B07NV5JMCS | |
| Electric razor | General Supply | General Supply | |
| ELISA kits (mouse IL-1β, IL-6 and TNFα) | Invitrogen | 88-7013, 88-7064, and 88-7324 | |
| Iodine | Dynarex | B003U463PY | PVP Iodine Wipes |
| Ketamine | FORT DODGE | NDC 0856-2013-01 | Amine hydrochloride injection |
| Laboratory scale | General Supply | General Supply | |
| LB Agar, Miller | Fisher Scientific | BP1425-500 | Molecular genetics, powder |
| Micropipette | ErgoOne | 7100-1100 | |
| Normal saline | General Supply | General Supply | |
| Polylined towel | CardinalHealth, Convertors | 3520 | Surgical drape, sterile, for single use only |
| Silk suture, 4-0 | DAVIS & GECK | 1123-31 | |
| Small animal needle holder | General Supply | General Supply | |
| Small animal surgery scissors | General Supply | General Supply | |
| Small animal surgical forceps | General Supply | General Supply | |
| Staphylococcus aureus | ATCC | 13301 | |
| Warm pad | General Supply | General Supply | |
| Xylazine | Alfa Aesar | 7361-61-7 |
References
- Singer, M., et al. The Third International Consensus Definitions for Sepsis and Septic Shock (Sepsis-3). JAMA. 315 (8), 801-810 (2016).
- Delano, M. J., Ward, P. A. The immune system's role in sepsis progression, resolution, and long-term outcome. Immunological Reviews. 274 (1), 330-353 (2016).
- Mayr, F. B., Yende, S., Angus, D. C.
- Fleischmann, C., et al. Assessment of Global Incidence and Mortality of Hospital-treated Sepsis. Current Estimates and Limitations. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 193 (3), 259-272 (2016).
- Reinhart, K., et al. Recognizing Sepsis as a Global Health Priority - A WHO Resolution. The New England Journal of Medicine. 377 (5), 414-417 (2017).
- Boomer, J. S., et al. Immunosuppression in patients who die of sepsis and multiple organ failure. JAMA. 306 (23), 2594-2605 (2011).
- Hotchkiss, R. S., Monneret, G., Payen, D. Sepsis-induced immunosuppression: from cellular dysfunctions to immunotherapy. Nature Reviews Immunology. 13 (12), 862-874 (2013).
- Dejager, L., Pinheiro, I., Dejonckheere, E., Libert, C. Cecal ligation and puncture: the gold standard model for polymicrobial sepsis? Trends in Microbiology. 19 (4), 198-208 (2011).
- Rittirsch, D., Huber-Lang, M. S., Flierl, M. A., Ward, P. A. Immunodesign of experimental sepsis by cecal ligation and puncture. Nature Protocols. 4 (1), 31-36 (2009).
- Hugunin, K. M. S., Fry, C., Shuster, K., Nemzek, J. A. Effects of tramadol and buprenorphine on select immunologic factors in a cecal ligation and puncture model. Shock. 34 (3), 250-260 (2010).
- He, S., et al. Annexin A2 Modulates ROS and Impacts Inflammatory Response via IL-17 Signaling in Polymicrobial Sepsis Mice. PLoS Pathogens. 12 (7), 23 (2016).
- Pu, Q. Q., et al. Atg7 Deficiency Intensifies Inflammasome Activation and Pyroptosis in Pseudomonas Sepsis. Journal of Immunology. 198 (8), 3205-3213 (2017).
- Zanotti-Cavazzoni, S. L., et al. Fluid resuscitation influences cardiovascular performance and mortality in a murine model of sepsis. Intensive Care Medicine. 35 (4), 748-754 (2009).
- Chin, W., et al. A macromolecular approach to eradicate multidrug resistant bacterial infections while mitigating drug resistance onset. Nature Communications. 9 (1), 917 (2018).
- Nascimento, D. C., et al. IL-33 contributes to sepsis-induced long-term immunosuppression by expanding the regulatory T cell population. Nature Communications. 8, 14919 (2017).
- Deng, D., et al. Systematic investigation on the turning point of over-inflammation to immunosuppression in CLP mice model and their characteristics. International Immunopharmacology. 42, 49-58 (2017).
