Summary
Este protocolo descreve as técnicas para medir os resultados infecciosos que subjacentes infecções hospital-adquiridas secundárias na condição imunossupressores, primeiramente estabelecendo camundongos cecal da ligadura/punctura então desafiando os com infecção intranasal a criar um modelo clinicamente relevante de sepse imunossupressor.
Abstract
A sepse, uma infecção grave e complicada e com risco de vida, caracteriza-se por um desequilíbrio entre respostas pró-inflamatórias e anti-inflamatórios em múltiplos órgãos. Com o desenvolvimento de terapias, a maioria dos pacientes sobrevive à fase hiperinflamatória, mas progride para uma fase imunossupressora, o que aumenta o surgimento de infecções secundárias. Conseqüentemente, a compreensão melhorada da patogénese que subjacente infecções hospital-adquiridas secundárias na fase imunossupressores durante o sepsis é da importância tremenda. Relatado aqui é um modelo para testar os resultados infecciosos, criando infecções de golpe duplo em camundongos. Um procedimento cirúrgico padrão é utilizado para induzir a peritonite polimicrobiana por ligadura cecal e punção (CLP) e seguida por infecção intranasal de Staphylococcus aureus para simular pneumonia ocorrendo na supressão imune que é freqüentemente observada em pacientes sépticos. Este modelo duplo pode refletir o estado imunossupressores que ocorre nos pacientes com sepsis prolongado e susceptibilidade à infecção secundária da pneumonia nosocomial. Assim, este modelo fornece uma abordagem experimental simples para investigar a fisiopatologia da pneumonia bacteriana secundária induzida por sepse, que pode ser utilizada para a descoberta de novos tratamentos para sepse e suas complicações.
Introduction
A sepse inicia uma complexa interação de processos pró-inflamatórios e anti-inflamatórios do hospedeiro e é caracterizada por uma resposta hiperinflamatória e subsequente disfunção imunológica1,2. A sepse representa uma prioridade de saúde global e provoca um elevado número de óbitos em unidades de terapia intensiva (UTI)3. Estima-se que a incidência de sepse exceda 30 milhões casos em todo o mundo por ano, com taxas de mortalidade tão elevadas quanto 30%, apesar dos avanços na gestão da UTI4,5. Em 2017, a Organização Mundial de saúde adotou uma resolução para melhorar a prevenção, o diagnóstico e a gestão desta doença mortal5. No entanto, estudos recentes têm ilustrado que a morte não resulta da infecção primária em pacientes sépticos graves, mas sim da infecção nosocomial secundária (particularmente pneumonia) causada pela imunossupressão6,7 . Portanto, compreender os mecanismos de por que os pacientes sépticos desenvolvem infecção secundária e descobrindo tratamentos mais eficazes são urgentemente necessários. Nisto, um modelo duplo, igualmente sabido como um modelo da dobro-batida, para estudar o fenômeno imunossupressores que ocorre nos pacientes com sepsis protracted é descrito.
Como modelo experimental padrão-ouro em pesquisa sobre sepse polimicrobiana, a ligadura e punção cecal (CLP) é uma cirurgia caracterizada por ligadura e perfuração de caqui, que contribui para a peritonite polimicrobiana e a sepse8,9 . O processo fisiopatológico e os perfis de citocinas, juntamente com a cinética e a magnitude, são semelhantes aos da sepse clínica. A posição da ligadura, o tamanho da agulha utilizada para a punção e o número de punções cecais são fatores importantes que impactam a mortalidade após o CLP.
A pneumonia nosocomial é a principal causa de mortalidade entre pacientes criticamente enfermos com sepse. O principal tipo de organismos causadores de sepse grave inclui Staphylococcus aureus (20,5%), espécies de Pseudomonas (19,9%), Enterobacteriacae (principalmente e. coli, 16,0%) e fungos (19%). Entretanto, estudos recentes sugerem uma incidência crescente de organismos gram-positivos, que agora são quase tão comuns quanto as infecções Gram-negativas3.
O método descrito neste protocolo envolve o CLP, realizado como o "primeiro hit" para induzir a peritonite polimicrobiana subletal, que manifesta uma condição de imunossupressão. O procedimento também envolve a subsequente instilação intranasal de S. aureus como o "segundo hit" para fornecer uma plataforma de pesquisa clinicamente relevante.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todos os métodos aqui descritos foram realizados de acordo com o guia do Instituto Nacional de saúde para o cuidado e uso de animais de laboratório e aprovados pelo Comitê institucional de cuidado e uso de animais da Universidade de Dakota do Norte (IACUC).
1. ligadura e punção cecal
Nota: fêmeas C57BL/6 camundongos (peso, 18-22 g; idade, 6-8 semanas) são divididos aleatoriamente em seis grupos: grupo controle (Ctrl), grupo de infecção (SA para S. aureus), dois grupos Sham, e dois grupos CLP. CTRL animais são deixados sem cirurgia e lesões secundárias infecção. Os animais SA são submetidos à infecção pulmonar por S. aureus sem a operação. Os animais operados por Sham passam pela mesma laparotomia com uma exposição do cálio (exceto que o cálio não é ligado nem perfurado). Oito camundongos por grupo são usados para análise de sobrevida, e três a cinco camundongos são usados para avaliação da inflamação em vários timepoints.
- Antes da cirurgia, esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos e materiais por autoclavagem por 20 min. Limpe e desinfete a tabela de funcionamento com limpezas do desinfetante. Para estabelecer condições estéreis durante a cirurgia, cubra os campos operativos inteiros com as cortinas cirúrgicas estéreis apropriadas, e desgaste uma tampa do cabelo, uma máscara cirúrgica, uns óculos protetores, um vestido cirúrgico, e umas luvas estéreis.
- Pesar e anestesiizar o rato usando 0,1 ml/mouse de cetamina (80 mg/kg), xilazina (10 mg/kg) mistura via intraperitoneal administrado. Com o polegar eo dedo indicador da mão esquerda formando uma posição em forma de U, aproximar o pescoço do mouse de trás suavemente e suavemente, em seguida, segure o pescoço imediatamente atrás das orelhas para que a cabeça do mouse é altamente contido. Use um mindinho para segurar a perna direita do mouse para trás e usar os dedos do meio e anel (todos os dedos da mão esquerda) para segurar o corpo.
- Verifique a intensidade da anestesia por pinça do dedo do pé até nenhuma flexão da extremidade.
- Raspar os quadrantes inferiores do abdômen usando uma navalha elétrica e desinfectar a área com iodo.
- Coloque o mouse sobre a superfície estéril em uma posição supina, com a cabeça orientada para longe do operador. Drape o rato com a toalha estéril com furo sobre a incisão cirúrgica planeada para manter campos estéreis.
- Faça uma incisão longitudinal da pele (aproximadamente 0,5 cm de comprimento) com um bisturi no abdômen mais baixo esquerdo. Use tesouras pequenas para estender a incisão (1-2 cm).
Cuidado: tenha cuidado para não penetrar na cavidade peritoneal. - Faça a incisão intramuscular para obter acesso na cavidade peritoneal e permitir a exposição do cálio com o intestino adjacente.
- Isolar o cálio no lado esquerdo do abdômen (na maioria dos casos, isso é feito usando fórceps anatômico sem corte) e removê-lo em um drapejar estéril, deixando os intestinos pequenos e grandes na cavidade peritoneal.
Cuidado: Evite danificar os vasos sanguíneos mesentéricos. - Ligate o ceco na posição longe do ponto de origem 25% para criar uma infecção prolongada com mortalidade relativamente baixa.
PRECAUÇÃO: Certifique-se de que não ligadura a válvula ileocecal. - Perfure o cálio com uma agulha de 21 G 1 1/2 por punção única através de e-through (dois furos) a meio caminho entre a ligadura e a ponta do cálio na área menos vascularizada.
Cuidado: Certifique-se de não perfurar os vasos sanguíneos. - Retire a agulha. Retire suavemente uma pequena quantidade de fezes dos orifícios de penetração para garantir a perfuração de espessura total.
PRECAUÇÃO: Tome cuidado para não obstruir a continuidade intestinal durante o procedimento. - Substitua o cálio na cavidade abdominal.
- Feche o abdômen em duas camadas com 4-0 suturas cirúrgicas de nylon. Feche a musculatura abdominal aplicando suturas de funcionamento simples e feche a pele aplicando suturas interrompidas simples. Limpe a pele com iodo.
- Injete 1 ml de solução de soro fisiológico normal (ns) pré-aquecido (37 ° c) 0,9% na parte traseira por via subcutânea para substituir a terceira perda de espaço e coloc a em uma almofada morna para recuperar.
- Retorne os ratos na gaiola em uma sala temperatura-controlada (22 ° c) com 12 h ciclos claros/escuros e livre o acesso à comida e à água. Monitore os ratos a cada 0,5 horas por pelo menos 2 h, em seguida, a cada 6 h para pelo menos 2 d, então a cada 12 h por 3 dias, ou eutanizar-los quando moribundo para a análise de sobrevivência.
Nota: a analgesia pré e pós-operatória (buprenorfina, 50 μg/kg por via subcutânea a cada 12 h) é recomendada para 24 h antes da cirurgia até 48 h após a cirurgia9,10.
2. infecção pulmonar secundária por S. aureus
Nota: excepto para os grupos CTRL e SA, os ratos sobreviventes aos 3 dias após o CLP nos grupos Sham e CLP devem ser administrados intranasalmente com 30 μL de uma suspensão bacteriana ou NS, respetivamente. Os ratos sobreviventes do grupo SA devem ser instilados intranasalmente com a suspensão bacteriana.
- Anestesiar o rato, injetando intraperitonealmente 100 μL de solução de cetamina (45mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) e aguarde até que o rato Respire lentamente. O ângulo de punção entre a agulha e a parede abdominal é inferior a 30 ° para a injeção lenta.
- Com a ajuda de uma micropipeta, lentamente e intranasal incutir com 30 μL de 1 x 107 colônia formando unidade (CFU) de S. aureus para ser aspirado em inalação. Segurando o mouse por suas orelhas em uma posição vertical, lentamente, solte 2-3 μL de suspensão bacteriana em ambas as narinas de cada vez. Ajuste a taxa de liberação para permitir que o mouse inspire sem formar bolhas e caindo fora.
- Levante o mouse para cima e para baixo, com a cabeça para cima e cauda para baixo, para ajudar as bactérias entram na traquéia. Mova o mouse para cima rapidamente e fortemente, enquanto movê-lo suavemente e lentamente para aumentar a gravidade. Repita a instilação sobre 15x até que todas as bactérias estejam inaladas, que devem tomar 10-15 minutos para cada rato.
- Coloque o mouse em suas costas e cabeça para cima na cama angular (cerca de 35 °) e ver o mouse até que sua respiração retorna ao normal e é completamente recuperado da anestesia e procedimentos.
- Coloque o mouse de volta na gaiola em uma sala com temperatura controlada (22 ° c) com 12 h de luz/ciclos escuros e acesso ilimitado à comida e água.
- Verifique as condições do mouse a cada 2 h para o primeiro dia e cada 12 h depois de 4 dias após a cirurgia. Eutanizar-los quando moribundo para a análise de sobrevivência ou 24 h após a infecção para a avaliação da inflamação.
3. parâmetros analisados
- Sobrevivência dos ratos
- Monitore os ratos por 7 dias. Eutanizar quando moribundo e gerar curvas de sobrevivência usando métodos de Kaplan-Meier11.
- Contagens bacterianas
- 24 h após a injeção de SA, colher o sangue, fluido de lavagem broncoalveolar (BALF), e fluido de lavagem peritoneal (PLF) dos camundongos. Posteriormente, adicione 100 μl dos diluentes às placas de ágar nutriente e cultive-as a 37 ° c por 24 h para determinar a contagem de colônias bacterianas11,12,13.
- Citocinas
Nota: as concentrações pró-inflamatórias de citocinas de IL-1 β, IL-6 e TNFα no soro e no BALF de camundongos devem ser avaliadas utilizando kits ELISA de acordo com as instruções do fabricante.- Revele a placa de 96 bem ELISA com 100 μL/poço da solução de trabalho diferente do anticorpo da captação para funcionar as normas na duplicata e nas amostras no Triplicate. Sele a placa e deixe-a durante a noite a 4 ° c.
- Lave a placa três vezes com 255 μL/tampão de lavagem do poço (1X PBS, 0, 5% Tween-20).
- Para bloquear a ligação não específica, adicione 200 μL/diluente de poço. Selar a placa e incubar à temperatura ambiente (RT) durante 1 h.
- Prepare a solução padrão: 8 2-Dobre diluições seriais de 1000 pg/mL.
- Adicionar 100 μL/poço de normas ou amostras aos poços adequados e 100 μL/poço de diluente aos poços em branco. Selar a placa e incubar em RT por 2 h ou durante a noite a 4 ° c.
- Lave a placa 5x com 255 μL/tampão de lavagem bem.
- Adicione 100 μL/poço da solução de trabalho diferente do anticorpo da deteção aos poços apropriados. Selar a placa e incubar em RT para 1 h.
- Lave a placa 5x com 255 μL/tampão de lavagem bem.
- Adicionar 100 μL/poço de solução de HRP diluída a todos os poços. Selar a placa e incubar em RT por 30 min.
- Lave a placa 5x com 255 μL/tampão de lavagem bem.
- Adicionar 100 μL/solução de TMB bem diluída. Incubar a placa longe da luz em RT por 15 min.
- Adicionar 50 μL/solução de paragem de poços (1 M H3po4). Leia a absorvência em 450 nanômetro com um leitor da placa.
- Citometria de fluxo
- Obter o número total de células de BALF. Lyse os eritrócitos usando ACK lise buffer e lave 2x usando PBS.
- Analise então as suspensões da único-pilha pelo fluxo citometria como descrito previamente11. Para coloração superficial, neutrófilos de manchas (CD11b + GR-1 +) com anticorpos APC anti-mouse CD11b e anti-mouse GR-1 (ly-6G/ly-6C). Colete um mínimo de 3 x 104 células ao vivo, não-detritos para análise.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dependendo do delineamento experimental e dos procedimentos, os camundongos C57BL/6 foram submetidos ao CLP e, após 3 dias, foram administrados bactérias intranasalmente (Figura 1). Como mostrado na Figura 2, os camundongos começaram a morrer em ~ 12 h após a indução da peritonite. Dois camundongos no grupo CLP + SA e três camundongos no grupo CLP + NS morreram antes da instilação de S. aureus intranasal. Nenhuma mortalidade foi detectada em ratos não-ou Sham-operados não infectados. Portanto, quando camundongos apresentaram CLP antes da pneumonia, a mortalidade foi muito maior (p < 0, 5). Após o desafio das bactérias intranasal (1 x 107 CFU), três de oito ratos sobreviveram nos grupos do SA e do Sham + SA, e quatro de oito ratos sobreviveram no grupo de CLP + NS. No entanto, todos os oito camundongos morreram no grupo CLP + SA. Por outro lado, cada rato no grupo CTRL e grupo Sham + NS sobreviveu. Camundongos CLP mostraram mais mortalidade quando posteriormente desafiados com S. aureus. Mortalidade de S. aureus após CLP (100%) foi maior do que o infectado isoladamente (37,5%) ou S. aureus após Sham-operated (37,5%; p < 0, 5).
Como mostrado na Figura 3, observou-se necrose severa de cécum em animais pós-CLP, mas mais do grupo de dupla batida (CLP + SA). No entanto, não houve alteração grosseira do cálio no controle ou único-hit com grupos de bactérias. O sangue, o BALF, e o PLF foram cultivados para avaliar o afastamento bacteriano do pulmão dos ratos contaminados com S. aureus 3 dias borne-CLP. Esta alta letalidade foi associada com aumento significativo do CFU de S. aureus no sangue e PLF de camundongos CLP em comparação com camundongos Sham (p < 0, 5; Figura 4a,C). O número de S. aureus CFU no sangue e Balf de camundongos CLP + SA foi marcadamente maior que os camundongos CLP + NS (p < 0, 1; Figura 4a,B).
Para citocinas pró-inflamatórias, os resultados mostraram que os níveis de expressão do soro IL-1 β, IL-6 e TNFα aumentaram significativamente a 24 h após a instilação bacteriana em camundongos que sobreviveram à sepse em comparação com os camundongos que realizaram o CLP isoladamente ou com o Sham-operado ratos desafiados com S. aureus (Figura 5a). No entanto, as citocinas pró-inflamatórias aumentaram levemente no BALF de camundongos sépticos com infecção secundária, diferente daquelas dos camundongos infectados pelo controle (camundongos SA) e Sham + SA. Enquanto isso, camundongos de dupla batida exibiram níveis significativamente reduzidos nos níveis de BALF IL-1 β, IL-6 e TNFα em comparação com camundongos SA e Sham + SA (p < 0, 1; Figura 5b).
Como mostrado na Figura 6, os camundongos foram sacrificados a 24 h após a infecção, e a porcentagem relativa de neutrófilos no Balf foi detectada por citometria de fluxo. Camundongos de dupla batida exibiram uma redução significativa dos neutrófilos no BALF em comparação com camundongos submetidos à pneumonia por S. aureus isoladamente. Coletivamente, esses dados mostraram que o CLP prejudica as respostas imunes do hospedeiro, resultando em aumento da suscetibilidade à pneumonia bacteriana secundária.
Figura 1 : Projeto experimental. Os camundongos foram divididos aleatoriamente em seis grupos. Dois grupos foram submetidos à ligadura e punção cecal (CLP) no D0, sendo os demais operados ou não operados. Três dias após a cirurgia (D3), S. aureus [SA, 1 x 107 unidades formando da colônia (CFU)] ou soro fisiológico normal (ns) foi administrado intranasally. Os ratos do grupo de controle (Ctrl) não foram instilados intranasal. O sangue, o líquido broncoalveolar do lavagem (Balf), e o líquido peritoneal do lavagem (PLF) foram colhidos 24 h após a injeção do SA para um ensaio da contagem das bactérias. A taxa de mortalidade em cada grupo foi observada ao longo de 7 dias para a análise de sobrevida. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Sobrevivência do rato. C57BL/6 camundongos submetidos à cirurgia de CLP ou Sham receberam S. aureus (SA) ou soro fisiológico normal (ns) no terceiro dia após a cirurgia (n = 8 camundongos por grupo). Os camundongos foram monitorados por 7 dias, e a mortalidade foi registrada a cada 12 h. curvas de sobrevida de Kaplan-Meier, teste de log-rank (* p < 0, 5) em comparação com camundongos Sham + SA e camundongos SA. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Cecum do rato. A infecção secundária foi induzida 3 dias após o CLP. 24 h após a infecção do SA, os ratos foram sacrificados para coletar tecidos do cólon. As fotos representativas da ligadura cecal ferimento diferente batem são mostradas. SA = S. aureus; Ns = soro fisiológico normal; CLP = ligadura cecal e punção. Barra de escala = 1 cm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Contagens bacterianas e imagens representativas de placas de agar. 3 dias após a cirurgia, os ratos foram instilados intranasal com 1 x 107 CFU de S. aureus (SA) (n ≥ 3 ratos por o grupo). O sangue, o BALF, e o PLF foram colhidos 24 h após a injeção do SA, e as contagens bacterianas da colônia foram determinadas após 24 h da incubação. Os resultados são expressos em média ± SEM. ANOVA One-Way (post hoc de Tukey; * p < 0, 5; * * p < 0, 1; * * * p < 0, 1; NS = não significante). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 : Elisa que detecta a secreção de citocinas. A infecção secundária foi induzida 3 dias após o CLP. Concentrações de IL-1 β, IL-6 e TNFα no soro (a) e Balf (B) de camundongos após infecção por SA (n ≥ 3 camundongos por grupo). Os dados são apresentados como a média ± SEM de três experimentos. ANOVA One-Way (post hoc de Tukey; * p < 0, 5; * * p < 0, 1; * * * * p < 0, 1; NS = não significativo). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6 : Frequência representativa da penetração de neutrófilos. 24 h após infecção intranasal, os camundongos foram sacrificados para obtenção de BALF (n ≥ 3 camundongos por grupo). A porcentagem de neutrófilos (CD11b+, GR-1+) foi quantificada por citometria de fluxo e mostra-se como médias ± sem de três experimentos. ANOVA One-Way (post hoc de Tukey; * * * * p < 0, 1; NS = não significante). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Como o modelo padrão-ouro para a pesquisa de sepse, o CLP tem uma combinação de três insultos, incluindo trauma tecidual causado pela laparotomia, necrose devido à ligadura do cálio, e infecção como resultado de vazamento microbiano que causa peritonite com translocação de bactérias no sangue8. Portanto, o CLP imita a complexidade da sepse humana melhor do que muitos outros modelos. No entanto, uma das principais limitações do modelo CLP atual é a incapacidade de refletir a fase mais prolongada da sepse observada em pacientes internados em UTI3,4,5. Assim, um modelo duplo clinicamente relevante (modelo de dupla batida) foi proposto para refletir a mortalidade tardia da sepse e investigar os mecanismos subjacentes à infecção secundária pulmonar. Neste protocolo, a sepse foi induzida pela combinação de CLP com infecção pulmonar por S. aureus aos 3 dias pós-CLP. Camundongos de dois acertos exibiram maior mortalidade, dano de cálio severo, sangue enfraquecido, folgas de bactérias BALF, citocinas pró-inflamatórias inferiores e neutrófilos inferiores em BALF. Isto conduziu ao sepsis severo, que imita o status do imunossupressão nas clínicas.
As descrições a seguir são etapas críticas. Mostrado em detalhe é como produzir sepse subletal nas mesmas condições. Em primeiro lugar, camundongos fêmeas foram usados porque camundongos fêmeas são mais resistentes ao CLP do que camundongos machos11. Segundo, a mortalidade induzida por CLP depende de vários parâmetros técnicos, como o comprimento do cécum ligado, o tamanho da agulha e o número de punções cecais9. A ligadura de aproximadamente 75% do caqui induz sepse grave, a ligadura de 60% do caqui induz sepse de nível médio, e a ligadura de 25% ou menos do caqui resulta em sepse menor9. Optou-se por padronizar o modelo realizando uma punção leve de CLP (25%, simples através de e-through com uma agulha de 21 G 1 1/2) para induzir sepse subletal11,12. Em terceiro lugar, a ressuscitação fluida é recomendada para evitar choque e morte rápida devido ao colapso da circulação e desenvolver um modelo de sepse animal hiperdinâmico, que mais estreitamente imita o perfil hemodinâmico da sepse humana13. Adicionalmente, o uso de analgésicos, como a buprenorfina, deve ser considerado a partir de um ponto de vista experimental e ético10.
Três dias após o CLP foi escolhido como um temporal para induzir a infecção secundária para refletir a fase imunossupressores do sepsis. A maioria dos pacientes com sepse tem um curso hospitalar prolongado com a maioria das mortes ocorrendo além de 3 dias, e muitos então entram em pneumonia secundária adquirida no hospital, o que foi consistentemente demonstrado em um estudo recente com CLP junto com P. aeruginosa14 . Os resultados anteriores de outros laboratórios também demonstram que 3 dias após o CLP, camundongos mostram alta sensibilidade a bactérias secundárias instiladas, e um dia após a infecção foi o ponto de viragem de excesso de inflamação para imunossupressão15, a 16.
Além disso, as diferenças nas cepas de bactérias e na dosagem instiladas são fatores significativos que causam variabilidade no modelo duplo. A seleção de níveis de deformação e dose baseia-se nas necessidades do experimento experimental de infecção secundária durante o estado imunossupressor. Com base em achados prévios, foram selecionados 1 x 107 CFU de S. aureus para este estudo.
Para melhorar a eficiência da entrega bacteriana intranasal diretamente nos pulmões do rato, a atenção deve ser dada ao volume da instilação, ao tempo, e à posição do corpo. Existem outras questões operacionais que podem influenciar enormemente o resultado do experimento. Estes incluem segurando o rato ereto, administrando o líquido da múltiplo-baixo-dose das bactérias em ambas as narinas separada durante cada instilação, prestando atenção à inalação do líquido sem dar forma a bolhas, controlando a velocidade da inalação; movendo o mouse para cima rapidamente, em seguida, para baixo lentamente, e colocando o mouse em um ângulo de 45 ° para recuperar de instilação. A administração de bactérias intranasais é não invasiva e ajuda a prevenir asfixia, aumentar a acessibilidade, melhorar a segurança e minimizar os ferimentos cirúrgicos.
No entanto, esse método tem suas limitações. Como este é um estudo metodológico, os dados não foram discutidos sobre as alterações dos sinais clínicos; citocinas anti-inflamatórias; e quantidade e função de monócitos, neutrófilos e linfócitos no sangue. Camundongos de laboratório são frequentemente incriados, têm idades e pesos semelhantes, são alojados em instalações específicas sem patógenos, e comumente não têm comorbidades, como imunossupressão pré-existente. No entanto, diferentes gêneros, idade, estado imunológico e nutricional e possível tratamento adjuvante, como antibióticos de pacientes, podem resultar em desfechos clínicos heterogêneos. Considerando a heterogeneidade de pacientes humanos, variáveis como idade, peso, doenças pré-existentes e cuidados clínicos de suporte devem ser cuidadosamente observadas.
O desenvolvimento deste modelo duplo (modelo de dupla batida) é oportuno e importante para a comunidade de pesquisa de infecção e imunidade porque se assemelha à progressão da fase hiper-inflamatória de sepse humana. Reflete o scenario clínico comum de uma pneumonia nosocomial secundária nos pacientes com sepsis mais exatamente. Este modelo pode ajudar a desenvolver novas estratégias terapêuticas para imunossupressão induzida por sepse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm conflitos financeiros de interesse.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelos institutos nacionais de subsídios à saúde R01 AI138203-01, AI109317-04, AI101973-01 e AI097532-01A1 para M. W. As instalações da Universidade de North Dakota Core foram apoiadas por subsídios NIH (INBRE P20GM103442 e COBRE P20GM113123). Este trabalho foi apoiado igualmente pelo programa chave da Fundação Nacional da ciência da natureza de China (81530063) a Jianxin Jiang. Os financiadores não tiveram papel no desenho do estudo, coleta e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. Agradecemos a Marvin Leier (centro de saúde rural, Universidade de Dakota do Norte) por fazer o vídeo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 21 G 1 ½ Needle | BD | BD305167 | |
| ACK lysing buffer | Gibco | A10492-01 | |
| Anti-mouse CD11b antibody | Biolegend | 101201 | |
| Anti-mouse Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) antibody | Biolegend | 108401 | |
| C57BL/6 mice | Harlan (Indianapolis) | C57BL/6NHsd | |
| Desk light | General Supply | General Supply | |
| Disinfecting wipes | Clorox | B07NV5JMCS | |
| Electric razor | General Supply | General Supply | |
| ELISA kits (mouse IL-1β, IL-6 and TNFα) | Invitrogen | 88-7013, 88-7064, and 88-7324 | |
| Iodine | Dynarex | B003U463PY | PVP Iodine Wipes |
| Ketamine | FORT DODGE | NDC 0856-2013-01 | Amine hydrochloride injection |
| Laboratory scale | General Supply | General Supply | |
| LB Agar, Miller | Fisher Scientific | BP1425-500 | Molecular genetics, powder |
| Micropipette | ErgoOne | 7100-1100 | |
| Normal saline | General Supply | General Supply | |
| Polylined towel | CardinalHealth, Convertors | 3520 | Surgical drape, sterile, for single use only |
| Silk suture, 4-0 | DAVIS & GECK | 1123-31 | |
| Small animal needle holder | General Supply | General Supply | |
| Small animal surgery scissors | General Supply | General Supply | |
| Small animal surgical forceps | General Supply | General Supply | |
| Staphylococcus aureus | ATCC | 13301 | |
| Warm pad | General Supply | General Supply | |
| Xylazine | Alfa Aesar | 7361-61-7 |
References
- Singer, M., et al. The Third International Consensus Definitions for Sepsis and Septic Shock (Sepsis-3). JAMA. 315 (8), 801-810 (2016).
- Delano, M. J., Ward, P. A. The immune system's role in sepsis progression, resolution, and long-term outcome. Immunological Reviews. 274 (1), 330-353 (2016).
- Mayr, F. B., Yende, S., Angus, D. C.
- Fleischmann, C., et al. Assessment of Global Incidence and Mortality of Hospital-treated Sepsis. Current Estimates and Limitations. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 193 (3), 259-272 (2016).
- Reinhart, K., et al. Recognizing Sepsis as a Global Health Priority - A WHO Resolution. The New England Journal of Medicine. 377 (5), 414-417 (2017).
- Boomer, J. S., et al. Immunosuppression in patients who die of sepsis and multiple organ failure. JAMA. 306 (23), 2594-2605 (2011).
- Hotchkiss, R. S., Monneret, G., Payen, D. Sepsis-induced immunosuppression: from cellular dysfunctions to immunotherapy. Nature Reviews Immunology. 13 (12), 862-874 (2013).
- Dejager, L., Pinheiro, I., Dejonckheere, E., Libert, C. Cecal ligation and puncture: the gold standard model for polymicrobial sepsis? Trends in Microbiology. 19 (4), 198-208 (2011).
- Rittirsch, D., Huber-Lang, M. S., Flierl, M. A., Ward, P. A. Immunodesign of experimental sepsis by cecal ligation and puncture. Nature Protocols. 4 (1), 31-36 (2009).
- Hugunin, K. M. S., Fry, C., Shuster, K., Nemzek, J. A. Effects of tramadol and buprenorphine on select immunologic factors in a cecal ligation and puncture model. Shock. 34 (3), 250-260 (2010).
- He, S., et al. Annexin A2 Modulates ROS and Impacts Inflammatory Response via IL-17 Signaling in Polymicrobial Sepsis Mice. PLoS Pathogens. 12 (7), 23 (2016).
- Pu, Q. Q., et al. Atg7 Deficiency Intensifies Inflammasome Activation and Pyroptosis in Pseudomonas Sepsis. Journal of Immunology. 198 (8), 3205-3213 (2017).
- Zanotti-Cavazzoni, S. L., et al. Fluid resuscitation influences cardiovascular performance and mortality in a murine model of sepsis. Intensive Care Medicine. 35 (4), 748-754 (2009).
- Chin, W., et al. A macromolecular approach to eradicate multidrug resistant bacterial infections while mitigating drug resistance onset. Nature Communications. 9 (1), 917 (2018).
- Nascimento, D. C., et al. IL-33 contributes to sepsis-induced long-term immunosuppression by expanding the regulatory T cell population. Nature Communications. 8, 14919 (2017).
- Deng, D., et al. Systematic investigation on the turning point of over-inflammation to immunosuppression in CLP mice model and their characteristics. International Immunopharmacology. 42, 49-58 (2017).
