Summary
Questo protocollo descrive le tecniche per misurare gli esiti infettivi alla base delle infezioni ospedaliere secondarie acquisite in ospedale nella condizione immunosoppressiva, prima istituendo topi di legatura/foratura della ceca e poi sfidandoli con infezioni intranasali creare un modello clinicamente rilevante di sepsi immunosoppressione.
Abstract
La sepsi, un'infezione pericolosa per la vita grave e complicata, è caratterizzata da uno squilibrio tra risposte pro e antinfiammatorie in più organi. Con lo sviluppo delle terapie, la maggior parte dei pazienti sopravvive alla fase iperinfiammatoria, ma progredisce verso una fase immunosoppressiva, che aumenta l'emergere di infezioni secondarie. Pertanto, una migliore comprensione della patogenesi alla base delle infezioni ospedaliere secondarie acquisite in ospedale nella fase immunosoppressiva durante la sepsi è di enorme importanza. Segnalato qui è un modello per testare i risultati infettivi creando infezioni a doppio colpo nei topi. Una procedura chirurgica standard viene utilizzata per indurre la peritonite polimicrobica mediante legatura e puntura (CLP) e seguita da un'infezione intranasale dello Staphylococcus aureus per simulare la polmonite che si verifica nella soppressione immunitaria che si vede frequentemente in pazienti settici. Questo doppio modello può riflettere lo stato immunosoppressivo che si verifica in pazienti con sepsi prolungata e suscettibilità all'infezione secondaria da polmonite nosocomiale. Quindi, questo modello fornisce un semplice approccio sperimentale per studiare la fisiopatologia della polmonite batterica secondaria indotta dalla sepsi, che può essere utilizzata per scoprire nuovi trattamenti per la sepsi e le sue complicazioni.
Introduction
Sepsis avvia un complesso gioco di processi pro-infiammatori e antinfiammatori dell'ospite ed è caratterizzato da una risposta iperinfiammatoria e dalla conseguente disfunzione immunitaria1,2. La sepsi rappresenta una priorità sanitaria globale e causa un elevato numero di decessi nelle unità di terapia intensiva (ICU)3. Si stima che l'incidenza della sepsi superi i 30 milioni di casi in tutto il mondo all'anno, con tassi di mortalità fino al 30% nonostante i progressi nella gestione delle unità di terapia intensiva4,5. Nel 2017, l'Organizzazione Mondiale della Sanità ha adottato una risoluzione per migliorare la prevenzione, la diagnosi e la gestione di questa malattia mortale5. Tuttavia, studi recenti hanno dimostrato che la morte non deriva da infezione primaria in pazienti settici gravi, ma piuttosto da infezione nosocomiale secondaria (in particolare polmonite) causata dall'immunosoppressione6,7 . Pertanto, è urgente comprendere i meccanismi del perché i pazienti settici sviluppano infezioni secondarie e scoprono trattamenti più efficaci. Qui, viene descritto un doppio modello, noto anche come modello a doppio colpo, per studiare il fenomeno immunosoppressivo che si verifica nei pazienti con sepsi prolungata.
Poiché il modello sperimentale gold standard nella ricerca sulla sepsi polimicrobica, la legatura e la puntura della ceca (CLP) è un intervento chirurgico caratterizzato da legatura e perforazione del cecum, che contribuisce alla peritonite polimicrobica e alla sepsi8,9 . Il processo patofisiologico e i profili di citochina, insieme alla cinetica e alla grandezza, sono simili alla sepsi clinica. La posizione della legatura, la dimensione dell'ago utilizzato per la puntura e il numero di forature del ceca sono fattori importanti che influenzano la mortalità dopo il CLP.
La polmonite nosocomiale è la principale causa di mortalità tra i pazienti gravemente malati di sepsi. Il principale tipo di organismi che causano sepsi grave sono lo Staphylococcus aureus (20,5%), le specie Pseudomonas (19,9%), le Enterobacteriacae (principalmente E. coli, 16,0%) e i funghi (19%). Nel frattempo, studi recenti hanno suggerito una crescente incidenza di organismi gram-positivi, che ora sono quasi altrettanto comuni delle infezioni gram-negative3.
Il metodo descritto in questo protocollo coinvolge CLP, eseguito come il "primo colpo" per indurre peritonite polimicrobica subletale, che manifesta una condizione di immunosoppressione. La procedura comporta anche la successiva instillazione intranasale di S. aureus come il "secondo colpo" per fornire una piattaforma di ricerca clinicamente rilevante.
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Protocol
Tutti i metodi qui descritti sono stati eseguiti in conformità con il National Institute of Health Guide for Care and Use of Laboratory Animals e approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali da parte dell'Università del Dakota del Nord (IACUC).
1. Legatura e puntura Cecal
NOTA: I topi femminili C57BL/6 (peso, 18-22 g; età, 6-8 settimane) sono suddivisi in sei gruppi: gruppo di controllo (Ctrl), gruppo di infezioni (SA per S. aureus),due gruppi fittizi e due gruppi CLP. Gli animali Ctrl vengono lasciati senza intervento chirurgico e lesioni secondarie alle infezioni. Gli animali SA sono sottoposti a infezione polmonare S. aureus senza l'operazione. Gli animali operati da ham subiscono la stessa laparotomia con un'esposizione del cecum (tranne che il cecum non è né legato né forato). Otto topi per gruppo vengono utilizzati per l'analisi della sopravvivenza e da tre a cinque topi vengono utilizzati per la valutazione dell'infiammazione in vari momenti.
- Prima dell'intervento, sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici e i materiali autoclaving per 20 min. Pulire e disinfettare la tabella operatoria con salviette disinfettanti. Per stabilire condizioni sterili durante l'intervento chirurgico, coprire tutti i campi operativi con tende chirurgiche sterili appropriate, e indossare una copertura per capelli, maschera chirurgica, occhiali protettivi, abito chirurgico, e guanti sterili.
- Pesare e anestesizzare il topo utilizzando 0,1 mL/topo di ketamina (80 mg/kg), xilazina (10 mg/kg) miscela somministrata intraperitonealmente. Con il pollice e l'indice della mano sinistra che formano una posizione a forma di U, avvicinati al collo del mouse da dietro senza intoppi e delicatamente, quindi tieni il collo immediatamente dietro le orecchie in modo che la testa del topo sia altamente contenuta. Utilizzare un mignolo per tenere la gamba posteriore destra del mouse e utilizzare il medio e l'anulare (tutte le dita dalla mano sinistra) per tenere il corpo.
- Controllare l'intensità dell'anestesia da pizzico di punta fino a quando non si flette l'estremità.
- Rasare i quadranti inferiori dell'addome utilizzando un rasoio elettrico e disinfettare l'area con iodio.
- Posizionare il mouse sulla superficie sterile in posizione supina, con la testa orientata lontano dall'operatore. Drappo il mouse con asciugamano sterile con foro sopra l'incisione chirurgica prevista per mantenere campi sterili.
- Fare un'incisione longitudinale della pelle (circa 0,5 cm di lunghezza) con un bisturi nell'addome inferiore sinistro. Utilizzare piccole forbici per estendere l'incisione (1-2 cm).
AVVISO: Fare attenzione a non penetrare nella cavità peritoneale. - Fare l'incisione intramuscolare per ottenere l'accesso nella cavità peritoneale e consentire l'esposizione del cecum con l'intestino adiacente.
- Isolare il cecum sul lato sinistro dell'addome (nella maggior parte dei casi, questo viene fatto utilizzando pinze anatomiche smussate) e rimuoverlo su un drappo sterile, lasciando l'intestino piccolo e grande nella cavità peritoneale.
AVVISO: Evitare di danneggiare i vasi sanguigni mesborici. - Ligate il cecum nella posizione distale 25% per creare un'infezione prolungata con mortalità relativamente bassa.
AVVISO: Assicurarsi di non legate la valvola ileocecal. - Perforare il cecum con un 21 G 1 1/2 ago per singola foratura attraverso-e-through (due fori) a metà strada tra la legatura e la punta del cecum nella zona meno vascolarizzata.
AVVISO: Assicurarsi di non forare i vasi sanguigni. - Rimuovere l'ago. Estrudere delicatamente una piccola quantità di feci dai fori di penetrazione per garantire la perforazione a pieno spessore.
AGGIORNAMENTO: Fare attenzione a non ostacolare la continuità intestinale durante la procedura. - Sostituire il cecum nella cavità addominale.
- Chiudere l'addome in due strati con suture chirurgiche in nylon 4-0. Chiudere la muscolatura addominale applicando semplici suture di corsa e chiudere la pelle applicando semplici suture interrotte. Pulire la pelle con iodio.
- Iniettare 1 mL di soluzione salina normale (NS) sterile preriscaldata (37 gradi centigradi) sulla schiena sottocutaneamente per sostituire la terza perdita di spazio e posizionarla su un cuscinetto caldo per recuperarla.
- Riportare i topi in gabbia in una stanza a temperatura controllata (22 gradi centigradi) con cicli di luce/buio di 12 h e libero accesso al cibo e all'acqua. Monitorare i topi ogni 0,5 ore per almeno 2 h, quindi ogni 6 h per almeno 2 d, quindi ogni 12 h per 3 giorni, o eutanasia quando moribondi per l'analisi di sopravvivenza.
NOTA: L'analgesia pre e post-operatoria (buprenorfina, 50 g/kg sottocutaneamente ogni 12 h) è raccomandata per 24 ore prima dell'intervento fino alle 48 ore dopo l'intervento chirurgico9,10.
2. Infezione polmonare secondaria con S. aureus
NOTA: ad eccezione dei gruppi Ctrl e SA, i mouse sopravvissuti a 3 giorni dopo la CLP nei gruppi sham e CLP devono essere somministrati intranasalmente con 30 - L di una sospensione batterica o NS, rispettivamente. I topi sopravvissuti del gruppo SA devono essere instillati intranasalmente con la sospensione batterica.
- Anestesizzare il topo iniettando intraperitonealmente una soluzione di chetamina (45mg/kg) e xylazina (10 mg/kg) e attendere che il mouse respiri lentamente. L'angolo di puntura tra l'ago e la parete addominale è inferiore a 30 gradi per un'iniezione lenta.
- Con l'aiuto di una micropipetta, instillare lentamente e intranasalmente con 30 -L di 1 x 107 unità formanti colonia (CFU) di S. aureus da aspirare durante l'inalazione. Tenendo il mouse per le orecchie in posizione eretta, diminuire lentamente 2-3 - L di sospensione batterica in entrambe le narici ogni volta. Regolare la velocità di rilascio per consentire al mouse di inalare senza formare bolle e cadere.
- Sollevare il mouse su e giù, con la testa su e la coda verso il basso, per aiutare i batteri a entrare nella trachea. Spostare il mouse rapidamente e fortemente, muovendolo verso il basso delicatamente e lentamente per aumentare la gravità. Ripetere l'instillazione di circa 15x fino a quando tutti i batteri sono inalati, che dovrebbe prendere 10-15 min per ogni topo.
- Posare il mouse sulla schiena e dirigersi verso l'alto sulla biancheria da letto angolata (circa 35 gradi) e guardare il mouse fino a quando il suo respiro torna alla normalità ed è completamente recuperato dall'anestesia e dalle procedure.
- Rimettere il mouse nella gabbia in una stanza a temperatura controllata (22 gradi centigradi) con cicli di luce/buio di 12 h e accesso illimitato al cibo e all'acqua.
- Controllare le condizioni del mouse ogni 2 h per il primo giorno e ogni 12 h in seguito per 4 giorni dopo l'intervento chirurgico. Eutanasia quando moribondo per l'analisi di sopravvivenza o 24 h dopo l'infezione per la valutazione dell'infiammazione.
3. Parametri analizzati
- Sopravvivenza dei topi
- Monitorare i topi per 7 giorni. Eutanasia quando moribonda e generare curve di sopravvivenza utilizzando metodi Kaplan-Meier11.
- Conteggi batterici
- 24 h dopo l'iniezione di SA, raccogliere il sangue, il liquido di lavaggio bronchoalveolar (BALF) e il liquido di lavaggio peritoneale (PLF) dai topi. In seguito, aggiungere 100 l diluenti a piastre di agar nutrienti e colture a 37 gradi centigradi per 24 h per determinare la colonia batterica conta11,12,13.
- Citochine
NOTA: Le concentrazioni di citochine pro-infiammatorie di IL-1, IL-6 e TNF nel siero e BALF dai topi devono essere valutate utilizzando i kit ELISA secondo le istruzioni del produttore.- Coprire la piastra ELISA da 96 pozzetto con 100 gradi di una diversa soluzione di lavoro anticorpale di cattura per eseguire gli standard in duplicati e campioni in triplice copia. Sigillare la piastra e lasciarla per una notte a 4 gradi centigradi.
- Lavare la piastra tre volte con 255 tampone di lavaggio lassista/ello (1x PBS, 0,05% Tween-20).
- Per bloccare l'associazione non specifica, aggiungere 200 l/well diluente. Sigillare la piastra e incubare a temperatura ambiente (RT) per 1 h.
- Preparare la soluzione standard: otto diluizioni seriali biduna da 1000 pg/mL.
- Aggiungete 100/pozze l/pozzetto di standard o campioni ai pozzi appropriati e a 100 gradi di diluente ai pozze tè vuoto. Sigillare la piastra e incubare a RT per 2 ore o peruna per una notte a 4 gradi centigradi.
- Lavare la piastra 5x con un buffer da 255 l/benlavare.
- Aggiungete 100 l/po di soluzione di lavoro anticorpale di rilevamento diversa ai pozzi appropriati. Sigillare la piastra e incubare a RT per 1 ora.
- Lavare la piastra 5x con un buffer da 255 l/benlavare.
- Aggiungere 100 l/podi di soluzione HRP diluita a tutti i pozzetto. Sigillare la piastra e incubare a RT per 30 min.
- Lavare la piastra 5x con un buffer da 255 l/benlavare.
- Aggiungete 100 TMB l/ben diluiti. Incubare la piastra lontano dalla luce a RT per 15 min.
- Aggiungete 50 soluzione l/stop ben (1 M H3PO4). Assorbimento in lettura a 450 nm con un lettore di lastre.
- Citometria di flusso
- Ottenere il numero totale di celle da BALF. Eseguire il lyse degli eritrociti utilizzando il buffer liscitale ACK e lavare 2x utilizzando PBS.
- Analizzare quindi le sospensioni a cella singola per citometria di flusso come descritto in precedenza11. Per la colorazione superficiale, neutrofili macchiati (CD11b-GR-1) con anticorpi APC anti-topo CD11b e gr-1 antitopo (Ly-6G/Ly-6C). Raccogliere un minimo di 3 x 104 cellule vive, non-debris per l'analisi.
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Representative Results
A seconda della progettazione e delle procedure sperimentali, i topi C57BL/6 sono stati sottoposti a CLP e, dopo 3 giorni, sono stati somministrati batteri per via intranasale (Figura1). Come mostrato nella Figura 2, i topi hanno cominciato a morire a 12 h dopo l'induzione della peritonite. Due topi del gruppo CLP-SA e tre topi del gruppo CLP-NS sono morti prima dell'instillazione intranasale S. aureus. Nessuna mortalità è stata rilevata in topi non infetti o con finta. Pertanto, quando i topi avevano CLP prima della polmonite, la mortalità era molto più alta (p < 0,05). Dopo la sfida dei batteri intranasali (1 x 107 CFU), tre degli otto topi sopravvissero sia nei gruppi SA che Sham-SA, e quattro degli otto topi sopravvissero nel gruppo CLP-NS. Tuttavia, tutti e otto i topi sono morti nel gruppo CLP-SA. Al contrario, tutti i mouse del gruppo Ctrl e del gruppo Sham-NS sono sopravvissuti. I topi CLP hanno mostrato più mortalità quando successivamente sono stati messi in discussione con S. aureus. Mortalità di S. aureus dopo CLP (100%) è stato superiore al solo infetto (37,5%) o S. aureus dopo l'opera di sham (37,5%; p < 0,05).
Come mostrato nella Figura 3, è stata osservata una grave necrosi di caecum negli animali post-CLP, ma più ancora dal gruppo a doppio colpo (CLP-SA). Tuttavia, non c'è stato alcun cambiamento grossolano del cecum in controllo o single-hit con gruppi di batteri. Sangue, BALF e PLF sono stati colti per valutare la clearance batterica polmonare dei topi infettati da S. aureus 3 giorni dopo il CLP. Questa elevata letalità è stata associata a un aumento significativo della CFU S. aureus nel sangue e al PLF dei topi CLP rispetto ai topi finti (p < 0,05; Figura 4A,C). Il numero di CFU S. aureus nel sangue e BALF di topi CLP-SA è stato notevolmente maggiore di mouse CLP-NS (p < 0.01; Figura 4A,B).
Per le citochine pro-infiammatorie, i risultati hanno mostrato che i livelli di espressione del siero IL-1, IL-6 e TNF sono aumentati significativamente a 24 ore dopo l'instillazione batterica nei topi sopravvissuti alla sepsi rispetto ai topi che hanno subito il CLP da soli o con mouse contestato con S. aureus (Figura 5A). Tuttavia, le citochine pro-infiammatorie sono leggermente aumentate in BALF di topi settici con infezione secondaria, diverse da quelle nei topi infetti dal controllo (topi SA) e Sham-SA. Nel frattempo, i topi a doppio colpo hanno mostrato livelli significativamente diminuiti nei livelli di BALF IL-1, IL-6 e TNF rispetto ai topi SA e Sham-SA (p < 0.001; Figura 5B).
Come mostrato nella Figura 6, i topi sono stati sacrificati a 24 h dopo l'infezione, e la percentuale relativa di neutrofili in BALF è stata rilevata dalla citometria di flusso. I topi a doppio colpo hanno mostrato una significativa riduzione dei neutrofili nel BALF rispetto ai topi che hanno subito la sola polmonite di S. aureus. Collettivamente, questi dati hanno mostrato che il CLP compromette le risposte immunitarie dell'ospite, con conseguente aumento della suscettibilità alla polmonite batterica secondaria.
Figura 1 : Progettazione sperimentale. I topi sono stati divisi casualmente in sei gruppi. Due gruppi hanno subito la legatura e la puntura del ceca (CLP) a D0, mentre gli altri sono stati gestiti o non gestiti. Tre giorni dopo l'intervento chirurgico (D3), S. aureus [SA, 1 x 107 unità formanti colonia (CFU)] o normale salina (NS) è stato somministrato intranasalmente. I topi del gruppo di controllo (Ctrl) non sono stati instillati intranasalmente. Sangue, liquido di lavage bronchoalveolar (BALF) e liquido di lavage peritoneale (PLF) sono stati raccolti 24 h dopo l'iniezione di SA per un saggio di conteggio batterico. Il tasso di mortalità in ogni gruppo è stato osservato nel corso di 7 giorni per l'analisi della sopravvivenza. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Sopravvivenza del mouse. I topi C57BL/6 sottoposti a CLP o a un intervento chirurgico fittizio hanno ricevuto S. aureus (SA) o salina normale (NS) il terzo giorno dopo l'intervento chirurgico (n x 8 topi per gruppo). I topi sono stati monitorati per 7 giorni, e la mortalità è stata registrata ogni 12 h. curve di sopravvivenza Kaplan-Meier, test log-rank (p < 0,05) rispetto ai topi Sham-SA e ai topi SA. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Cecum del mouse. L'infezione secondaria è stata indotta 3 giorni dopo il PPL. 24 h dopo l'infezione Da SA, i topi sono stati sacrificati per raccogliere i tessuti del colon. Vengono mostrate le foto rappresentative della legatura cecal in caso di diversi infortuni. SA - S. aureus; NS - normale salina; CLP - legatura e foratura del ceca. Barra della scala: 1 cm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : Conteggi batterici e immagini rappresentative di piastre di agar. 3 giorni dopo l'intervento chirurgico, i topi sono stati instillati intranasalmente con 1 x 107 CFU di S. aureus (SA) (n - 3 topi per gruppo). Sangue, BALF e PLF sono stati raccolti 24 h dopo l'iniezione di SA, e i conteggi delle colonie batteriche sono stati determinati dopo 24 h di incubazione. I risultati sono espressi come media : SEM. ANOVA unidirezionale (Post hoc di Tukey; .p < 0.05; .p < 0.01; .p < 0.001; ns - non significativo). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5 : secrezione citochina che rileva ELISA. L'infezione secondaria è stata indotta 3 giorni dopo il PPL. Concentrazioni di IL-1, IL-6 e TNF nel siero (A) e BALF (B) dai topi dopo l'infezione da SA (n - 3 topi per gruppo). I dati sono presentati come la media : SEM di tre esperimenti. Unidirezionale ANOVA (Tukey's post hoc; < 0.05; .p < 0.01; .p < 0.0001; ns - non è significativo). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6 : Frequenza rappresentativa di penetrazione dei neutrofili. 24 h dopo l'infezione intranasale, i topi sono stati sacrificati per ottenere BALF (n 3 topi per gruppo). La percentuale di neutrofili (CD11b,GR-1)è stata quantificata dalla citometria di flusso e sono indicati come mezzi: SEM di tre esperimenti. Unidirezionale ANOVA (tukey's post hoc; . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Come modello standard d'oro per la ricerca sulla sepsi, il CLP ha una combinazione di tre insulti, tra cui il trauma tissutale causato dalla laparotomia, la necrosi dovuta alla legatura del cecum e l'infezione a causa di perdite microbiche che causano peritonite con traslocazione di batteri nel sangue8. Pertanto, CLP imita la complessità della sepsi umana meglio di molti altri modelli. Tuttavia, una delle principali limitazioni dell'attuale modello CLP è l'incapacità di riflettere la fase più prolungata della sepsi osservata nei pazienti in terapia intensiva3,4,5. Di conseguenza, è stato proposto un modello duale clinicamente rilevante (modello a doppio colpo) per riflettere la mortalità ritardata della sepsi e studiare i meccanismi alla base dell'infezione secondaria polmonare. In questo protocollo, la sepsi è stata indotta combinando CLP con S. aureus infezione polmonare a 3 giorni dopo Il CLP. I topi a due colpi hanno mostrato una maggiore mortalità, gravi danni al cecum, sangue indebolito, spazi di batteri BALF, citochine pro-infiammatorie più basse e neutrofili inferiori in BALF. Ciò ha provocato la sepsi grave, che imita lo stato di immunosoppressione nelle cliniche.
Le descrizioni seguenti sono passaggi critici. Mostrato in dettaglio è come produrre sepsi sublethal nelle stesse condizioni. In primo luogo, sono stati usati topi femminili perché i topi femminili sono più resistenti al CLP rispetto ai topi maschi11. In secondo luogo, la mortalità indotta da CLP dipende da diversi parametri tecnici, come la lunghezza del cecum ligated, la dimensione dell'ago e il numero di forature cecali9. La legatura di circa il 75% del cecum induce sepsi grave, legatura del 60% del cecum induce sepsi di livello medio, e legatura del 25% o meno del cecum si traduce in sepsi minore9. È stato scelto di standardizzare il modello eseguendo un CLP lieve (25%, una singola puntura attraverso e attraverso con un21 G 1 1/2 ago) per indurre la sepsi sublethal1,12. In terzo luogo, la rianimazione dei fluidi è raccomandata per prevenire gli urti e la morte rapida a causa del collasso della circolazione e sviluppare un modello di sepsi animale iperdinamica, che imita più da vicino il profilo emodinamico della sepsi umana13. Inoltre, l'uso di analgesici, come la buprenorfina, dovrebbe essere considerato da un punto di vista sperimentale ed etico10.
Tre giorni dopo il CLP è stato scelto come punto temporale per indurre l'infezione secondaria a riflettere la fase immunosoppressiva della sepsi. La maggior parte dei pazienti con sepsi ha un corso ospedaliero prolungato con la maggior parte dei decessi che si verificano oltre 3 giorni, e molti poi entrano in polmonite acquisita dall'ospedale secondario, che è stata costantemente dimostrata in un recente studio con CLP insieme a P. aeruginosa14 . I risultati precedenti di altri laboratori dimostrano anche che 3 giorni dopo il CLP, i topi mostrano un'elevata sensibilità ai batteri instillati secondari, e un giorno dopo l'infezione è stato il punto di svolta da un'eccessiva infiammazione all'immunosoppressione15, 16.
Inoltre, le differenze nei ceppi di batteri e dosaggio instillato sono fattori significativi che causano la variabilità nel modello duale. La selezione dei livelli di deformazione e dose si basa sulle esigenze della progettazione sperimentale dell'infezione secondaria durante lo stato immunosoppressivo. Sulla base dei risultati precedenti, 1 x 107 CFU di S. aureus è stato selezionato per questo studio.
Per migliorare l'efficienza della consegna batterica intranasale direttamente nei polmoni del topo, è necessario prestare attenzione al volume di instillazione, al tempo e alla posizione del corpo. Ci sono altre questioni operative che possono influenzare immensamente l'esito dell'esperimento. Questi includono tenere il topo in posizione verticale, somministrare liquidi batteri multi-basse dosi in entrambe le narici separatamente durante ogni instillazione, osservare l'inalazione di liquido senza formare bolle, controllare la velocità di inalazione; muovendo il mouse rapidamente poi verso il basso lentamente, e ponendo il mouse ad un angolo di 45 gradi per recuperare dall'instillazione. La somministrazione di batteri intranasali non è invasiva e aiuta a prevenire il soffocamento, aumentare l'accessibilità, migliorare la sicurezza e ridurre al minimo le lesioni chirurgiche.
Tuttavia, questo metodo ha i suoi limiti. Poiché si tratta di uno studio metodologico, i dati non sono stati discussi sui cambiamenti dei segni clinici; citochine antinfiammatorie; e quantità e funzione di monociti, neutrofili e linfociti nel sangue. I topi di laboratorio sono spesso inbred, hanno età e pesi simili, sono alloggiati in strutture specifiche prive di agenti patogeni e comunemente non hanno comorbidità, come l'immunosoppressione preesistente. Tuttavia, diversi generi, età, stato immunitario e nutrizionale, e possibile trattamento adiuvante come antibiotici dei pazienti possono provocare esiti clinici eterogenei. Considerando l'eterogeneità dei pazienti umani, variabili come l'età, il peso, le malattie preesistenti e le cure cliniche di supporto dovrebbero essere attentamente osservate.
Lo sviluppo di questo modello duale (modello a doppio colpo) è tempestivo e importante per la comunità di ricerca sull'infezione e l'immunità perché assomiglia alla progressione dalla fase iper- a ipoinfiammatoria della sepsi umana. Riflette lo scenario clinico comune di una polmonite nosocomiale secondaria in pazienti con sepsi in modo più accurato. Questo modello può aiutare a sviluppare nuove strategie terapeutiche per l'immunosoppressione indotta dalla sepsi.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse finanziari.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da National Institutes of Health Grants R01 AI138203-01, AI109317-04, AI101973-01 e AI097532-01A1 a M. W. Le strutture principali dell'Università del Dakota del Nord sono state supportate da sovvenzioni NIH (INBRE P20GM103442 e COBRE P20GM113123). Questo lavoro è stato sostenuto anche dal Key Program of National Nature Science Foundation of China (81530063) a Jianxin Jiang. I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio, nella raccolta e nell'analisi dei dati, nella decisione di pubblicazione o nella preparazione del manoscritto. Ringraziamo Marvin Leier (Center for Rural Health, University of North Dakota) per aver fatto il video.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 21 G 1 ½ Needle | BD | BD305167 | |
| ACK lysing buffer | Gibco | A10492-01 | |
| Anti-mouse CD11b antibody | Biolegend | 101201 | |
| Anti-mouse Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) antibody | Biolegend | 108401 | |
| C57BL/6 mice | Harlan (Indianapolis) | C57BL/6NHsd | |
| Desk light | General Supply | General Supply | |
| Disinfecting wipes | Clorox | B07NV5JMCS | |
| Electric razor | General Supply | General Supply | |
| ELISA kits (mouse IL-1β, IL-6 and TNFα) | Invitrogen | 88-7013, 88-7064, and 88-7324 | |
| Iodine | Dynarex | B003U463PY | PVP Iodine Wipes |
| Ketamine | FORT DODGE | NDC 0856-2013-01 | Amine hydrochloride injection |
| Laboratory scale | General Supply | General Supply | |
| LB Agar, Miller | Fisher Scientific | BP1425-500 | Molecular genetics, powder |
| Micropipette | ErgoOne | 7100-1100 | |
| Normal saline | General Supply | General Supply | |
| Polylined towel | CardinalHealth, Convertors | 3520 | Surgical drape, sterile, for single use only |
| Silk suture, 4-0 | DAVIS & GECK | 1123-31 | |
| Small animal needle holder | General Supply | General Supply | |
| Small animal surgery scissors | General Supply | General Supply | |
| Small animal surgical forceps | General Supply | General Supply | |
| Staphylococcus aureus | ATCC | 13301 | |
| Warm pad | General Supply | General Supply | |
| Xylazine | Alfa Aesar | 7361-61-7 |
References
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