Summary
Dieses Protokoll beschreibt Techniken zur Messung von infektiösen Ergebnissen, die sekundären Krankenhausinfektionen im immunsuppressiven Zustand zugrunde liegen, indem sie zunächst Cecal-Ligations-/Punktionsmäuse einrichten und sie mit intranasalen Infektionen herausfordern, um ein klinisch relevantes Modell der Immunsuppressionssepsis zu erstellen.
Abstract
Sepsis, eine schwere und komplizierte lebensbedrohliche Infektion, ist durch ein Ungleichgewicht zwischen pro- und entzündungshemmenden Reaktionen in mehreren Organen gekennzeichnet. Mit der Entwicklung von Therapien überleben die meisten Patienten die hyperinflammatorische Phase, kommen aber zu einer immunsuppressiven Phase, die das Auftreten von Sekundärinfektionen erhöht. Daher ist ein verbessertes Verständnis der pathogenese zugrunde liegenden sekundären Krankenhaus-erworbenen Infektionen in der immunsuppressiven Phase während der Sepsis von enormer Bedeutung. Hier wird berichtet, dass ein Modell, um infektiöse Ergebnisse zu testen, indem Sie Doppelschlag-Infektionen bei Mäusen. Ein Standard-Chirurgisches Verfahren wird verwendet, um polymikrobielle Peritonitis durch Cecal Ligation und Punktion (CLP) zu induzieren, gefolgt von einer intranasalen Infektion von Staphylococcus aureus, um Einelungenentzündung zu simulieren, die bei der Immunsuppression auftritt, die häufig beobachtet wird bei septischen Patienten. Dieses duale Modell kann den immunsuppressiven Zustand widerspiegeln, der bei Patienten mit langwieriger Sepsis und Anfälligkeit für sekundäre Infektionen durch nosokomiale Lungenentzündung auftritt. Daher bietet dieses Modell einen einfachen experimentellen Ansatz zur Untersuchung der Pathophysiologie der Sepsis-induzierten sekundären bakteriellen Lungenentzündung, die für die Entdeckung neuartiger Behandlungen für Sepsis und ihre Komplikationen verwendet werden kann.
Introduction
Sepsis initiiert ein komplexes Zusammenspiel von wirt pro-inflammatorischen und entzündungshemmenden Prozessen und zeichnet sich durch eine hyperinflammatorische Reaktion und nachfolgende Immunfunktionsstörung1,2aus. Sepsis stellt eine globale Gesundheitspriorität dar und verursacht eine hohe Zahl von Todesfällen auf Intensivstationen (IKUs)3. Die Inzidenz von Sepsis wird auf über 30 Millionen Fälle weltweit pro Jahr geschätzt, mit Sterblichkeitsraten von bis zu 30% trotz Fortschritten im ICU-Management4,5. Im Jahr 2017 verabschiedete die Weltgesundheitsorganisation eine Resolution zur Verbesserung der Prävention, Diagnose und Desmanagement dieser tödlichen Krankheit5. Jüngste Studien haben jedoch gezeigt, dass der Tod nicht auf eine primäre Infektion bei schweren septischen Patienten zurückzuführen ist, sondern auf eine sekundäre nosokomiale Infektion (insbesondere Lungenentzündung), die durch Immunsuppression verursacht wird6,7 . Daher ist es dringend erforderlich, die Mechanismen zu verstehen, warum septische Patienten sekundäre Infektionen entwickeln und effektivere Behandlungen entdecken. Hierin wird ein duales Modell beschrieben, das auch als Double-Hit-Modell bekannt ist, um das immunsuppressive Phänomen bei Patienten mit langwieriger Sepsis zu untersuchen.
Als Goldstandard-Experimentalmodell in der Forschung an polymikrobiellen Sepsis ist Cecal Ligation und Punktion (CLP) eine Operation, die sich durch Cecumligation und Perforation auszeichnet, die zu polymikrobieller Peritonitis und Sepsisbeiträgt 8,9 . Der pathophysiologische Prozess und die Zytokinprofile sowie die Kinetik und Die Größe ähneln der klinischen Sepsis. Die Position der Ligation, die Nadelgröße, die für die Punktion verwendet wird, und die Anzahl der Cecal-Punktionen sind wichtige Faktoren, die die Sterblichkeit nach CLP beeinflussen.
Die nosokomiale Lungenentzündung ist die Hauptursache für die Sterblichkeit bei schwerkranken Patienten mit Sepsis. Die wichtigsten Arten von Organismen, die schwere Sepsis verursachen, sind Staphylococcus aureus (20,5%), Pseudomonas-Arten (19,9%), Enterobacteriacae (hauptsächlich E. coli, 16,0%) und Pilze (19%). In der Zwischenzeit deuten neuere Studien auf eine zunehmende Inzidenz von grampositiven Organismen hin, die heute fast so häufig sind wie gramnegative Infektionen3.
Die in diesem Protokoll beschriebene Methode beinhaltet CLP, das als "erster Treffer" durchgeführt wird, um subleelle polymikrobielle Peritonitis zu induzieren, die eine Immunsuppressionsbedingung manifestiert. Das Verfahren beinhaltet auch die nachfolgende intranasale Instillation von S. aureus als "zweiten Treffer", um eine klinisch relevante Forschungsplattform zur Verfügung zu stellen.
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Protocol
Alle hier beschriebenen Methoden wurden in Übereinstimmung mit dem National Institute of Health Guide for Care and Use of Laboratory Animals durchgeführt und vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of North Dakota zugelassen.
1. Cecal Ligation und Punktion
HINWEIS: Weibliche C57BL/6-Mäuse (Gewicht, 18-22 g; Alter, 6-8 Wochen) werden nach dem Zufallsprinzip in sechs Gruppen eingeteilt: Kontrollgruppe (Strg), Infektionsgruppe (SA für S. aureus), zwei Scheingruppen und zwei CLP-Gruppen. Strgtiere bleiben ohne Operation und sekundäre Infektionsverletzungen. SA-Tiere werden ohne Die Operation einer Lungeninfektion von S. aureus ausgesetzt. Scheinbetriebene Tiere unterziehen sich der gleichen Laparotomie mit einer Exposition des Cecums (außer das Cecum ist weder ligted noch punktiert). Acht Mäuse pro Gruppe werden für die Überlebensanalyse und drei bis fünf Mäuse zur Beurteilung von Entzündungen zu verschiedenen Zeitpunkten verwendet.
- Sterilisieren Sie vor der Operation alle chirurgischen Instrumente und Materialien durch Autoklavieren für 20 min. Reinigen und desinfizieren Sie den Operationstisch mit Desinfektionstüchern. Um sterile Bedingungen während der Operation zu etablieren, decken Sie die gesamten operativen Felder mit richtigen sterilen chirurgischen Vorhängen ab und tragen Sie eine Haarabdeckung, eine chirurgische Maske, eine Schutzbrille, ein chirurgisches Kleid und sterile Handschuhe.
- Wiegen und anästhesieren Sie die Maus mit 0,1 ml/Maus Ketamin (80 mg/kg), Xylazin (10 mg/kg) Mischung intraperitoneal verabreicht. Mit Daumen und Zeigefinger der linken Hand, die eine U-förmige Position bilden, nähern Sie sich dem Hals der Maus von hinten sanft und sanft, dann halten Sie den Hals direkt hinter den Ohren, so dass der Mauskopf sehr zurückhaltend ist. Verwenden Sie ein Pinky, um das rechte Hinterbein der Maus zu halten und verwenden Sie die Mittleren und Ringfinger (alle Finger von der linken Hand), um den Körper zu halten.
- Überprüfen Sie die Intensität der Anästhesie durch Zehenkneifen, bis keine Flexion der Extremität.
- Rasieren Sie die unteren Quadranten des Bauches mit einem elektrischen Rasiermesser und desinfizieren Sie den Bereich mit Jod.
- Legen Sie die Maus auf die sterile Oberfläche in einer Supine-Position, mit dem Kopf weg vom Bediener ausgerichtet. Die Maus mit sterilem Handtuch mit Loch über den geplanten chirurgischen Schnitt zu drapieren, um sterile Felder zu erhalten.
- Machen Sie einen Längshautschnitt (ca. 0,5 cm lang) mit einem Skalpell im linken Unterbauch. Verwenden Sie eine kleine Schere, um den Schnitt (1-2 cm) zu verlängern.
VORSICHT: Achten Sie darauf, nicht in die Peritonealhöhle einzudringen. - Machen Sie den intramuskulären Schnitt, um Zugang in die Peritonealhöhle zu erhalten und ermöglichen Exposition des Cecums mit dem angrenzenden Darm.
- Isolieren Sie das Cecum auf der linken Seite des Bauches (in den meisten Fällen geschieht dies mit stumpfen anatomischen Zangen) und entfernen Sie es auf einem sterilen Vorhang, so dass der kleine und große Darm in der Peritonealhöhle.
VORSICHT: Vermeiden Sie es, die mesenterischen Blutgefäße zu beschädigen. - Ligate das Cecum in der distalen 25% Position, um eine längere Infektion mit relativ niedriger Sterblichkeit zu schaffen.
VORSICHT: Achten Sie darauf, das Ileocecal-Ventil nicht zu ligte. - Perforieren Sie das Cecum mit einer 21 G 1 1/2 Nadel durch einzelne Durchgangs- und Durchgangspunktion (zwei Löcher) auf halbem Weg zwischen Ligation und Spitze des Cecums im am wenigsten vaskularisierten Bereich.
VORSICHT: Achten Sie darauf, die Blutgefäße nicht zu durchstechen. - Entfernen Sie die Nadel. Extrudieren Sie vorsichtig eine kleine Menge Kot aus den Penetrationslöchern, um eine volle Dicke Perforation zu gewährleisten.
VORSICHT: Achten Sie darauf, die Darmkontinuität während des Eingriffs nicht zu behindern. - Ersetzen Sie das Cecum in die Bauchhöhle.
- Schließen Sie den Bauch in zwei Schichten mit 4-0 Nylon chirurgische Nähte. Schließen Sie die Bauchmuskulatur, indem Sie einfache laufende Nähte anwenden und schließen Sie die Haut, indem Sie einfache unterbrochene Nähte auftragen. Reinigen Sie die Haut mit Jod.
- 1 ml vorgewärmte (37 °C) 0,9% sterile Normal-Saline-Lösung (NS) subkutan auf die Rückseite injizieren, um den dritten Platzverlust zu ersetzen und auf ein warmes Pad zu legen, um sich zu erholen.
- Bringen Sie die Mäuse im Käfig in einem temperaturgeregelten Raum (22 °C) mit 12 h Licht/Dunkel-Zyklen und freiem Zugang zu Nahrung und Wasser zurück. Überwachen Sie die Mäuse alle 0,5 Stunden für mindestens 2 h, dann alle 6 h für mindestens 2 d, dann alle 12 h für 3 Tage, oder einschläfern Sie sie, wenn sie für die Überlebensanalyse verkümmert werden.
HINWEIS: Vor- und nachoperative analgesie (Buprenorphin, 50 g/kg subkutan alle 12 h) werden für 24 h vor der Operation bis 48 h nach der Operation9,10empfohlen.
2. Sekundäre Lungeninfektion mit S. aureus
HINWEIS: Mit Ausnahme der Strg- und SA-Gruppen sollten überlebende Mäuse nach 3 Tagen nach DER CLP-Gruppe intranasal mit 30 L einer bakteriellen Suspension bzw. NS verabreicht werden. Die überlebenden Mäuse in der SA-Gruppe sollten intranasal mit der bakteriellen Suspension eingeflößt werden.
- Anästhesisieren Sie die Maus durch intraperitoneal injizieren 100 L Lösung von Ketamin (45mg/kg) und Xylazin (10 mg/kg) und warten, bis die Maus langsam atmet. Der Punktionswinkel zwischen Nadel und Bauchwand beträgt weniger als 30° für eine langsame Injektion.
- Mit Hilfe einer Mikropipette, langsam und intranasal instillieren mit 30 l von 1 x 107 Kolonie bildende Einheit (CFU) von S. aureus bei der Inhalation angesaugt werden. Halten Sie die Maus an den Ohren in einer aufrechten Position, fallen Sie langsam 2-3 l bakterielle Suspension in beide Nasenlöcher jedes Mal. Passen Sie die Entriegelungsrate an, damit die Maus einatmen kann, ohne Blasen zu bilden und abzufallen.
- Heben Sie die Maus nach oben und unten, mit dem Kopf nach oben und Schwanz nach unten, um den Bakterien zu helfen, in die Luftröhre einzutreten. Bewegen Sie die Maus schnell und stark nach oben, während Sie sie sanft und langsam nach unten bewegen, um die Schwerkraft zu erhöhen. Wiederholen Sie die Instillation etwa 15x, bis alle Bakterien eingeatmet werden, was 10-15 min für jede Maus dauern sollte.
- Legen Sie die Maus auf den Rücken und kopfauf auf die abgewinkelte Bettwäsche (ca. 35°) und beobachten Sie die Maus, bis ihre Atmung wieder normal ist und sie vollständig von der Anästhesie und den Eingriffen erholt ist.
- Legen Sie die Maus wieder in den Käfig in einem temperaturgeregelten Raum (22 °C) mit 12 h Licht/Dunkel-Zyklen und unbegrenztem Zugang zu Nahrung und Wasser.
- Überprüfen Sie die Mausbedingungen alle 2 h für den ersten Tag und alle 12 h danach für 4 Tage nach der Operation. Euthanisieren Sie sie, wenn sie für die Überlebensanalyse oder 24 h nach der Infektion zur Beurteilung der Entzündung verkümmert werden.
3. Analysierte Parameter
- Überleben von Mäusen
- Überwachen Sie die Mäuse 7 Tage lang. Euthanisieren, wenn moribund und erzeugen Überlebenskurven mit Kaplan-Meier-Methoden11.
- Bakterielle Zählungen
- 24 h nach SA-Injektion, Ernten Sie das Blut, Bronchoalveolar-Spülflüssigkeit (BALF) und Peritoneal-Lavage-Flüssigkeit (PLF) von den Mäusen. Anschließend 100 l der Verdünnungsmittel zu Nährstoff-Agar-Platten hinzufügen und sie bei 37 °C für 24 h kulturieren, um die Bakterienkoloniezahlen11,12,13zu bestimmen.
- Zytokine
HINWEIS: Pro-inflammatorische Zytokinkonzentrationen von IL-1, IL-6 und TNF im Serum und BALF von Mäusen sollten mit ELISA-Kits gemäß den Anweisungen des Herstellers bewertet werden.- Beschichten Sie die 96-Well-ELISA-Platte mit 100 L/Well aus unterschiedlicher Capture-Antikörper-Arbeitslösung, um die Standards in Doppelta und Proben in dreifacher Ausführung auszuführen. Versiegeln Sie die Platte und lassen Sie sie über Nacht bei 4 °C.
- Waschen Sie die Platte dreimal mit 255 L/Well-Waschpuffer (1x PBS, 0,05% Tween-20).
- Um die unspezifische Bindung zu blockieren, fügen Sie 200 l/Well-Verdünnungsmittel hinzu. Versiegeln Sie die Platte und brüten Bei Raumtemperatur (RT) für 1 h.
- Standardlösung vorbereiten: Acht zweifache serielle Verdünnungen ab 1000 pg/ml.
- Fügen Sie 100 L/Well von Standards oder Proben zu den entsprechenden Brunnen und 100 l/Well von Verdünnungsgut zu den Rohbrunnen hinzu. Die Platte versiegeln und bei RT 2 h oder über Nacht bei 4 °C inkubieren.
- Waschen Sie die Platte 5x mit 255 l/gut Waschpuffer.
- Fügen Sie den entsprechenden Bohrkörpern 100 L/Well verschiedener Detektionsantikörper-Arbeitslösung hinzu. Versiegeln Sie die Platte und brüten Sie bei RT für 1 h.
- Waschen Sie die Platte 5x mit 255 l/gut Waschpuffer.
- Fügen Sie 100 L/Well der verdünnten HRP-Lösung in alle Brunnen ein. Versiegeln Sie die Platte und brüten Sie bei RT für 30 min.
- Waschen Sie die Platte 5x mit 255 l/gut Waschpuffer.
- Fügen Sie 100 L/gut verdünnte TMB-Lösung hinzu. Inkubieren Sie die Platte 15 min vom Licht bei RT weg.
- Fügen Sie 50 L/Well Stop-Lösung (1 M H3PO4) hinzu. Leseabsorption bei 450 nm mit einem Plattenleser.
- Durchflusszytometrie
- Rufen Sie die Gesamtzahl der Zellen von BALF ab. Lyse die Erythrozyten mit ACK Lysing Puffer und waschen 2x mit PBS.
- Analysieren Sie dann die einzelzelligen Suspensionen durch Durchflusszytometrie, wie zuvor beschrieben11. Für Oberflächenfärbung, Flecken neutrophile (CD11b+GR-1+) mit APC Anti-Maus CD11b und Anti-Maus Gr-1 (Ly-6G/Ly-6C) Antikörper. Sammeln Sie mindestens 3 x 104 lebende, nicht-Trümmern-Zellen für die Analyse.
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Representative Results
Je nach experimentellem Design und Verfahren wurden C57BL/6-Mäuse CLP unterzogen, und nach 3 Tagen wurden ihnen intranasal Bakterien verabreicht (Abbildung 1). Wie in Abbildung 2dargestellt, begannen die Mäuse nach der Induktion der Peritonitis bei 12 h zu sterben. Zwei Mäuse in der CLP+SA-Gruppe und drei Mäuse in der CLP+NS-Gruppe starben vor der intranasalen S. aureus-Instillation. Bei nicht infizierten nicht oder scheinbetriebenen Mäusen wurde keine Sterblichkeit festgestellt. Daher war die Sterblichkeit bei Mäusen, die CLP vor einer Lungenentzündung hatten, viel höher (p < 0,05). Nach der Herausforderung der intranasalen Bakterien (1 x 107 CFU) überlebten drei von acht Mäusen sowohl in der SA- als auch in der Sham+SA-Gruppe, und vier von acht Mäusen überlebten in der CLP+NS-Gruppe. Alle acht Mäuse starben jedoch in der CLP+SA-Gruppe. Im Gegensatz dazu überlebte jede Maus in der Strg-Gruppe und der Sham+NS-Gruppe. CLP-Mäuse zeigten eine erhöhte Sterblichkeit, wenn sie anschließend mit S. aureus herausgefordert wurden. Sterblichkeit von S. aureus nach CLP (100%) war höher als die infizierten Personen (37,5%) oder S. aureus nach Scheinbetrieb (37,5%; p < 0,05).
Wie in Abbildung 3dargestellt, wurde bei Tieren nach der CLP eine schwere Cäkumnekrose beobachtet, vor allem jedoch aus der Doppelschlaggruppe (CLP+SA). Es gab jedoch keine grobe Veränderung des Cecums bei der Kontrolle oder bei Bakteriengruppen. Blut, BALF und PLF wurden kultiviert, um die lungenbakterielle Clearance von Mäusen zu bewerten, die mit S. aureus infiziert wurden, 3 Tage nach CLP. Diese hohe Letalität war mit einer signifikant erhöhten S. aureus CFU im Blut und PLF von CLP-Mäusen im Vergleich zu Scheinmäusen (p < 0,05; Abbildung 4A,C). Die Anzahl der S. aureus CFU im Blut und BALF von CLP+SA-Mäusen war deutlich größer als CLP+NS-Mäuse (p < 0,01; Abbildung 4A,B).
Bei proinflammatorischen Zytokinen zeigten die Ergebnisse, dass die Expressionskonzentrationen von Serum IL-1, IL-6 und TNF nach bakterieller Instillation bei Sepsis-überlebenden Mäusen signifikant um 24 h stiegen im Vergleich zu den Mäusen, die CLP allein oder der Schein-operierten Mäuse mit S. aureus herausgefordert (Abbildung 5A). Jedoch, die pro-inflammatorischen Zytokine leicht in BALF von septischen Mäusen mit sekundärer Infektion, anders als bei den kontrollinfizierten Mäusen (SA-Mäuse) und Sham+SA. In der Zwischenzeit zeigten Doppelschlagmäuse im Vergleich zu SA- und Sham+SA-Mäusen signifikant abgesenkte Konzentrationen in den Ebenen BALF IL-1, IL-6 und TNF (p < 0,001; Abbildung 5B).
Wie in Abbildung 6dargestellt, wurden Mäuse nach einer Infektion mit 24 h geopfert, und der relative Neutrophilenanteil in BALF wurde durch Durchflusszytometrie nachgewiesen. Doppelgetroffene Mäuse zeigten eine signifikante Reduktion von Neutrophilen im BALF im Vergleich zu Mäusen, die allein einer S. aureus-Pneumonie unterzogen wurden. Zusammen zeigten diese Daten, dass CLP die Immunantworten des Wirts beeinträchtigt, was zu einer erhöhten Anfälligkeit für sekundäre bakterielle Lungenentzündung führt.
Abbildung 1 : Experimentelles Design. Mäuse wurden nach dem Zufallsprinzip in sechs Gruppen eingeteilt. Zwei Gruppen wurden bei D0 einer Cecal-Ligation und Punktion (CLP) unterzogen, die anderen wurden scheinbetrieben oder nicht operiert. Drei Tage nach der Operation (D3) wurde S. aureus [SA, 1 x 107 Koloniebildner (CFU)] oder normale Saline (NS) intranasal verabreicht. Die Kontrollgruppenmäuse (Strg) wurden nicht intranasal eingeflößt. Blut, Bronchoalveolar-Spülflüssigkeit (BALF) und peritoneale Spülflüssigkeit (PLF) wurden 24 h nach SA-Injektion für einen Bakterienzähler-Assay geerntet. Die Sterblichkeitsrate in jeder Gruppe wurde im Laufe von 7 Tagen für die Überlebensanalyse beobachtet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2 : Maus Überleben. C57BL/6-Mäuse, die entweder CLP oder Scheinchirurgie unterzogen wurden, erhielten am dritten Tag nach der Operation S. aureus (SA) oder normale Salin (NS). Die Mäuse wurden 7 Tage lang überwacht, und die Sterblichkeit wurde alle 12 h aufgezeichnet. Kaplan-Meier Überlebenskurven, Log-Rank-Test (*p < 0,05) im Vergleich zu Sham+SA-Mäusen und SA-Mäusen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3 : Maus-Cecum. Sekundäre Infektion wurde 3 Tage nach CLP induziert. 24 h nach SA-Infektion wurden Mäuse geopfert, um Dickdarmgewebe zu sammeln. Gezeigt werden die repräsentativen Fotos von cecal ligation unter verschiedenen Verletzungen. SA = S. aureus; NS = normale Saline; CLP = Cecal Ligation und Punktion. Maßstabsleiste = 1 cm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4 : Bakterielle Zählungen und repräsentative Bilder von Agarplatten. 3 Tage nach der Operation wurden Mäuse intranasal mit 1 x 107 CFU von S. aureus (SA) eingeflößt (n 3 Mäuse pro Gruppe). Blut, BALF und PLF wurden 24 h nach SA-Injektion geerntet, und die Anzahl der Bakterienkolonien wurde nach 24 h Inkubation bestimmt. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ausgedrückt: SEM. Einweg-ANOVA (Tukeys post hoc; *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ns = nicht signifikant). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5 : ELISA-Erkennung der Zytokinsekretion. Sekundäre Infektion wurde 3 Tage nach CLP induziert. Konzentrationen von IL-1, IL-6 und TNF im Serum (A) und BALF (B) von Mäusen nach SA-Infektion (n 3 Mäuse pro Gruppe). Die Daten werden als Mittelwert von drei Experimenten dargestellt. Einweg-ANOVA (Tukeys post hoc; *p < 0.05; **p < 0.01; ****p < 0.0001; ns = nicht signifikant). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6 : Repräsentative Häufigkeit der Neutrophilenpenetration. 24 h nach einer intranasalen Infektion wurden Mäuse geopfert, um BALF zu erhalten (n 3 Mäuse pro Gruppe). Der Prozentsatz der Neutrophilen (CD11b+, GR-1+) wurde durch Durchflusszytometrie quantifiziert und wird als Mittel von drei Experimenten gezeigt. Einweg-ANOVA (Tukeys post hoc; ****p < 0.0001; ns = nicht signifikant). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Als Goldstandardmodell für die Sepsisforschung hat CLP eine Kombination aus drei Beleidigungen, darunter Gewebetrauma, das durch die Laparotomie verursacht wird, Nekrose aufgrund der Ligatur des Cecums und Infektionen als Folge einer mikrobiellen Leckage, die Peritonitis mit Translokation verursacht. von Bakterienin blut8 . Daher imitiert CLP die Komplexität menschlicher Sepsis besser als viele andere Modelle. Eine wesentliche Einschränkung des aktuellen CLP-Modells ist jedoch die Unfähigkeit, die längere Phase der Sepsis zu reflektieren, die bei Patienten auf der Intensivstation3,4,5beobachtet wurde. Daher wurde ein klinisch relevantes duales Modell (Double-Hit-Modell) vorgeschlagen, um die verzögerte Sterblichkeit von Sepsis widerzuspiegeln und die Mechanismen zu untersuchen, die einer lungensekundären Infektion zugrunde liegen. In diesem Protokoll wurde sepsis durch die Kombination von CLP mit S. aureus Lungeninfektion bei 3 Tagen nach CLP induziert. Zwei getroffene Mäuse wiesen eine höhere Sterblichkeit, schwere Cecum-Schäden, geschwächtes Blut, BALF-Bakterien-Clearances, niedrigere pro-inflammatorische Zytokine und niedrigere Neutrophile in BALF auf. Dies führte zu der schweren Sepsis, die den Immunsuppressionsstatus in den Kliniken imitiert.
Die folgenden Beschreibungen sind wichtige Schritte. Im Detail wird gezeigt, wie man subtödliche Sepsis unter den gleichen Bedingungen produziert. Erstens wurden weibliche Mäuse verwendet, weil weibliche Mäuse resistenter gegen CLP sind als männliche Mäuse11. Zweitens hängt die CLP-induzierte Mortalität von mehreren technischen Parametern ab, wie z. B. der Länge des Cecumligierten, der Nadelgröße und der Anzahl der Cecal-Punktionen9. Ligation von etwa 75% des Cecums induziert schwere Sepsis, Ligation von 60% des Cecums induziert mittlere Sepsis, und Ligation von 25% oder weniger des Cecums führt zu einer kleinen Sepsis9. Es wurde gewählt, um das Modell durch die Durchführung einer milden CLP (25%, einzelne Durch-und-Durch-Punktion mit einer 21 G 1 1/2 Nadel) zu standardisieren, um subleale Sepsis11,12zu induzieren. Drittens wird eine reanimation von Flüssigkeiten empfohlen, um Schock und schnellen Tod durch Kreislaufkollaps zu verhindern und ein hyperdynamisches Tiersepsismodell zu entwickeln, das das hämodynamische Profil der menschlichen Sepsis stärker imitiert13. Darüber hinaus sollte die Verwendung von Analgetika, wie Buprenorphin, unter experimenteller und ethischer Sicht betrachtet werden10.
Drei Tage nach CLP wurde als Zeitpunkt gewählt, um sekundäre Infektionzufall zu induzieren, um die immunsuppressive Phase der Sepsis widerzuspiegeln. Die meisten Patienten mit Sepsis haben einen langwierigen Krankenhausverlauf mit den meisten Todesfällen, die über 3 Tage hinaus auftreten, und viele treten dann in eine sekundäre Krankenhaus-erworbene Lungenentzündung ein, die in einer kürzlich enzausten Studie mit CLP zusammen mit P. aeruginosa14 . Frühere Ergebnisse aus anderen Laboratorien zeigen auch, dass 3 Tage nach CLP, Mäuse zeigen hohe Empfindlichkeit gegenüber sekundären instillierten Bakterien, und einen Tag nach der Infektion war der Wendepunkt von Überentzündung zu Immunsuppression15, 16.
Darüber hinaus sind Unterschiede in Bakterienstämmen und Dosierung eingeflößt signifikante Faktoren, die Variabilität im dualen Modell verursachen. Die Auswahl der Stamm- und Dosiswerte basiert auf den Erfordernissen der experimentellen Entwicklung einer Sekundärinfektion während des immunsuppressiven Status. Basierend auf früheren Ergebnissen wurde 1 x 107 CFU von S. aureus für diese Studie ausgewählt.
Um die Effizienz der intranasalen bakteriellen Abgabe direkt in die Lungen der Maus zu verbessern, sollte auf das Instillationsvolumen, die Zeit und die Körperposition geachtet werden. Es gibt andere operative Angelegenheiten, die das Ergebnis des Experiments immens beeinflussen können. Dazu gehören das Aufrechthalten der Maus, die Verabreichung von mehrfach niedrig dosierten Bakterien flüssigkeit in beiden Nasenlöchern getrennt während jeder Instillation, beobachten das Einatmen von Flüssigkeit, ohne Blasen bildung, Kontrolle der Geschwindigkeit der Inhalation; bewegen Sie die Maus schnell nach oben, dann langsam nach unten, und legen Sie die Maus in einem 45°-Winkel, um von der Instillation zu erholen. Die Verabreichung von intranasalen Bakterien ist nicht invasiv und hilft, Erstickungen zu verhindern, die Zugänglichkeit zu erhöhen, die Sicherheit zu verbessern und chirurgische Verletzungen zu minimieren.
Diese Methode hat jedoch ihre Grenzen. Da es sich um eine methodische Studie handelt, wurden die Daten über die Veränderungen der klinischen Symptome nicht erörtert; entzündungshemmende Zytokine; Menge und Funktion von Monozyten, Neutrophilen und Lymphozyten im Blut. Labormäuse sind oft inzucht, haben ähnliche Alter und Gewichte, sind in bestimmten pathogenfreien Einrichtungen untergebracht und haben in der Regel keine Komorbiditäten, wie z. B. eine bereits bestehende Immunsuppression. Dennoch können unterschiedliches Geschlecht, Alter, Immun- und Ernährungsstatus und eine mögliche adjuvante Behandlung wie Antibiotika von Patienten zu heterogenen klinischen Ergebnissen führen. Angesichts der Heterogenität menschlicher Patienten sollten Variablen wie Alter, Gewicht, bereits bestehende Krankheiten und klinische unterstützende Versorgung sorgfältig beobachtet werden.
Die Entwicklung dieses dualen Modells (Doppelschlagmodell) ist zeitgemäß und wichtig für die Infektions- und Immunitätsforschungsgemeinschaft, da es dem Fortschreiten von der hyper- zur hypo-inflammatorischen Phase der menschlichen Sepsis ähnelt. Es spiegelt das übliche klinische Szenario einer sekundären nosokomialen Lungenentzündung bei Patienten mit Sepsis genauer wider. Dieses Modell kann helfen, neue therapeutische Strategien für sepsis-induzierte Immunsuppression zu entwickeln.
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Disclosures
Die Autoren haben keine finanziellen Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health Grants R01 AI138203-01, AI109317-04, AI101973-01 und AI097532-01A1 an M. W. unterstützt. Die Kerneinrichtungen der University of North Dakota wurden durch NIH-Stipendien (INBRE P20GM103442 und COBRE P20GM113123) unterstützt. Diese Arbeit wurde auch vom Key Program of National Nature Science Foundation of China (81530063) an Jianxin Jiang unterstützt. Die Geldgeber spielten keine Rolle bei der Studiengestaltung, Datenerhebung und -analyse, der Entscheidung zur Veröffentlichung oder der Vorbereitung des Manuskripts. Wir danken Marvin Leier (Center for Rural Health, University of North Dakota) für das Video.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 21 G 1 ½ Needle | BD | BD305167 | |
| ACK lysing buffer | Gibco | A10492-01 | |
| Anti-mouse CD11b antibody | Biolegend | 101201 | |
| Anti-mouse Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) antibody | Biolegend | 108401 | |
| C57BL/6 mice | Harlan (Indianapolis) | C57BL/6NHsd | |
| Desk light | General Supply | General Supply | |
| Disinfecting wipes | Clorox | B07NV5JMCS | |
| Electric razor | General Supply | General Supply | |
| ELISA kits (mouse IL-1β, IL-6 and TNFα) | Invitrogen | 88-7013, 88-7064, and 88-7324 | |
| Iodine | Dynarex | B003U463PY | PVP Iodine Wipes |
| Ketamine | FORT DODGE | NDC 0856-2013-01 | Amine hydrochloride injection |
| Laboratory scale | General Supply | General Supply | |
| LB Agar, Miller | Fisher Scientific | BP1425-500 | Molecular genetics, powder |
| Micropipette | ErgoOne | 7100-1100 | |
| Normal saline | General Supply | General Supply | |
| Polylined towel | CardinalHealth, Convertors | 3520 | Surgical drape, sterile, for single use only |
| Silk suture, 4-0 | DAVIS & GECK | 1123-31 | |
| Small animal needle holder | General Supply | General Supply | |
| Small animal surgery scissors | General Supply | General Supply | |
| Small animal surgical forceps | General Supply | General Supply | |
| Staphylococcus aureus | ATCC | 13301 | |
| Warm pad | General Supply | General Supply | |
| Xylazine | Alfa Aesar | 7361-61-7 |
References
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