Summary
פרוטוקול זה מתאר טכניקות למדידת תוצאות זיהומיות בבסיס החולים שנרכשו משני זיהומים במצב המדכא, הראשון על ידי הקמת לאחר הקשר/עכברים לאחר מכן מאתגרת אותם עם זיהום intranasal כדי ל ליצור מודל רלוונטי קלינית של אלח דם חיסוני.
Abstract
אלח דם, זיהום חמור ומורכב מסכנת חיים, מאופיין בחוסר איזון בין תגובות פרו-דלקתיות באיברים מרובים. עם התפתחות של טיפולים, רוב המטופלים לשרוד את השלב hyperinflammatory אבל התקדמות לשלב המדכא, אשר מגביר את הופעתה של זיהומים משניים. לכן, הבנה משופרת של הפתוגנזה הבסיסית של זיהומים שנרכשו בבית החולים המשני בשלב המדכא במהלך אלח דם הוא בעל חשיבות אדירה. דווח כאן הוא מודל לבדיקת תוצאות זיהומיות על ידי יצירת כפול פגע זיהומים בעכברים. הליך כירורגי רגיל משמש כדי לגרום polymicrobial צפקת על ידי ליזיא וניקוב (CLP) ואחריו intranasal זיהום של האורהולוקוקוס כדי לדמות דלקת ריאות המתרחשת בדיכוי החיסונית הנתפסת לעתים קרובות בחולים בספיגה זה מודל כפול יכול לשקף את המדינה מדכאים חיסוני המתרחשים בחולים עם אלח דם ממושך הרגישות לזיהום משני של דלקת ריאות מחלה נוזוקומיאלית. מכאן, מודל זה מספק גישה ניסיונית פשוטה כדי לחקור את הפתופסולוגיה של דלקת ריאות משנית המושרה אלח דם, אשר עשוי לשמש לגילוי טיפולים חדשניים עבור אלח דם וסיבוכים שלה.
Introduction
אלח דם יוזם משנה מורכבת של תהליכים pro-דלקתיות מארח אנטי דלקתית והוא מאופיין תגובה היפרדלקתית ובתפקוד החיסוני הבאים1,2. אלח דם מייצג עדיפות בריאותית גלובלית וגורם למותם של מספר רב של מקרי מוות ביחידות הטיפול הנמרץ (קוס)3. השכיחות של אלח דם מוערך עולה על 30,000,000 מקרים ברחבי העולם בשנה, עם שיעורי התמותה גבוה ככל 30% למרות ההתקדמות בניהול טיפול נמרץ4,5. בשנת 2017, ארגון הבריאות העולמי אימץ החלטה לשפר את המניעה, האבחנה והניהול של המחלה הקטלנית הזאת5. עם זאת, מחקרים שנעשו לאחרונה מומחש כי המוות אינו נובע זיהום ראשוני בחולים ספיגה חמורים אלא מזיהום מחלה נוזוקומיאלית משני (במיוחד דלקת ריאות) שנגרמו על ידי דיכוי חיסוני6,7 . לכן, הבנת המנגנונים של מדוע חולים ספיגה לפתח זיהום משני וגילוי טיפולים יעילים יותר הם נדרשים בדחיפות. כאן, מודל כפול, הידוע גם כמודל להיט כפול, כדי ללמוד את התופעה החיסונית מדכאים המתרחשים בחולים עם אלח דם ממושך מתוארת.
בתור המודל הניסיוני הזהב במחקר על אלח דם פוליפטיים, ליזיט וניקוב (CLP) הוא ניתוח המאופיין באמצעות סקנום ליזיט וניקוב, התורם לפוליחיידקים צפקת ואלח דם8,9 . התהליך הפתופסולוגי ופרופילי הציטוקין, יחד עם הקינטיקה והגודל, דומים לאלח דם קליני. המיקום של הארכה, גודל מחט המשמש לנקב, ומספר דקירות cecal הם גורמים עיקריים המשפיעים על התמותה לאחר CLP.
דלקת הריאות מחלה נוזוקומיאלית היא הגורם המוביל של התמותה בקרב חולים באורח קשה עם אלח דם. הסוג העיקרי של אורגניזמים הגורמים לאלח דם חמורים כולל האורהולוקוקוס (20.5%), מינים של פסבדו-הפסדומונס (19.9%), מיני בוקבריא (בעיקר E. coli, 16.0%), ופטריות (19%). בינתיים, מחקרים שנעשו לאחרונה הציעו שכיחות הולכת וגוברת של אורגניזמים גראם חיוביים, אשר כיום נפוצים כמעט כמו זיהומים גראם שליליים3.
השיטה המתוארת בפרוטוקול זה כרוכה ב-CLP, שבוצעה כ"להיט הראשון" כדי לגרום לצפקת polymicrobial משניים, המתבטאת במצב דיכוי חיסוני. ההליך גם כרוך בעקבות intranasal ביזילציה של S. האוראוס כמו "הלהיט השני" כדי לספק פלטפורמת מחקר הרלוונטית קלינית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל השיטות המתוארות כאן בוצעו בהתאם למכון הלאומי למדריך בריאות לטיפול ולשימוש בבעלי חיים מעבדתיים ואושרה על-ידי אוניברסיטת צפון דקוטה בעלי חיים מוסדיים והוועדה לשימוש (IACUC).
1. הארכה וניקוב
הערה: נשים C57BL/6 עכברים (משקל, 18-22 g; גיל, 6-8 שבועות) מחולקים באופן אקראי לשישה קבוצות: קבוצת שליטה (Ctrl) , קבוצת זיהום (SA עבור האוראוס), שתי קבוצות התחזות, ושתי קבוצות CLP. בעלי חיים משמאל ללא ניתוח ופציעות זיהום משני. בעלי חיים של ה- SA חשופים לדלקת ריאות בארה ב ללא הניתוח. בעלי חיים שפעלו בפועל עוברים את אותה כריתת אונה באמצעות מוזיציה של המעי הקרה (למעט המעי הרגיל אינו מנוקב ואינו כושל). שמונה עכברים לכל קבוצה משמשים ניתוח הישרדות, ושלושה עד חמישה עכברים משמשים להערכת דלקת בנקודות זמן שונות.
- לפני הניתוח, לעקר את כל כלי ניתוח וחומרים על ידי אוטוקלינג עבור 20 דקות. לנקות ולחטא את שולחן הניתוחים עם מגבונים לחיטוי. כדי ליצור תנאים סטריליים במהלך הניתוח, לכסות את כל השדות האופרטיביים מתאימים וילונות כירורגיים, ולחבוש כיסוי שיער, מסכה כירורגית, משקפי שמש, שמלת כירורגית, וכפפות סטרילי.
- שוקלים ומורדם העכבר באמצעות 0.1 mL/עכבר של קטמין (80 מ"ג/ק"ג), xylazine (10 מ"ג/ק"ג) תערובת intraperitoneally מנוהל. עם האגודל ואת האצבע המורה של יד שמאל להרכיב מיקום בצורת U, לגשת לצוואר של העכבר מאחור בצורה חלקה ובעדינות, ואז להחזיק את הצוואר מיד מאחורי האוזניים, כך ראש העכבר הוא מאוד מרוסן. השתמשו בזרת כדי להחזיק את הרגל הימנית של העכבר ולהשתמש באצבעות האמצע והטבעת (כל האצבעות מהיד השמאלית) כדי להחזיק את הגוף.
- בדוק את עוצמת ההרדמה על ידי צביטה בבוהן עד לא בגמישות של הגפיים.
- לגלח את הרביעים התחתון של הבטן באמצעות תער חשמלי לחטא את האזור עם יוד.
- הניחו את העכבר על פני השטח הסטרילי במצב פרקדן, כאשר הראש מכוון הרחק מן המפעיל. לעטוף את העכבר עם מגבת סטרילית עם חור על החתך כירורגי מתוכננת לשמור על שדות סטרילי.
- לעשות חתך העור האורך (כ 0.5 ס מ ארוך) עם אזמל בבטן התחתונה השמאלית. השתמש במספריים קטנים כדי להאריך את החתך (1-2 ס מ).
זהירות: היזהרו לא לחדור את חלל הצפק. - הפוך את החתך התוך-שרירי כדי לקבל גישה לחלל הצפק ולאפשר חשיפה של מעי עם המעי הסמוך.
- לבודד את מעי בצד שמאל של הבטן (ברוב המקרים, זה נעשה על ידי שימוש מלקחיים אנטומיים קהה) ולהסיר אותו על העטוף סטרילי, עוזב את המעי הקטן והגדול בחלל הצפק.
התראה: הימנע מפגיעה בכלי הדם המצע. - כדי ליצור זיהום ממושך עם תמותה נמוכה יחסית.
התראה: הקפד לא להפוך את השסתום ileocecal. - מנקב את המעי הסטום עם מחט של 21 גר' 1 1/2 באמצעות ניקוב יחיד דרך נקב (שני חורים) באמצע המעבר בין הקשר לקצה של המעי הקולי באזור הנמוך ביותר.
התראה: הקפידו לא לנקב כלי דם. - הסר את המחט. הבלטת בעדינות כמות קטנה של צואה מן החורים חדירה כדי להבטיח מחורר עובי מלא.
זהירות: היזהרו לא לחסום את המשכיות המעיים במהלך ההליך. - החליפו את המעי. בחלל הבטן
- סגרו את הבטן בשתי שכבות עם 4-0 התפרים כירורגי ניילון. סגור את שרירי הבטן על ידי החלת תפרים פועל פשוט לסגור את העור על ידי החלת תפרים פשוט הפריעו. לנקות את העור עם יוד.
- להזריק 1 מ ל של טרום מחומם (37 ° c) 0.9% מלוחים רגיל סטרילי (NS) פתרון על תת-עורי האחורי כדי להחליף אובדן החלל השלישי ולמקם אותו על משטח חם כדי להתאושש.
- החזר את העכברים בכלוב בחדר מבוקר טמפרטורה (22 ° c) עם 12 h מחזורים אור/כהה וגישה חופשית למזון ולמים. לפקח על העכברים כל 0.5 שעות עבור לפחות 2 h, אז כל 6 h עבור לפחות 2 ד, אז כל 12 h עבור 3 ימים, או המתת אותם כאשר מורבונד לניתוח הישרדות.
הערה: לפני ואחרי ניתוח משככי כאבים (בופרינורפין, 50 μg/ק"ג תת-עורי כל 12 h) מומלצים 24 שעות לפני הניתוח עד 48 h אחרי כירורגיה9,10.
2. דלקת ריאות שניוני עם האורנות
הערה: פרט לקבוצות Ctrl ו-SA, עכברים ששרדו ב 3 ימים post-CLP בקבוצות הדמה ו CLP צריך להיות מנוהל intranasally עם 30 μL של השעיה בקטריאלי או NS, בהתאמה. העכברים ששרדו בקבוצת ה-SA יש להחדיר intranasally עם ההשעיה חיידקי.
- מורדם העכבר על ידי intraperitoneally הזרקת 100 μL פתרון של קטמין (45mg/ק"ג) ו xylazine (10 מ"ג/ק"ג) ולחכות עד שהעכבר לנשום לאט. הזווית המנוחלת בין המחט לדופן הבטן היא פחות מ -30 ° עבור הזרקה איטית.
- בעזרתו של מיקרופיפטה, לאט וintranasally להחדיר עם 30 μL של 1 x 107 המושבה להרכיב יחידה (cfu ) של הברית להיות מנושב שאיפת. החזקת העכבר על ידי אוזניו במצב זקוף, לאט ירידה 2-3 μL של השעיית בקטריאלי לשני נחיריים בכל פעם. להתאים את קצב השחרור כדי לאפשר לעכבר לשאוף בלי להרכיב בועות ולהפיל.
- להרים את העכבר למעלה ולמטה, עם ראשו למעלה וזנב למטה, כדי לעזור החיידקים להיכנס לקנה הנשימה. הזז את העכבר למעלה במהירות ובחוזקה, תוך הזזתו למטה בעדינות ובאיטיות כדי להגביר את כוח הכבידה. חזור על הנושא על 15x עד כל החיידקים הם שאפה, אשר צריך לקחת 10-15 דקות עבור כל עכבר.
- הנח את העכבר על גבו, ראש על מצעים זוויתי (על 35 °) ולצפות בעכבר עד נשימתו חוזר לקדמותו וזה התאושש לחלוטין מן ההרדמה והליכים.
- מניחים את העכבר חזרה בכלוב בחדר מבוקר טמפרטורה (22 ° c) עם 12 h מחזורים אור/כהה וגישה בלתי מוגבלת למזון ומים.
- בדוק את תנאי העכבר כל 2 h עבור היום הראשון ואת כל 12 h לאחר מכן עבור 4 ימים לאחר הניתוח. המתת החסד אותם כאשר מורבונד לניתוח הישרדות או 24 שעות לאחר זיהום להערכת דלקת.
3. שנותחו פרמטרים
- הישרדות עכברים
- . פקח על העכברים במשך 7 ימים המתת חסד כאשר מוריקה ויוצרת עקומות הישרדות בשיטות של קפלן-מאייר11.
- ספירת חיידקים
- 24 שעות לאחר הזרקת SA, לקצור את הדם, שורף ברונכשיים נוזל (BALF), ו שורף הצפק נוזל (PLF) מן העכברים. לאחר מכן, להוסיף 100 μl של מדלל לצלחות אגר מזינים ותרבות אותם ב 37 ° c עבור 24 שעות כדי לקבוע את המושבה חיידקים ספירות11,12,13.
- ציטוקינים
הערה: ריכוזי ציטוקינים הפרו-דלקתיים של il-1β, il-6, ו-tnfα ב סרום balf מעכברים יש להעריך באמצעות ערכות אליסה על פי הוראות היצרן.- המעיל 96 היטב לוחית אליסה עם 100 μL/הבאר של שונים נוגדן ללכוד פתרון העבודה כדי להפעיל את הסטנדרטים בשכפול ודגימות ב טרילקאט. סגרו את הלוחית והשאירו אותו לילה ב -4 ° c.
- לשטוף את הצלחת שלוש פעמים עם 255 μL/היטב לשטוף מאגר (1x PBS, 0.05% רצף-20).
- כדי לחסום איגוד שאינו ספציפי, הוסף 200 μL/היטב מדלל. לאטום את הצלחת ואת הדגירה בטמפרטורת החדר (RT) עבור 1 h.
- הכנת הפתרון הסטנדרטי: מ8 2 טוריות מתקפלות מ-1000 pg/mL.
- הוסף 100 μL/באר של תקנים או דגימות לבארות המתאימות ו 100 μL/טוב של מדלל את הבארות הריקות. אטום את הצלחת ואת הדגירה ב RT עבור 2 h או לילה ב 4 ° c.
- שטוף את הצלחת 5x עם 255 μL/טוב מאגר לשטוף.
- הוסף 100 μL/טוב של נוגדן זיהוי שונים העבודה פתרון לבארות המתאימות. לאטום את הצלחת ואת הדגירה ב RT עבור 1 h.
- שטוף את הצלחת 5x עם 255 μL/טוב מאגר לשטוף.
- הוסף 100 μL/באר של פתרון HRP מדולל לכל הבארות. אטום את הצלחת ואת הדגירה ב RT עבור 30 דקות.
- שטוף את הצלחת 5x עם 255 μL/טוב מאגר לשטוף.
- הוסף 100 μL/היטב פתרון TMB מדולל. מודקת את הצלחת מן האור בשעה RT עבור 15 דקות.
- הוסף 50 μL/הפסקת פתרון (1 M H3PO4). לקרוא ספיגת ב 450 nm עם קורא צלחת.
- ציטומטלי זרימה
- השג את המספר הכולל של תאים מ-BALF. לאחר מכן האריתרופוציטים באמצעות מאגר ACK לישיר ולשטוף 2x באמצעות PBS.
- לאחר מכן לנתח את השעיות התא היחיד על ידי זרימה cy, כמתואר בעבר11. עבור כתמי פני השטח, נויטרופילים כתם (CD11b + GR-1 +) עם CD11b הנגמ ש נגד העכבר ו אנטי עכבר Gr-1 (Ly-6G/Ly-6G) נוגדנים. לאסוף מינימום של 3 x 104 חי, ללא פסולת תאים לניתוח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בהתאם לעיצוב הניסיוני ונהלים, C57BL/6 עכברים היו חשופים CLP, ואחרי 3 ימים, הם היו מנוהלים חיידקים intranasally (איור 1). כפי שמוצג באיור 2, העכברים החלו למות ב ~ 12 h לאחר אינדוקציה של צפקת. שני עכברים בקבוצת CLP + SA ושלושה עכברים בקבוצת CLP + NS מתו לפני intranasal S. לא התגלתה התמותה בעכברים לא מופעלים או מזויפים. לכן, כאשר עכברים היו CLP לפני דלקת ריאות, התמותה היתה גבוהה הרבה יותר (p < 0.05). לאחר האתגר intranasal חיידקים (1 x 107 cfu), שלושה מתוך שמונה עכברים שרדו הן בקבוצות sa ו-שיוך, וארבעה מתוך שמונה עכברים שרדו בקבוצה CLP + NS. עם זאת, כל שמונת העכברים מתו בקבוצת CLP + SA. לעומת זאת, כל עכבר בקבוצה Ctrl והקבוצה שאם-אס שרדו. עכברים CLP הראו יותר תמותה כאשר לאחר מכן מאותגרים עם ס. האוראוס. תמותת האוראוס אחרי הCLP (100%) היה גבוה יותר מאשר נגוע בלבד (37.5%) או ס. אוראוס לאחר הפעלת האשם (37.5%; p < 0.05).
כפי שמוצג באיור 3, מקרה חמור של caecum נצפתה בחיות POST-CLP, אך יותר מכך מהקבוצה כפולה (CLP + SA). עם זאת, לא היה שינוי מגעיל של מעי בשליטה או להיט יחיד עם קבוצות חיידקים. דם, BALF, ו PLF היו תרבותי כדי להעריך את הסיווג בקטריאלי לריאות של עכברים נגוע S. האוראוס 3 ימים POST-CLP. הרמה הגבוהה הזאת היתה קשורה עם הגדילה משמעותית של cfu בארה ב בדם ו plf של עכברים CLP לעומת עכברים מזויפים (p < 0.05; איור 4A,C). מספרם של הכאוס cfu בדם ו balf של CLP + SA עכברים היה גדול במידה ניכרת יותר מאשר CLP + NS עכברים (p < 0.01; איור 4A,B).
עבור ציטוקינים אנטי דלקתיות, התוצאות הראו כי רמות הביטוי של סרום IL-1β, IL-6, ו-TNFα גדל באופן משמעותי במשך 24 שעות לאחר המניפולציה חיידקי בעכברים ששרדו אלח דם לעומת העכברים שעברו CLP לבד או המזויף מופעל עכברים מאותגרים עם ס אוראוס (איור 5a). עם זאת, ציטוקינים pro-דלקתיות גדל מעט בתוך BALF של עכברים ספיגה עם זיהום משני, שונה מן האלה בעכברים נגועים בקרת (עכברים SA) ו-שאם SA. בינתיים, כפול פגע עכברים הציגו רמות ירידה משמעותית ב BALF IL-1β, IL-6, ו-TNFα רמות לעומת שניהם SA ו-שאם SA עכברים (p < 0.001; איור 5B).
כפי שמוצג באיור 6, עכברים הוקרבו 24 שעות לאחר ההדבקה, ואחוז נויטרופילים יחסיים ב balf זוהו על ידי cy, הזרמת לנסות. שני כניסות עכברים הציגו הפחתה משמעותית של נויטרופילים ב BALF בהשוואה לעכברים שעברו לבדו דלקת ריאות בלבד. באופן קולקטיבי, נתונים אלה הראו כי CLP פוגע בתגובות החיסונית מארח, וכתוצאה מכך רגישות מוגברת לדלקת ריאות משנית בקטריאלי.
איור 1 : תכנון ניסיוני. עכברים חולקו באופן אקראי לשישה קבוצות. שתי קבוצות עברו לCLP וניקוב בD0, והאחרים היו מופעלים או לא פעלו. שלושה ימים לאחר הניתוח (D3), S. האוראוס [SA, 1 x 107 מושבה היוצרים יחידות (cfu)] או מלוחים רגיל (NS) היה מנוהל intranasally. העכברים של קבוצת הבקרה (Ctrl) לא intranasally החדירו. דם, נוזל ברונכמכתשי נוזלים (BALF), ונוזל שאיפה הצפק (PLF) נקצרו 24 שעות לאחר הזרקת SA עבור חיידקים ספירת החיידק. שיעור התמותה בכל קבוצה נצפתה במהלך 7 ימים לניתוח הישרדות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2 : הישרדות העכבר. C57BL/6 עכברים שהוגשו ל CLP או ניתוח מזויף קיבל S. האוראוס (SA) או מלוחים רגיל (NS) ביום השלישי לאחר הניתוח (n = 8 עכברים לכל קבוצה). העכברים היו מנוטרים במשך 7 ימים, והתמותה נרשמה כל 12 h. מבחני ההישרדות של קפלן-מאייר, מבחן בדרגה (* p < 0.05) בהשוואה לעכברים האלה + SA ועכברים SA. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3 : העכבר cecum. זיהום משני המושרה 3 ימים post-CLP. 24 שעות לאחר זיהום SA, עכברים הוקרבו כדי לאסוף רקמות המעי הגס. התמונות הייצוגיות של הנוגע לפגיעה בפגיעות מוצגות. SA = S.האוראוס; NS = תמיסת מלח רגילה; CLP = הארכה וניקוב. סרגל בקנה מידה = 1 ס מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4 : ספירות חיידקים ותמונות מייצגות של צלחות אגר. 3 ימים לאחר הניתוח, עכברים היו intranasally החדירו עם 1 x 107 cfu של S. האוראוס (SA) (n ≥ 3 עכברים לכל קבוצה). דם, BALF, ו PLF נקצרו 24 שעות לאחר הזרקת SA, וספירות המושבה חיידקי נקבעו לאחר 24 שעות של דגירה. התוצאות מתבטאות כממוצע ± SEM. ANOVA בכיוון אחד (הדואר הפוסט-הוק של Tukey; * p < 0.05; * * p < 0.01; * * * p < 0.001; ns = לא משמעותי). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5 : אליסה מזהה הפרשת ציטוקין. זיהום משני המושרה 3 ימים post-CLP. ריכוזים של IL-1β, IL-6, ו TNFα בסרום (A) ו balf (ב) מ עכברים לאחר זיהום (n ≥ 3 עכברים לכל קבוצה). נתונים מוצגים כממוצע ± SEM של שלושה ניסויים. בכיוון אחד ANOVA (הודעה של Tukey-הוק; * p < 0.05; * * p < 0.01; * * * * p < 0.0001; ns = לא משמעותי). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6 : התדר המייצג של חדירה נויטרופילים. 24 שעות לאחר זיהום intranasal, עכברים הוקרב כדי להשיג BALF (n ≥ 3 עכברים לכל קבוצה). האחוז של נויטרופילים (CD11b+, GR-1+) היה כמת על ידי הזרמת cy, ומוצגים כאמצעי ± SEM של שלושה ניסויים. בכיוון אחד של ANOVA (ההודעה של Tukey הודעה; * * * * p < 0.0001; ns = לא משמעותי). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כמו המודל הסטנדרטי זהב עבור מחקר אלח דם, CLP יש שילוב של שלושה עלבונות, כולל טראומה רקמות שנגרמו על ידי האונה, נמק עקב הארכה של cecum, וזיהום כתוצאה של דליפת חיידקים שגורם צפקת עם טרנסלוקציה של חיידקים לתוך דם8. לכן, CLP מחקה את המורכבות של אלח דם אנושי טוב יותר מדגמים רבים אחרים. עם זאת, הגבלה מרכזית של המודל הנוכחי CLP היא חוסר יכולת לשקף את השלב ממושך יותר של אלח דם שנראה אצל חולים בטיפול נמרץ3,4,5. מכאן, מודל כפול רלוונטי קלינית (כפול להיט מודל) הוצע לשקף את התמותה התעכבה של אלח דם ולחקור את המנגנונים הבסיסיים זיהום משני ריאתי. בפרוטוקול זה, אלח דם המושרה על ידי שילוב CLP עם הדלקת הריאה של האוראוס ב 3 ימים POST-CLP. שני כניסות עכברים הציגו תמותה גבוהה יותר, נזק מעי חמור, חלש דם, בקטריה balf סיווג, ציטוקינים pro-דלקתיות נמוך, ו נויטרופילים התחתון balf. זה הביא לאלח דם חמורים, אשר מחקה את מצב דיכוי החיסוני במרפאות.
התיאורים הבאים הם שלבים קריטיים. מוצג בפרוטרוט כיצד לייצר אלח דם תת-קטלני באותם תנאים. ראשית, עכברים נשים שימשו כי עכברים נשים עמידים יותר CLP מאשר עכברים גברים11. שנית, התמותה הנגרמת על ידי CLP תלוי במספר פרמטרים טכניים, כגון אורך של ליגיום, גודל מחט, ומספר דקירות מעי9. הארכה של כ 75% של מעי גורם אלח דם חמורים, הארכה של 60% של מעי משרה אלח דם ברמה האמצעית, והארכה של 25% או פחות של תוצאות מעי קטין אלח דם9. זה נבחר לתקנן את המודל על ידי ביצוע CLP קלה (25%, יחיד דרך-ובדרך נקב עם מחט 21 G 1 1/2) כדי לגרום לאלח דם משנה11,12. שלישית, החייאה הנוזלים מומלץ למנוע הלם ומוות מהיר עקב התמוטטות המחזור ולפתח מודל אלח דם היפרדינמי של בעלי חיים, אשר מחקה באופן הדוק יותר פרופיל של אלח דם של אדם13. בנוסף, השימוש בשככי כאבים, כגון בופרינורפין, צריך להיחשב מבחינה ניסויית ואתית10.
שלושה ימים post-CLP נבחרה כנקודת זמן כדי לגרום לזיהום משני כדי לשקף את השלב המדכא של אלח דם. רוב החולים עם אלח דם יש קורס ממושך בבית החולים עם רוב מקרי המוות המתרחשים מעבר 3 ימים, ורבים מכן להיכנס לתוך דלקת ריאות משנית בבית החולים, אשר הוצג בעקביות במחקר שנערך לאחרונה עם CLP יחד עם P. aeruginosa14 . התוצאות הקודמות של מעבדות אחרות גם להדגים כי 3 ימים לאחר CLP, עכברים להראות רגישות גבוהה לחיידקים החדירו משני, ויום אחד לאחר הזיהום היה נקודת המפנה מדלקת יתר לדיכוי חיסוני15, . שישה עשרה
בנוסף, הבדלים זני חיידקים והמינון החדירו הם גורמים משמעותיים הגורמים להשתנות במודל כפול. בחירת רמות המתח והמינון מבוססים על הצרכים של התכנון הניסיוני של זיהום משני במצב מדכא חיסוני. בהתבסס על ממצאים קודמים, 1 x 107 Cfu של ס. אוראוס נבחר למחקר זה.
כדי לשפר את היעילות של משלוח חיידקי intranasal ישירות לתוך הריאות העכבר, תשומת לב יש לשלם את עוצמת הקול, זמן, ואת מיקום הגוף. ישנם עניינים מבצעיים אחרים שעלולים להשפיע מאוד על תוצאות הניסוי. אלה כוללים מחזיק את העכבר זקוף, ניהול חיידקים מרובים במינון נמוך לתוך שני נחיריים בנפרד במהלך כל מחסור, צפייה באינהלציה של נוזל ללא יצירת בועות, שליטה על מהירות האינהלציה; להזיז את העכבר למעלה במהירות למטה לאט, והנחת העכבר בזווית 45 ° כדי להתאושש מתוך הסטיזילציה. ממשל חיידקים Intranasal הוא לא פולשני ומסייע למנוע חנק, להגביר את הנגישות, לשפר את הבטיחות, ולמזער פציעות כירורגי.
עם זאת, לשיטה זו יש מגבלות. כפי שזהו מחקר מתודולוגי, נתונים לא נדונו על שינויים של סימנים קליניים; ציטוקינים אנטי דלקתיים; וכמות ותפקוד של מונוציטים, נויטרופילים, לימפוציטים בדם. עכברי מעבדה הם לעתים קרובות הטבעי, יש בגילאים דומים ומשקולות, הם שוכנו במתקנים ספציפיים הפתוגן נטול, ובדרך כלל אין מדובר בתחלואה, כגון דיכוי חיסוני טרום הקיים. עם זאת, מין שונה, גיל, מעמד החיסון והתזונתי, וטיפול אפשרי שפיטה כגון אנטיביוטיקה של חולים עלול לגרום לתוצאות קליניות הטרוגנית. בהתחשב בטרוגניות של חולים אנושיים, משתנים כגון גיל, משקל, טרום קיימים מחלות, טיפול קליני תומכת צריך להיות מצופה היטב.
הפיתוח של מודל כפול זה (כפול פגע מודל) הוא בזמן וחשוב עבור הזיהום ואת הקהילה מחקר החסינות משום שהוא דומה התקדמות מן hyper-כדי היפו השלב הדלקתי של אלח דם אנושי. זה משקף את התרחיש הקליני הנפוץ של דלקת ריאות מחלה נוזוקומיאלית משנית בחולים עם אלח דם באופן מדויק יותר. מודל זה עשוי לסייע לפתח אסטרטגיות טיפוליות חדשות לדיכוי חיסוני המושרה על ידי אלח דם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין קונפליקטים פיננסיים של עניין.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת על ידי המכונים הלאומיים של מענקי בריאות R01 AI138203-01, AI109317-04, AI101973-01, ו AI097532-01A1 ל M. W. האוניברסיטה של צפון דקוטה ליבה מתקנים תמכו על ידי NIH מענקים (INBRE P20GM103442 ו COBRE P20GM113123). עבודה זו נתמכת גם על ידי תוכנית מפתח של הקרן הלאומית למדע הטבע של סין (81530063) ל Jianxin Jiang. לתורמים לא היה כל תפקיד בתכנון לימוד, איסוף נתונים וניתוח, החלטה לפרסם או הכנת כתב היד. אנו מודים למארווין לייר (המרכז לבריאות הכפר, אוניברסיטת דקוטה הצפונית) על ביצוע הווידאו.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 21 G 1 ½ Needle | BD | BD305167 | |
| ACK lysing buffer | Gibco | A10492-01 | |
| Anti-mouse CD11b antibody | Biolegend | 101201 | |
| Anti-mouse Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) antibody | Biolegend | 108401 | |
| C57BL/6 mice | Harlan (Indianapolis) | C57BL/6NHsd | |
| Desk light | General Supply | General Supply | |
| Disinfecting wipes | Clorox | B07NV5JMCS | |
| Electric razor | General Supply | General Supply | |
| ELISA kits (mouse IL-1β, IL-6 and TNFα) | Invitrogen | 88-7013, 88-7064, and 88-7324 | |
| Iodine | Dynarex | B003U463PY | PVP Iodine Wipes |
| Ketamine | FORT DODGE | NDC 0856-2013-01 | Amine hydrochloride injection |
| Laboratory scale | General Supply | General Supply | |
| LB Agar, Miller | Fisher Scientific | BP1425-500 | Molecular genetics, powder |
| Micropipette | ErgoOne | 7100-1100 | |
| Normal saline | General Supply | General Supply | |
| Polylined towel | CardinalHealth, Convertors | 3520 | Surgical drape, sterile, for single use only |
| Silk suture, 4-0 | DAVIS & GECK | 1123-31 | |
| Small animal needle holder | General Supply | General Supply | |
| Small animal surgery scissors | General Supply | General Supply | |
| Small animal surgical forceps | General Supply | General Supply | |
| Staphylococcus aureus | ATCC | 13301 | |
| Warm pad | General Supply | General Supply | |
| Xylazine | Alfa Aesar | 7361-61-7 |
References
- Singer, M., et al. The Third International Consensus Definitions for Sepsis and Septic Shock (Sepsis-3). JAMA. 315 (8), 801-810 (2016).
- Delano, M. J., Ward, P. A. The immune system's role in sepsis progression, resolution, and long-term outcome. Immunological Reviews. 274 (1), 330-353 (2016).
- Mayr, F. B., Yende, S., Angus, D. C.
- Fleischmann, C., et al. Assessment of Global Incidence and Mortality of Hospital-treated Sepsis. Current Estimates and Limitations. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 193 (3), 259-272 (2016).
- Reinhart, K., et al. Recognizing Sepsis as a Global Health Priority - A WHO Resolution. The New England Journal of Medicine. 377 (5), 414-417 (2017).
- Boomer, J. S., et al. Immunosuppression in patients who die of sepsis and multiple organ failure. JAMA. 306 (23), 2594-2605 (2011).
- Hotchkiss, R. S., Monneret, G., Payen, D. Sepsis-induced immunosuppression: from cellular dysfunctions to immunotherapy. Nature Reviews Immunology. 13 (12), 862-874 (2013).
- Dejager, L., Pinheiro, I., Dejonckheere, E., Libert, C. Cecal ligation and puncture: the gold standard model for polymicrobial sepsis? Trends in Microbiology. 19 (4), 198-208 (2011).
- Rittirsch, D., Huber-Lang, M. S., Flierl, M. A., Ward, P. A. Immunodesign of experimental sepsis by cecal ligation and puncture. Nature Protocols. 4 (1), 31-36 (2009).
- Hugunin, K. M. S., Fry, C., Shuster, K., Nemzek, J. A. Effects of tramadol and buprenorphine on select immunologic factors in a cecal ligation and puncture model. Shock. 34 (3), 250-260 (2010).
- He, S., et al. Annexin A2 Modulates ROS and Impacts Inflammatory Response via IL-17 Signaling in Polymicrobial Sepsis Mice. PLoS Pathogens. 12 (7), 23 (2016).
- Pu, Q. Q., et al. Atg7 Deficiency Intensifies Inflammasome Activation and Pyroptosis in Pseudomonas Sepsis. Journal of Immunology. 198 (8), 3205-3213 (2017).
- Zanotti-Cavazzoni, S. L., et al. Fluid resuscitation influences cardiovascular performance and mortality in a murine model of sepsis. Intensive Care Medicine. 35 (4), 748-754 (2009).
- Chin, W., et al. A macromolecular approach to eradicate multidrug resistant bacterial infections while mitigating drug resistance onset. Nature Communications. 9 (1), 917 (2018).
- Nascimento, D. C., et al. IL-33 contributes to sepsis-induced long-term immunosuppression by expanding the regulatory T cell population. Nature Communications. 8, 14919 (2017).
- Deng, D., et al. Systematic investigation on the turning point of over-inflammation to immunosuppression in CLP mice model and their characteristics. International Immunopharmacology. 42, 49-58 (2017).
