Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

التصوير إنتغرين التوتر وقوة الخلوية في القرار Submicron مع جهاز استشعار توتر التكاملية

Published: April 25, 2019 doi: 10.3791/59476
Automatic Translation
1, 1, 2
1Department of Physics and Astronomy, Iowa State University, 2Department of Physics and Astronomy, Molecular, Cellular, and Developmental Biology Interdepartmental Program, Iowa State University

Summary

التوتر إنتغرين تلعب أدواراً هامة في مختلف وظائف الخلية. مع جهاز استشعار توتر تكاملية، معايرة بحساسية بيكونيوتون (pN) إنتغرين التوتر وتصويرها في القرار submicron.

Abstract

هو التوتر الجزيئية المرسلة بواسطة السندات إنتغرين-يجند الإشارات الميكانيكية الأساسية في المسار إنتغرين التي تضطلع بأدوار هامة في العديد من وظائف الخلية والسلوكيات. لمعايرة والصورة إنتغرين التوتر مع حساسية عالية القوة والقرار المكانية، قمنا بتطوير جهاز استشعار توتر تكاملية (البحث عن)، جهاز استشعار توتر فلورية القائمة على الحمض النووي. يتم تنشيط البحث عن فلوريس إذا إدامة توتر جزيئية، وبالتالي تحويل القوة إلى إشارة مضيئة على المستوى الجزيئي. عتبة التوتر عن التنشيط الانضباطي في النطاق من 10 – 60 pN جيدا يغطي النطاق الديناميكي للتوتر إنتغرين في الخلايا. على الركازة المطعمة بالبحث عن، تصور بالأسفار التوتر إنتغرين الخلايا ملتصقة وتصويرها في القرار submicron. البحث عن أيضا متوافقة مع التصوير الهيكلي الخلية في الخلايا الحية والخلايا الثابتة. البحث عن طبق بنجاح دراسة تقلص الصفائح الدموية والهجرة الخلية. هذه الورقة تفاصيل الإجراء للتوليف وتطبيق لها في الدراسة المنقولة إنتغرين القوة الخلوية.

Introduction

الخلايا تعتمد على إينتيجرينس الالتزام وبذل القوات الخلوية للمصفوفة خارج الخلية. نقل الخلية بوساطة إنتغرين الالتصاق والقوة حاسمة بالنسبة للخلية التي تنتشر الهجرة3،4،1،2وبقاء5،،من67. على المدى الطويل، إنتغرين مما يشير إلى النشاط الحيوي أيضا يؤثر على خلية انتشار8،،من910 والتمايز11،12. قد طور الباحثون أساليب مختلفة لقياس والخريطة المنقولة إنتغرين الخلوية قوات في واجهة الخلية-مصفوفة. وتستند هذه الطرق التحتية المرنة13، مجموعة من14من micropost، أو ذرية قوة مجهرية (فؤاد)15،16. الطرق التحتية و micropost مرنة تعتمد على تشوه ركائز تقرير الإجهاد الخلوية والقيود فيما يتعلق بالقرار المكانية وقوة حساسية. فؤاد قوة عالية الحساسية، ولكن فإنه لا يمكن الكشف عن القوة في مواقع متعددة في وقت واحد، مما يجعل من الصعب على خريطة القوة الخلوية أحالها إينتيجرينس.

في السنوات الأخيرة، وضعت عدة تقنيات لدراسة القوة الخلوية على المستوى الجزيئي. ووضعت مجموعة من أجهزة الاستشعار الجزيئية التوتر على أساس17،البولي إيثيلين غليكول18وعنكبوت الحرير الببتيد19، والحمض الخلوي الصبغي20،21،،من2223 إلى تصور ورصد التوتر المرسلة بواسطة البروتينات الجزيئية. من بين هذه التقنيات، اعتمد الحمض النووي أولاً كقياس المواد التوليف في التوتر الحبل (TGT)، رابط روبتورابل الذي ينظم الحد الأعلى للتوترات إنتغرين في الخلايا الحية22،24. في وقت لاحق، تقنية نقل صدى الحمض النووي والأسفار تم الجمع بين لخلق دبوس أجهزة استشعار التوتر الفلورسنت على أساس الحمض النووي أولاً تشن المجموعة23 و مجموعة ساليتا في20. جهاز استشعار التوتر القائم على الحمض النووي دبوس تقارير إنتغرين التوتر في الوقت الحقيقي وتم تطبيقه بنجاح على دراسة سلسلة من الوظائف الخلوية21. بعد ذلك، ضم مختبر وانغ TGT مع زوج فلوروفوري-يحتوي تقرير إنتغرين التوتر. يدعى هذا الاستشعار البحث عن25،26. يستند مزدوج تقطعت الحمض النووي (dsDNA) ومجموعة ديناميكية أوسع (10-60 pN) لمعايرة التوتر إنتغرين. على النقيض من دبوس أجهزة الاستشعار على أساس الحمض النووي، البحث عن لا تبلغ قوة الخلوية في الوقت الحقيقي لكن يسجل جميع الأحداث التاريخية إنتغرين كالبصمة الخلوية القوة؛ تحسن هذه العملية تراكم الإشارات حساسية الخلوية قوة التصوير، ويجعلها ممكنة لقوة الصورة الخلوية حتى مع مجهر الأسفار منخفضة. توليف للبحث عن نسبيا أكثر ملاءمة، فإنه يتم إنشاؤه بواسطة التهجين اثنين واحد-الذين تقطعت بهم السبل المعينة (سدنا).

البحث عن دسدنا 18-قاعدة-إقران مترافق مع البيوتين، فلوروفوري، تقضي (الثقب الأسود يحتوي 2 [BHQ2])27، و دوري أرجينيلجليسيلاسبارتيك حمض (إدارات) ببتيد28 يجند ببتيد إنتغرين (الشكل 1). حبلا أقل هو مترافق مع فلوروفوري (Cy3 ويستخدم في هذه المخطوطة، بينما الأصباغ الأخرى، مثل سلسلة Cy5 أو أليكسا، ثبت عمليا في المختبر لدينا أيضا) والعلامة البيوتين، التي هي معطلة البحث عن على الركازة بالسندات avidin البيوتين. ستراند العلوي هو مترافق مع إدارات الببتيد و "تقضي الثقب الأسود"، الذي يروي Cy3 مع حوالي 98 ٪ التبريد الكفاءة26،27. مع البروتوكول المعروضة في هذه الورقة، كثافة الطلاء لها على الركازة حول 1,100/ميكرون2. وهذا هو كثافة نحن معايرة سابقا عن 18 شركة بريتيش بتروليوم بيوتينيلاتيد دسدنا المغلفة على الركازة فونكتيوناليزيد نيوترافيدين باتباع نفس طلاء بروتوكول29. عندما تلتزم الخلايا الركيزة مغطاة البحث عن، يربط لها من خلال إدارات إنتغرين وينقل التوتر إلى البحث عن. وقد البحث عن توتر محددة تسامح (تيتول) الذي يعرف بأنه على عتبة التوتر الذي يفصل ميكانيكيا دسدنا لها داخل 2 ق22. تمزق سبب التوتر إنتغرين يؤدي إلى فصل يحتوي من الصبغة التي تنبعث الأسفار فيما بعد. نتيجة لذلك التوتر إنتغرين غير مرئية يتم تحويلها إلى إشارة الأسفار ويمكن تعيين قوة الخلوية بتصوير الأسفار.

لبيان تطبيق للبحث عن، نستخدم الأسماك كيراتوسيتي هنا، نموذج خلية مستخدمة على نطاق واسع للخلية الهجرة دراسة30،،من3132، الخلية K1 تشو، خط الخلية نونموتيلي استخداماً، وتنتجها الخلايا الليفية 3T3 المعاهد الوطنية للصحة. ويجري أيضا كويماجينج إنتغرين الهياكل التوتر والخلية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

جميع الأساليب الموصوفة هنا أقرتها لجنة الاستخدام (IACUC، 8-16-8333--أنا) من جامعة ولاية آيوا ورعاية الحيوان المؤسسية.

1-تجميع لاستشعار التوتر التكاملية

  1. تخصيص وترتيب سدناس (انظر الجدول للمواد).
    ملاحظة: تسلسل سدنى كما يلي. ستراند العلوي هو/5ThioMC6-D/GGG AGG ACG كاج وظفته دول مجلس التعاون الخليجي/3BHQ_2/. فيما يلي فروع أقل.
    pN 12 للبحث عن:/5Cy3//3Bio/"السواقين سی CTG CGT CCT مجلس التعاون الجمركي"
    pN 23 لها: السواقين سی CTG CGT CC/iBiodT//5Cy3/سي سي سي
    pN 33 للبحث عن:/5Cy3/السواقين سی CTG CG/إيبيودت/CCT مجلس التعاون الجمركي
    pN 43 للبحث عن:/5Cy3/السواقين سی ج/إيبيودت/G CGT CCT مجلس التعاون الجمركي
    pN 54 للبحث عن:/5Biosg//iCy3/السواقين سی CTG CGT CCT مجلس التعاون الجمركي
    هنا،/5ThioMC6-D/يمثل معدل ثيول C6 S-S (ثنائي كبريتيد) في نهاية 5 '. ويمثل/3BHQ_2/2 تقضي الثقب الأسود في نهاية 3 '. /3Bio/و/5Biosg/و/iBiodT/بيوتينيليشن بنهاية 3 '، 5' نهاية، وعلى الثايمين للحمض النووي، والداخلية على التوالي. ويمثل/iCy3/Cy3 إدراجها في العمود الفقري الداخلية من سدنى. هذه الرموز المستخدمة من قبل المورد التجارية المحددة المستخدمة هنا، وقد تكون مختلفة في الشركات الأخرى من الحامض النووي.
  2. المتقارنة إدارات الببتيد إلى SH-سدنا-تقضي.
    ملاحظة: الكواشف المستخدمة هي مخزنة الفوسفات المالحة (PBS)، سولفوسوكسينيميديل 4-(ن-ماليميدوميثيل) الحلقي-1-كاربوكسيلات (سالفو-بين الموظفين) وإدارات الببتيد تريس-هيدروكلوريد الفوسفين (2-كاربوكسيثيل)، تعرف أيضا باسم تسيب-HCl.
    1. ديبروتيكت المعدل ثيول على الحمض النووي حبلا العلوي باستخدام حل تسيب.
      ملاحظة: يتم شحنها السلطات الوطنية المعينة ثيول تعديل أمر من مصدر تجاري في شكل المؤكسد، مع ذرات الكبريت المحمية بموجب سند ثنائي كبريتيد يحتاج قللت من قبل الاقتران إدارات-الحمض النووي. تسيب كاشف الحد من رائحة المستخدمة ل deprotection ثيول.
      1. حل مغ 14.3 من HCl تسيب في 300 ميليلتر من الماء. ضبط الأس الهيدروجيني من تسيب حل ~7.2–7.4 حل هيدروكسيد الصوديوم 1 متر (حوالي 150 ميليلتر)، باستخدام أوراق اختبار درجة الحموضة. إضافة الماء النقي لجعل وحدة تخزين نهائي 0.5 مل. أن تركيز تسيب النهائي 100 مم.
        ملاحظة: من المستحسن جعل الحل تسيب جديدة كل مرة للحمض النووي ثيول deprotection. تجنب تخزين تسيب حل لفترة طويلة.
      2. إضافة 100 ميليلتر 0.5 م الإيثيلين حمض الحل (يدتا) و 400 ميليلتر من الماء إلى الحل تسيب.
      3. إضافة 10 ميليلتر من الحل تسيب + أدتا إلى 20 ميليلتر من 1 مم ثيول-الحمض النووي--BHQ2 في برنامج تلفزيوني. واسمحوا أن الحل الرد لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
        ملاحظة: سوف المشقوق رباط ثنائي كبريتيد 5 ' ثيول معدل تصريف C6 S-S في هذا سدنى تسيب، تاركاً مجموعة ثيول جاهزة للتفاعل مع ماليميدي في الخطوات التالية. تسيب لا تتداخل مع رد فعل ثيول-ماليميدي التالية؛ وهكذا، فإنه ليس من الضروري تخميل تسيب بعد هذه الخطوة.
    2. المتقارنة إدارات-NH2 مع سالفو-بين الموظفين.
      1. حل 5 ملغ من إدارات-NH2 في 100 ميليلتر من برنامج تلفزيوني للحصول على 11 مم إدارات-NH2.
      2. إضافة 200 ميليلتر من الماء النقي للأنبوب مع 2 مغ من سولفو-بين الموظفين (بريميسوريد من المورد). وسحق الصلبة سالفو-التنسيق مع تلميح ماصة بشدة "الماصة؛" وفي الوقت نفسه لتسهيل حل بين الموظفين وفي الماء. وسيكون تركيز التنسيق سالفو 23 ملم.
        ملاحظة: نظراً لأن إستر دائرة الصحة الوطنية في العشرين سالفو يخضع للتحلل المائي ومدى حياة لبضع دقائق، ينبغي استكمال هذه الخطوة حل داخل 1 دقيقة لتجنب فقدان المفرط إستر دائرة الصحة الوطنية بسبب التحلل. استخدام الماء النقي لحل سالفو-بين الموظفين لأن ذوبانه في برنامج تلفزيوني أو المخازن المؤقتة الأخرى الفقيرة.
      3. إضافة 40 ميليلتر للحل بين الموظفين سالفو للحل2 إدارات-NH 100 ميليلتر واحتضان عليه لمدة 20 دقيقة.
        ملاحظة: إستر دائرة الصحة الوطنية في سولفو-بين الموظفين وسوف يتفاعل مع مجموعة أمين في إدارات-NH2، تشكل في سندات أميد التي تربط إدارات وسولفو-بين الموظفين.
    3. متزاوجة إدارات التنسيق مع ش-سدنى-يحتوي.
      1. مزيج من الحلول التي أعدت في خطوات 1.2.1 و 1.2.2 واحتضان الخليط عن 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. نقل الحل إلى مجموعة ثلاجة عند درجة 4 مئوية، والسماح لها بمواصلة التفاعل بين عشية وضحاها. ثيول مترافق على الحمض النووي حبلا العلوي سوف يتفاعل مع ماليميدي على سالفو-بين الموظفين، وتشكيل جماعة ثيوثير التي تربط إدارات مع حبلا العلوي الحمض النووي.
    4. تؤدي الأمطار الإيثانول لتنقية إدارات-سدنى-تقضي من الممتص سالفو-بين الموظفين، وإدارات، وتسيُّب.
      1. تشيل 10 مل إيثانول 100% في أنبوب مخروطي 15 مل في ثلاجة-20 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل.
      2. مزيج حل م 3 كلوريد الصوديوم، والحل الحمض النووي، وبرود الإيثانول بنسبة حجم 01:10:25. الاحتفاظ السائل مختلطة في ثلاجة-20 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة أو حتى هو عجلت في الحمض النووي.
      3. أجهزة الطرد المركزي السائل في 10,000 س ز للحد الأدنى 30 تجاهل المادة طافية.
      4. إضافة برنامج تلفزيوني لبيليه الحمض النووي. قياس تركيز الحمض النووي باستخدام مطياف.
    5. (اختياري) إجراء التفريد الحمض النووي للحصول على درجة نقاء إدارات-سدنا العالي.
      ملاحظة: مع البروتوكول أعلاه، حوالي 70% – 90% من ssDNA سوف مترافق مع إدارات. إذا كان المطلوب هو نقاء أعلى، يمكن أيضا إجراء التفريد الحمض النووي لفصل الحمض النووي مترافق من الحمض النووي أونكونجوجاتيد.
      1. تجميع نظام التفريد رأسي.
      2. تحضير حل جل polyacrylamide 10% بخلط 50 مل مياه النقية، 20 مل هلام الاكريلاميد 40% ومل 8 من 10 × تريس-بورات-يدتا (TBE) العازلة 800 ميليلتر من فوق كبريتات الأمونيوم 10% (الجزائرية).
      3. إضافة 80 ميليلتر من تيتراميثيليثيلينيدياميني (تيميد) لحل جل. من أجل الحل في قاعة الزجاج نظام التفريد. إدراج مشط واحد، حسنا لإنشاء بئر على رأس الهلام. الانتظار لمدة 10 دقائق حتى الجل كروسلينكيد.
      4. يخلط والغليسيرول 100% بنسبة 1:1 حجم الحل الحمض النووي. إزالة المشط وتحميل حل الحمض النووي للهلام جيدا.
      5. تشغيل الهلام في جهد 200 ملاحظة ف هما الحمض النووي العصابات التي تخلف واحد هو الحمض النووي مترافق.
      6. قطع الفرقة جل مع الحمض النووي مترافق والنرد إلى قطع صغيرة.
      7. جمع جل مكعبات في اثنين من أنابيب الطرد المركزي 1.5 مل مع عوامل التصفية. إضافة 500 ميليلتر من برنامج تلفزيوني لكل أنبوبة.
      8. وضع هلام غارقة في برنامج تلفزيوني في مكان مظلم في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 يوم. وسوف منتشر الحمض النووي من القطع جل في برنامج تلفزيوني.
      9. جمع الحل الحمض النووي عن طريق سينتريفوجينج الأنابيب في 1,000 س ز 2 دقيقة.
      10. إجراء جولة أخرى من الإيثانول هطول الأمطار (الخطوة 1.2.4) لجمع الحمض النووي.
  3. توليف البحث عن طريق التهجين إدارات-سدنى-تقضي وصبغ-سدنى-البيوتين.
    1. مزيج من الحلول حبلا العلوي وحبلا أقل السلطات الوطنية المعينة بنسبة مولى 1.1:1. يبقى الخليط في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها إنتاج البحث عن طريق تهجين الحمض النووي.
      ملاحظة: يتم استخدام نسبة مولى من 1.1:1 تهجين الحمض النووي بدلاً من 1:1. يتم استخدام المفرط إدارات-سدنى-يحتوي لضمان أن جميع صبغ-سدنى-البيوتين سوف هجن مع إدارات-سدنى-يحتوي. سيتم غسله إدارات-سدنى-تقضي دون التهجين أثناء طلاء السطح، الذي لن يؤثر على نوعية طلاء السطح لها.
    2. قاسمة ومخزن للبحث عن الحل في-20 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل.
      ملاحظة: المخزن المؤقت التخزين هو برنامج تلفزيوني، وعموما ينبغي أن يكون تركيز التخزين فوق 10 ميكرون. للاستخدام العادي، يمكن تخزينها في الحل عند 4 درجة مئوية لبضعة أسابيع دون تدهور نوعية ملحوظة.

2-إعداد على الأسطح بشل حركة لها على أطباق بيتري زجاجية

ملاحظة: الكواشف المستخدمة هي بيوتينيلاتيد ألبومين المصل البقري (جيش صرب البوسنة-البيوتين) والبروتين عبدين للبحث عن. تشيل كل الكواشف وبرنامج تلفزيوني المخزن المؤقت إلى حوالي 0 درجة مئوية على الجليد دلو الجليد.

  1. تحميل 200 ميليلتر من 0.1 مغ/مل جيش صرب البوسنة-البيوتين في برنامج تلفزيوني على بئر طبق بيتري زجاجية (29 مم في القطر، مع 14 مم جيدا). تبني عليه لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية في ثلاجة. جيش صرب البوسنة-البيوتين هو تمتز جسديا على سطح الزجاج.
  2. تمتص من الحل من جيدا باستخدام ماصة وإضافة 200 ميليلتر من برنامج تلفزيوني مرة أخرى إلى البئر ليغسل السطح. كرر هذا x 3 لإكمال الغسيل.
  3. احتضان 200 ميليلتر من 50 ميكروغرام/مل عبدين البروتين في البئر لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية. تغسل x 3 مع برنامج تلفزيوني. بعد هذه الخطوة، تربط بين جيش صرب البوسنة-البيوتين البروتين عبدين ويصبح معطلة على سطح الزجاج.
  4. احتضان 200 ميليلتر من 0.1 ميكرون لها في البئر لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية. أغسل الطبق مع x 3 مع برنامج تلفزيوني. اترك برنامج تلفزيوني في البئر حتى طلاء الخلية. بعد هذه الخطوة، مع العلامة البيوتين بربط البروتين عبدين ويصبح معطلة على السطح.
    ملاحظة: الحيطة واحد حاسم بالنسبة لنوعية الطلاء والتجانس أثناء التثبيت للبحث عن السماح ابدأ على سطح طبق بيتري تجف. حفظ جميع المواد الكاشفة وبرنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية أو حوالي 0 درجة مئوية على الجليد مع دلو الجليد يساعد على تقليل معدل تبخر المياه أثناء خطوات الغسيل، عندما برنامج تلفزيوني يسترعى من البئر.

3-خلية الطلاء على السطوح،

  1. ثقافة السمك كيراتوسيتيس.
    ملاحظة: هنا، يستخدم ذهبية (السمك Carassius) كمثال، ولكن قد تعمل أيضا في الأنواع الأخرى.
    1. نتف قطعة من حجم الأسماك من أسماك مع ملقط مسطحة-تلميح. اضغط برفق المقياس على بئر طبق بيتري زجاجية، مع الجانب الداخلي من نطاق الاتصال بالزجاج. انتظر ~ 30 ثانية لحجم الأسماك التمسك جيدا بسطح الزجاج للطبق.
    2. أضف 1 مل Iscove لتعديل المتوسط (إيمدم) المتوسطة في دولبيكو كاملة تغطية كامل حجم الأسماك. تبقى طبق بيتري في مربع ح 6 – 48 المظلمة والرطبة في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: إيمدم المتوسطة كاملة تحتوي على 79% إيمدم + 20% مصل بقرى الجنين (FBS) البنسلين 1%. هناك حاجة إلى لا إمدادات إضافية من الأكسجين أو CO2 . يمكن ترك بضع لفات المناديل الورقية غارقة بالمياه في المربع للحفاظ على رطوبة عالية في المربع. سيتم ترحيل كيراتوسيتيس الأسماك خارج نطاق الأسماك كورقة للخلايا بعد بضع ساعات. ويمكن ملاحظة هذا مع مجهر زراعة الأنسجة. الخلايا قابلة للتطبيق عموما في ح 48.
  2. فصل ولوحة الخلايا كيراتوسيتيس على الأسطح للبحث عن.
    1. إزالة المتوسطة من طبق بيتري الذي كان مثقف حجم الأسماك. أغسل جيدا 1 x مع الخلية فصل الحل، وإضافة فصل إلى حل لتغطية حجم الأسماك واحتضان لمدة 3 دقائق.
      ملاحظة: وصفه للخلية فصل الحل يدتا كما يلي: 100 مل 10 x متوازن الملح الحل (حبس هانكس) + 10 مل من 1 "م حبيس" (درجة الحموضة 7.6) + 10 مل من بيكربونات الصوديوم 7.5% + 2.4 مل يدتا 500 مم + 1 لتر من H2o. يتم ضبط ال pH إلى 7.4.
    2. تمتص من كل خلية فصل الحل وإضافة إيمدم المتوسطة كاملة. تفريق كيراتوسيتيس من بيبيتينج لطيف. ضبط كثافة حل الخلية إلى المستوى المطلوب (1 × 104– 1 × 105/mL). لوحة الخلايا على السطح للبحث عن (أعدت وفقا للبند 2). احتضان الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة قبل التصوير.
      ملاحظة: عد الخلايا يمكن القيام به مع هيموسيتوميتير بعد فصل الخلايا مع فصل الحل. الخلية تصفيح كثافة منخفضة نسبيا حيث يكون كيراتوسيتيس الكثير من المساحة السطحية لترحيل.
  3. لوحة تشو-K1 الخلايا والخلايا 3T3 المعاهد الوطنية للصحة في الأسطح.
    ملاحظة: هو المتوسط للخلايا تشو-K1 F12 89% هام + 10% FBS + البنسلين 1%. المتوسطة للخلايا 3T3 المعاهد الوطنية للصحة هو المتوسطة النسر معدلة 89% دولبيكو (دميم) + 10% مصل بقرى العجل (CBS) البنسلين 1%. وشروط الثقافة هي شركة 37 درجة مئوية و 5%2.
    1. ثقافة تشو-K1 الخلايا أو الخلايا 3T3 المعاهد الوطنية للصحة لالتقاء 80%-100% في طبق بتري (أو قارورة الثقافة).
    2. الحارة الخلية فصل الحل والمتوسطة الثقافة إلى 37 درجة مئوية.
    3. إزالة جميع الثقافة المتوسطة في طبق بتري مع ماصة. تغسل الخلايا 1 x مع الخلية فصل الحل. تغطية الخلايا مع فصل الحل واحتضان أنه عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
    4. تفريق الخلايا من بيبيتينج. جمع حل الخلية والطرد المركزي أنه في 300 x غ لمدة 3 دقائق.
    5. تمتص من المادة طافية وإضافة المتوسطة كاملة أو متوسطة خالية من المصل.
    6. ضبط كثافة حل الخلية إلى المستوى المطلوب (1 × 105 – 1 × 106/mL). لوحة الخلايا على الأسطح للبحث عن (أعدت وفقا للبند 2). احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية ح 1-2 قبل التصوير، أو 30 دقيقة قبل تسجيل الفيديو.

4-تصوير، تسجيل الفيديو، ورسم خرائط التوتر إنتغرين في الوقت الحقيقي

  1. توفر تصوير إنتغرين التوتر في الخلايا الحية
    1. احتضان كيراتوسيتيس على الأسطح لها (أعد وفقا للمادة 2) لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، أو احتضان تشو-K1 الخلايا أو الخلايا 3T3 المعاهد الوطنية للصحة ح 1 عن الأسطح في حاضنة في 37 درجة مئوية.
    2. جبل طبق بيتري في مرحلة مجهر الأسفار. القيام بتصوير قوة الخلوية مع وقت تعرض 1 s. التكبير هو 40 x أو 100 x.
    3. أخذ فيديو الصور مع فاصل إطار من 20 ثانية كيراتوسيتيس، أو 1 – 2 دقيقة لخلايا تشو-K1 أو خلايا 3T3 المعاهد الوطنية للصحة.
    4. استخدام MATLAB أو أداة تحليل صورة أخرى لطرح إطار سابق للبحث عن الفيديو من إطار الحالي لحساب إشارة لها المنتجة حديثا في الفاصل الزمني للإطار الأخير. يمثل إشارة للبحث عن المنتجة حديثا إنتغرين التوتر المتولدة في الفاصل الزمني للإطار الأخير، وبالتالي الإبلاغ القوة الخلوية بطريقة توفر.
  2. كويماجينج من التوتر إنتغرين والبنية الخلوية في الخلايا إيمونوستاينيد
    1. بعد خطوة 3.2.2 أو خطوة 3.3.6، أداء إيمونوستينينج بمناسبة البروتينات الهيكلية المستهدفة.
      ملاحظة: استخدم صبغات مختلفة لتجنب الأسفار الحديث المتبادل بين إنتغرين التوتر التصوير والتصوير الهيكلي الخلية. في هذه المخطوطة، استخدمت فلوروفوري Cy5 فالويدين وكان يستخدم 488 أليكسا لتلطيخ فينكولين. أن تركيز الأجسام المضادة في المرحلتين الابتدائية والثانوية 2.5 ميكروغرام/مل. تركيز فالويدين 1.5 وحدات/ميليلتر.
    2. أداء قناة مولتيفلوريسسينت التصوير للحصول على كلا من خريطة التوتر إنتغرين والتصوير الهيكلي بالخلية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

مع لها، تم القبض على خريطة التوتر إنتغرين كيراتوسيتيس الأسماك. وتبين أن كيراتوسيتي وترحيل ويولد التوتر إنتغرين في مسارين القوة (الشكل 2A). تمت معايرة القرار خريطة القوة إلى 0.4 ميكرومتر (الشكل 2). ويركز إنتغرين ارتفاع حدة التوتر في الهامش الخلفي (الشكل 3A). كما يظهر البحث عن مختلف أنماط محددة من خلايا مختلفة. خلية نونموتيلي، المعاهد الوطنية للصحة-3T3، أشكال محددة إنتغرين توتر نمطاً (الشكل 3B) يختلف تماما عن كيراتوسيتي ترحيل سريعة.

مع إيمونوستينينج، كويماجيد التصاقات التنسيق والتوتر إنتغرين الأسماك كانت كيراتوسيتيس (الشكل 4 أ). تمت دراسة العلاقة بين التوتر إنتغرين وهيكل الخلية في كيراتوسيتيس بالتفصيل Wang et al.25. وكانت ألياف إنتغرين التوتر والإجهاد في الخلايا تشو-K1 أيضا كويماجيد (الشكل 4 باء). وتبين هذه التجارب أن تمكن البحث عن كويماجينج من قوة التصاق الخلايا والهياكل الخلية في نفس الوقت ضمن إعدادات التصوير مماثلة، مما يسهل دراسة تفاعل الهيكل/قوة الخلية.

Figure 1
رقم 1: الخطط به. البحث عن دسدنا مزينة يجند إدارات ويحتوي الأسفار وصبغة وعلامة بيوتين. هو مروي الصبغ (دائرة مملوءة بالأخضر) قبل تقضي. ظل التوتر إنتغرين، هو تمزق في دسدنا و Cy3 هو إطلاق سراح من تبريد وتنبعث من الأسفار التي يمكن الكشف عنها بواسطة الفحص المجهري نيون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: خريطة التوتر إنتغرين كيراتوسيتي أسماك والقرار submicron للها- (أ) أثناء الترحيل السريع، يولد كيراتوسيتي استمرار مخطط توتر إنتغرين في مسارين القوة. (ب) المسافة بين البلدين قوة المسارات هو عادة 40 ميكرومتر. القرار المكانية خريطة القوة الخلوية تصويرها لها حوالي 0.4 ميكرومتر. يتم حساب الشخصية الخطية من شدة الفلورسنت Cy3 من منطقة تتسم بخط أحمر قصير في اللوحة اليسرى السفلي لمعايرة القرار في تصوير قوة الخلوية. النتيجة تظهر في اللوحة اليسرى السفلي ومزودة بمنحنى غاوسي. شريط المقياس = 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: خريطة التوتر إنتغرين في الوقت الحقيقي للأسماك كيراتوسيتي والمعاهد الوطنية للصحة-3T3- (A) بالأسماك كيراتوسيتي وخريطة التوتر إنتغرين بها. (أعلى اليسار) كيراتوسيتي أسماك متحركة. (أسفل اليسار) خريطة التوتر إنتغرين كيراتوسيتي أفادت لها. (أعلى اليمين) وحصل التوتر إنتغرين في الوقت الحقيقي بإطار الطرح. ويبين أن التوتر الذي تم إنشاؤه حديثا إنتغرين هو كولوكاليزيد مع الحافة الخلفية الخلية. (أسفل اليمين) خريطة التوتر إنتغرين (الأخضر) والتوتر إنتغرين في الوقت الحقيقي (أرجواني) ترد في الشكل مدمجة واحدة. شريط المقياس = 10 ميكرون. (ب) المعاهد الوطنية للصحة-3T3 تنتجها الخلايا الليفية وخريطة التوتر إنتغرين بها. (أعلى اليسار) المعاهد الوطنية للصحة-3T3 تنتجها الخلايا الليفية. (أسفل اليسار) إنتغرين خريطة التوتر تنتجها الخلايا الليفية 3T3 المعاهد الوطنية للصحة. إنتغرين التوتر ولدت في نمط شريطية. (أعلى اليمين) ويظهر التوتر إنتغرين في الوقت الحقيقي أن التوتر الذي تم إنشاؤه حديثا إنتغرين يشكل أساسا في منطقة هامشية في الخلية. (أسفل اليمين) خريطة التوتر إنتغرين (الأخضر) والتوتر إنتغرين في الوقت الحقيقي (أرجواني) ترد في الشكل مدمجة واحدة. شريط المقياس = 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: كويماجينج بنية التوتر وخلية إنتغرين- (أ) كويماجينج من التوتر إنتغرين، فينكولين، وواو-أكتين في كيراتوسيتي. كانت ثابتة في كيراتوسيتي وإيمونوستينيد فينكولين وواو-أكتين. (ب) كويماجينج من التوتر إنتغرين، فينكولين، وواو-أكتين في خلية شو-K1. شريط المقياس = 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

البحث عن هو الوصول للغاية بعد قوة تقنية قوية للخلوي التعيين من حيث التوليف والتطبيق. مع جميع المواد جاهزة، يمكن توليفها البحث عن إطار يوم 1. خلال التجارب، هناك حاجة فقط ثلاث خطوات لطلاء السطح قبل الطلاء الخلية. في الآونة الأخيرة، نحن كذلك تبسيط الإجراءات طلاء إلى خطوة واحدة بربط مباشرة البحث عن ألبومين المصل البقري، التي تمكن امتزاز المادية المباشرة عن الزجاج أو الأسطح البوليستيرين33. يجلب البحث عن شدة الفلورسنت الإشارات الخلوية القوة إلى مستوى مماثل لتصوير الهيكلية الخلوية. جعل التوليف مريحة وإعداد العينات، متطلبات متواضعة للفحص المجهري، وحساسية عالية للقوة الخلوية البحث عن تقنية قوية وموثوق بها لدراسة الميكانيكا الخلية. في هذه الورقة، وقد عرضنا إجراء شامل للتوليف والتطبيق.

التصريف إدارات يجند مع سدنى هو الإجراء الأكثر أهمية في التقرير التوليفي للبحث عن. كما هو مذكور في المقطع بروتوكول، إستر دائرة الصحة الوطنية في العشرين سالفو ليست مستقرة في المياه. أطول يستغرق حل سولفو-بين الموظفين في المياه، ومبلغ أكثر من بين الموظفين سولفو يفقد إستر المستشفيات العامة للتحلل ويصبح "الفاشلة"، الذي يرتبط مع الحمض النووي من خلال رد فعل ماليميدي-ثيول لكنه فشل مترافق مع إدارات-NH2. كنتيجة لذلك، جزء كبير من جزيئات الحمض النووي سوف تكون تحتلها سالفو الميت-بين الموظفين ولا يمكن ربط مع إدارات، مما أدى إلى انخفاض عائد من إدارات ssDNA. ولهذا السبب، تذويب سالفو-بين الموظفين في المياه ينبغي أن تستكمل بسرعة، عموما داخل 1 دقيقة. من المستحسن أيضا التحقق من عائد إدارات ssDNA مع التفريد. إذا كان المحصول أعلى من 80%، تنقية عموما لا لزوم لها. وبخلاف ذلك، يوصي بتنقية الحمض النووي من هلام بولياكريلاميدي. معدل الاسترداد للحمض النووي من جل polyacrylamide هو حوالي 60%-80%.

لتوليف قدرا معقولاً من إدارات-سدنى-بك2، ينبغي أن يكون المبلغ من ثيول-سدنى-بك2 بداية نمول 20 على الأقل (1 مم × 20 ميليلتر). لاحظ أن الحمض النووي تعديلات تقلل إلى حد كبير كمية سدنا أمر من الشركات الحمض النووي. على سبيل المثال، إذا كان هو أمر نمول 1,000 من سدنى مع تعديلين، عائد مضمون لا يجوز نمول 20. إذا كان هذا هو الحال، أمر نمول 1,000 على الأقل من سدنى لتصريف إدارات ssDNA. الباحثون أيضا تصميم تسلسل الخاصة بهم على نيات. عادة، ونحن الحفاظ على المحتوى GC في لها أعلى من 70% لتحسين الاستقرار الحراري دسدنا. يمكن إجراء تحليل تسلسل الحمض النووي للتقليل من احتمال تشكيل المتمتعة بالحكم الذاتي-دبوس، التهجين الذاتي، هيكل الثانوية مستقر، إلخ. تقوم أداة التحليل متاح على الإنترنت. في المخطوطة، هو نفسه بالنسبة ITSs حبلا العلوي الحمض النووي مع مختلف تيتول. نحن تختلف موقع البيوتين في حبلا أقل الحمض النووي لتحقيق تيمختلفةتول. ومع ذلك، اختلاف موقع إدارات في حبلا العلوي يمكن أيضا تطبيقها على لحن تيتول للها. حساب Tتول لهندسة دسدنا مختلفة يتم توفيرها من قبل وانغ وها22 وموساييبي et al.34، خاصة بالنسبة دسدنا في ال35،وضع36 حيويى وطريقة القص 37،38.

على الرغم من أن الأسطح تسجيل جميع إنتغرين التوترات التي حدثت في الماضي، عن طريق تسجيل فيديو لخريطة القوة الخلوية التتالي، الباحثين يمكن حساب التوتر إنتغرين المنتجة في الفاصل الزمني للإطار الأخير بطرح الإطار السابق من إطار الحالي لإنشاء 'قوة الخلوية توفر خريطة'. الفاصل الزمني الإطار بالفيديو عن تختلف تبعاً لأنواع الخلايا لكن عادة 20 s للخلايا المهاجرة سريعة و 1 – 2 دقيقة لخلايا ثابتة. أسلوب الطرح الإطار تقارير التوتر إنتغرين إدراج مع احتفاظها بحساسية عالية للتصوير إنتغرين التوتر بسبب تأثير تراكم الإشارات. وهو الحد الأدنى بين صورتين على التوالي فوتوبليتشينج، ولذلك ليس له أي تأثير ملحوظ على أسلوب الطرح الإطار.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

هذا العمل كان يدعمها الصندوق بدء التشغيل المقدمة من جامعة ولاية آيوا والمعهد الوطني للعلوم الطبية العامة (R35GM128747).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BSA-biotin Sigma-Aldrich A8549
Neutravidin Thermo Fisher Scientific 31000
Streptavidin Thermo Fisher Scientific 434301
upper strand DNA Integrated DNA Technologies N/A Customer designed. DNA sequence is shown in PROTOCOL section
lower strand DNA Integrated DNA Technologies N/A Customer designed. DNA sequences are shown in PROTOCOL section.
sulfo-SMCC Thermo Fisher Scientific A39268
Cyclic peptide RGD with an amine group Peptides International PCI-3696-PI
IMDM ATCC ‎62996227
FBS ATCC 302020
Penicillin gibco 15140122
TCEP Sigma-Aldrich C4706
200 uL petri dish Cellvis D29-14-1.5-N
NanoDrop 2000 Thermo Scientific N/A spectrometer
SE410 Tall Air-Cooled Vertical Protein Electrophoresis Unit Hoefer SE410-15-1.5 Device for electroporesis
CHO-K1 cell line ATCC CCL-61
NIH/3T3 cell line ATCC CRL-1658
Anti-Vinculin Antibody EMD Millipore 90227 Primary antibody for vinculin immunostaining
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Superclonal Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Invitrogen A28175 Secondary antibody for vinculin immunostaining
Alexa Fluor 647 Phalloidin Invitrogen A22287
Eclipse Ti Nikon N/A microscope

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Price, L. S., Leng, J., Schwartz, M. A., Bokoch, G. M. Activation of Rac and Cdc42 by Integrins Mediates Cell Spreading. Molecular Biology of the Cell. 9 (7), 1863-1871 (1998).
  2. Cavalcanti-Adam, E. A., et al. Cell Spreading and Focal Adhesion Dynamics Are Regulated by Spacing of Integrin Ligands. Biophysical Journal. 92 (8), 2964-2974 (2007).
  3. Huttenlocher, A., Horwitz, A. R. Integrins in cell migration. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (9), a005074 (2011).
  4. Hood, J. D., Cheresh, D. A. Role of integrins in cell invasion and migration. Nature Reviews Cancer. 2 (2), 91-100 (2002).
  5. Giancotti, F. G. Integrin signaling: specificity and control of cell survival and cell cycle progression. Current Opinion in Cell Biology. 9 (5), 691-700 (1997).
  6. Illario, M., et al. Integrin-Dependent Cell Growth and Survival Are Mediated by Different Signals in Thyroid Cells. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 88 (1), 260-269 (2003).
  7. Aoudjit, F., Vuori, K. Integrin Signaling in Cancer Cell Survival and Chemoresistance. Chemotherapy Research and Practice. 2012, 1-16 (2012).
  8. Hou, S., et al. Distinct effects of β1 integrin on cell proliferation and cellular signaling in MDA-MB-231 breast cancer cells. Scientific Reports. 6, 18430 (2016).
  9. Shankar, G., Davison, I., Helfrich, M. H., Mason, W. T., Horton, M. A. Integrin receptor-mediated mobilisation of intranuclear calcium in rat osteoclasts. Journal of Cell Science. 105 (Pt 1) (1), 61-68 (1993).
  10. Moreno-Layseca, P., Streuli, C. H. Signalling pathways linking integrins with cell cycle progression. Matrix Biology. 34, 144-153 (2014).
  11. Gómez-Lamarca, M. J., Cobreros-Reguera, L., Ibáñez-Jiménez, B., Palacios, I. M., Martín-Bermudo, M. D. Integrins regulate epithelial cell differentiation by modulating Notch activity. Journal of Cell Science. 127 (Pt 1), 4667-4678 (2014).
  12. Wang, H., Luo, X., Leighton, J. Extracellular Matrix and Integrins in Embryonic Stem Cell Differentiation. Biochemistry Insights. 8 (Suppl 1), 15-21 (2015).
  13. Schwarz, U. S., Soiné, J. R. D. Traction force microscopy on soft elastic substrates: A guide to recent computational advances. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1853 (11), 3095-3104 (2015).
  14. Rittié, L. Traction Force Measurement Using Deformable Microposts. Fibrosis. Methods and Protocols. , Humana Press. New York, NY. 235-244 (2017).
  15. Radmacher, M. Studying the Mechanics of Cellular Processes by Atomic Force Microscopy. Methods in Cell Biology. 83, 347-372 (2007).
  16. Charras, G. T., Lehenkari, P. P., Horton, M. A. Atomic force microscopy can be used to mechanically stimulate osteoblasts and evaluate cellular strain distributions. Ultramicroscopy. 86 (1-2), 85-95 (2001).
  17. Miller, J. S., et al. Bioactive hydrogels made from step-growth derived PEG-peptide macromers. Biomaterials. 31 (13), 3736-3743 (2010).
  18. Legant, W. R., Miller, J. S., Blakely, B. L., Cohen, D. M., Genin, G. M., Chen, C. S. Measurement of mechanical tractions exerted by cells within three-dimensional matrices. Nature Methods. 7 (12), 969 (2010).
  19. Brenner, M. D., et al. Spider Silk Peptide Is a Compact, Linear Nanospring Ideal for Intracellular Tension Sensing. Nano Letters. 16 (3), 2096-2102 (2016).
  20. Zhang, Y., Ge, C., Zhu, C., Salaita, K. DNA-based digital tension probes reveal integrin forces during early cell adhesion. Nature Communications. 5, 5167 (2014).
  21. Liu, Y., et al. DNA-based nanoparticle tension sensors reveal that T-cell receptors transmit defined pN forces to their antigens for enhanced fidelity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (20), 5610-5615 (2016).
  22. Wang, X., Ha, T. Defining Single Molecular Forces Required to Activate Integrin and Notch Signaling. Science. 340 (6135), (2013).
  23. Blakely, B. L., et al. A DNA-based molecular probe for optically reporting cellular traction forces. Nature Methods. 11 (12), 1229-1232 (2014).
  24. Wang, Y., Wang, X. Integrins outside focal adhesions transmit tensions during stable cell adhesion. Scientific Reports. 6 (1), 36959 (2016).
  25. Wang, Y., et al. Force-activatable biosensor enables single platelet force mapping directly by fluorescence imaging. Biosensors and Bioelectronics. 100, 192-200 (2018).
  26. Zhao, Y., Wang, Y., Sarkar, A., Wang, X. Keratocytes Generate High Integrin Tension at the Trailing Edge to Mediate Rear De-adhesion during Rapid Cell Migration. iScience. 9, 502-512 (2018).
  27. Crisalli, P., Kool, E. T. Multi-Path Quenchers: Efficient Quenching of Common Fluorophores. Bioconjugate Chemistry. 22 (11), 2345-2354 (2011).
  28. Mondal, G., Barui, S., Chaudhuri, A. The relationship between the cyclic-RGDfK ligand and αvβ3 integrin receptor. Biomaterials. 34 (26), 6249-6260 (2013).
  29. Wang, X., et al. Integrin Molecular Tension within Motile Focal Adhesions. Biophysical Journal. 109 (11), 2259-2267 (2015).
  30. Euteneuer, U., Schliwa, M. Persistent, directional motility of cells and cytoplasmic fragments in the absence of microtubules. Nature. 310 (5972), 58-61 (1984).
  31. Kucik, D. F., Elson, E. L., Sheetz, M. P. Cell migration does not produce membrane flow. The Journal of Cell Biology. 111 (4), 1617-1622 (1990).
  32. Mueller, J., et al. Load Adaptation of Lamellipodial Actin Networks. Cell. , (2017).
  33. Sarkar, A., Zhao, Y., Wang, Y., Wang, X. Force-activatable coating enables high-resolution cellular force imaging directly on regular cell culture surfaces. Physical Biology. 15 (6), 065002 (2018).
  34. Mosayebi, M., Louis, A. A., Doye, J. P. K., Ouldridge, T. E. Force-Induced Rupture of a DNA Duplex: From Fundamentals to Force Sensors. ACS Nano. 9 (12), 11993-12003 (2015).
  35. Bockelmann, U., Essevaz-Roulet, B., Heslot, F. Molecular Stick-Slip Motion Revealed by Opening DNA with Piconewton Forces. Physical Review Letters. 79 (22), 4489-4492 (1997).
  36. Krautbauer, R., Rief, M., Gaub, H. E. Unzipping DNA oligomers. Nano Letters. 3 (4), 493-496 (2003).
  37. de Gennes, P. G. Maximum pull out force on DNA hybrids. Comptes Rendus de l’Académie des Sciences - Series IV - Physics. 2 (10), 1505-1508 (2001).
  38. Hatch, K., Danilowicz, C., Coljee, V., Prentiss, M. Demonstration that the shear force required to separate short double-stranded DNA does not increase significantly with sequence length for sequences longer than 25 base pairs. Physical Review E. 78 (1), 011920 (2008).

Tags

تراجع، 146 قضية، ميكانيكا الخلية، ميتشانوبيولوجي، إنتغرين، إنتغرين التوتر، تعيين قوة الخلوية، واستشعار التوتر إنتغرين
التصوير إنتغرين التوتر وقوة الخلوية في القرار Submicron مع جهاز استشعار توتر التكاملية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhao, Y., Wetter, N. M., Wang, X.… More

Zhao, Y., Wetter, N. M., Wang, X. Imaging Integrin Tension and Cellular Force at Submicron Resolution with an Integrative Tension Sensor. J. Vis. Exp. (146), e59476, doi:10.3791/59476 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter